MX2007001863A - Lactobacillus rhamnosus con actividad reductora de la grasa corporal y alimentos que los contienen. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con una cepa de Lactobacillus que tiene actividad reductora de la grasa corporal y proporciona Lactobacillus rhamnosus Cepa PL60 KCCM-10654P. La cepa de la invencion se puede usar directamente como alimento funcional que reduce la grasa corporal o se puede usar como aditivo de alimentos funcionales que reducen la grasa corporal o una cepa iniciadora del fermento de los alimentos funcionales fermentados que reducen la grasa corporal. Los materiales inhibidores de la grasa corporal que la cepa de la presente invencion producen se pueden aislar para utilizarse. Por otra parte, cuando los alimentos fermentados se producen con la cepa de la invencion proporcionan condiciones capaces de producir un maximo efecto reductor de la grasa corporal.

Description

LACTOBACILLUS RHAMNOSUS CON ACTIVIDAD REDUCTORA DE LA GRASA CORPORAL Y ALIMENTOS QUE LOS CONTIENEN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con los Lactobacill us rhamnosus con actividad reductora de la grasa corporal y con los alimentos que los cont-ienen. La presente invención aporta cepas de Lactobacill us con actividad reductora de la grasa corporal. La presente invención también aporta organismos vivos, organismos muertos, fracciones de pared celular fragmentada, una solución de cultivo, una solución de cultivo seco, un extracto del cultivo que contiene CLA (ácido linoleico conjugado) con efecto reductor de la grasa corporal, que se deriva de las cepas de Lactobacill us de la presente invención, aporta también alimentos funcionales que reducen la grasa corporal y aditivos alimenticios que las contienen. Por otra parte, la presente invención aporta alimentos y bebidas funcionales que reducen la grasa corporal utilizando una cepa de Lactoba cill us con efecto reductor de la grasa corporal como cepa o aditivo iniciador. También, la presente invención aporta un medicamento con efecto reductor de la grasa corporal que contiene las cepas de Lactobacill us de la presente invención. Por otra parte, la presente invención proporciona condiciones con la capacidad de aumentar al máximo el efecto reductor de la grasa corporal cuando se producen alimentos fermentados utilizando las cepas de la presente invención .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En las sociedades modernas, la obesidad es una enfermedad con menor proporción de cura total que el cáncer, que provoca un aumento en la tasa de mortalidad y también varias enfermedades en adultos. Ha ocasionado problemas suficientemente graves como para hacer pública una "guerra contra la obesidad" en los Estados Unidos. Se han evaluado muchos productos con el fin de encontrar un producto eficaz en la prevención y tratamiento de la obesidad, pero hasta ahora sólo el ácido pirúvico y el ácido linoleico conjugado (CLA) han mostrado eficacia sustentada en una base científica (Lenz TL, Hamilton WR. Supplemen tal products used for weight loss (Suplementos utilizados para perder peso). 2004. J Am Pharm Assoc(Wash DC) 44:59-67) . Se supone que un mecanismo reductor de la grasa corporal genera reducción del número de células adiposas, reducción del tamaño de la célula adiposa, reducción de la ingestión de energía y de alimento, reducción de la producción de grasa, aumento del consumo de energía, actividad lipolítica, aumento de la oxidación de lípidos o lo similar, al inducir apoptosis de las células adiposas (Chardigny JM, Hasselwander 0, Genty M, Kraemer K, Ptock A, Sebedio JL. 2003, Effect of conj uga ted FA on feed in take , body composi tion , and liver FA in mice (Efecto del FA conjugado en la ingesta de alimentos, composición corporal y FA hepático en ratones). Lipids . 38 ( 9) : 895-902 ) . El CLA (ácido c9tll-octadecadienoico, ácido tl0cl2-octadecadienoico) se forma a través de la isomerización del ácido linoleico (LA, C18:2 cis9cisl2). Es sabido que, según la ubicación de sus dobles enlaces, el CLA tiene efectos antioxidante, reductor del colesterol, promotor del crecimiento y anticáncer. Recientemente se ha descubierto que el CLA tiene un efecto reductor de la grasa corporal, de los lípidos plasmáticos corporales o lo similar. Se ha reportado que el CLA se puede encontrar en carne de origen animal, leche fermentada o lo similar. Experimentos en animales y pruebas clínicas ya han demostrado que en especial los isómeros c9, tll-CLA del CLA tienen un efecto reductor de la grasa corporal. Lo ideal y más preferible es que el c9tll-CLA y el tl0cl2-CLA se produzcan en la misma cantidad. El Butyrivibrio fibriosolvents es el primer microorganismo anaeróbico descubierto que produce CLA, se aisla a partir de rumiantes como el ganado vacuno. Este microorganismo produce en 2 etapas ácido trans-11- octadecenoico durante la biohidrogenación del LA. cis-9, trans-11-octadecadienoico se produce por l de isomerasas que actúan sobre el ácido linoleico, la hidrogenación del ácido conjugado generado para 5 el ácido trans-11-octadecenoico . Según un estudio reciente en Noruega publ 2004 (Gaullier JM, Halse J, Hoye K, Kristiansen K, H, Vik H, Gudmundsen O. 2004. Conj uga ted ácido l supplementa tion for 1 y reduces body fa t mass in overweight humans (La suplementación de ácido l conjugado durante 1 año reduce la masa de la grasa en sujetos sanos). Am J Clin Nutr . 79 ( 6) : 1118-1125) produjo una pérdida de peso de 4-10% sin provocar secundarios al administrarlo durante un año a 180 con sobrepeso. La presente invención seleccionó e identi cepa de La ctobacill us tipo Corea con efecto reduct grasa corporal que produce tl0cl2-CLA en exc confirmaron en la cepa características de un pro por ejemplo, la adaptación intestinal o lo simil descubrieron condiciones en las que la cepa podr una producción máxima de CLA y cepas de Lactobaci efecto reductor de la grasa corporal confirmado pérdida de peso en experimentos con animales.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN [Problema técnico] Por lo tanto, la presente invención se concibió considerando los problemas anteriores y es un objetivo de la presente invención proporcionar una cepa que produce CLA. La cepa de la presente invención es Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 depositada como KCCM-10654P en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos ( Korean Cul ture Center of Microorganisms) el 9 de mayo de 2005. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar cepas de Lactobacill us con capacidad para reducir la grasa corporal. Otro objetivo más de la presente invención es prevenir o tratar varias enfermedades en adultos mediante la reducción de la grasa corporal. También es otro objetivo de la presente invención proporcionar condiciones que permitan la producción máxima de CLA con efecto reductor de la grasa corporal. Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar una cepa que tenga un efecto reductor de la grasa corporal, buena adhesión a los intestinos y buena tolerancia al ácido y a la bilis. También es otro objetivo de la presente invención proporcionar como probiótico, cepas de Lactobacill us que no transfieran resistencia a los antibióticos y sean inocuas. Las cepas de Lactobacill us se pueden preparar en varias composiciones, de preferencia, estas composiciones son formas farmacéuticas como cápsulas, tabletas, polvos, etc. y formas convenientes que puedan adicionarse a diversos alimentos. Estas formulaciones se pueden preparar utilizando vehículos, excipientes, solventes o suplementos farmacéuticamente aceptables, conforme a los métodos conocidos. Estos métodos e ingredientes son muy conocidos y se describen con detalle en textos y manuales de uso común en este campo técnico, por ejemplo, (Remington. 1995. The Science and Practice of Pharmacy. Mack Publishing Co . Easton, PA 18042, USA) , la cual se considera forma parte de la presente, como referencia. Se pueden preparar alimentos digestivos que contengan cepas de Lactobacill us utilizando métodos muy conocidos en la técnica. Se pueden preparar alimentos y bebidas con efecto reductor de la grasa corporal con un método muy conocido en la técnica en el que se utiliza la cepa como cepa iniciadora o aditivo de alimentos fermentados que contienen productos lácteos fermentados . Se pueden producir alimentos fermentados con máximo efecto reductor de la grasa corporal utilizando las condiciones que aquí se sugieren. En lo sucesivo, la presente invención se explicará con más detalle.

