CN107217022A - 一株鼠李糖乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株鼠李糖乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)DY4，已于2017年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017279，保藏地址为中国武汉武汉大学。本发明的鼠李糖乳杆菌DY4能够耐受高盐度高酸度，进行香肠发酵时，能够有效抑制有害菌的生长，并且能有效改善干发酵香肠的风味和品质。

Description

一株鼠李糖乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株鼠李糖乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
我国传统发酵香肠因其独特的风味深受消费者青睐。传统的发酵生产不添加任何发酵剂，主要靠原料肉，香辛料，以及自身微生物菌群完成发酵和成熟。发酵周期较长且产品质量难以控制。肉类中加入食盐，硝酸盐以及香辛料，另外加工温度低，使得不耐盐菌，好氧菌等腐败菌难以生长。而上述环境乳酸菌正好能适应，并成为优势菌。
乳酸菌不但可以提升食品的营养价值，改善食品风味，并帮助改善食品的保藏性。还可以调节人体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，对人和动物健康都有益。近年来，在发酵过程中人工添加发酵剂可以获得很好的产品风味和质量，而乳酸菌因其优异的性能在食品生产方面被认为是良好的发酵剂。
但是在香肠发酵过程中盐度较高，一般乳酸菌对盐的耐受性较低，不能适用于香肠发酵。因此，筛选一株能耐受高盐度并改善香肠风味的乳酸菌对于香肠发酵具有重要意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明筛选得到一株能够在高盐浓度下仍能生长良好且能够改善香肠风味物质的鼠李糖乳杆菌，符合香肠发酵生产要求。
本发明的第一个目的是提供一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)DY4，所述鼠李糖乳杆菌DY4已于2017年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类学命名为鼠李糖乳杆菌DY4Lactobacillus rhamnosus DY4，保藏编号为CCTCC NO:M 2017279，保藏地址为中国武汉武汉大学。
在本发明的一种实施方式中，所述鼠李糖乳杆菌DY4能够利用半乳糖、麦芽糖、鼠李糖、甘露糖、可溶性淀粉、蔗糖、阿拉伯糖或木糖产酸。
在本发明的一种实施方式中，所述鼠李糖乳杆菌经革兰氏染色确定为革兰氏阳性菌，平板培养基菌落中等大小，凸起，白色湿润。
本发明的第二个目的是提供所述鼠李糖乳杆菌DY4在食品防腐中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是利用鼠李糖乳杆菌DY4抑制金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌在食品中繁殖。
本发明的第三个目的是提供所述鼠李糖乳杆菌DY4在香肠发酵中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是将鼠李糖乳杆菌以1-4％的添加量接种到原料肉中。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是在温度为35-45℃条件下发酵48h。
本发明的第四个目的是提供所述鼠李糖乳杆菌DY4在发酵肉制品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是利用鼠李糖乳杆菌DY4抑制有害菌生长，改善风味。
本发明的第五个目的是提供一种包含所述鼠李糖乳杆菌DY4的微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为固态菌剂或液态菌剂。
本发明有益效果
本发明的鼠李糖乳杆菌可以耐受高盐度和高酸度，能够有效的改善干发酵香肠的风味和品质，防止生产过程中有害菌的滋生，并且对人体无害优于添加食品防腐剂。添加本发明的鼠李糖乳杆菌发酵制作的干香肠外形良好，无污染，无破损，颜色均匀一致，有光泽，组织密致，有弹性，切片性能好，并且柔嫩鲜美，无异味，有淡淡的酸香味。
生物材料保藏
