CN116656534B - 一种改善运动能力的长双歧杆菌长亚种及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可改善运动能力的长双歧杆菌长亚种及其应用，所述可改善运动能力的长双歧杆菌长亚种命名为长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longum subsp.longum BL11菌株，保藏编号为CGMCC NO.24412，保藏日期为2022年02月21日。该菌株作为人类和动物胃肠道中的一种天然菌群，可降低运动诱导的胃肠道通透性，重塑肠道微生物群，显著改善肌力和耐力表现，增加肌和肝糖原储存，降低运动后乳酸，抑制炎症细胞因子和减少氧化还原反应降低结肠黏膜的通透性，减少疲劳，增强碳水化合物代谢，提供能量。该菌株可以作为一种营养补充剂被运动员作为营养补充。

Description

一种改善运动能力的长双歧杆菌长亚种及其应用
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种改善运动能力的长双歧杆菌长亚种及其应用。
背景技术
运动能力(E.C)指人参加运动和训练所具备的能力，是人的身体形态、素质、机能、技能和心理能力等因素的综合表现，从生物化学的观点分析，运动能力高低主要取决于运动过程中能量的供给和利用的能力。运动能力不强可以表现为非病理性/生理疲劳，可进一步由中枢和外周机制引起，这两种机制在运动过程、类型、强度和持续时间的生理效应中发挥重要作用。在长时间的耐力运动中，肌肉所需的能力资源不足以维持和产生相同水平的力量，导致疲劳反应，降低运动性能。随着肠道微生物群的越来越受关注，发现运动和肠道微生物群之间可能存在密切关联。肠道微生物群对运动表现、恢复和疾病模式的各种指标都有间接影响，例如通过细胞因子、激素、神经肽和其他代谢物发出信号，通过下丘脑-垂体-肾上腺轴的激活，以及影响与表现相关的代谢途径。
研究表明，运动对肠道微生物有很多好处，它与有益微生物物种数量的增加和微生物多样性的丰富以及锻炼脂肪酸合成和碳水化合物代谢的增强有关。适当的运动频率会导致厚壁菌门的多样性更大，包括产生丁酸等抗炎共生菌，更有助于健康肠道环境。运动与肠道微生物群组成之间的关联似乎是双向的，动物研究越来越证实肠道微生物群在宿主的身体机能中起着重要作用，肠道微生物群的组成及其代谢有助于消化膳食化合物，为运动员在高强度运动和恢复期间提供代谢益处。在观察性研究中发现，运动员微生物组中与氨基酸和碳水化合物代谢相关的代谢活动和途径增加。在肠道中，细菌将不易消化的碳水化合物发酵成短链脂肪酸乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐。特定短链脂肪酸与改善身体技能有关，研究表明，经过长期训练及锻炼，人类粪便短链脂肪酸含量会显著增加。在一项调研40名国际职业橄榄球联盟球员的微生物组的研究中，发现运动员肠道微生物多样性显著增加。作为试验组，与对照组相比，其他参数也显示出了显著的改善，包括短链脂肪酸(SCFA)、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐和戊酸盐的水平也明显升高。目前，短链脂肪酸可改善肠道屏障完整性，降低局部验证和全身炎症风险，临床前研究表明短链脂肪酸可能是身体机能的关键调节剂。肠道微生物群与运动的关系，肠道菌群失调会引起炎症，进而导致负面抑郁情绪等，会导致积极运动锻炼积极性受阻。研究还对中等强度及长期运动的人进行了分析，分别能够促进健康和抗炎细菌增加以及菌群多样性会更高。肠道微生物群可以将膳食纤维发酵成短链脂肪酸(SCFA)，作为肝脏和肌肉细胞的能量来源，并通过稳定的血糖调节来提高耐力性能。除了影响肠道微生物群，运动还会影响胃肠道生理机能，如果持续时间和强度的增加得不到足够的训练、休息和抗氧化状态的支持，就会变得有害。运动后会激活自主神经系统，增加外周组织和胃肠道中皮质醇和儿茶酚胺、肾上腺素和去甲肾上腺素的循环浓度，导致流向胃肠道的血流量减少，导致缺氧、ATP耗竭和氧化应激。而这些作用会破坏肠道屏障，增加肠道通透性、内毒素血症、营养消耗和炎症。导致胃肠道症状的氧化应激增加和肠道屏障功能紊乱也会影响肠道微生物群。