[Solución técnica] Según un aspecto de la presente invención, éstos y otros objetivos se pueden lograr a través de alimentos funcionales que reducen la grasa corporal. Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una cepa de Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 KCCM-10654P con capacidad para reducir la grasa corporal. Según otro aspecto de la presente invención, se proporcionan alimentos funcionales que reducen la grasa corporal que contienen Lactoba cill us rhamnosus Cepa PL60 KCCM-10654P en una cantidad de 1 106 a l*10 UFC/g, destinados a prevenir y tratar enfermedades en adultos aprovechando el efecto reductor de la grasa corporal. Según otro aspecto de la presente invención, se proporcionan aditivos para alimentos y bebidas que contienen Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 KCCM-10654P. Según otro aspecto de la presente invención, se proporcionan condiciones que permiten obtener un máximo efecto reductor de la grasa corporal en alimentos fermentados utilizando La ctobacill us rhamnosus Cepa PL60 KCCM-10654P.

En adelante, la presente invención se describirá con más detalle al hacer referencia a ejemplos de las modalidades preferidas de la presente invención, los cuales, sin embargo, de ninguna manera deberán considerarse como limitativos de la presente invención.

[Efectos ventajosos] El Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 de la presente invención tiene un efecto reductor de la grasa corporal con capacidad de prevenir o tratar enfermedades que resultan de la obesidad. Por otra parte, el La ctobacill us rhamnosus Cepa PL60 seco y los filtrados de cultivo de Lactoba cill us rhamnosus Cepa PL60 y filtrados de cultivo secos de la presente invención se pueden usar como aditivos de diversos alimentos y bebidas que son útiles para prevenir y tratar la grasa corporal, por lo tanto, se pueden usar para prevenir y tratar todas las enfermedades relacionadas con la obesidad. También, los alimentos fermentados que utilizan el Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 de la presente invención pueden prevenir y tratar la obesidad por un efecto reductor de la grasa corporal. Por otra parte, según la presente invención el Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 tiene que cultivarse primero en un medio que contenga LA con el fin de que haya una producción máxima de CLA. El contenido de LA es de 100 a 1000 ppm, el contenido de T een-80 es de 1 a 0.1% y el carbohidrato es de preferencia fructosa, sacarosa o lactosa y con la máxima preferencia fructosa, para que los alimentos fermentados que utilizan el Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 tengan un máximo efecto reductor de la grasa corporal.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Estos y otros objetivos, particularidades y otras ventajas de la presente invención se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se considere junto con los dibujos que la acompañan, en los que : La Figura 1 es un cromatograma de gases en el que se identifica el CLA generado por el Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60. La Figura 2 es una micrografía de Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60. La Figura 3 muestra la secuencia 16S rARN del Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60. La Figura 4 es un patrón de bandas que identifica el Lactoba cillus rhamnosus Cepa PL60 mediante PCR múltiple (reacción en cadena de polimerasa múltiple) (Mul típlex PCR) . La Figura 5 muestra los resultados experimentales para una adaptación del Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 a células Caco-2. Las Figuras 6a y 6b muestran los resultados experimentales para una adhesión del Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 a los intestinos humanos. La Figura 7 es un patrón de bandas que ilustra los resultados de PCR (reacción en cadena de polimerasa) de una colonia aislada después de la administración oral de Lactobacillus rhamnosus Cepa PL60 en humanos. La Figura 8 muestra los cambios del peso corporal de ratas que consumieron Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60. La Figura 9 es una gráfica que compara el peso corporal de las ratas de cada grupo después de administrarles Lactoba cill us rhamnosus Cepa PL60, en la 10a semana.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN [Modalidad preferida] Ejemplo 1: Tamizaje de cepas de La ctobacill us con capacidad para producir ácido linoleico conjugado (en lo sucesivo, denominado CLA) Con el fin de seleccionar cepas productoras de CLA, se tamizaron las cepas de Lactoba cill us desarrolladas en un medio que contenía LA, un sustrato de CLA. Luego, se confirmó si expresaban o no una enzima isomerasa, enzima implicada en la producción de CLA. <Materiales y método > Primero, se seleccionaran cepas de La ctobacill us cultivadas en un medio que contenía ácido linoleico (LA) , de las cuales se tamizaron las cepas de La ctobacill us productoras de CLA. Las cepas productoras de CLA se pueden tamizar con facilidad a partir de una gran cantidad de cepas de Lactobacill us utilizando una prueba de isomerasa (Ogawa J, Matsumura K, Kishino S, Omura Y, y Shimizu S. 2001. Conj uga ted ácido linoleico accumula tion via 10-Hydroxy-12-octadecaenoic acid during microaerobic transforma tion of ácido linoleico by Lactobacillus acidophilus (Acumulación de ácido linoleico conjugado via ácido 10-hidroxi-12-octadecaenoico durante la transformación microaeróbica de ácido linoleico por Lactobacillus acidophilus) . Appl . Envir. Microbiol . 67:1246-1252). Primero, se seleccionaron las cepas de Lactoba cillus que crecieron en un medio MRS (DeMan-Rogosa-Sharpe) que contenia LA 0.1%. Luego, estas cepas de Lactoba cillus se subcultivaron dos veces en un medio MRS y se cultivaron en un medio MRS que contenia 10 mL de LA 0.1%, durante 2 dias. 5 mL del medio se centrifugaron a 8000 rpm durante 10 minutos para recolectar las células, antes de lavarlas con una solución amortiguadora de fosfato de potasio 0.1 M (pH 7.0) . Nuevamente, se adicionó 1.0 mL de solución amortiguadora de fosfato de potasio 0.1 M (pH 7.0), enseguida la mezcla se sometió a fragmentación y centrifugación cada 3 minutos, en frió, utilizando un fragmentador ultrasónico para obtener una solución de enzima cruda. La solución de enzima cruda se adicionó a una solución de sustrato (0.1 mL de LA, 2.7 mL de amortiguador de fosfato de potasio 0.1 M y 0.2 L de 1, 3-propanodiol) para medir absorbancia a 233 nm. <Resultados y comentarios> Las cepas de Lactobacill us productoras de CLA se tamizaron a partir de más de 200 cepas de Lactobacill us mediante el ensayo con isomerasa.

