CN114381407B - 一种鼠李糖乳杆菌r7970及其产物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鼠李糖乳杆菌R7970及其产物和应用，该一种鼠李糖乳杆菌R7970保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.22244。本发明提供的鼠李糖乳杆菌R7970与原始菌株M9相比，菌落显著增大，表面光滑，边缘整齐，经荚膜染色后，能明显观察到荚膜，表面粗糙度明显增加，光滑程度显著下降，细胞壁与外层荚膜边界清晰，有更多的荚膜多糖产生，荚膜多糖对环境具有更高的抗性，提高了其肠道中存活率，并具有免疫活性；并且，还能使发酵液的黏度显著增加，极其适用于高粘度发酵产品的制备。

Description

一种鼠李糖乳杆菌R7970及其产物和应用

技术领域

本发明涉及乳杆菌领域，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌R7970及其产物和应用。

背景技术

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称。乳酸菌发酵能够产生多种风味物质和一些功能性成分。胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)是乳酸菌发酵过程的重要代谢产物，它们有的黏附于细胞表面形成荚膜多糖(capsular polysaccharides，CPS)或分泌到周围培养基中形成黏液多糖(slime polysaccharides，SPS)。胞外多糖有利于改善发酵乳制品的理化特性并赋予产品独特的风味和生理功能。

乳酸菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性，至少包含18个属，共200多种，从形态上可以形态上可分成球菌、杆菌。其中的乳杆菌属，细胞形态多样，尺寸通常为(0.5-1.2)μm×(1.0-10.0)μm，呈长或细长杆状弯曲形短杆状及棒形球杆状，通常成短链；属于革兰氏阳性菌，不生孢。

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)多存在于人和动物的肠道内，细菌分类学属于乳杆菌属、鼠李糖亚种，是厌氧耐酸、不产芽孢的一种革兰氏阳性益生菌。鼠李糖乳杆菌具有不能利用乳糖，可发酵多种单糖(葡萄糖、阿拉伯糖、麦芽糖等)，大多数菌株能产生少量的可溶性氨，但不产生吲哚和硫化氢，耐酸、耐胆汁盐、耐多种抗生素等生物学特点。

对于现有鼠李糖乳杆菌而言，其产荚膜多糖的量相对较少，对发酵产物粘度的提升也有限，因此，将其应用到乳制品中进行发酵时，其增黏效果并不优异。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有高产黏发酵特点的鼠李糖乳杆菌R7970，其能够有效适用于乳制品发酵中，具有产酸、产黏能力强，可利用乳糖等性能优势。

一株鼠李糖乳杆菌R7970，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.22244，分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，保藏时间为2021年4月27日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路西路1号院3号，经保藏中心于2021年4月27日检测为存活菌株。

发酵菌剂，包括上述的一株鼠李糖乳杆菌R7970。

所述发酵菌剂还包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌和其余鼠李糖乳杆菌中的一种或几种。

发酵乳制品，采用上述的发酵菌剂对乳制品进行发酵得到。

所述发酵菌剂的用量为(1～9)×10⁶cfu/ml；优选的，鼠李糖乳杆菌R7970的用量为(1～3)×10⁶cfu/ml；

和/或，所述乳制品为豆乳和/或牛乳。

一种保健食品，包括上述的鼠李糖乳杆菌R7970。

所述的保健食品还包括食品学上允许的载体或添加剂。

所述保健食品的剂型为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂或浸膏；优选为固体饮料。

一株鼠李糖乳杆菌R7970在发酵中的应用，包括(a)-(c)中至少一种：

(a)在利用乳糖进行发酵中的应用；

(b)在提高发酵产物产酸或/和产黏能力的应用；

(c)在提高发酵产物产荚膜多糖能力中的应用。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的鼠李糖乳杆菌R7970与原始菌株M9相比，菌落显著增大，表面光滑，边缘整齐，经荚膜染色后，能明显观察到荚膜，表面粗糙度明显增加，光滑程度显著下降，细胞壁与外层荚膜边界清晰，有更多的荚膜多糖产生，荚膜多糖对环境具有更高的抗性，提高了其在胃肠中的存活率，并具有免疫活性；并且，该鼠李糖乳杆菌R7970还能使发酵液的黏度显著增加，极其适用于高粘度发酵产品的制备。

2.本发明提供的鼠李糖乳杆菌R7970，与原始菌株M9相比，在发酵过程中保持了较高活菌数。

3.本发明提供的鼠李糖乳杆菌R7970能适用于多种碳源(D-果糖、乳糖、D-半乳糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖等)和氮源(酵母浸粉、酵母蛋白胨、牛肝浸粉等)的利用，具有应用广泛的特点，极其适用于乳制品的发酵。