当前，目前现有技术中用于改善运动能力的微生物制剂还十分有限。因此，提供一种改善运动能力的效果好，且在治疗过程中不会导致相关不良反应的微生物制剂，是亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种改善运动能力的长双歧杆菌长亚种及其应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种可改善运动能力的长双歧杆菌长亚种，所述可改善运动能力的长双歧杆菌长亚种命名为长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longumsubsp.longum BL11菌株，保藏编号为CGMCC NO.24412，保藏日期为2022年02月21日。
本发明从粪便样本中分离获得并保藏了一株新的能够改善运动能力的菌株，将其命名为长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longum subsp.longum BL11菌株，该菌株具有较强的自聚能力和胆盐耐受能力，对胃酸的耐受能力也较强。它是一种对人体肠道及其重要的肠道微生物，与肠道健康密切相关，长双歧杆菌长亚种BL11对正常机体生长机能、调节肠道动态平衡、保护肠道上皮屏障和提高免疫力，保持肠道屏障的完整性，减少炎症细胞的生成，同时长双歧杆菌长亚种BL11还可以增强机体免疫力，促进宿主的新陈代谢。显著改善肌力和耐力表现，增加肌和肝糖原储存，降低运动后乳酸。可以将膳食纤维发酵成短链脂肪酸(SCFA)，作为肝脏和肌肉细胞的能量来源，稳定的血糖调节来提高耐力性能。长双歧杆菌长亚种BL11还可以增强碳水化合物代谢，产生丁酸，然后丁酸转化为乙酰辅酶A，产生三磷酸腺苷(ATP)。
经过初步研究已经证实在细胞系、小鼠、大鼠和人类中的免疫调节特性，以消除体内的疾病和促进宿主的健康。能够通过调节中性粒细胞的功能和转移、抑制炎症细胞因子和减少氧化还原反应来降低结肠黏膜的通透性来减少疲劳。在抑制病原体方面，以及宿主对抗菌防御的能力证明了生态位的适应性。可改善运动能力的长双歧杆菌长亚种可降低运动诱导的胃肠道通透性，重塑肠道微生物群。
该菌株具有良好的耐胃肠液能力和肠粘附能力，能顺利通过胃肠道到达小肠发挥益生功效；能够减轻细胞中NO的分泌，以及炎症因子TNF-α、IL 6、IL 10，因此具有较强抗炎活性；具有一定的改善运动的能力。该菌株是一种益生菌，安全性高，性质稳定，且其不会产生抗药性，不会导致患者产生不良反应。
本发明所涉及的长双歧杆菌长亚种菌株的筛选方式如下：
将采集的人粪便样本用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10-6，然后分别取100μL稀释梯度为10-4、10-5、10-6的稀释液于MRS固体培养基上进行平板涂布，37℃培养48h，挑选具有长双歧杆菌形态的单菌落。画线接种于含0.04％溴甲酚紫的改良MRS培养基上进行产酸复筛，37℃厌氧培养48h，长出的单菌落经革兰染色后在显微镜下进行形态学观察，挑取单菌落在37℃下培养48h后，再次挑取MRS固体培养基上不同形态的单菌落进行划线分离，直至得到形态一致的纯的单菌落，取1mL菌液于无菌离心管中，8000r/min离心3min后弃去上层培养基，使用质量浓度为30％的甘油混匀，在-80℃保藏。
第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的可改善运动能力的长双歧杆菌长亚种的培养方法，所述培养方法包括将长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longumsubsp.longum BL11菌株接种于MRS培养基上进行培养，培养的温度为35-45℃，培养时间为16-28h。
所述培养方法包括在无菌条件下准确称取1g固体或用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，而后加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其震荡均匀，制成10-1稀释液，用无菌注射器吸取1mL 10-1稀释液至另一支装有9mL生理盐水的试管中，制成10-2稀释液。按此操作方法依次进行10倍系列稀释至10-7，制成不同浓度的样品稀释液。通常选10-5、10-6、10-7三个稀释度进行滚管培养计数。
所述培养的温度可以选择35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃等，所述培养时间可以选择16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第三方面，本发明提供一种营养补充剂，所述营养补充剂中的菌株包括第一方面所述的长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longum subsp.longum BL11菌株。
