KR20070054670A - 위장계 내의 통증 완화의 특성을 가지는 호산성 젖산균주 - Google Patents

위장계 내의 통증 완화의 특성을 가지는 호산성 젖산균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 위장계 내의 통증 완화의 목적으로 인간 또는 동물들에게 투여되는 조력물질을 제조하기 위한 적어도 하나의 호산성 젖산균(Lactobacillus acidophilus)의 용도를 제공한다.
호산성 젖산균, 진통, 아편유사제, 대마초제제.

Description

위장계 내의 통증 완화의 특성을 가지는 호산성 젖산균주{STRAIN OF LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS HAVING ANALGESIC PROPERTIES IN THE GASTROINTESTINAL SYSTEM}
본 발명의 주제는 위장계에서의 통증완화목적으로 인간 또는 동물들에게 투여되는 지원을 제조하기 위해 적어도 하나의 호산성 젖산균(Lactobacillus acidophilus)을 이용하는 것에 관한 것이다.
미생물 가운데, 구체적으로는 박테리아 가운데 일부는 면역 체계에 긍정적인 영향을 가지는 것, 구체적으로는 젖산 박테리아 및 비피더스균(bifidobacteria)이 있으며 "장내 유익균(probiotic bacteria)" 또는 균주로 묘사된다.
일반적으로, 장내 유익균 또는 균주는 살아있는 채로 섭취되어 숙주의 건강 또는 생리학에 유리한 효과를 발휘하는 비병원성 미생물을 의미한다. 이러한 장내 유익균주는 일반적으로 소화관의 상부를 통과할 때 생존하는 능력을 지니고있다. 이들은 비병원성, 무독성이며 소화관 내에서 토박이 균무리와 생태적인 상호작용을 통하는 한편 "GALT"(장 관련 림프 조직)를 통해 긍정적인 방식으로 면역 체계에 영향을 끼침으로써 건강에 유리한 효과를 발휘한다. 장내 유익균의 정의에 의거, 이러한 박테리아들은 충분한 숫자가 제공될 때 장 통과시 삶을 유지하는 능력을 가지 나 장 내벽을 통과하지 못하며 이들의 주된 효능은 따라서 관내강 및/또는 위장관에 미친다. 이들은 이후 투여기간동안 토박이 균무리의 일부를 형성한다. 이러한 군체형성(또는 일시적인 군체형성)은 장내 유익균이 균무리에 존재하는 잠재적으로 병원성인 미생물 억제 및 장의 면역체계와의 상호작용 같은 유리한 효과를 발휘하도록 해준다.
가장 많이 특히 낙농제품에 사용되는 장내 유익균주는 주로 다음 속의 박테리아 및 이스트류이다: 젖산구균속(Lactobacillus spp .), 연쇄상구균속(Streptococcus spp .), 장구균속(Enterococcus spp .), 비피더스구균속(Bifidobacterium spp .) 및 사카로마이세스구균속(Sacharomyces spp .). 이러한 박테리아들에 의해 기록되는 장내 유익효과 중에서 예를 들면 락토오스 내성 향상, 위장 및 비뇨생식성 감염의 예방 및 치료, 암의 감소, 혈중 콜레스테롤 수치의 감소 등을 들 수 있다. 그러나, 상기 언급된 속의 모든 균주가 개별적으로 취해졌을 때 이러한 효과들을 가지는 것이 아니라 일부만이 그러하므로 신중하게 선택되어야 한다는 점이 강조되어야 한다.
제조업자로서의 요구조건을 만족시키기 위해서는 효과적인 균주 또는 균주혼합물을 발견하고 종종 장내 거북감으로 표현되는 장내단계에서 경험되는 고통, 구체적으로는 염증성 장내 증후군(irritable bowel syndrome: IBS) 또는 장내단P에서의 염증에 의해 유발되는 고통, 구체적으로는 대장염 또는 설사에 대한 해결책을 제공하는 것이 가능해야하는 것이 필수적이다.
따라서 본 발명이 해결하기 위해 제안하는 문제점은 진통 특성을 가진 장내 유익균의 균주를 제공하는 것이다.
이러한 목적으로 본 발명은 장내 체계에서의 진통 목적으로 인간 또는 동물에 투여되는 조력물질을 제조하기 위해 적어도 하나의 호산성 젖산균의 균주를 이용하는 것이다.