一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)DY4，已于2017年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类学命名为鼠李糖乳杆菌DY4Lactobacillus rhamnosusDY4，保藏编号为CCTCC NO:M 2017279，保藏地址为中国武汉武汉大学。
附图说明
图1是鼠李糖乳杆菌在平板培养基形态；
图2是鼠李糖乳杆菌生长曲线；
图3是鼠李糖乳杆菌生长过程中pH变化曲线；
图4是鼠李糖乳杆菌在不同pH下生长情况；
图5是鼠李糖乳杆菌耐胆盐情况；
图6是鼠李糖乳杆菌做发酵剂生产干发酵香肠的菌落变化。
具体实施方式
实施例1：菌株的筛选
本发明菌株采用平板稀释分离法从腊肠样品中分离筛选出抑菌效果好的菌株。
分离筛选方法如下所述：
1、混合菌种的稀释：购买的腊肠样品，取些许放入MRS培养基37℃培养24小时，并进行菌种的梯度稀释。
2、MRS培养基：蛋白胨10.0，牛肉膏8.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸三铵2.0，乙酸钠5.0，七水硫酸镁0.58，四水硫酸锰0.25，吐温801ml，蒸馏水1L，115℃灭菌20分钟。
3、菌株的初筛：取梯度稀释后的菌液100微升涂于初筛添加有溴甲酚紫的MRS固体培养基平板，37℃培养24小时。选择生长快、菌落大、黄色菌圈大的菌株，经过多次初筛，得到4株乳酸菌种，将其编号为DY4，DY7，DY8，DY9。
4、菌种的复筛：将初筛出来的3株菌接入到复筛液体培养基(蛋白胨10.0，牛肉膏8.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸三铵2.0，乙酸钠5.0，七水硫酸镁0.58，四水硫酸锰0.25，吐温801ml，蒸馏水1L，pH6.5)，37℃200rpm培养24h，采用牛津杯法测定其抑菌效果：取直径约90mm的平板，分别倾注加热融化的营养琼脂培养基18-20mL，使其在平板内均匀摊布，放置水平台面上使凝固，作为底层。另取半固体营养琼脂培养基(琼脂含量为1％)适量加热融化后，放冷至48-50℃，每50-100mL培养基加入指示菌菌悬液0.1-0.2mL，在每1个平板中分别加入5mL，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。在每1平板中以等距离均匀安置牛津杯4个备用，每个双层平板中的牛津杯中分别滴装200μL乳酸菌上清液，37℃培养18h后，测量各抑菌圈直径以作出评价。
5、最优菌种的筛选：DY4相对于DY7，DY8，DY9抑菌效果最佳。最终筛选出编号DY4的菌种作为保鲜菌株。
6、菌种的鉴定：将筛选出来的菌种DY2-DY4涂布于MRS固体培养基，挑取单菌落利用通用引物1492R和27F进行扩增，将扩增产物交由生工生物工程(上海)有限公司进行16SrRNA测序，序列所得结果通过NCBI的Nucleotide BLAST与Genbank中的模式菌株进行同源性比对。比对结果显示与Genbank中相关模式菌株的16sRNA有99％的相似性，确定该菌株为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。该菌已于2017年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017279，保藏地址为中国武汉武汉大学。
实施例2：鼠李糖乳杆菌DY4生理生化特征的鉴定
参照《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》(凌代文，1999)。
DY4菌株的生理生化特性见表1，表2，为石蕊牛奶，V-P实验阳性，淀粉水解、过氧化氢酶、硫化氢实验、葡聚糖、葡萄糖产气、精氨酸产氨、明胶液化呈阴性。能发酵利用麦芽糖，鼠李糖，D-半乳糖，甘露糖，阿拉伯糖产酸，产气。
表1DY4菌的生理特性
注：“-”表示阴性，“+”表示阳性。
表2DY4菌糖发酵结果
注：“+”表示强发酵，“d”表示略微发酵。
实施例3：鼠李糖乳杆菌DY4抑菌性研究
指示菌菌液的制备：将大肠杆菌、沙门氏菌和金黄葡萄球菌三种指示菌接种于LB液体培养基，37℃培养24h。
乳酸菌菌液制备：将保存管中的乳酸菌按2％的接种量接种于MRS液体培养基中进行活化，37℃下活化24h，再以1％的接种量转接于MRS液体培养基中，37℃培养24h，获得菌液。过程中测定鼠李糖乳杆菌的生长曲线和pH变化曲线，结果如图2和图3。
按照实施例1中牛津杯法测定抑菌效果。实验结果如表3所示。
表3乳酸菌抑菌效果比较