本发明所涉及的长双歧杆菌长亚种BL11可以被单独地应用到产品中，也可以与其他菌株联合应用于相关产品中，用于改善代谢能力，提高相应的身体机能。
优选地，所述营养补充剂中长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longumsubsp.longum BL11的活菌数不低于1×109CFU/g，例如1×109CFU/g、2×109CFU/g、3×109CFU/g、4×109CFU/g、5×109CFU/g、6×109CFU/g、7×109CFU/g、8×109CFU/g、9×109CFU/g、1×1010CFU/g等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述营养补充剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
优选地，所述营养补充剂还包括保护剂和/或辅助添加剂。
优选地，所述保护剂包括脱脂乳粉。
优选地，所述营养补充剂中的菌株还包括鼠李糖乳杆菌Lactobacillusrhamnosus LRa05菌株，所述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株的保藏编号为CGMCC NO.1.12734，保藏日期为2020年07月20日。
本发明创造性地发现上述长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longumsubsp.longum BL11菌株能够与鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株进行复配使用，在提高运动能力方面的效果显著优异于单一菌剂或者其他复配方式，说明长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longum subsp.longum BL11菌株与鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株在提高运动能力方面具有协同增效作用。
优选地，所述长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longum subsp.longum BL11菌株与鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株的活菌数比为(4-8):1，其中(4-8)中具体点值均可选择4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longum subsp.longum BL11菌株与鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株以上述特定的活菌数比例复配时，其在提高运动能力方面的效果最佳。
第四方面，本发明提供一种根据第一方面所述的可改善运动能力的长双歧杆菌长亚种菌株和/或第三方面所述的营养补充剂在制备提高运动表现和/或减少运动后疲劳的产品中的应用。
本发明还创造性地发现上述长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longumsubsp.longum BL11菌株在帮助提高运动表现和能力方面的应用，可以增加肌肉力量、耐力表现和肝脏和肌肉细胞中的糖原储存。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明从人粪便样本中分离获得并保藏了一株新的改善运动能力的菌株，将其命名为长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longum subsp.longum BL11菌株，该菌株具有良好的耐胃肠液能力和肠粘附能力，能顺利通过胃肠道到达小肠发挥益生功效；能够减轻细胞中NO的分泌，以及炎症因子TNF-α、IL 6、IL 10，因此具有较强抗炎活性；具有一定的改善运动的能力。该菌株是一种益生菌，安全性高，性质稳定，且其不会产生抗药性，不会导致患者产生不良反应。
本发明还创造性地发现上述长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longumsubsp.longum BL11菌株在帮助提高运动表现和能力方面的应用，所述产品中，长双歧杆菌长亚种还被发现可以增加肌肉力量、耐力表现和肝脏和肌肉细胞中的糖原储存。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