Ejemplo experimental 1: Identificación de la producción de CLA mediante cromatografía de gases Para confirmar cuánto CLA fue producido básicamente por las cepas de Lactobacill us que expresan enzimas isomerasas, la cantidad de CLA generado se determinó por cromatografia de gases. <Materiales y método Los Lactoba cill us candidatos se inocularon en un medio MRS liquido que contenía LA, antes de cultivar la mezcla a 37 °C durante 24 a 48 horas. El medio cultivado se extrajo con ácido heptadecanoico y una mezcla de cloroformo :metanol . El extracto se trató con sulfato de sodio para eliminar la humedad y se evaporó. A la muestra preparada se le adicionó hidróxido de sodio 1 N (en metanol) , antes de saponificarla a 100°C durante 15 minutos. Luego, se le adicionó HCl al 4% (en metanol) para metilarla. A la muestra metilada se le adicionó una mezcla de hexano:agua (1:1, v/v), se mezcló y se centrifugó. Se tomó una fracción con solvente orgánico para eliminar el solvente orgánico con gas nitrógeno, enseguida, la muestra se disolvió en 1 mL de hexano. Según la presente invención, el contenido de CLA en cada muestra se determinó antes y después de eliminar los óxidos por cromatografia de gases (Hewlett Packard 5890 Series II GC) con detector de ionización de flama (FID) . La columna capilar utilizada (columna capilar DB FFAP) tenia una longitud de 30 m, un diámetro interior de 0.25 µm y un espesor de película de 0.25 µm. Después de fijar la columna en el cromatógrafo de gases, éste tenía las siguientes condiciones: temperatura del horno (210°C) , temperatura del detector (270°C) , temperatura del inyector (250°C) , gas acarreador (helio(l mL/min)), relación de spli t (50:1) y temperatura de inyección de la muestra (2°C) . El área de cada pico se calculó mediante un integrador (3395, Hewlett Packard) acoplado al cromatógrafo. El CLA se identificó comparando su tiempo de retención (TR) con el de un material estándar. Como estándar interno se utilizó ácido heptadecanoico para determinar el contenido -de CLA (Lin, T.Y. 2000. Conj uga ted linoleic acid concentra tion as affected by lactic cul tures and addi tives (Concentración de ácido linoleico conjugado y cómo es afectada por cultivos lácticos y aditivos), Food Chemis try 69. 27-31) . <Resultados y comentarios> Como se observa en el cromatograma de gases de la Figura 1, la cepa aislada de Lactoba cill us produjo los isómeros c9tll y tl0cl2 del CLA. Si el rendimiento de tl0cl2 CLA con efecto reductor de la grasa corporal se presentó en términos de ppm, el Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 produjo tl0cl2 CLA en una cantidad de 43.25 ppm y tuvo una mejor productividad en comparación con lo reportado para Lactobacillus reuteri y Lactobacillus fermen tum que produjeron el CLA en cantidades de 30 ppm y 28 ppm, respectivamente.

