CN114717132A - 一株具有预防和缓解便秘症状的乳双歧杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株具有预防和缓解便秘症状的乳双歧杆菌，其保藏号为CCTCCNO：M2021905；可用于制备预防和缓解便秘症状的制品。本发明所提供的乳双歧杆菌可以作为一种食品原料来源使用，长期服用不会有副作用及过量的风险，对机体无毒害作用，可单独使用，也可以与益生元和/或其它益生菌复配使用，有望开发成具有预防或缓解便秘功效的食品、保健品或药品，应用前景广阔。

Description

一株具有预防和缓解便秘症状的乳双歧杆菌及其应用

技术领域

本发明属于益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株具有预防和缓解便秘症状的乳双歧杆菌及其应用。

背景技术

便秘是临床上常见的一种消化系统疾病，主要指排便次数少、排便频率低。排便同时伴有腹痛、腹泻等症状。由于便秘是一种较为普遍的症状，轻重不一，所以一般不会引起人们注意，大部分人并不把便秘当作疾病来对待，从而忽视了便秘对身体的危害。

近年来，随着对便秘发病机制的不断探索，发现肠道菌群失调与便秘密不可分，便秘同时伴有肠道菌群失调，肠道菌群失调也会引起便秘的发生，二者互为因果。便秘患者的肠道菌群失调的现象也引起了微生物学家的重视。研究发现口服微生态制剂能够调节肠道菌群，促进肠道菌群代谢产生短链脂肪酸(SCFAs)，起到抑制病原菌生长并降低肠道pH促进肠蠕动的功效。因此，服用益生菌来预防和缓解便秘成为一种新思路。

益生菌一词源于希腊语，2001年FAO/WHO联合将益生菌定义为活的微生物，通过摄入充足的数量，可以对宿主健康产生益处。益生菌这一概念才被人们普遍所接受。而乳杆菌是肠道有益菌，具有耐酸和胆汁的能力，能黏附并定植于肠粘膜上，抑制病原菌的生长，调节免疫系统，因而被广泛用来预防各种疾病。

公开号为CN109182166A的中国发明专利公开了一株具有缓解便秘功效的鼠李糖乳杆菌，该菌株可降低肠道pH，提高肠道SCFAs水平。公开号为CN112980734A的中国发明专利公开了一株缓解便秘并调节肠道菌群紊乱的两歧双歧杆菌，对两歧双歧杆菌的便秘缓解机理进行了探讨。公开号为CN110157649A的中国发明专利公开了一株改善人便秘功效的副干酪乳杆菌L9，利用该菌制成的常温酸奶和发酵乳都可缓解人的便秘症状。

但便秘的发病机制复杂，且益生菌的益生特性在属种水平上都具有差异，同种不同株的益生菌株其预防和缓解便秘的效果及其作用机制也会存在差异。因此，筛选获得便秘缓解效果突出，作用机制明确的益生菌株仍是目前研究的难点和热点。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有预防和缓解便秘症状的乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)及其应用；所提供的乳双歧杆菌分离自健康婴儿粪便，能够调节调节胃肠功能，有效预防和缓解便秘症状。

本发明所提供的乳双歧杆菌，为乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)VHProbiYB11株，已在2021年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2021905。

所述的乳双歧杆菌VHProbi YB11菌株的Riboprinter指纹图谱如图2所示，其RAPD指纹图谱如图3所示，rep-PCR指纹图谱如图4所示。

本发明提供的乳双歧杆菌VHProbi YB11株，其16s rDNA序列为SEQ ID NO:1。

本发明还提供了乳双歧杆菌VHProbi YB11在制备用于预防和缓解便秘症状的制品中的应用。

本发明还提供一种预防和缓解便秘症状的制品，所述的制品中包含有乳双歧杆菌VHProbi YB11株和/或乳双歧杆菌VHProbi YB11的发酵产物。

所述制品为食品、保健品或药品。

本发明提供的乳双歧杆菌VHProbi YB11是一种新型的乳双歧杆菌，耐酸能力强，对模拟人工胃肠液具有很强的耐受能力，在人工胃液中消化2h后，其存活率高达100％，在人工肠液中消化3h后，仍能保留较高的活菌量，能顺利经过胃肠道在结肠处定植下来发挥益生功能。

所述乳双歧杆菌不产生溶血素，不会溶解血细胞，对氨苄西林和红霉素等常见抗生素较敏感，生物安全性良好。同时，该菌株抗氧化能力强，对DPPH自由基和HRS自由基的清除率分别达到25.94％％和66.45％，其上清液抗脂质过氧化抑制率达73.12％。该菌株还能够有效吸附黄曲霉毒素B₁，吸附率为8.29％。