4.本发明提供的鼠李糖乳杆菌R7970由于能显著提高黏度，因此能更适用于高黏度发酵乳的生产，尤其是高黏度发酵乳制品的生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为鼠李糖乳杆菌R7970革兰氏染色结果图；

图2为鼠李糖乳杆菌R7970菌体形态图片；

图3为鼠李糖乳杆菌R7970菌落电镜图片；

图4为鼠李糖乳杆菌R7970荚膜染色结果图；

图5为鼠李糖乳杆菌R7970极端盐浓度耐受性结果图；

图6为鼠李糖乳杆菌R7970极端pH耐受性结果图；

图7为鼠李糖乳杆菌R7970极端温度耐受性结果图；

图8为鼠李糖乳杆菌R7970发酵过程pH值变化图；

图9为鼠李糖乳杆菌R7970发酵过程滴定酸度变化图；

图10为鼠李糖乳杆菌R7970与原始菌株M9发酵过程黏度值变化对比图；

图11为鼠李糖乳杆菌R7970可利用碳源结果图；

图12为鼠李糖乳杆菌R7970可利用氮源结果图；

图13为鼠李糖乳杆菌R7970全基因组完成图。

具体实施方式

实施例1

一株具有高产黏的鼠李糖乳杆菌R7970，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.22244，保藏时间为2021年4月27日，保藏地址北京市朝阳区北辰路西路1号院3号。

1、鼠李糖乳杆菌R7970的获取

本实施例中提供了该所述的鼠李糖乳杆菌R7970的来源，具体的，其为益生菌鼠李糖乳杆菌Probio-M9(原始菌株M9)搭载新型载人飞船试验船进行太空诱变后进行分离筛选得到。该鼠李糖乳杆菌Probio-M9分离自健康妇女母乳，具有提高机体免疫力，改善高血压，调节肠道菌群等作用。轨道基本参数为：远地点7970Km，近地点324.2Km，轨道倾角41.01°，升交点赤经322.091°，近地点幅角105.928°，圈次6圈，舱内压力1atm，飞行时间2天19h，舱内辐射剂量128rad(si)。

该鼠李糖乳杆菌R7970的活化过程如下：

将鼠李糖乳杆菌R7970接入到MRS液体培养基，37℃培养24h，继代培养3代，恢复菌株活力。对菌液进行10倍比稀释，得到10^-1～10^-7稀释梯度。分别吸取200μL 10^-4、10^-5、10^-6、10^-7梯度稀释液，均匀涂布于MRS固体培养基平皿内，37℃厌氧培养24h。挑取形态、大小、颜色不同的菌株接种于液体培养基中，于37℃恒温厌氧培养箱中培养24h。MRS培养基的组成是：蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖4.0g、吐温80 1.0mL、磷酸氢二钾(7H₂O)2.0g、乙酸钠(3H₂O)5.0g、柠檬酸三铵2.0g、硫酸镁(7H₂O)0.2g、硫酸锰(4H₂O)0.05g，调节pH至6.2，琼脂15g，121℃、15min灭菌。待菌株生长良好后，进行革兰氏染色、镜检，革兰氏染色法为常规方法，此处不再赘述。本实施例的鼠李糖乳杆菌R7970的镜检结果如图1所示，由镜检得到的颜色推导可知，该菌体为革兰氏阳性菌。

2、菌株的分子生物学鉴定

保存分离株，并提取菌株基因组DNA用于后续测定分析。具体的，

将冷冻保存的供试菌株鼠李糖乳杆菌R7970接种于MRS增菌液体培养基中，37℃恒温培养24h；经MRS增菌液体培养基传代培养2～3代后，取2mL对数生长末期的菌体培养物置于无菌EP管内离心，经8000×g离心3min(4℃)后收集菌体，弃上清，采用乳酸菌专用试剂盒提取菌株的基因组DNA。

利用Sanger测序方法对鼠李糖乳杆菌R7970的16S rDNA序列进行全基因组测序，与鼠李糖乳杆菌的模式菌株的16S rDNA序列构建系统发育树。

全基因组测序的过程如下：

a.主要试剂和仪器

GeNomic DNA Purification Kit，Promega公司；MRS培养基，广州环凯微生物科技有限公司，SMRT建库试剂盒(DNA Template Prep Kit1.0)、测序试剂(DNA/Polymerase Bingding Kit P6 V2和DNA Sequencing Bundle 4.0)，Pacific Biosciences公司。