Ejemplo experimental 2: Identificación de la cepa de Lactobacill us : Tinción de Gram, identificación mediante el estuche API, análisis de secuencia 16S rRNA, ensayos de PCR múltiple Para identificar las cepas de Lactobacill us productoras de CLA, se confirmó si presentaban o no resultado gram positivo con tinción de gram y catalasa negativo. Se llevaron a cabo varias pruebas bioquímicas y fisiológicas utilizando un Estuche API y se analizó e identificó la secuencia 16S rRNA. Por otra parte, para clasificar las especies estrechamente relacionadas, se identificaron cepas por ensayos de PCR múltiple utilizando un cebador especifico para un grupo. 1. Tinción de Gram Se preparó un frotis con la cepa y se fijó con calor, antes de adicionarle una solución de violeta de cristal que se dejó reaccionar durante 1 minuto aproximadamente. El frotis resultante se trató con una solución de yodo para lavar el exceso de colorantes, enseguida se le adicionó yodo que se dejó actuar durante 1 minuto. El frotis resultante se decoloró con etanol al 95% durante 30 segundos, luego, se lavó con agua durante 2 a 3 segundos, el agua se eliminó con un aspirador. El frotis resultante se trató con solución de safranina O durante 10 a 30 segundos para realizar conteo de tinción. El frotis resultante se enjuagó cuidadosamente con agua hasta que ya no salieron colorantes, se secó con un aspirador y se le depositó una gota de aceites de inmersión para observarlo a través de un microscopio. <Resultados y comentarios> Como se muestra en la Figura 2, las cepas de Lactobacill us productoras de CLA dieron gram positivo. 2. Pruebas bioquímicas y fisiológicas con el estuche API Después de confirmar si las cepas se aislaron o no con alto grado de pureza, se cultivaron en medio MRS a 30°C o 37°C durante 24 horas. Se subcultivaron más de dos veces en medio MRS, antes de aislar una colonia del medio MRS. Se abrió una muestra del medio en suspensión para preparar una suspensión pesada de turbidez muy alta, se utilizó una bola de algodón. La solución preparada de la cepa se agregó gota a gota a 5 mL del medio en suspensión hasta que la turbidez llegó a un valor McFarland 2. El medio API 50 CHL que contenía las cepas se dividió en tubos de una banda y se cultivó en condiciones aeróbicas a 30°C o 37°C durante 48 horas. Si se generó ácido, con el estuche API se logra que el medio tome un color amarillento mediante el indicador púrpura de bromocresol. Si el color cambia de púrpura a negro en la prueba de esculina (tubo No. 25), se considera reacción positiva. <Resultados y comentarios> Como se señala en el Cuadro 1, los re experimentales con el estuche API 50CH mostraron cepa de Lactobacillus de la invención tuvo similitu Lactobacillus rhamnosus y el Lactobacillus para pa pero no se evaluó en términos de porcentaje.

[Cuadro 1] Resultados de la identificación de 3. Identificación mediante análisis secuencia 16S rRNA Se aisló ADN genómico para amplifi fragmentos ADN 16S ribosomal, antes de confir electroforesis los fragmentos de ADN amplifica fragmentos de ADN se purificaron por medio de un es purificación Qiagen PCR (Qiagen, Hilden, Aleman mezclarse con una solución reactiva que conteni marcada con el colorante d-rhodamina, antes de real secuenciación directa para purificar el ADN mediante precipitación con etanol/acetato de sodio purificado se disolvió en TSR ( témpla te suppression o reactivo de supresión de molde) para analizars analizador genético ABI Prism 310 (PE Applied Bio E.U.A.). La secuencia analizada se identificó Genebank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) . <Resultados y comentarios> El resultado del análisis de la secuenc * 15 cepa de Lactobacillus productora de CLA (Figura 3 similitud con el Lactobacill us rhamnosus 842/844 (9 Lactobacillus casei ( 99% ) . 4. Identificación con PCR múltiple 20 Para confirmar si la cepa PL60 fu Lactobacillus rhamnosus o Lactobacillus ( Lactobacill us paracasei ) , los fragmentos de ADN o de la cepa PL60 se compararon con sus fragmento después de realizar los ensayos de PCR múltiple (S 25 N. Kato, C. Liu, Y. Matsumiya, H. Kato, and K. 2000. Rapid identification of 11 human intestinal Lactobacillus species by PCR múl tiple assays using group-and species-specific primers derived from the 16S 23S rRNA intergenic spacer región and i ts flanking 23S rRNA (Identificación rápida de 11 especies de Lactobacill us intestinales humanos por ensayos de PCR múltiple mediante cebadores específicos de grupo y de especie derivados de la región espaciadora intergénica 16S 23S rRNA y sus regiones flanqueantes 23S rRNA). FEMS Mictrobiol . Let ters, 187:167-173) . Para esto, se llevó a cabo una reacción de PCR en una cantidad final de 30µL utilizando una mezcla que contenía lx amortiguador por reacción, dNTPs de 200 µM, 0.15 unidades, 10 pmol de cebadores (LU-5, CTA GCG GGT GCG ACT TTG; Lpar-4, GGC CAG CTA TGT ATT CAC TGA; Rha a, GCG ATG CGA ATT TCT ATT ATT) y 20 ng de ADN. La reacción PCR comprendió las siguientes etapas: hacer reaccionar la mezcla repitiendo un ciclo de 20 segundos a 95°C, 2 minutos a 62°C y 2 minutos a 74°C, 35 veces; hacer reaccionar la mezcla a 72 °C durante 10 minutos; y conservar el producto resultante a 4°C. El producto PCR resultante se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1.5% durante 20 minutos empleando una solución amortiguadora 0.5x de TBE (tris-borato 0.045 M, EDTA 0.001 M) y después se observaron los patrones de los fragmentos de ADN revelados . <Resultados y comentarios> Como resultado de los ensayos de PCR múltiple, la cepa de Lactobacill us rhamnosus y la cepa PL60 produjeron fragmentos de ADN de 113bp, mientras que el Lactobacill us para casei ATCC 25302 produjo fragmentos de ADN con un tamaño de 312bp tal como se muestra en la Figura 4. Por lo tanto, la cepa PL60 se identificó como Lactobacillus rhamnosus . Hasta ahora, la cepa de Lactobacill us rhamnosus productores de CLA aún no se ha reportado. La presente invención reporta por primera vez la cepa de La ctobacill us rhamnosus productores de CLA.

Ejemplo experimental 3: Adaptación intestinal del Lactobacillus rhamnosus Para utilizarse como probiótico, tiene que tener alta tolerancia tanto al ácido como a la bilis y buena adaptación a las células intestinales. La adaptación intestinal debe confirmarse mediante experimentos en humanos . 1. Prueba de resistencia al ácido Con el fin de conocer si el pH afectó la supervivencia de las cepas seleccionadas, se usó un medio MRS (DeMan-Rogosa-Sharpe) después de ajustar el pH a 7.0, 4.8 y 4.5 con HCl 10 N. Una solución de cepa activada (0.D=2.0) se inoculó en el medio MRS en una proporción de 2% y se cultivó a 37°C durante 24 horas, a determinar la absorbancia a 600 nm. Se examinó afectaba el crecimiento de las cepas seleccionadas la absorbancia determinada. La O.D de pH 7.0 se 1/10 para medir y registrar la absorbancia (Co Gorback SL, Goldin BR, 1987. Survival of lac bacteria in the human stomach and adhesión to i cells (Supervivencia de bacterias de ácido lácti estómago humano y adhesión a las células intestina Dairy Sci . 70:1-12) . <Resultados y comentarios> En un experimento de sobrevivencia de l en presencia de bajo nivel de ácido, incluso tr durante 24 horas, el resultado fue que sobrevivie lo tanto tuvieron una fuerte resistencia al ácido, se muestra en el Cuadro 2.