所述乳双歧杆菌可以显著提高小鼠粪便的含水量，提高便秘小鼠小肠的转运能力，从而有利于促进排便，改善便秘症状。

所述乳双歧杆菌能有效调节胃肠调节肽的分泌，通过促进兴奋性递质胃动素、胃泌素和P物质的分泌，减少抑制性递质生长抑素-1、血管活性肠肽分泌实现对胃肠道运动和胃酸分泌的有效调节，缓解便秘症状。

所述乳双歧杆菌能预防及缓解便秘引起的肠壁屏障破坏，减轻炎症反应，使肠黏膜屏障趋于完整。

所述乳双歧杆菌能使便秘小鼠粪便菌群的丰富度和均匀度显著提升，使属水平上的优势物种如乳杆菌属和双歧杆菌属等有益菌的丰度趋向于空白组小鼠菌群特征，菌群组成的差异性减少，群落结构组成与空白组相似，趋于正常小鼠水平。

本发明所提供的乳双歧杆菌VHProbi YB11可以作为一种食品原料来源使用，长期服用不会有副作用及过量的风险，对机体无毒害作用，可单独使用，也可以与益生元和/或其它益生菌复配使用，有望开发成具有预防或缓解便秘功效的食品、保健品或药品，应用前景广阔。

附图说明

图1为YB11菌株革兰氏染色照片；

图2为YB11菌株Riboprinter指纹图谱；

图3为YB11菌株的RAPD指纹图谱；

图4为YB11菌株的rep-PCR指纹图谱；

图5为各组别小鼠粪便含水量结果图；

图6为各组别小鼠小肠推进率解剖图；

图7为各组别小鼠小肠推进率结果图；

图8为各组别小鼠胃肠调节肽结果图；

图9为各组别小鼠回肠病理切片结果图；

图10为各组别小鼠粪便菌群α多样性分析图；

图11为各组小鼠粪便样本在属水平上群落组成分析柱状图；

图12为各组小鼠粪便样本PCoA分析结果图。

具体实施方式

本发明所述筛选方法并不局限于实施例所述，已知的能够达到筛选目的的方法均可以，实施例的筛选说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下面结合具体实施例和附图对本发明做详细的描述。

实施例1乳双歧杆菌VHProbi YB11的分离筛选

1、初筛

配制MRS(Man Rogosa Sharpe)琼脂培养基：纯化水1000mL，蛋白胨10g，牛肉浸取物10g，酵母提取物5.0g,乙酸钠5g，葡萄糖5g，磷酸二氢钾2g，吐温80 1.0mL，柠檬酸二胺2.0g,碳酸钙20g，七水硫酸镁0.58g，七水硫酸锰0.25g，琼脂15g，调pH 6.2-6.5，121℃高压灭菌15min。

依据2019版《人类遗传资源库伦理规范》，与样本提供者签订项目承诺书和知情同意书后，按照生物样本库标准操作规范，取1mL半年内未食用过益生菌制剂的健康婴儿新鲜粪便，经无菌生理盐水稀释后放入无菌样品袋中，用匀浆仪拍打混匀；取100μL混匀液梯度稀释，涂布于MRS琼脂培养基后于37℃厌氧培养48h，待平板长出单菌落镜检。

根据镜检结果，申请人共筛选出15株潜在乳酸杆菌，分别命名为YB01，YB02，……YB15。

2、复筛

配制1L的MRS液体培养基121℃高压灭菌15min，待培养基冷却后加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h制成耐酸性培养基。

将筛选得到的15株乳酸杆菌分别按6％接种量分别接种于上述耐酸性培养基中，37℃条件下厌氧静置培养48h，取发酵液进行菌量计数。

结果显示，所述15株乳酸杆菌发酵液中活菌量的对数值分别为6.51、7.36、5.35、6.29、8.18、7.11、7.59、8.32、7.05、7.01、8.87、5.39、6.76、7.32、7.35Log CFU/mL，其中YB11菌株经耐酸性培养基复筛后活菌量最多，对数值高达8.87Log CFU/mL。从而说明YB11菌株耐酸能力最高。

实施例2菌株鉴定

1、菌落形态鉴定

将YB11菌株接种于MRS琼脂培养基上，37℃厌氧培养24h后，可见YB11单菌落呈米白色，菌落直径在0.5-1.5mm左右，表面光滑湿润，革兰氏染色后显微镜下呈短杆状，有的会呈分支状，革兰氏染色照片如图1所示。

2、生理生化特性鉴定

接种液的准备如下：在无菌条件下，取适量新鲜菌液，5000rpm/min离心5min，用PBS缓冲液洗2次，再用同体积PBS缓冲液重悬菌体后稀释50倍，作为接种液。

2.1、盐度耐受性试验

在无菌条件下，向96孔板中分别加入190μL盐浓度为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％的MRS液体培养基，每个盐浓度做3个平行，然后再加入10μL接种液，不接菌的孔作为对照。每孔加入50μL高压灭菌过的石蜡油以防止培养过程中水分蒸发。置于37℃恒温培养，观察培养基是否变浑浊。