본 발명은 또한 다음 단계들을 포함하는 장내 체계에서의 진통 목적으로 인간 또는 동물에 투여되는 조력물질을 제조하기 위해 미생물을 선택하는 방법을 제공한다:
i) 실험될 미생물을 적어도 하나의 상피세포에 접촉하게 하는 단계;
ii) 최소 하나의 상피세포에서 아편유사제 수용체 및/또는 대마초제제 수용체의 발현을 검출하는 단계.
본 발명은 반론의 여지가 없고 유용한 균주의 범위를 넓히는 장점을 제공하는 장점이 있다.
본 발명은 장내체계에서 치료 또는 예방 목적을 위해 사용될 수 있는 다른 장점이 있다.
본 발명은 특히 장내체계에서 치료 또는 예방 목적, 특히 염증성 장내 증후군의 경우 경험되는 고통 또는 염증반응 또는 장내 염증의 제어에서 발생되는 고통을 위해 인간 또는 동물들에게 투여되었을 때 장점이 있다.
본 발명은 또한 치료 또는 예방 목적을 위해 인간 또는 동물들에게 투여되었을 때 소화 동력 및 분비를 조정함으로써 장내 통과를 제어하는 것을 가능하게 하는 다른 장점이 있다.
본 발명은 또한 약학적으로 수용가능한 조력물질 또는 식품으로 통합되었을 때 모든 특성을 보호하는 장점이 있다.
본 발명의 기타 장점 및 특성은 순수하게 묘사 및 비-제한적으로 제공되는 이후의 상세한 설명 및 실시예를 통해 명백할 것이다.
본 발명의 주제는 위장계 내의 진통목적으로 인간 또는 동물들에게 투여되는 조력물질을 제조하기 위해 적어도 하나의 호산성 젖산균의 균주를 이용하는 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 호산성 젖산균은 그람-양성(gram-positive) 균주이다. 바람직하게는 락트산의 생산을 증가시키는 동종발효성의 신진대사를 지닌 카탈라제-음성균주이다.
본 발명에 따라 사용된 호산성 젖산균주는 락타신(lactacin)과 같이 기타 미생물에 활성인 박테리오신(bacteriocin)도 생산할 수 있다.
바람직하게는, 산성 pH 조건하에서 펩신에 우수한 내성, 판크레아틴에 대한 우수한 내성 및 담즙산염에 대한 우수한 내성을 지닌 호산성 젖산균이다.
바람직하게는, "소수성"으로 묘사되는 호산성 젖산균, 즉 예를 들면 n-데칸, 클로로포름, 헥사데칸 또는 크실렌과 같은 극성 또는 비극성 소수성 유기용매들에 대해 강한 친화력을 가지는 것이 사용될 수 있다.
본 발명에서 선호되는 호산성 젖산균주는 호산성 젖산균 PTA-4797 및 NCFM이다. 호산성 젖산균의 호산성 젖산균주 PTA-4797은 부다페스트 조약에 의거 미국 표준균주 분양기관인 ATCC(American Type Culture Collection)에 Rhodia Chimie, 26, Quai Alphonse Le Gallo, 92 512 BOULOGNEBILLANCOURT Cedex France에 의해 등록번호 PTA-4797로 등록되어있다. 이 균주는 WO 2004052462에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 본 용도의 뼈대 내에서, 위장계의 진통은 바람직하게는 아편유사제 수용체 및/또는 대마초제제 수용체를 통해 조절된다.
기재된 아편유사제 수용체는 세개이다: δ, κ 및 μ이다. 이들은 7개의 횡막 헬릭스들로 구성된 G 단백질에 결합되는 수용체의 상과(superfamily)이다. 수용체의 세포내부분은 이와 결합되고 사용되는 작용제의 타입에 따라 다양할 수 있는 G 단백질에 접하나, 단백질 Gαi3>Gαi2>Gαi1로 우세하다.
아편유사제 수용체, 구체적으로 μ수용체는 몇 가지 기능을 지니고 있다. 주된 한가지는 혈색소수막벽(haematomeningeal barrier)을 통과하는 상기 수용체에 특이적인 β-엔돌핀 또는 몰핀 타입 제제를 사용함으로써 진통 역할을 수행하는 것이다. 상기 수용체의 소화관 내에서의 두번째 기능은 분비 및 소화 동력을 억제함으로써 장내 이동을 감소시키는 것이다. 최종적으로 아편유사제 수용체는 또한 장내 염증의 조절에 포함된다.