[Cuadro 2] 20 Resultados experimentales de la resist ácido del Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 (O.D. a 2. Prueba de resistencia a la bilis Con el fin de conocer si la bilis a crecimiento de las cepas seleccionadas, se adicion (OXOID) en proporciones de 0.125% y 0.25% a un (DeMan-Rogosa-Sharpe) para esterilizarlo. La sol cepa activada (O.D=2.0) se inoculó en el medio est en una proporción de 2% y se cultivó a 37°C du horas, después se midió la absorbancia a 600 nm. bilis al 0% se diluyó a 1/10 para medir y regi absorbancia (Ibrahim SA, Bezkorovainy A. 1993. Su bifidobacteria in the presence of bile salt (Supe de bifidobacterias en presencia de sales biliares) . Food Agrie. 62: 351-354). <Resultados y comentarios> Las personas sanas tienen una concentr bilis de 0.06% en el intestino delgado. L sobrevivieron incluso en presencia de 0.250% de decir, presentaron una fuerte resistencia a la bili [Cuadro 3] Tiempo 0 horas 3 horas 6 horas 24 hor 0.000% de 0.022 0.069 0.467 8.080 0.250% de 0.007 0.038 0.335 3.570 3. Prueba de adhesión intestinal Con el fin de conocer el grado de adhesión a los intestinos humanos, el Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 se adhirió a lineas celulares Caco-2 derivadas de células epidérmicas intestinales. Para esto, las líneas celulares Caco-2 se cultivaron en un medio DMEM (pH 7.0) que contenía bicarbonato de sodio 2.7 g/L, suero fetal bovino ( fetal bovine serum o FBS) 20% (v/v) y antimicóticos antibióticos. Se inocularon 3xl05 células en 2 mL de medio en una caja petri de 30 mm y se cultivaron en una sola capa. El medio se cambió una vez cada dos dias. Seis dias después, la capa simple de células se lavó dos veces con 2 mL de solución salina amortiguada de fosfato (phospha te buffered saline o PBS) . La cepa de Lactobacill us de lxlO7 células se suspendió en 2 mL de un medio y se colocó en una caja petri, antes de cultivar la mezcla a 37°C en atmósfera de aire-C02 (95%-5%) durante 60 a 90 minutos. Las células se lavaron dos veces con PBS esterilizada y se fijaron con metanol durante 10 minutos. Se observaron a través de un microscopio óptico después de hacer tinción de gram. Para el análisis cuantitativo se observaron 20 campos con un microscopio de 100 aumentos. Se contó el número de cepas adheridas y se expresó en términos del número de cepas adheridas por 100 células Caco-2 (Bibiloni R, Pérez PF, DeAntoni GL. 1999. Anaeroje 5, 483-485; Editado por R. Fuller (1997) Probiotics 2 , 10-22). <Resultados y comentarios> Como se muestra en la Figura 5, el Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 tuvo excelente adhesión a las células Caco-2. Si para calcular el promedio de cepas adheridas por campo se contó el número de cepas adheridas de cada 20 campos, se adhirieron por campo 59.29+5.33 cepas de Lactobacillus . Esto significa que se adhirieron a las células más de 4000 cepas de Lactobacill us por caja petri y tuvieron mejor adhesión intestinal que las cepas convencionales de Lactobacill us .

A . Prueba de adaptación a los intestinos humanos A fin de confirmar si las cepas de La ctobacill us se adaptaban a los intestinos después que las personas las ingerían, el Lactobacillus rhamnosus Cepa PL60 se administró por via oral en una cantidad de 1010 UFC una vez al dia durante 8 dias. El siguiente día, las heces se cultivaron en un medio MRS (con azul de bromofenol al 1%, 30 µg/mL de vancomicina) durante 48 horas. Todas las colonias similares se observaron con tinción de gram, se subcultivaron y se aislaron puras. Se realizaron análisis por PCR especifico para la especie, utilizando las colonias aisladas y puras. <Resultados y comentarios> Como se muestra en la Figura 6 , el Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 se detectó en los días uno al seis después de la ingestión y su administración se detuvo tan pronto como se detectó. La colonia detectada de La ctobacill us resultó ser de La ctobacill us rhamnosus mediante un ensayo PCR específico para la especie (Figura 7) . Esto demuestra que el Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 se adaptó a los intestinos. En especial, como se muestra en la Figura 6, dado el hecho de que la flora bacteriana dentro de los intestinos se simplificó después de que se administró el Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60, se pensó que el Lactobacill us ejercía regulación intestinal.