结果显示YB11菌株最大耐受盐浓度为6％。

2.2、碳源代谢试验

本实施例中所用的基础培养基配方如下：

蛋白胨1.5g；酵母提取物0.6g；吐温80 0.1g；盐溶液0.5mL；酚红18mg；蒸馏水100mL；pH7.4±0.2。盐溶液成分：MgSO₄·7H₂O 11.5g，MnSO₄·4H₂O 2.8g，蒸馏水100mL。

配制10g/100mL的糖、醇和苷类碳水化合物溶液，并用0.22μm的无菌过滤器进行过滤。在无菌条件下，向96孔板中加入20μL除菌后的碳水化合物溶液，每种碳水化合物4个平行，然后加入170μL灭菌后含酚红的基础培养基，再加入10μL接种液，不接菌反应孔作为对照。每孔加入50μL液体石蜡以防止培养过程中水分蒸发。37℃厌氧培养，以酚红为指示剂，观察培养基颜色变化；具体结果见表1。

表1：YB11菌株碳源代谢结果表

注：“+”阳性反应；“-”阴性反应。

2.3、温度耐受性试验

在无菌条件下，将接种液按10％的接种量接种到10mL MRS液体培养基中，不接菌的10mL MRS液体培养基作为对照，置于15℃、37℃、45℃恒温振荡培养箱培养，观察培养液是否变浑浊。

结果显示：15℃和45℃恒温培养7天后，培养基仍澄清；37℃恒温培养3天后，培养基变浑浊。说明YB11菌株在37℃能生长，在15℃和45℃条件下不能正常生长。

3、分子生物学鉴定

3.1 16s rDNA基因序列分析

3.1.1、基因组DNA提取

参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP302)操作。

3.1.2、16s rDNA基因扩增

1)引物序列:

27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA；

1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。

2)反应体系(50μL)

表2：16s rDNAPCR扩增体系表

3)电泳验证PCR产物核酸电泳结果为1500bp左右时符合要求。

4)PCR产物测序

通过测序获得YB11菌株的16s rDNA序列SEQ ID NO:1，并将该序列在NCBI数据库中进行比对，确定YB11菌株为乳双歧杆菌。

3.2 Riboprinter指纹图谱

用一根取菌棒从琼脂培养基平板上沾取已纯化好的单菌落，将其放入有缓冲液的样品管中，用手持搅拌器搅拌使其在缓冲液中悬浮，然后将样品架放入加热器中灭活后放入Riboprinter系统中，样品经过DNA制备、转膜、成像检测及数据处理后，得到细菌鉴定结果。鉴定结果显示，YB11菌株为乳双歧杆菌，其Riboprinter指纹图谱结果如图2所示。

3.3 RAPD和rep-PCR指纹图谱鉴定

3.3.1、RAPD指纹图谱鉴定

1)引物序列：M13(5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’)；

2)RAPD反应体系

表3：RAPD反应体系表

3)电泳

制备1.5％的琼脂糖凝胶板，DL2000 DNAMarker作为结果对照，稳压100V电泳80min，最后利用凝胶成像系统检测电泳图。YB11菌株的RAPD指纹图谱如图3所示。

3.3.2、rep-PCR指纹图谱

1)rep-PCR引物

CTACGGCAAGGCGACGCTGACG。

2)rep-PCR的反应体系

表4：rep-PCR的反应体系表

3)电泳

DL2000 DNAMarker作为结果对照。电压100V，电泳时间80min检测扩增结果。YB11菌株的rep-PCR指纹图谱如图4所示。

综上，将YB11菌株的菌落形态以及生理生化特性结果上传至网站http://www.tgw1916.net/bacteria_logare_desktop.htmL，同时结合文献De Clerck E，etal.Systematic and applied microbiology,2004,27(1)50公布的结果，进行比对。综合分子生物学的鉴定结果，可以得出结论，YB11菌株为一株新型的乳双歧杆菌，将其命名为乳双歧杆菌VHProbi YB11(Bifidobacterium lactis VHProbi YB11)，已于2021年7月19日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M 2021905。

实施例3乳双歧杆菌VHProbi YB11对人工胃液和人工肠液的耐受性试验

1、人工胃液的配制

分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g和NaCl 2g，加入1000mL蒸馏水，用稀盐酸调pH3.0，然后115℃灭菌20min。然后使用前加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h，以模拟人体温度。

2、人工肠液的配制

分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g、KH₂PO₄ 6.8g和牛胆盐3.0g，加入77mL的0.2mol/L的NaOH溶液，定容至1000mL，用稀盐酸或者氢氧化钠溶液调pH6.8±0.1，115℃灭菌20min。然后使用前加入1g胰酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h，以模拟人体温度。

3、试验方法

取2mL新鲜菌液，5000rpm/min离心5min收集菌体，菌体用生理盐水洗涤3次，再用2mL生理盐水重悬，作为接种液。取1mL接种液，加入到24mL人工肠液中，置于37℃水浴摇床(200rpm/min)3h，取样1mL，检测活菌量。