아편유사제에 대한 μ수용체는 중추 신경계 및 말초에도 존재한다. 이것의 존재는 인체의 생체 기관 대다수: 비장, 간, 신장, 소장 및 결장, 구체적으로는 점막밑 및 장간막 얼기뿐만 아니라 생체외의 림프구, 단핵세포/마크로파지 및 상피세포에서 검출된다.
CB1 및 CB2로 불리는 대마초제제 수용체는 7개의 횡막 헬릭스들로 구성된 G 단백질에 결합된 수용체의 상과에 속한다. 이들은 CB1을 위한 중추 및 말초 신경계 및 CB2를 위한 면역반응 세포에 의해 기본적으로 발현된다. 인간에 있어서, 상기 대마초제제 수용체의 두가지의 내부 리간드가 있는데, 이들은 내장 상피세포에 의해 자연적으로 생산된다.
내장 신경계에 의해 발현되는 대마초제제 수용체 CB1은 위 및 소장의 꿈틀운동 및 위 분비 억제의 완화 요인이 된다. 대마초제제 수용체의 기타 지사 및 항암 기능들이 추정된다.
본 발명에 따른 본 용도의 뼈대 내에서 위장계 내의 진통은 바람직하게는 아편유사제에 대한 μ수용체 및/또는 대마초제제 수용체 CB1 및/또는 수용체 CB2를 통해 중재된다.
본 발명에 따른 용도에 채용된 조력물질은 바람직하게는 약학적으로 수용가능한 조력물질 또는 식품이다.
약학적으로 수용가능한 조력물질은 특히 압축된 정(tablet), 캡슐, 연고, 좌약 또는 음용액을 의미한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 용도에 채용된 조력물질은 밀크를 기초로 한 식품 보충제(food supplement), 음료 또는 분말과 같은 식품이다. 바람직하게는 동물 또는 식물성 낙농제품이다.
낙농제품(dairy product)은 동물 및/또는 식물성 밀크를 포함하는 매체를 의미한다. 동물성 밀크로는 소, 양, 염소 또는 들소의 젖을 들 수 있다. 식물성 밀크로는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 식물성 발효가능한 물질, 구체적으로는 콩, 쌀 및 씨리얼을 들 수 있다.
더욱 바람직하게는 본 발명에 따라 채용되는 조력물질은 발효 밀크 또는 모유화 밀크(humanized milk)이다.
본 발명에 따른 조력물질을 제조하기 위해 사용되는 호산성 젖산균주는 냉동 전 또는 후의 박테리아성 서스펜션, 농축물 또는 건조, 냉동건조 또는 동결물 형태가 될 수 있다. 어떠한 형태로 사용되던지 균주는 냉동될 수 있다.
본 발명에 따라 조력물질을 제조하기 위해 사용되는 호산성 젖산균주는 건조 또는 동결건조 동안에 첨가되는 다른 첨가제를 함유할 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 호산성 균주는 106 내지 1012 박테리아CFU/조력물g, 바람직하게는 108 내지 1012 박테리아CFU/조력물g을 포함할 수 있다. CFU는 "콜로니 형성 유닛"을 의미한다. 조력물의 g은 바람직하게는 식품 또는 약학적으로 수용가능한 조력물을 의미하며, 바람직하게는 동결건조 형태로는 109 내지 1012 CFU/g이다.
본 발명에 따른 조력물질을 제조하기 위해 사용되는 호산성 젖산균주는 락트산의 박테리아와의 혼합물 형태가 될 수 있다. 본 발명에 따라 적합할 듯한 락트산의 박테리아는 농산물 또는 의약산업에 보통 채용되는 모든 락트산 박테리아를 포함한다.
본보기로, 가장 사용되고 발효에 존재하는 락트산 박테리아는 락토커쿠스(Lactococcus)속, 연쇄상구균(Streptococcus)속, 젖산균(Lactobacillus)속, 류코노스톡(Leuconostoc)속, 페디오커쿠스(Pediococcus)속, 비피더스균(Bifidobacterium)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 카르노박테리움(Carnobacterium)속, 엔테로커쿠스(Enterococcus)속, 미크로커쿠스(Micrococcus)속, 바고커쿠스(Vagococcus)속, 스타필로커쿠스(Staphylococcus)속, 막대균(Bacillus)속, 코쿠리아(Kocuria)속, 아트로박터(Arthrobacter)속, 프로프리오니박테리움(Proprionibacterium)속 및 코리네박테리움(Corynebacterium)속에 속하는 것들이다. 이러한 락트산 박테리아들은 단독으로 또는 혼합되어 사용된다. 상기 목록은 완전한 것은 아니다.