下述涉及的长双歧杆菌长亚种为长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longumsubsp.longum BL11菌株，保藏编号为CGMCC NO.24412，保藏日期为2022年02月21日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述涉及的鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株，保藏编号为CGMCC NO.1.12734，保藏日期为2020年07月20日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述涉及的改良MRS液体培养基包括蛋白胨10g/L、牛肉浸粉10g/L、葡萄糖20g/L、醋酸钠5g/L、乙酸钠2g/L、酵母浸蛋白粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、吐温1mL/L，pH调节为6-7，固体培养基每升另加入20g琼脂。
其中，蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉提供氮源；柠檬酸氢二胺、吐温80等提供生长因子，其成分还能抑制某些杂菌。
实施例1
本实施例筛选一株改善运动能力的长双歧杆菌长亚种，步骤如下：
(1)将采集的人粪便样本用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10-6，然后分别取100μL稀释梯度为10-4、10-5、10-6的稀释液于MRS固体培养基上进行平板涂布，37℃培养48h，挑选具有长双歧杆菌形态的单菌落。画线接种于含0.04％甲酚紫的改良MRS培养基上进行产酸复筛，37℃厌氧培养48h，长出的单菌落经革兰染色后在显微镜下进行形态学观察，挑取单菌落在37℃下培养48h后，再次挑取MRS固体培养基上不同形态的单菌落进行划线分离，直至得到形态一致的纯的单菌落，取1mL菌液于无菌离心管中，8000r/min离心3min后弃去上层培养基，使用质量浓度为30％的甘油混匀，在-80℃保藏。
(2)针对保藏的单菌进行体外生理特性测试，具体为如下：
耐酸耐胆盐的测定：
配置人工模拟胃液：称取稀盐酸16.4mL(相当于盐酸3.84mL)，加水800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释至1000mL，即得。
配置人工模拟肠液：取KH2PO4 6.8g加水500mL溶解，用0.4％(w/w)的NaOH回调pH至6.8。每100mL液体中加入1g胰蛋白酶，混匀，用0.2μm的无菌滤头滤过待用。
菌种活化：将菌株以2％(v/v)的接种量接种至MRS液体培养基中复壮，于37℃厌氧培养24h。培养的菌液放入冰块中冷却备用。
分别取10μL冷却后的菌液加至1mL的模拟胃液和模拟肠液中，震荡均匀。菌液进入模拟胃液后，于37℃中培养0h、3.5h时进行活菌计数，进入模拟肠液后，于37℃中培养0h、4h时进行活菌计数。以长双歧杆菌的存活率来评价其耐酸耐胆盐能力，其中存活率R的计算公式为：
R(％)＝Nf/N0×100％
公式中：R，存活率(％)；N0，起始活菌数(CFU/mL)；Nf，最终活菌数(CFU/mL)。
粘附能力测定：
取出双歧杆菌细胞玻片，经pH为7.4的PBS清洗一次后，加入37.03％的链霉素、10.87％的氨苄西林和48.63％的庆大霉素处理的细菌悬液。37℃湿盒温育2小时后，经pH为7.4的PBS漂洗6次，自然干燥，甲醇固定，革兰氏染色，分别加入六孔细胞培养板中，并在DMEM细胞培养液中加入1％的D-甘露醇以阻止I型纤毛介导的粘附，后置于37℃，10％ CO2、90％空气的二氧化碳培养箱中孵育3h，将细胞用灭菌的PBS漂洗细胞3次，后用无水甲醇2mL固定2h后，在显微镜随机20个视野下，对双歧杆菌细胞中黏附的细菌计数。
抑制病原菌实验：
方法如下：将保藏的菌株以2％接种量接入改良MRS液体培养基中，将灭菌固体培养基加热至融化，待冷却至50℃时，每20mL培养基倒入无菌培养皿中。待平板自然晾干后，分别取0.1mL待测长双歧杆菌，0.1mL供试菌悬液，均匀涂布于平板上(涂布30min后再倒置)，每个处理3次重复。另设对照组，取0.1mL无菌水和0.1mL供试菌悬液均匀涂布于平板上，上述操作在超净工作台内进行。将做好的细菌平板在37℃恒温培养24h，统计菌落个数，按照下式计算抑菌率。若有抑菌圈出现，说明该菌株具有抑菌活性，每株菌做3个平行，取平均值。