活菌计数方法按照国标《GB4789.35-2016-食品微生物检验乳酸菌检验》测定菌量。

结果显示，本发明筛选到的乳双歧杆菌VHProbi YB11对人工胃液和人工肠液均有较强的的耐受性。在人工胃液中消化2h后，该菌株的存活率高达100％；在人工肠液中消化3h后，仍能保留较高的活菌量。从而说明，本发明提供的乳双歧杆菌VHProbi YB11菌株能活着到达肠道，并在人体肠道中实现有效定植，发挥益生作用。

实施例4乳双歧杆菌VHProbi YB11的溶血性及抗生素耐受性实验

1、溶血性实验

(1)接种液制备：将冷冻保存的乳双歧杆菌VHProbi YB11菌株划线接种于MRS琼脂培养基中，在温度37℃培养24～48h，再经MRS液体培养基传代培养1次后，以5％的接种量把乳双歧杆菌VHProbi YB11接种到新鲜的MRS液体培养基中37℃培养24～48h，获得新鲜的菌液，作为接种液。

(2)血细胞培养基准备：称取TBS基础培养基的各种组分，溶解，121℃高压灭菌15min，等培养基冷却到50℃的时候加入5％的无菌脱纤维绵羊血，混匀，倒平板。

(3)划线培养：将测试菌株划线接种于准备好的血细胞平板，37℃培养箱培养，24～48h观察测试菌是否有溶血现象。

结果显示：乳双歧杆菌VHProbi YB11不能生长，血细胞平板没有变化，说明乳双歧杆菌VHProbi YB11不产生溶血素，不能够溶解血细胞，生物安全性良好，不会对人体产生危害。

2、抗生素耐受性实验

(1)抗生素配制：氨苄青霉素、克林霉素、红霉素、庆大霉素、链霉素、四环素、万古霉素均配制成2048μg/mL的贮存液，-20℃保存备用。使用时将贮存液用BSM液体培养基进行2倍系列梯度稀释成使用液，梯度稀释浓度为1～1024μg/mL共11个梯度。

(2)接种液制备：取适量新鲜菌液(37℃培养24h)，5000rpm离心5min，用无菌生理盐水洗一次，再用同体积生理盐水重悬菌体后稀释50倍，作为接种液。

(3)微量肉汤稀释法测定抗生素对乳双歧杆菌VHProbi YB11的最小抑菌浓度MIC值

a.96孔板第1列次加入不含抗生素的MRS液体培养基，作为阴性对照，向第2～12列依次加入190μL含不同浓度抗生素的MRS液体培养基，然后分别接种10μL上述接种液，做3个平行孔，并以1个孔不加菌液作为空白。

b.加入50μL石蜡油覆盖防止水分蒸发。

c.将96孔板于37℃培养24h后取出，测定OD₆₀₀值，用24h的结果统计抗生素对菌株的MIC值，具体结果见表5。

表5：乳双歧杆菌VHProbi YB11的抗生素MIC值表(μg/mL)

从表5的结果可以看出，本发明提供的乳双歧杆菌VHProbi YB11对氨苄西林和红霉素等常见抗生素较敏感，生物安全性良好。

实施例5乳双歧杆菌VHProbi YB11的疏水性细胞表面测试

1、待测菌液制备

挑取纯化好的乳双歧杆菌VHProbi YB11菌落接种于新配制的MRS液体培养基中，于37℃培养24～48h。再按1％(V/V)的接种量接至MRS液体培养基中于37℃继续培养24～48h后6000×g离心10min，收集菌体后用无菌生理盐水冲洗2次，再用灭菌0.1M KNO₃ 1mL溶液重悬菌体，作为待测菌液。

2、表面疏水性测定

吸取50μL上述菌悬液加入2450μL的0.1M KNO₃并记录OD₆₀₀为A₀,取1.5mL菌悬液与500μL二甲苯混匀后在室温下静置10min(此时形成两相体系)。将两相体系涡旋振荡2min后再静置20min,重新形成水相和有机相。小心吸取水相(不要吸到有机相)，OD₆₀₀处测量吸光度A₁。

疏水性％＝(A₀-A₁)/A₁×％计算，测三次实验取平均值。

结果显示：本发明提供的乳双歧杆菌VHProbi YB11细胞表面疏水性为97.26％，标准差为11.27％。

实施例6乳双歧杆菌VHProbi YB11抗氧化功能测定

1、菌株清除DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)和羟基自由基(HRS)能力测定

1)PBS菌悬液制备

将生长状态优良的单菌落接种于3mL的MRS液体培养基中，37℃条件下培养24h，以此培养液为接种液，按照2％的接种量接种于50mL的MRS液体培养基中，静置培养24h，获得菌株的培养液。吸取1mL菌液收集菌体后用1mLPBS缓冲液洗涤菌体2遍后再加入2mLPBS溶液重悬菌体备用。