Ejemplo experimental 4: Prueba de seguridad en cepas de Lactobacill us La prueba de seguridad en cepas de Lactobacill us debe llevarse a cabo para su dosificación en humanos. Con este fin, se confirmó si las cepas de Lactobacill us producían o no materiales tóxicos como amoníaco, indol, hemolisina o lo similar y si estaban o no presentes enzimas venenosas . 1. Prueba de hemolisis Cuando el Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 se inoculó en agar con sangre de oveja y se cultivó a 37 °C durante 24 horas, sólo se desarrolló a-hemólisis y no ß-hemólisis . 2. Prueba de licuefacción de gelatina El Lactobacillus rhamnosus Cepa PL60 se inoculó en un medio inclinado constituido por medio de gelatina y MRS (0.3 g de extracto de carne, 0.5 g de peptona, 12 g de gelatina y 100 mL de caldo MRS) y se cultivó a 35°C durante 6 semanas. Cuando el cultivo y el control se enfriaron a 4°C durante 4 horas aproximadamente para verificar la licuefacción de la gelatina, se pensó que las gelatinasas no estaban presentes porque no se observó licuefacción. 3. Prueba de formación de amoniaco Un medio de agar urea (20 g de urea, 5 g de NaCl, 2 g de KH2P04, 1 g de peptona, 1 g de glucosa, 12 mg de fenol y 100 mL de agua destilada) se filtró y esterilizó, después se disolvieron 15 g de agar en 900 mL de agua destilada para esterilizarse en húmedo y mezclarse con el medio agar urea preparado y ajustarlo a un volumen total de 1 L (pH 6.9) . A este cultivo se le inoculó el Lactoba cill us rhamnosus Cepa PL60 y se cultivó a 37°C durante 12 horas aproximadamente, después se observó el cambio de color del medio. Un medio de color amarillo significa que el resultado es negativo, con ello se demostró que el Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 no generó amoniaco.

. Prueba de formación de indol El Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 se inoculó en agar MRS que contenía triptona al 0.1% y se cultivó durante 18 horas aproximadamente. Cuando a este cultivo se le adicionaron 5 gotas de reactivo de Kovac (10 g de p-dimetilaminobenzaldehído, 150 mL de butanol y 50 mL de ácido hidrocólico) , no se observó cambio de color. Esto significa que no se produjo indol.

. Prueba de desaminación de fenilalanina El Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 se inoculó en un medio MRS que contenia D, L-fenilalanina al 0.2% y se cultivó durante 24 horas o lo similar. Después de que se dejaron fluir 5 a 10 gotas de cloruro férrico al 10% sobre este cultivo en un medio inclinado, se observó un cambio de color en los primeros 1 a 5 minutos. En caso de una reacción positiva, el ácido fenilpirúvico generado reaccionaria con el cloruro férrico e impartiría al medio un color verde. El Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 mostró reacción negativa. 6. Prueba de ß-glucuronidasa Se disolvió p-nitrofenil-ß-D-glucurónido en amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M (pH 6.0) a una concentración de 0.2%. El Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 se suspendió en amortiguador de fosfato y se formó una suspensión con un valor Ab6oo=4. Una solución amortiguadora de 200 µL con un sustrato se adicionó a la suspensión de 200 µL y se trató a 37°C durante 16 horas. Si una solución de cultivo se vuelve amarilla, la prueba se considera positiva. Sin embargo, esta prueba mostró reacción negativa. La solución de cultivo se centrifugó y se obtuvo un sobrenadante. La absorbancia del sobrenadante determinada a 405 nm fue 0.078. 7. Prueba de actividad de nitrorreductasa El Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 cultivado en medio MRS liquido durante toda la noche se centrifugó a 3000xg durante 10 minutos y se recolectó la biomasa que se sometió a sonicación durante 5 minutos . Se adicionaron al sobrenadante ácido 4-nitrobenzoico (concentración final 300 µg/mL) y ácido tricloroacético (concentración final 0.21%) y se dejó reaccionar a 37 °C durante 1 hora, después se adicionó nitrito de sodio (concentración final 0.007%) y se dejó a temperatura ambiente durante 20 minutos. A esta mezcla se le adicionó sulfamato de amonio (concentración final 0.04%) y se dejó a temperatura ambiente durante 3 minutos. Después se adicionó NEDD (diclorhidrato de N-(l-naftil) etilenediamina) (concentración final 0.35%) y se dejó reaccionar a 4°C. Cuando se desarrolló la reacción en el sobrenadante se observó a 540 nm en un espectrofotómetro y se detectó reacción negativa. Se hizo la comparación con la reacción positiva obtenida al adicionar 1 µg/mL de ácido 4-aminobenzoico . 8. Resistencia a los antibióticos Mientras más fuerte es la resistencia a los antibióticos en un probiótico mayor es su capacidad de sobrevivir en los intestinos. Es decir, es mejor mientras mayor sea la resistencia a los antibióticos. Sin embargo, si la resistencia a los antibióticos se transfiere, pueden surgir problemas de resistencia. Se verificó si la resistencia a los antibióticos se transfirió o no a otras bacterias .

[Cuadro 4] Resistencia a los antibióticos del Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 9. Prueba de transferencia de la resistencia a los antibióticos Para investigar la transferencia de la resistencia a los antibióticos, se llevó a cabo un ensayo de unión en filtro (Givers, D., G. Huys, and J, Swings . 2003. In vitro conj ugal transfer of tetracycline resistance from Lactobacillus isola tes to other Gram-positive bacteria (Transferencia conjugada in vi tro de resistencia a tetraciclina de aislados de Lactoba cillus a otras bacterias gram positivas). FEMS Microb . Let ters 225:125-130). El Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 se cultivó hasta una fase exponencial media (aproximadamente 4 a 5 horas) . 1 mL de la cepa cultivada se mezcló con 1 mL de Enterococcus faecal is CCARM 5510, después la mezcla se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa esterilizado y se lavó con PPS (solución salina de peptona fisiológica) . El papel filtro se colocó en un medio de agar no selectivo y se cultivó a 37 °C durante 16 horas. La biomasa que se desarrolló en el papel filtro se lavó con 2 mL de PPS y se retiró del papel antes de diluirla e inocularla en un medio selectivo Enterococcosal que contenia varios antibióticos y cultivarla a 37°C durante 24 a 48 horas. Se evaluó si habla o no E. faecal is resistente a los antibióticos y se confirmó que en el cultivo no había E . faecal is resistente a los antibióticos. Esto significa que no se transfirió la resistencia a los antibióticos.