结果表明：鼠李糖乳杆菌DY4对大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌有良好的抑制作用且效果较好。
产酸测定：将活化三代的鼠李糖乳杆菌DY4，DY6，DY7接种至MRS培养基，37℃培养24-48小时后采用HPLC测定发酵液中的有机酸含量。在发酵过程中以乳酸，乙酸，这两种酸量最多，并对有害菌起主要抑制作用。结果如表4所示。
表4不同乳酸菌产酸量
结果表明：鼠李糖乳杆菌DY4相对于其他菌株乳酸产量较高，这也导致了它的抑菌效果优于其他两种，另外由于该菌产酸能力强，所以在制作香肠过程中要控制好菌株的接种量，防止过酸影响风味。
实施例4：鼠李糖乳杆菌肠胃耐受性检测
1、耐酸性实验：将活化培养三代的鼠李糖乳杆菌分别接种于pH为2，3，4的生理盐水中，在37℃培养2小时，观察生长情况。实验结果如图4所示。
2、菌株对不同pH值胃液的耐受性：将培养24h的菌液于6000rpm/min转速下离心，用灭菌的生理盐水洗涤两次，再用生理盐水重悬，并测定初始菌数。分别将菌液以10％的接种量加到pH为2，3，4的模拟胃液中，在37℃培养2-4h，观察生长状况。
3、菌株在模拟肠道实验：将培养24h的菌液于6000rpm/min转速下离心，用灭菌的生理盐水洗涤两次，再用生理盐水重悬，并测定初始菌数。分别将菌液以10％的接种量加到模拟肠液中，在37℃培养2h，4h，观察生长状况。
4、模拟胃液：首先用浓盐酸将1％氯化钠盐水pH值调至2，3，4，灭菌后将10g/L胃蛋白酶溶解到盐水中。过滤除菌待用。模拟肠液：取磷酸二氢钾6.8g，加蒸馏水500ml溶解，并用2mol/L氢氧化钠调pH为6.8，加水稀释至1000ml，每100ml加1g胰蛋白酶，充分溶解，过滤除菌待用。
表5鼠李糖乳杆菌菌株对不同pH值胃液的耐受性
表6DY4菌株在模拟肠液生长情况
结果表明：鼠李糖乳杆菌能够对模拟胃肠环境有很好的耐受性，其中DY4菌比另外两种鼠李糖乳杆菌对酸环境有更好的耐受性，通过该乳酸菌发酵香肠，食用后乳酸菌进入肠道，乳酸菌仍可以保持近107CFU/ml，优于与已报道的鼠李糖乳杆菌。对肠道有很好的保护作用。
实施例5鼠李糖乳杆菌耐胆盐实验
将活化三代的鼠李糖乳杆菌，分别接种于0，0.1％，0.3％，0.5％牛胆盐浓度的MRS液体培养基中，在37℃培养24小时，观察生长情况。测定结果如图5显示。
结果表明：当胆盐浓度为0.1％的时候菌落并未有太大变化，而当0.3％，0.5％的浓度使菌落数有明显的下降，但它的活菌数依然可以达到106CFU，证明鼠李糖乳杆菌DY4对胆盐有很好的耐受性。使得它能在高盐环境下继续生长，使得乳酸菌成为发酵过程中的优势菌。
实施例6鼠李糖乳杆菌耐高盐实验
配制含有NaCl(10g/L，20g/L，30g/L，40g/L，50g/L)的MRS液体培养基，115℃灭菌20分钟备用。以不含NaCl的MRS液体培养基作为参照，乳酸片球菌活化多次，以2％(v/v)的接种量接入上述培养基，37℃培养24小时，取样，测定不同浓度菌落变化。
表7不同乳酸片球菌耐高盐特性(单位CFU/mL)
结果表明：鼠李糖DY4乳杆菌有很好的耐高盐性使得在制作过程中，能够保持乳酸菌自身的正常生长。
实施例7：干发酵香肠的制备
原料制备：新鲜猪后腿肉馅1200g，食盐40g，味精20g，蔗糖20g，葱100g，姜100g，酵母粉10g，牛肉膏5g，乳糖20g，磷酸氢二钾2g，醋酸钠5g，500ml水。
菌液制备：将鼠李糖乳杆菌转接到MRS液体培养基，37℃培养24小时。获得菌液。
将鼠李糖乳杆菌以2％的接种量接种于原料肉中，按顺时针搅拌，至均匀粘稠为止，用绞肉机灌制，将肉馅连续灌入肠衣内。灌制完成后，排除两头空气，扎紧。将其在温度40℃，相对湿度高的环境中发酵48小时，然后至阴凉处干燥。
菌落数测定结果见图6，在前两天鼠李糖乳杆菌菌落数呈增长趋势，后期开始逐渐下降，在8天左右依然含有鼠李糖乳杆菌菌落数，表明鼠李糖乳杆菌在生产干发酵香肠的时候是优势菌株，有效的抑制了有害菌的生长。而过高的乳酸菌接种量会影响到干发酵香肠的口味，导致酸味明显，而2％的接种量最为适宜。
表8干发酵香肠感官评价
结果表明：通过鼠李糖乳杆菌发酵生产干香肠，一方面可以抑制病原菌和有害菌的生长，另外也使得滋味和风味有所改善。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一株鼠李糖乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 959