电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；台式高速离心机，Eppendorf公司；超微量紫外分光光度计，NaNoDrop公司；Qubit 2.0荧光计，Life TechNologies公司；PacBioSMRT RS II测序平台，Pacific Biosciences公司。

b.菌株培养与基因组DNA的提取、测序

菌株R7970的DNA提取具体操作步骤如下：(1)将该菌株接种到5mL的MRS液体培养基(62g/L)中，37℃无氧条件下培养24h；(2)以2％的接种量到50mL的MRS液体培养基中，在37℃的厌氧工作站扩培24h；(3)扩配至三代菌液3 000×g/min离心10min收集菌泥；(4)将收集的菌泥用PBS缓冲液清洗2遍，准备进行全基因组DNA的提取。具体的全基因组DNA提取参考本研究团队钟智等的方法。

对于提取后的DNA具体处理如下：(1)使用微量紫外分光光度计(NaNoDrop)测定浓度，用0.6％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的纯度和完整度进行检测；(2)将符合要求的DNA保存至2mL离心管中，加入0.46×磁珠进行吸附，直至磁珠全部吸附到磁力架上；(3)将废液吸出，将无水乙醇稀释至75％对吸附有DNA离心管快速洗涤2遍，并将废液全部弃掉；4)用回溶液将纯化后的DNA从磁珠上回溶，用Qubit检测纯化后DNA的浓度，计算DNA质量(回溶后DNA体积与浓度相乘)，要求DNA质量大于7μg且体积小于150μL。将符合要求的高质量DNA按照PacBio SMRT全基因组DNA建库流程建立10kb文库，建库后根据PacBio SMRT RS II测序平台上机流程进行全基因组测序。一株菌使用一个PacBio SMRT Cell，平均可测得高于150×的原始数据。

c.基因组测序和组装

将测序所得原始数据进行质量评估，去掉低质量Reads和接头，通过Portal(V2.7)中RS_HGAP_Assembly.3软件对菌株R7970序列进行质控和菌株基因组组装。使用Circlator(V1.5.5)对组装完成的基因组进行环化。

d.全基因组圈图

将组装完成的R7970全基因组序列上传至RAST网站(Repaid AnNotion usingSubsystem TechNology；http://rast.nmpdr.org/rast.cgi)进行注释，下载其注释文件。注释文件及核酸序列上传CGView Server(http://stothard.afns.ualberta.ca/cgview_server/)进行圈图绘制。

鼠李糖乳杆菌R7970基因组信息结果表明，将样品鼠李糖乳杆菌R7970测序数据评估组装。R7970的基因组圈图如图13所示，并统计菌株的基因组信息：基因组大小为2997099bp，GC含量为46.76％，包含2789个蛋白质编码区(Coding Sequence，CDS)。R7970菌株与原始菌株M9具有极高的同源关系，R7970分离株与Probio-M9的平均核苷酸一致性大于99.99047％。经单核苷酸多态性(SNP)分析后发现，R7970有四个非同义突变的ywqD基因(非特异性酪氨酸蛋白激酶)，该基因参与调节荚膜多糖的生物合成。

3、菌落形态特性鉴定

本发明中的鼠李糖乳杆菌R7970的形态学特征如图2所示：在MRS培养基上生长形成乳白色菌落，不透明，圆形，表面光滑，中央凸起，直径约为1.2～1.5mm。与原始菌株M9相比，本发明中的鼠李糖乳杆菌R7970菌落形态明显增大，菌落表面光滑，菌液发黏，产生大量黏性物质。

本实施例中进一步采用电镜观察鼠李糖乳杆菌R7970和其原始菌株M9，电镜对照图片如图3所示，通过图3的扫描电镜结果显示：鼠李糖乳杆菌R7970菌体表面粗糙度明显增加，细胞膜外有明显颗粒状物质，细胞壁与外层荚膜边界清晰，有明显荚膜多糖产生。

4、荚膜染色

荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖类，不易被染色，故常用衬托染色法，即将菌体和背景着色，而把不着色且透明的荚膜衬托出来。荚膜很薄，易变形，因此，制片时一般不用热固定。

具体操作步骤为:

a.涂片：在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水(或用接种环挑1-2滴水)，用无菌的接种环挑取少量菌种与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜，涂布面积约1cm²。

b.干燥：涂片在室温下使其自然干燥，也可以小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

c.固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过微火三次(手指触摸反面不烫手为宜)，待玻片冷却后，再加染色液。

d.染色：玻片置于玻片搁架上，加适量(以盖满菌膜为度)草酸铵结晶紫(或石炭酸复红染液)于菌膜部位，染色1-2min。

e.水洗：斜置载玻片，在自来水龙头(或洗瓶)下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

f.干燥：自然干燥或用吸水纸吸去涂片上的水，用吸水纸时切勿将菌体擦掉。

j.镜检：镜检结果如图4所示。

通过与原始菌株M9相比，本发明中的鼠李糖乳杆菌R7970，有明显荚膜产生。

5、菌株极端环境耐受性检测

通过比浊度来检测鼠李糖乳杆菌R7970在极低、极高pH的(MRS增菌液体培养基下，采用NaOH和HCl调整pH值)下的生长状况，如图6所示。通过比浊度来检测鼠李糖乳杆菌R7970在高盐浓度(MRS增菌液体培养基下，调整NaCl浓度)下的生长状况，如图5所示。通过比浊度来检测鼠李糖乳杆菌R7970在高温条件(MRS增菌液体培养基，调整培育温度)下的生长状况，如图7所示。