[Modalidad para invención] Ejemplo 2: Condiciones óptimas para la producción de CLA Encontramos la concentración de LA y la clase de sustratos que pueden producir la máxima cantidad de CLA. 1. Concentración de LA capaz de producir una cantidad máxima de CLA Ya que el LA en alta concentración inhibe de por si el crecimiento de las bacterias, el LA en alta concentración no se puede adicionar a un medio. Por otra parte, con el fin de ahorrar el gasto de LA en un medio, se investigó la concentración de LA que podía producir la cantidad máxima de CLA. <Materiales y método> Un éster de LA soluble en agua, en varias concentraciones, se adicionó a un medio de leche descremada y un medio MRS y se cultivó durante la noche, después se midió la cantidad de CLA generado en el medio. Con este fin, se extrajeron los lípidos del medio y se metilaron antes de determinar por cromatografía de gases la cantidad de CLA generado. Para esto, se adicionaron 1000 ppm de ácido heptadecanoico y 200 mL de cloroformo ¡metanol (2 : 1) a 200 mL de solución de cultivo, después se añadieron perlas de vidrio y se agitó vigorosamente durante 5 minutos y se homogeneizó durante 5 minutos. La mezcla se centrifugó a 6000 rpm durante 15 minutos (4°C) y se separó en dos fracciones. La fracción en solvente orgánico se trató con sulfato de sodio para eliminar la humedad residual, antes de evaporar el solvente orgánico y secar con gas nitrógeno. Se adicionaron 3 mL de hidróxido de sodio (metanol) a la muestra seca y se saponificó a 100°C durante 15 minutos. En este punto, se utilizó un tubo con tapa de rosca recubierta con cinta de Teflon que se recubrió con " Paraf ilm" . Allí se adicionaron 6 L de HCl al 4% (metanol) para metilar durante 20 minutos. La muestra metilada se mezcló con 2 mL de hexanoiagua (1:1, v/v) y se agitó vigorosamente durante 10 minutos, después la mezcla se centrifugó a 8000 rpm y 4°C durante 15 minutos. Se separó la fracción orgánica y se secó con gas nitrógeno, antes de disolver la materia seca en 1 mL de hexano. <Resultados y comentarios> Suponiendo que el área del pico del ácido heptadecanoico (estándar de referencia) es 100, cuando la cantidad de LA adicionada al medio fue mayor de 100 ppm el CLA se produjo en cantidad suficiente (Cuadro 5) . Por otra parte, si el LA se adicionó en cantidades de 1000 ppm y 500 ppm cada vez, no se observó una diferencia notable entre cada adición en cuanto a la producción de CLA. De preferencia, el LA se adiciona en una cantidad de 100 a 1000 ppm para producir CLA. Considerando el costo y la eficiencia, la cantidad más preferible es 500 ppm.

[Cuadro 5] Producción de CLA según la concentración de LA adicionado a un medio 2. Condiciones de adición de emulsificante para producir la máxima cantidad de CLA Se investigó si cuando se adicionaba un emulsificante con el fin de aumentar la solubilidad del LA en una solución de cultivo, la producción de CLA aumentaba o no. Para esto, se adicionó LA a un medio de leche descremada y un medio MRS en una concentración de 0.1%. En este punto, se adicionó LA en tres formas LA, sal de LA y LA y Tween-80 (0.2%) y se cultivó durante la noche para confirmar después la productividad en CLA del Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60. Con el método antes mencionado, se extrajeron los lipidos de la solución de cultivo y se metilaron, antes de determinar por cromatografia de gases la cantidad de CLA. <Resultados y comentarios> El Tween-80 que se usó para aumentar la solubilidad del LA en la solución de cultivo, triplicó la producción de tl0cl2 CLA, en comparación con la sal de LA. Es muy importante que se adicione un emulsificante para aumentar la solubilidad del LA cuando éste se adiciona a un medio .

[Cuadro 6] Influencia de la adición del Tween-80 en la 3. Condiciones de la adición del emulsificante en un cultivo primario para inducir la producción de CLA Con el fin de producir la máxima cantidad de CLA inmediatamente después de ingerir el Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 tal cual, una cepa iniciadora o un aditivo constituido por la misma, se investigó si en el caso de que el Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 se cultivara para hacer productos como polvos liofilizados, la adición de Tween-80 para aumentar la solubilidad del LA era o no una condición eficiente. Para esto, se adicionaron 0.1% de sal de LA, LA y Tween-80, 0.2% de LA y Tween-80 y 0.5% de LA y Tween-80 a un medio para cultivo primario de cepas iniciadoras. El Lactobacillus rhamnosus Cepa PL60 de cultivo primario se cultivó en un medio de producción de CLA (leche descremada que contenia 0.1% de LA) para medir la cantidad de CLA generado. <Resultados y comentarios> Con el fin de producir la máxima cantidad de CLA en un medio de leche descremada (medio de suero) usado en la producción comercial, la mejor productividad en cuanto a CLA se obtuvo cuando el Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 se cultivó en un medio de leche descremada que contenia 0.1% de LA y 0.1 a 0.5% de Tween-80 para inducir la productividad (Cuadro 7) . Se pensó que la razón por la que se obtuvo mayor productividad en CLA con 0.2% de Tween-80 que con 0.5%, fue la inhibición del crecimiento de las cepas de Lactobacill us ocasionada por la proporción de 0.5% de Tween-80.

[Cuadro 7] Productividad en CLA del Lactobacillus rhamnosus Cepa PL60 dependiendo de las concentraciones de Tween-80 utilizadas para disolver el LA en un medio . Condiciones de la adición de sacáridos para producir la máxima cantidad de CLA Descubrimos la clase de polisacáridos capaces de producir la máxima cantidad de CLA. Para esto, se adicionaron fructosa, sacarosa y lactosa en una concentración de 6% a un medio de leche descremada que contenia 0.1% de LA y se midió la producción de CLA. <Resultados y comentarios> La máxima cantidad de CLA se produjo con la adición de fructosa, seguida por la sacarosa y la lactosa. Cuando se adicionó glucosa, no se observó una producción eficaz de CLA.