2)菌株清除DPPH自由基能力的测定

取1mL待测菌株的PBS菌悬液，加入1mL 0.4mM的现配的DPPH自由基溶液，混合均匀后然后置于室温温度下遮光反应30min，然后测定样品在波长517nm处的吸光度A_样本，测3次平行。对照组样品以等体积PBS溶液和DPPH·乙醇混合液，并以等体积PBS菌悬液和乙醇混合液空白调零。清除率按下列公式计算：清除率％＝[1-(A_样品-A_空白)/A_对照]×100％。结果见表6。

表6：DPPH自由基清除率表

从表6的数据可以看出，本发明提供的乳双歧杆菌VHProbi YB11能有效清除DPPH自由基，清除率达到25.94％。

3)菌株清除HRS能力的测定

将100μL 5mM的水杨酸钠-乙醇溶液，100μL 5mM的硫酸亚铁，500μL去离子水和200μL乳酸菌PBS菌悬液混匀后加入100μL过氧化氢溶液(3mM)，37℃水浴15min后在510nm波长处测量样品吸光度。羟自由基清除率按照下列公式进行计算。

清除率％＝(A_样品-A_控制)/(A_空白-A_控制)×100％，其中A_控制为去离子水替代样品，A_空白为去离子水替代样品和H₂O₂。结果见表7。

表7：HRS自由基清除率表

从表7的数据可以看出，本发明提供的乳双歧杆菌VHProbi YB11能有效清除HRS自由基，清除率高达66.45％。

2、菌株抗脂质过氧化实验

1)乳酸菌的培养及发酵上清液、菌体的制备：

乳酸菌在MRS液体培养基中37℃培养24h，传3代后，6000rpm/min，4℃离心10min，收集上清液即为发酵上清液。收集的菌体用PBS缓冲液(pH 7.4)于6000r/min离心10min，洗涤3次。将菌体重悬于PBS缓冲液，调整菌体浓度为1.0×10⁹cells/mL，获得菌悬液。

2)亚油酸乳化液的制备：0.1mL亚油酸，0.2mL Tween 20，19.7mL去离子水。

3)0.5mL的PBS溶液(pH 7.4)中加入1mL亚油酸的乳化液，1mLFeSO₄(1％)，再加入0.5mL样品，37℃水浴1.5h，混合液加入0.2mL TCA(4％)，2mL TBA(0.8％)，100℃水浴30min，迅速冷却，4000rpm/min离心15min，收集上清液在532nm下测吸光度即为A；对照组以0.5mL蒸馏水代替样品即为A₀。抑制率/％＝(A₀－A)/A₀×100％

注：A为样品组吸光度；A₀为对照组吸光度，结果见表8。

表8：抗脂质过氧化抑制率表

从表8的数据可以看出，本发明提供的乳双歧杆菌VHProbi YB11的上清液抗脂质过氧化抑制率高达73.12％。

上述结果表明，本发明提供的乳双歧杆菌VHProbi YB11具有很强的抗氧化能力。

实施例7乳双歧杆菌VHProbi YB11黄曲霉毒素B₁吸附能力测定

1、配制浓度为1μg/mL的AFB1-PBS溶液。

2、接种吸附：取1mL新鲜菌液(37℃培养24h)，8000rpm离心5min，弃上清，用同体积PBS缓冲液清洗菌体2次，8000rpm离心5min，弃上清，然后将菌体重悬于1mL上述AFB1-PBS溶液，置于37℃恒温培养箱，1h后取出，8000rpm离心10min，取上清待测。每株菌设置2平行。空白对照为不加菌的AFB1-PBS溶液。按照黄曲霉毒素B₁检测试剂盒说明书测定上清液中黄曲霉毒素B₁浓度。测定前，将上清液用甲醇稀释100倍。

3、结果显示：本发明提供的乳双歧杆菌VHProbi YB11能有效吸附黄曲霉毒素B₁，吸附率为8.29％。

实施例8乳双歧杆菌VHProbi YB11在缓解小鼠便秘中的应用1实验动物处理及模型构建

1.1实验耗材

表9：实验耗材信息表

1.2实验动物处理

选用SPF级BALB/c小鼠，雄性，24只，随机分为4组，每组6只，分别为空白组、建模组、阳性组、益生菌组。其中，空白组小鼠不做任何处理，全程灌胃生理盐水；建模组、阳性组和益生菌组小鼠采用硫糖铝构建便秘模型，建模组和阳性组小鼠在建模后分别灌胃等量的生理盐水和酚酞(治疗便秘药物)，益生菌组小鼠建模前后灌胃益生菌液。各组小鼠自由饮水。具体的处理方法如下：