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ccacctgtca cttagacggc tcgctcccta aagggttacg ccaccggctt cgggtgttac 60
aaactctcat ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcgt 120
gctgatccgc gattactagc gattccgact tcgtgtaggc gagttgcagc ctacagtccg 180
aactgagaat ggctttaaga gattagcttg acctcgcggt ctcgcaactc gttgtaccat 240
ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca 300
ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtctta ctagagtgcc caactaaatg ctggcaacta 360
gtcataaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga 420
caaccataca ccacctgtca ttttgccccc gaaggggaaa cctgatctct caggtgatca 480
aaagatgtca agacctggta aggttcttcg cgttgcttcg aattaaacca catgctccac 540
cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg agtttcaacc ttgcggtcgt actccccagg 600
cggaatgctt aatgcgttag ctgcggcact gaagggcgga aaccctccaa cacctagcat 660
tcatcgttta cggcatggac taccagggta tctaatcctg ttcgctaccc atgctttcga 720
gcctcagcgt cagttacaga ccagacagcc gccttcgcca ctggtgttct tccatatatc 780
tacgcatttc accgctacac atggagttcc actgtcctct tctgcactca agtttcccag 840
tttccgatgc acttcctcgg ttaagccgag ggctttcaca tcagacttaa aaaaccgcct 900
gcgctcgctt tacgcccaat aaatccggat aacgcttgcc acctacgtat taccgcggc 959

Claims (10)

1.一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)DY4，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌DY4已于2017年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类学命名为鼠李糖乳杆菌DY4Lactobacillus rhamnosus DY4，保藏编号为CCTCC NO:M 2017279，保藏地址为中国武汉武汉大学。
2.权利要求1所述鼠李糖乳杆菌DY4在食品防腐中的应用。
3.权利要求2所述应用，其特征在于，所述应用是利用鼠李糖乳杆菌DY4抑制金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌在食品中繁殖。
4.权利要求1所述鼠李糖乳杆菌DY4在香肠发酵中的应用。
5.权利要求4所述应用，其特征在于，所述应用是将鼠李糖乳杆菌以1-4％的添加量接种到原料肉中。
6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述应用是在温度为35-45℃条件下发酵48h。
7.权利要求1所述鼠李糖乳杆菌DY4在发酵肉制品中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述应用是利用鼠李糖乳杆菌DY4抑制有害菌生长，改善风味。
9.一种包含权利要求1所述鼠李糖乳杆菌DY4的微生物菌剂。
10.权利要求9所述微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为固态菌剂或液态菌剂。
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