抑菌率＝(对照菌落数-处理菌落数)/对照菌落数×100％
综合上述筛选实验，筛选出一株耐胃肠液能力、粘附能力、抑菌能力最好的单菌株，将其命名为长双歧杆菌长亚种BL11。其性能测试结果为：人工模拟胃液(3.5h)中的存活率为93.5％，在人工模拟肠液(4h)中的存活率为91.5％，黏附指数为58.89，抑菌率为96.03％。上述结果说明长双歧杆菌长亚种BL11具有更强的肠道环境的生存能力以及黏附在肠道细胞上的能力，可以将失调的肠道菌群的多样性和丰富度维持在正常水平，甚至优于正常水平，还可以有效平衡失调的肠道菌群的肠道菌群结构。
实施例2
本实施例对实施例1筛选得到的菌株进行形态鉴定以及16SrRNA分子生物学鉴定，步骤如下：
(1)形态鉴定
取玻片在火焰上稍微加温，用清洁纱布擦净，用无菌接种环取生理盐水一滴，置于载玻片的中央，再用接种环进行灭菌，冷却后取细菌少量与盐水混匀，直接1环菌液作涂片，然后进行干燥，手持玻片一端，标本面朝上，在火焰外层快速地来回通过三次，之后进行初染，滴加结晶紫溶液盖满涂抹面，染色3分钟，加卢戈式染液5滴作用30秒，在95％酒精中脱色，拿出玻片使酒精由玻片流下，反复3次，直至流下酒精略呈淡紫色为宜，并用流水清洗，将玻片轻轻洒净，复染时，用稀释石炭酸-复红复染半分钟后按上去清洗，在光学显微镜下观察细菌染色情况。
染色观察结果：革兰氏染色镜检结果显示长双歧杆菌长亚种BL11菌株为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在BBL平板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在BBL液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
(2)16SrRNA分子生物学鉴定
将实施例1筛选得到的菌株，置于装有100μL PrepMan Ultra的离心管中，混悬液震荡混匀30s左右，然后100℃水浴10min后，以12000rpm离心3min，取10μL上清液与490μLddH2O(即稀释50倍)，混匀作为下步PCR的模板DNA，提取的DNA于-20℃保存。
扩增体系为25μL：Template 2.5μL、dNTP 1μL、Taq酶0.2μL、引物27F0.5μL、引物1492R 0.5μL、ddH2O 20μL。
扩增程序设置为：94℃预变性4min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环30次，终末72℃延伸10min。称取1g琼脂糖置于100mL TAE电泳缓冲液中，加热融化，将温度降至60℃左右时，均匀铺板，制成1％的琼脂糖凝胶，PCR反应结束后，加样，以100V电压进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，染色，用凝胶成像仪观察，拍照，记录实验结果。每5μL PCR产物加入2μL ExoSAP-IT试剂，混匀，37℃温育15min，80℃温育15min。纯化后的PCR产物作为下一步测序反应的模板，上样量2μL，150V，20min，然后进行凝胶成像，将16S rRNA的PCR产物进行测序分析，序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为长双歧杆菌长亚种。
该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示
SEQ ID No:1：
GTGGACTCGAGCTCACCTTAGACGGCTCCATCCCACAAGGGGTTAGGCCACCGGCTTCGGGTGCTGCCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGACGTTGCTGATTCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGGGATCCGCTCCGCGTCGCCGCGTCGCATCCCGTTGTACCGGCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACG
TCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTAACCCCGGCGGTCCCCCGTGAGTTCCCG
GCATAATCCGCTGGCAACACGGGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTT
AACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGA
ACCCGCCCCGAAGGGAAGCCGTATCTCTACGACCGTCGGGAACATGTCAA
GCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCG
CTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACT
CCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTAGCTCCGACACGGAACCCGTGGAAC
GGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCT
AATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTAACGGCCCAG
AGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTT
ACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCAAGCCCGCCCGTACCCG
GCGCGGATCCACCGTTAAGCGATGGACTTTCACACCGGGACGCGACGAAA
CCGCCTCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCATAACGCTTGCACCCTACGTA
TTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCAACGGGTAAAC
TCACTCTCGCTTGCTCCCCGATAAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCTCC
ATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATGTGCAATATTCC
CCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGC
CGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGAAGCCACGGTGGGCCGTTAC
CCCGCCGTCAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATACCGCGAAAGCTT
TCCCAGAAGACCATGCGATCAACTGGAGCATCCGGCATTACCACCCGTTTC
CAGGAGCTATTCCGGTGTATGGGGCAGGTCGGTCACGCATTACTCACCCGT
TCGCCACTCTCACCACCAAGCAAGCTTGATGGATCCCGTTCGACTTGCATG
TGTAAGCACGCTAATGCGC。
实施例3
本实施例验证长双歧杆菌长亚种BL11对改善运动能力的影响：
将长双歧杆菌长亚种BL11菌株和鼠李糖乳杆菌LRa05菌株分别按照2％的接种量接种至MRS培养基中，40℃恒温厌氧培养16h，得到一级种子液；用上述同样的方法制得二级种子液。将种子液按2％(v/v)的接种量分别接种至2L密闭发酵瓶，40℃恒温厌氧培养24h，发酵结束后4000r/min离心获得菌泥，菌泥用PBS缓冲液洗涤两次，得到的菌泥悬浮在20％的蔗糖溶液中，1mL菌悬液分装在3mL的甘油管中，-80℃保存，为后续大鼠实验使用。
(1)动物分组及建模：
选用无病原体的雄性6周龄ICR小鼠，小鼠在室温下(23±2℃)和55％湿度下保持12小时的光/暗循环，并提供反渗透(R.0)水和标准饲料，小鼠模型的建立：根据现有技术常用方法(参考文献：Miguel,Z.D.,Khoury,N.,Betley,M.J.,Lehallier,B.,Willoughby,D.,Olsson,N.,et al.(2021).Exercise plasma boosts memory and dampens braininflammation via clusterin.Nature,600(7889),494-499.DOI:10.1038/s41586-021-04183-x)，向久坐的幼龄小鼠体内注射簇集素CLU(一种抑制神经炎症的特定基因)。除对照组和模型组外，每日腹腔注射给药一次，连续10天，根据人体表面积从人体等效剂量(HED)转换而成，每日剂量为1×109CFU。将48只大鼠随机分为6组，每组8只：对照组(CTL)、模型组(MC)、经长双歧杆菌长亚种BL11用药组(BL11)、经鼠李糖乳杆菌LRa05用药组(LRa05)、经长双歧杆菌长亚种BL11和鼠李糖乳杆菌LRa05联合用药组(BL11+LRa05，活菌数比例6:1)、经长双歧杆菌长亚种ATCC15707和鼠李糖乳杆菌LRa05联合用药组(ATCC15707+LRa05，活菌数比例6:1)。