(1)空白组：适应性结束后每天灌胃1mL生理盐水；

(2)建模组：每次灌胃生理盐水1mL至试验结束；

(3)阳性组：每次灌胃酚酞溶液1mL至第14天，从第15天开始每天灌胃生理盐水1mL至实验结束，酚酞用量依小鼠体重按照70mg/Kg的标准灌胃；

(4)益生菌组：在适应性饲喂结束后开始灌胃益生菌，一直持续至试验结束，每天灌胃1×10⁹CFU/mL菌液1mL。

在第15d，除空白组外，建模组、阳性组、益生菌组分别按照1mL/只灌胃给予浓度为50％的硫糖铝，连续灌胃2天；第2天灌胃后禁食过夜，自由饮水；第3天按照0.5mL/只灌胃给予50％硫糖铝，连续灌胃5天至第21天。

2指标检测

2.1粪便含水量

末次灌胃硫糖铝24h后(第22天)，收集小鼠湿便(晚8:00至早8:00)，称量湿便重量(只/天)，将粪便进行冷冻干燥后记录粪便的干重，计算含水量。

2.2小肠推进率

末次灌胃硫糖铝24h后，给予3％失活炭灌胃，1h后CO₂窒息处死，快速分取小肠并拉成直线，置于无菌垫单上，测量肠管(幽门至回盲部)长度作为小肠总长度，从碳粉前沿至幽门的距离为碳粉在小肠内推进距离，计算碳粉推进率及碳粉推进抑制率。

碳粉推进率(％)＝碳粉在肠内推进距离(cm)/小肠全长(cm)×100％。

2.3血清中神经递质含量

末次灌胃硫糖铝24h后，眼眶取血，离心，取血清，Elisa法检测血清中胃动素(MTL)、胃泌素(GAS)、P物质(SP)、内皮素(SS)、生长抑素-1(ET-1)和血管活性肠肽(VIP)6种神经递质的含量。

2.4组织病理检查

末次灌胃硫糖铝24h后，处死小鼠，取小鼠回肠组织，脱水、包埋、切片，HE染色，观察组织病理改变。

2.5粪便菌群检测

所有组别于第21天取粪便，-80℃冻存，提取DNA以16S rRNA高通量测序分析肠道菌群的结构。

3.数据处理

所有实验数据以均数±标准差表示，用GraphPad Prism 7.0软件进行数据统计和作图，多组数据间比较采用单因素方差分析，两组数据间比较采用t检验，以P<0.05判定为有显著性差异。

4.实验结果

4.1粪便含水量

粪便含水量与粪便的软硬度有关，含水量少则粪便干燥，导致排便困难，因而粪便含水量是便秘治疗的常见指标之一。各组小鼠粪便含水量变化比较如图5、表10所示。

与空白组比较，建模组小鼠的粪便含水量降低，且具有显著性差异(P<0.05)，说明便秘造模成功。

与建模组比较，益生菌组小鼠粪便含水量显著升高，与阳性组相当。从而说明，服用本发明提供的乳双歧杆菌VHProbi YB11可以有效软化小鼠粪便，有利于改善便秘。

表10：各组小鼠粪便含水量比较表(n＝6，

)

4.2小肠推进率

小肠转运时间是衡量整个肠道转运能力的指标之一。申请人采用碳粉推进实验观察小肠推进率。结果如图6、图7所示。

与空白组比较，建模组小肠推进率降低，差异具有显著性(P<0.05)，说明建模成功。与建模组比较，益生菌组的小肠推进率显著升高。从而说明，本发明提供的乳双歧杆菌VHProbi YB11能够显著提高便秘小鼠小肠的转运能力，从而有利于促进排便，改善便秘症状。

4.4血清中MTL、Gas、ET-1、SS、SP、VIP 6种胃肠调节肽的含量变化

便秘相关胃肠调节肽能够对胃肠道运动发挥重要的调节运动，胃动素(MTL)、胃泌素(GAS)和P物质(SP)为兴奋性递质，内皮素(SS)、生长抑素-1(ET-1)和血管活性肠肽(VIP)为抑制性递质。胃动素影响水和电解质的运输，促进胃的收缩和小肠节段性运动，加速肠道传输时间和增加结肠运动。胃泌素刺激胃酸和胃蛋白酶的分泌，促进消化道黏膜上皮的生长，促进胃肠道平滑肌的收缩和幽门括约肌的松弛。P物质主要调节胃肠道的收缩、肠蠕动和胃酸分泌。内皮素-1作为一种多功能肽，在心血管、神经内分泌和胃肠功能等方面给发挥重要作用。生长抑素可以抑制胃肠激素的释放。血管活性肽可以使胃肠道括约肌放松。

本发明采用Elisa法检测小鼠血清中胃动素、胃泌素、生长抑素-1、内皮素、P物质、血管活性肽6种胃肠调节肽的变化。结果如图8所示。

结果显示，与空白组比较，建模组小鼠血清中兴奋性递质胃动素、胃泌素和P物质显著降低(P<0.01)，抑制性递质内皮素、生长抑素-1和血管活性肠肽显著升高(P<0.01)；