6、耐酸耐胆盐检测

将鼠李糖乳杆菌R7970培养液经离心(3000r/min，10min)收集菌体，用灭菌生理盐水离心洗涤2次，将其菌体悬浮于5mL灭菌生理盐水中制成菌悬液。然后，将乳杆菌菌悬液各1mL分别接种于含9mL过滤除菌处理的pH值为2.5的人工胃液中，并在37℃培养，在开始和培养0h、3h、7h分别取样，测定其活菌数。

然后取pH值为2.5的人工胃液中消化3h后的培养液1mL，分别接种于9mL过滤除菌的pH值为8.0的人工肠液中，继续置37℃下厌氧培养(BBL Gas park)，并分别在3h、7h测定活菌数，测定结果如下表1所示。

其中，人工胃液配制方法：NaCl 0.2g/100mL、胃蛋白酶(pepsin)0.35g/100mL，用浓度为1mol/L的HCl调整pH值为2.5后，过滤除菌备用。

人工肠液配制方法：将下述a液和b液以2∶1混合即为人工肠液。

a.胰腺液：重碳酸钠1.1g/100mL，NaCl0.2 g/100mL，胰蛋白酶(Trypsin)0.1g/100mL，调整pH值为8.0，过滤除菌备用。

b.胆汁液：Bile Salts(Difco)1.8g/100mL，调整pH值为8.0，过滤除菌备用。

表1

通过上述表1的结果表明，与鼠李糖乳杆菌Probio-M9(原始菌株M9)相比，人工胃液耐受性提高。

实施例2

一株具有高产黏的鼠李糖乳杆菌R7970在发酵乳制品中的应用。

将活化3代的鼠李糖乳杆菌R7970培养液(MRS增菌液体培养基培育得到的培养液，活菌数为1×10⁶cfu/mL)0.1mL接种到100g的脱脂乳中，脱脂乳由脱脂乳粉和水组成，其中脱脂乳粉：水的质量比为1:9，鼠李糖乳杆菌R7970培养液的总含量为3％。

发酵过程为：37℃静置发酵，每2小时测定一次发酵pH、滴定酸度和发酵黏度，如图8-图10所示。本实施例同时采用原始菌株M9作为对照。

通过测定结果可知，发酵乳在发酵15小时后即可达到发酵终点，进而可以得到鼠李糖乳杆菌R7970的发酵乳。且通过图8-图10的结果显示，在发酵过程中滴定酸度和pH均无显著变化，但在发酵12h时，黏度最高可达1600pa·s，进一步说明这株诱变菌株在发酵过程中可能产生更多的荚膜多糖。

实施例3

一株具有高产黏的鼠李糖乳杆菌R7970利用不同碳源和氮源进行发酵生产。

1、可利用碳源

采用不同碳源替换MRS增菌液体培养基里的碳源葡萄糖，用量与葡萄糖相同，进行37℃、24h培养后测定菌液OD₆₀₀值，检测结果如图11所示。通过图11的结果表明，鼠李糖乳杆菌R7970对D-果糖、乳糖、D-半乳糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖利用较多。

2、可利用氮源

采用不同氮源替换MRS增菌液体培养基里的氮源蛋白胨，用量与蛋白胨相同，进行37℃、24h培养后测定菌液OD₆₀₀值，检测结果如图12所示。通过图12的结果表明，鼠李糖乳杆菌R7970对酵母粉、大豆蛋白胨、牛肝浸粉利用较多。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (4)

1.一株鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）R7970在发酵中的应用，其特征在于，包括（b）-（c）中至少一种：

（b）在提高发酵产物产黏能力的应用；

（c）在提高发酵产物产荚膜多糖能力中的应用；

所述鼠李糖乳杆菌R7970，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 22244。

2.一株鼠李糖乳杆菌R7970在制备高产黏发酵乳制品中的应用，其特征在于，采用发酵菌剂对乳制品进行发酵得到，所述发酵菌剂包括一种鼠李糖乳杆菌R7970；所述鼠李糖乳杆菌R7970，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.22244；

所述发酵菌剂的用量为（1~9）×10⁶ cfu/ml。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，还包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌和其余鼠李糖乳杆菌中的一种或几种。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，

所述鼠李糖乳杆菌R7970的用量为（1~3）×10⁶ cfu/ml；

和/或，所述乳制品为豆乳和/或牛乳。