(2)游泳运动耐力测试
小鼠落水后，由本能趋势，游泳挣扎使鼻孔漏出水面呼吸，直至体力不支而下沉溺死，估算自落水开始鼻孔沉入水面的时间为小鼠游泳时间，作为判断小鼠体力活动程度的可观指标。将小鼠放入水槽时进行游泳试验，水深25cm，水温28-30℃。每鼠尾负重为体重7％，记录小鼠游泳持续时间，结果如下表1所示。
表1
组别 小鼠游泳持续时间(min)
对照组 60.5±15.9
模型组 46.1±28.7
BL11 72.5±26.4
LRa05 70.2±21.9
BL11+LRa05 187.3±18.7
ATCC15707+LRa05 153.8±13.2
由表1数据可知，对比对照组，模型组小鼠游泳能力下降，游泳持续时间缩短，在长双歧杆菌长亚种BL11菌株和鼠李糖乳杆菌LRa05菌株的干预下，小鼠能够抗疲劳，提高运动能力，且长双歧杆菌长亚种BL11菌株和鼠李糖乳杆菌LRa05菌株在上述效果上有一定的协同效果，且该复配方式优于其他复配方式。
实施例4
小鼠前肢握力测试
动物分组及建模同实施例3。使用张力杆(直径2毫米，长度7.5厘米)和力传感器，用于测试小鼠的握力。测试过程中分为两个阶段，练习阶段过程为将小鼠放于抓力板上，匀速水平向后拉动小鼠尾部，根据力度记录抓力值，一天测试2次，测试时长为3天。测试阶段为：在练习阶段基础上，对每只小鼠依次进行测试，连续测试6次，间隔时长大约为20秒，记录相应每次抓力，取中间3次记录平均值，为每只小鼠的抓力值，结果如下表2所示：
表2
组别 抓力值(N)
对照组 1.07
模型组 0.65
BL11 0.76
LRa05 0.69
BL11+LRa05 1.37
ATCC15707+LRa05 1.25
由表2数据可知，对比对照组，模型组小鼠握力下降，在长双歧杆菌长亚种BL11菌株和鼠李糖乳杆菌LRa05菌株的干预下，小鼠的握力提高，且长双歧杆菌长亚种BL11菌株和鼠李糖乳杆菌LRa05菌株在上述效果上有一定的协同效果，且该复配方式优于其他复配方式。
实施例5
疲劳相关生化变量的测定
动物分组：选用无病原体的雄性6周龄ICR小鼠，小鼠在室温下(23±2℃)和55％湿度下保持12小时的光/暗循环，并提供反渗透(R.0)水和标准饲料，除正常对照组和游泳对照组外，每日腹腔注射给药一次，连续7天。将32只大鼠随机分为4组，每组8只：正常对照组、游泳对照组、低剂量长双歧杆菌长亚种BL11用药组(每日剂量为1×109CFU)、高剂量长双歧杆菌长亚种BL11用药组(每日剂量为1×1010CFU)。
除正常对照组外，其余组小鼠在介入游泳10min，休息20min后采血。样品在4℃，1500xg离心15min，收集血清进行分析，评估补充长双歧杆菌长亚种BL11菌株对疲劳相关生化指标的影响以准确的显示和评估生理状态。采用自动分析仪(7060型，日立，东京，日本)测定血乳酸和血糖，血尿氮(BUN)在90min的延长运动和60min的休息后立即进行评估，小鼠尿素氮正常值为10-50mg/L。
测定标本中小鼠尿素氮(BUN)水平，首先使用纯化的小鼠尿素氮(BUN)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入血清，再与HRP标记的尿素氮(BUN)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成黄色。颜色的深浅和样品中的尿素氮(BUN)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中小鼠尿素氮(BUN)浓度。
结果如表3所示。
表3
组别 血糖(mg/dL) 血乳酸(mmol/L) 血尿素氮(mg/dL)
正常对照组 111.74±8.57 3.93±0.57 32.23±4.20
游泳对照组 84.4±13.29 5.74±0.91 46.34±5.12
BL11低剂量组 93.08±10.23 5.94±0.63 32.13±6.39
BL11高剂量组 100.36±12.15 6.46±1.04 35.12±6.81
与正常对照组比较，游泳对照组血糖含量显著降低，血乳酸、尿素氮水平升高，说明游泳动物体内糖、蛋白质分解代谢加速，能量消耗增加；与游泳对照组小鼠比较，采用长双歧杆菌长亚种BL11菌株干预的小鼠血糖有所回升，尿素氮水平有所下降，说明BL11能有效提高游泳动物血糖水平。