而与建模组比较，益生菌组和阳性组的兴奋性递质胃动素、胃泌素和P物质显著升高(P<0.01)，抑制性递质生长抑素-1、血管活性肠肽显著降低(P<0.01)，内皮素有降低，但无显著性差异(P>0.05)。从而说明，本发明提供的乳双歧杆菌VHProbi YB11能通过调节胃肠调节肽的分泌，增加小肠蠕动和胃酸分泌。

4.5组织病理观察

光学显微镜下观察各组小鼠回肠病理切片结果如图9所示。

空白组小鼠肠黏膜基本完好，黏膜上皮完整、连续，腺体排列规则结构清楚，肠绒毛结构完整；模型组小鼠回肠局部充血水肿，黏膜上皮不完整，腺体排列不清楚，黏膜层疏松变薄，可见炎性细胞浸润，此外可见肠绒毛杯状细胞显著减；阳性对照组小鼠可见少量肠绒毛断裂，肠黏膜结构基本完整，腺体排列清晰；益生菌组黏膜上皮可见脱落，腺体排列较清晰，黏膜层充盈较差，腺体内可见少量炎性细胞浸润。

上述结果表明，本发明提供的乳双歧杆菌VHProbi YB11能有效预防及缓解便秘引起的肠壁屏障破坏，减轻炎症反应，使肠黏膜屏障趋于完整。

4.6各组小鼠粪便菌群差异

为了研究乳双歧杆菌VHProbi YB11对便秘小鼠肠道菌群的影响，对收集到的各组小鼠粪便进行菌群结构分析，48个样本共产生了258692条16s rDNA V4区的有效序列数目，平均序列长度为252bp。

4.6.1菌群α多样性分分析

为了研究各组别小鼠粪便菌群多样性，采用chao指数来反应小鼠粪便菌群的丰富度，heip指数来反应各组别粪便菌群的均匀度，采用simpson指数来综合反应各组别小鼠粪便菌群的多样性。结果如图10所示。

(1)与空白组相比，建模组chao指数、heip指数和simpson指数均降低，且有显著性差异，说明建模组小鼠粪便菌群的丰富度和均匀度显著降低。

(2)与建模组相比，阳性组heip指数升高，且有显著性差异(P<0.01)，chao指数和simpson指数有变化，但是没有显著性差异，说明阳性组小鼠粪便菌群的均匀度显著改善，丰富度下降，整体粪便菌群多样性有所改善。

(3)与建模组相比，益生菌组heip指数(P<0.05)和chao指数(P<0.01)均升高，且有显著性差异，说明益生菌组小鼠粪便菌群的丰富度和多样性有显著改善。

4.6.2菌群组成分析

在属水平上，小鼠的粪便菌群主要是由Muribaculaceae属、乳杆菌属、Lachnospiraceae属、拟杆菌属、梭菌属、普雷沃菌属和双歧杆菌属(由下往上属分别对应第1、2、3、4、5、7、8色块)等组成。各组小鼠粪便菌群在属水平上的组成情况如图11所示。

(1)与空白组相比，建模组小鼠粪便菌群中Muribaculaceae属Lachnospiraceae属、拟杆菌属和普雷沃菌属增加，而乳杆菌属和双歧杆菌属显著减少；

(2)与建模组相比，阳性组小鼠粪便菌群中Muribaculaceae属、Lachnospiraceae属和拟杆菌属减少，而梭菌属、普雷沃菌属和乳杆菌属增加；

(3)与建模组相比，益生菌组小鼠粪便菌群中Muribaculaceae属、拟杆菌属和梭菌属减少，Lachnospiraceae属、乳杆菌属和双歧杆菌属增加。

各组小鼠粪便菌群从属水平上看，硫糖铝致便秘后小鼠粪便中的乳杆菌属和双歧杆菌属等有益菌属显著减少；使用酚酞药物治疗的便秘小鼠其粪便菌群组成中双歧杆菌属并未增加，其它菌属的含量有所恢复；而益生菌组小鼠粪便的菌群组成趋近于空白组的正常小鼠，粪便中的有益菌如乳杆菌属和双歧杆菌属含量增加而较常出现的致病菌如梭菌属减少。

4.6.3菌群组成差异性分析

采用β多样性来研究不同组小鼠粪便样本菌群组成的差异性，结果如图12所示。

通过PcoA主坐标分析发现，空白组小鼠和建模组小鼠菌群组成存在差异，空白组集中在左上区域而建模组集中在右下区域。阳性组小鼠和建模组小鼠菌群组成有一定的相似性，而益生菌组小鼠与空白组正常小鼠的菌群组成具有一定的相似性，

上述结果表明，本发明提供的乳双歧杆菌VHProbi YB11能使便秘小鼠粪便菌群的丰富度和均匀度显著提升，使属水平上的优势物种的丰度趋向于空白组小鼠菌群特征，菌群组成的差异性减少，群落结构组成与空白组相似，趋于正常小鼠水平。