[Cuadro 8] Cambio en la producción de CLA dependiendo de los diversos sacáridos Ejemplo 3: Cambio en el peso corporal de ratas a las que se les administró el Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 productor de CLA El La ctobacill us rhamnosus Cepa PL60 cultivado en un medio que contenia 0.1% de LA y 0.2% de Tween-80 con leche descremada como excipiente, se administró a ratas en una dosis de 109 UFC/día y 107 UFC/dia junto con una dieta alta en grasas. Después, se observó el cambio en el peso corporal de las ratas.. <Materiales y método> Se asignaron cuatro ratas C57BL/6N (Charles River Laboratory Animal Facility, E.U.A.) a cinco grupos. Al primer grupo se le administró una dieta normal (croquetas para roedor Purina #5057 (3.28 cal/g)), al segundo grupo se le administró una dieta alta en grasas (dieta para investigación 45% de grasas D12451 (5.252 cal/g)), el tercer grupo fue un grupo de control al que se le administró una dieta alta en grasas y leche descremada como excipiente, al cuarto grupo se le administró una dieta alta en grasas y Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 en alta concentración (109 UFC/dia) y el quinto grupo fue un grupo al que se le administró una dieta alta en grasas y Lactobacillus rhamnosus Cepa PL60 en baja concentración (107 UFC/dia). Mientras, las ratas de 3 semanas de edad ingerían a saciedad una dieta rica en grasas y agua. Se observó el cambio en su peso corporal y la cantidad de dieta consumida. Las ratas se anatomizaron en la 8a semana para determinar el peso de la grasa intestinal y observar mediante tinción y al microscopio el tamaño y número de las células adiposas en todos los órganos. <Resultados y comentarios> El Cuadro 9 representa el cambio en el peso corporal de las ratas a las que se les administró el Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60. Según el Cuadro 9, mientras que el grupo al que se le administró el Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 en alta concentración, apenas mostró en la 4a semana un cambio estadísticamente significativo, si disminuyó la ganancia de peso en más de 2 g en la 8a semana, en comparación con el grupo de control (Figura 8 y Figura 9) . Es decir, el grupo con dieta normal tuvo un peso promedio de 24.7 g, el grupo con la dieta alta en grasa tuvo un peso promedio de 33.4 g, el grupo que consumió leche descremada tuvo un peso promedio de 31.9 g, el grupo al que se le administró Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 en alta concentración tuvo un peso promedio de 26.9 g y el grupo al que se le administró Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 en baja concentración tuvo un peso promedio de 28.7 g. La ganancia de peso del grupo de alta concentración fue 6.5 g menor que el del grupo de la dieta alta en grasa, lo que representó 19.5%. El grupo de baja concentración tuvo 4.7 g menos en ganancia de peso que el grupo de la dieta alta en grasa, lo cual representó 14%. El grupo de alta concentración y el grupo de baja concentración, respectivamente, mostraron 5 g (15.7%) y 3.2 g (10%) menos ganancia de peso, en comparación con el grupo que consumió leche descremada. Se determinó que la diferencia de peso entre el grupo con dieta alta en grasa y el grupo con dieta de leche descremada fue de 1.5 g (4.5%), lo cual estuvo en el intervalo de tolerancia de error y no fue una pérdida de peso derivada de la leche descremada.

[Cuadro 9] [Aplicación industrial] El Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 de la presente invención tiene un efecto reductor de la grasa corporal. La cepa de La ctobacill us se puede usar directamente en alimentos funcionales que reduzcan la grasa corporal, con el fin de prevenir o tratar todas las enfermedades derivadas de la obesidad, o se puede usar en forma de aditivos para alimentos funcionales que reduzcan la grasa corporal. Aunque las modalidades preferidas de la presente invención se expusieron con fines ilustrativos, los expertos en la técnica observarán que es posible hacer varias modificaciones, adiciones y sustituciones, sin desviarse del alcance y espíritu de la invención tal como se expone en las reivindicaciones que la acompañan.

Claims (14)

1. EIVINDICACIONES 1. Una cepa de Lactobacill us rhamnosus que convierte el ácido linoleico en ácido linoleico conjugado.
2. 2. La cepa de Lactobacillus rhamnosus según la reivindicación 1, en donde la cepa es Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 KCCM-10654P.
3. 3. La cepa de Lactobacill us rhamnosus según las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la cepa es una cepa viva o una cepa seca.
4. 4. Una composición para producir CLA que comprende la cepa según una de las reivindicaciones 1 a 3.
5. 5. Un proceso de CLA que produce masa que utiliza la cepa de Lactobacill us rhamnosus , cultivo primario de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
6. 6. El proceso de CLA que produce masa mediante una cepa de Lactobacill us rhamnosus según la reivindicación 5, en donde se adiciona 0.01 a 1.0% de LA o aceite de cártamo a un medio de cultivo primario de la cepa.
7. 7. El proceso de CLA que produce masa mediante una cepa de Lactobacillus rhamnosus según la reivindicación 6, en donde se adiciona 0.01 a 1.0% de Tween-80 un medio de cultivo primario de la cepa.
8. 8. El proceso de CLA que produce masa mediante una cepa de Lactobacill us rhamnosus según la reivindicación 7, en donde se adiciona fructosa, sacarosa o lactosa como sustrato de carbohidrato a un medio de cultivo primario de la cepa.
9. 9. Alimentos funcionales que reducen la grasa corporal que contienen como aditivo la cepa según una de las reivindicaciones 1 a 3.
10. 10. Los alimentos funcionales que reducen la grasa corporal según la reivindicación 9, en donde los alimentos son alimentos para el cuidado de la salud o alimentos fermentados que contienen yogurt, queso, kimchi , kochujang (pasta de soya espesa coreana mezclada con pimienta roja) y doenjang (pasta de soya fermentada coreana) .
11. 11. Productos lácteos preparados con La ctoba cill us rhamnosus Cepa PL60 KCCM-10654P como cepa iniciadora .
12. 12. Alimentos fermentados a partir de cereales preparados mediante el Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 KCCM-10654P como cepa iniciadora del fermento.
13. 13. Un medicamento para prevenir y tratar enfermedades relacionadas con la obesidad, que contiene cepas vivas, cepas secas o filtrados de cultivo de Lactobacillus rhamnosus Cepa PL60 KCCM-10654P.
14. 14. El medicamento para prevenir y tratar enfermedades relacionadas con la obesidad según la reivindicación 13, por el que personas sanas con un peso promedio de 60 kg ingieren Lactobacill us rhamnosus Cepa PL60 KCCM-10654P en una cantidad de Ixl07-lxl0u UFC por dosis de 1 a 2 veces al día.