实施例6
游泳代谢试验
小鼠游泳前后体重变化测试
本试验反应抗疲劳及改善运动能力的生化机制，动物分组：选用无病原体的雄性6周龄ICR小鼠，小鼠在室温下(23±2℃)和55％湿度下保持12小时的光/暗循环，并提供反渗透(R.0)水和标准饲料，除正常对照组和游泳对照组外，每日腹腔注射给药一次，连续7天。将32只大鼠随机分为4组：正常对照组、游泳对照组、低剂量长双歧杆菌长亚种BL11用药组(每日剂量为1×109CFU)、高剂量长双歧杆菌长亚种BL11用药组(每日剂量为1×1010CFU)。
正式游泳前动物游泳训练2次，正式游泳时，除正常对照组不游泳，其余动物游泳时长均为90min，小鼠游泳前后体重的变化如表4所示。
表4
组别 试验前 试验后
正常对照组 24.8±1.2 35.7±2.8
游泳对照组 24.3±3.6 36.2±2.0
BL11低剂量组 25.6±1.0 35.5±2.4
BL11高剂量组 25.2±1.1 36.1±2.3
由表4数据可知，各组动物试验开始及结束时体重均没有显著差异。
小鼠游泳衰竭时间测试
动物分组：选用无病原体的雄性6周龄ICR小鼠，小鼠在室温下(23±2℃)和55％湿度下保持12小时的光/暗循环，并提供反渗透(R.0)水和标准饲料，除游泳对照组外，每日腹腔注射给药一次，连续7天。将24只大鼠随机分为3组，每组8只：游泳对照组、低剂量长双歧杆菌长亚种BL11用药组(每日剂量为1×109CFU)、高剂量长双歧杆菌长亚种BL11用药组(每日剂量为1×1010CFU)。
游泳衰竭时间测试方法：灌服7天后(小鼠体重增至30-32g，且三组间无差别)，三组动物同池游泳，水温22℃，水深约为小鼠体长2倍，室温18℃，小鼠游泳至力竭。
小鼠游泳至衰竭的标准为：小鼠不能在水中保持上浮，开始下沉，取出后尾部受刺激逃避呈踉跄步态，身体不能保持平衡，但呼吸心跳存在。
表5
组别 游泳衰竭时间(min)
游泳对照组 25.6±56.2
BL11低剂量组 30.3±12.3
BL11高剂量组 69.2±33.9
长双歧杆菌长亚种BL11菌株干预后，小鼠游泳衰竭时长显著长于对照组，说明长双歧杆菌长亚种BL11菌株具有抗疲劳作用，对于改善运动能力有一定的作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种改善运动能力的长双歧杆菌长亚种及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (7)

1.一种营养补充剂，其特征在于，所述营养补充剂中的菌株由可改善运动能力的长双歧杆菌长亚种（Bifidobacterium longum subsp. longum）BL11菌株和鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）LRa05菌株组成；
所述长双歧杆菌长亚种（Bifidobacterium longum subsp. longum）BL11菌株，保藏编号为CGMCC NO.24412，保藏日期为2022年02月21日；
所述鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）LRa05菌株的保藏编号为CGMCCNO.1.12734，保藏日期为2020年07月20日。
2.根据权利要求1所述的营养补充剂，其特征在于，所述营养补充剂中长双歧杆菌长亚种（Bifidobacterium longum subsp.longum）BL11的活菌数不低于1×109CFU/g。
3.根据权利要求1所述的营养补充剂，其特征在于，所述营养补充剂的剂型为冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
4.根据权利要求1所述的营养补充剂，其特征在于，所述营养补充剂还包括保护剂和/或辅助添加剂。
5.根据权利要求4所述的营养补充剂，其特征在于，所述保护剂为脱脂乳粉。
6.根据权利要求1所述的营养补充剂，其特征在于，所述长双歧杆菌长亚种（Bifidobacterium longum subsp. longum）BL11菌株与鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）LRa05菌株的活菌数比为(4-8):1。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的营养补充剂在制备提高运动表现和/或减少运动后疲劳的产品中的应用。
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