综上所述，本发明提供的乳双歧杆菌VHProbi YB11对模拟人工肠胃液具有很强的耐受能力，这对于益生菌株顺利经过胃肠道在结肠处定植下来发挥益生功能奠定了基础。溶血性试验证实乳双歧杆菌VHProbi YB11不产生溶血素，不会溶解血细胞，生物安全性良好。同时，乳双歧杆菌VHProbi YB11能够清除DPPH自由基，抑制脂质过氧化，具有一定的抗氧化功能活性，能够降解胆固醇，具有降低血清胆固醇的益生特性。经动物实验证实，乳双歧杆菌VHProbi YB11能能显著提高小鼠粪便的含水量和小鼠小肠的运转能力，通过调节胃肠调节肽的分泌、增加小肠蠕动能力以及调节肠道菌群等途径预防并缓解小鼠便秘，有望开发成具有预防或缓解便秘功效的食品、保健品或药品。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物股份有限公司

青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一株具有预防和缓解便秘症状的乳双歧杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1473

<212> DNA

<213> 乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)

<400> 1

aacagagtct acttagacgg ctccccccac aagggtcggg ccaccggctt cgggtgctac 60

ccactttcat gacttgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgcattc accgcggcgt 120

tgctgatccg cgattactag cgactccgcc ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc 180

gaactgagac cggttttcag cgatccgccc cacgtcaccg tgtcgcaccg cgttgtaccg 240

gccattgtag catgcgtgaa gccctggacg taaggggcat gatgatctga cgtcatcccc 300

accttcctcc gagttgaccc cggcggtccc acatgagttc ccggcatcac ccgctggcaa 360

catgcggcga gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga 420

cgacgaccat gcaccacctg tgaaccggcc ccgaagggaa accgtgtctc cacggcgatc 480

cggcacatgt caagcccagg taaggttctt cgcgttgcat cgaattaatc cgcatgctcc 540

gccgcttgtg cgggcccccg tcaatttctt tgagttttag ccttgcggcc gtactcccca 600

ggcgggatgc ttaacgcgtt ggctccgaca cgggacccgt ggaaagggcc ccacatccag 660

catccaccgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt 720

cgctcctcag cgtcagtgac ggcccagaga cctgccttcg ccattggtgt tcttcccgat 780

atctacacat tccaccgtta caccgggaat tccagtctcc cctaccgcac tccagcccgc 840

ccgtacccgg cgcagatcca ccgttaggcg atggactttc acaccggacg cgacgaaccg 900

cctacgagcc ctttacgccc aataaatccg gataacgctc gcaccctacg tattaccgcg 960

gctgctggca cgtagttagc cggtgcttat tcgaacaatc cactcaacac ggccgaaacc 1020

gtgccttgcc cttgaacaaa agcggtttac aacccgaagg cctccatccc gcacgcggcg 1080

tcgctgcatc aggcttgcgc ccattgtgca atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt 1140

ctgggccgta tctcagtccc aatgtggccg gtcaccctct caggccggct acccgtcaac 1200

gccttggtgg gccatcaccc cgccaacaag ctgataggac gcgaccccat cccatgccgc 1260

aaaagcattt cccaccccac catgcgatgg agcggagcat ccggtattac cacccgtttc 1320

caggagctat tccggtgcac agggcaggtt ggtcacgcat tactcacccg ttcgccactc 1380

tcaccccgac agcaagctgc cagggatccc gttcgacttg catgtgttaa gcacgccgcc 1440

agcgttcatc ctgagccaat caaaaaactt ata 1473

Claims (10)

1.一种乳双歧杆菌，其特征在于，所述的乳双歧杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2021905。

2.如权利要求1所述的乳双歧杆菌，其特征在于，所述的乳双歧杆菌的Riboprinter指纹图谱如图2所示。

3.如权利要求1所述的乳双歧杆菌，其特征在于，所述的乳双歧杆菌的RAPD指纹图谱如图3所示。

4.如权利要求1所述的乳双歧杆菌，其特征在于，所述的乳双歧杆菌的rep-PCR指纹图谱如图4所示。

5.如权利要求1所述的乳双歧杆菌，其特征在于，所述的乳双歧杆菌的16s rDNA序列为SEQ ID NO:1。

6.权利要求1所述的乳双歧杆菌在制备用于预防和缓解便秘症状的制品中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的制品为食品、保健品或药品。

8.一种预防和缓解便秘症状的制品，其特征在于，所述的制品中包含有权利要求1所述的乳双歧杆菌的活菌。

9.如权利要求8所述的预防和缓解便秘症状的制品，其特征在于，所述的制品中包含有权利要求1所述的乳双歧杆菌的发酵产物。

10.如权利要求8或9所述的制品，其特征在于，所述的制品为食品、保健品或药品。

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