본 발명의 주제는 다음 단계를 포함하는 위장계내의 진통 목적으로 인간 또는 동물들에게 투여되는 조력물질을 제조하기 위해 미생물을 선택하는 방법이다:
i) 실험될 미생물을 적어도 하나의 상피세포에 접촉시키는 단계;
ii) 적어도 하나의 상피세포 내에서 아편유사제 수용체 및/또는 대마초제제 수용체의 발현을 검출하는 단계.
단계 i) 또는 ii)에 사용되는 상피세포 또는 세포들은 바람직하게는 통상 HT-29 라인으로 불리는 세포주(cell line) ATCC HTB-38, 또는 세포주 Caco-2로부터 선택된다. 이들은 결장(colon)암 세포주들이다. 이들은 또한 인체에 대한 수술로부터 대상의 생체검사법을 통해 분리되고 정제된 세포가 될 수 있다.
단계 i)은 바람직하게는 적어도 하나의 상피세포와 실험될 미생물 108 내지 1012 CFU를 사용해 수행될 수 있다.
단계 i)에서 접촉 시간은 0 내지 24시간 사이에서 다양할 수 있는데, 바람직하게는 3시간이다.
일반적으로, 단계 i)에 따라 세포와 접촉하도록 하는 단계는 당업자에게 공지된 표준온도, 조제된 대기 및 무균조건, 특히 상피세포 배양조건 하에서 수행된다.
본 발명에 따른 단계 ii)의 선택 공정은 바람직하게는 아편유사제의 μ수용체(MOR) 및/또는 CB1 수용체 및/또는 CB2 수용체의 발현을 검출함으로써 수행된다. 전형적으로는, 단 하나의 수용체의 발현이 검출될 수 있다: MOR 단독, CB1 수용체 단독 또는 CB2 수용체 단독. 선택적으로는, 두 수용체의 발현이 검출될 수 있다: MOR과 CB1 수용체; MOR과 CB2 수용체; CB1 수용체와 CB2 수용체. 선택적으로는 세개의 수용체의 발현이 검출될 수 있다: MOR, CB1수용체 및 CB2 수용체.
본 발명에 따른 단계 ii)의 공정은 바람직하게는 아편유사제 수용체 및/또는 대마초제제 수용체의 메신저 RNA의 발현, 선택적으로는 그 수치를 검출하는 단계로, 예를 들면 PCR, 특히 정량 PCR 또는 면역조직화학에 의해 수행된다. 해당분야에서 당업자에게 공지된 기타 mRNA 검출기술 및 장치가 사용될 수 있다.
도 1은 시간의 함수로서 다른 4 미생물에 의한 자극 동안 ATCC HTB-38 상피 세포내에서 발현되는 아편유사제에 대한 μ수용체의 메신저 RNA 발현 동역학을 나 타내고 있다.
도 2는 시간의 함수로서 다른 3 미생물에 의한 자극 동안 ATCC HTB-38 상피 세포내에서 발현되는 CB1 수용체의 메신저 RNA 발현 동역학을 나타내고 있다.
도 3은 시간의 함수로서 다른 4 미생물에 의한 자극 동안 ATCC HTB-38 상피 세포내에서 발현되는 CB2 수용체의 메신저 RNA 발현 동역학을 나타내고 있다.
도 4는 다른 조건 하에서의 MOR mRNA 발현을 나타내고 있다.
도 5는 처리되지 않은 생쥐들 및 호산성 젖산균 처리된 생쥐들의 결장 TNF 알파 mRNA 발현을 나타내고 있다.
도 6은 처리되지 않은 생쥐들 및 호산성 젖산균 처리된 생쥐들의 결장 KC mRNA 발현을 나타내고 있다.
도 7은 처리되지 않은 생쥐들 및 호산성 젖산균 처리된 생쥐들의 IL-1 베타 mRNA 발현을 나타내고 있다.
도 8, 10, 12는 면역염색처리된 상피세포들을 나타내고 있다.
도 9, 11, 13은 면역염색처리된 상피세포들의 백분율(%)을 나타내고 있다.
실시예 1
1/상피세포의 제조
5%의 CO2를 함유하고 있는 37℃의 대기중에서 결장암 세포주 HT-29(ATCC HTB-38)이 DMEM 배양액에서 각각 20 및 10%의 태아 소 혈청으로 희석되었다. ATCC HTB-38 세포주는 실험될 미생물의 서로다른 균주와 1; 3; 4; 8; 18; 또는 24시간 동안 접촉되었다. ATCC HTB-38 상피세포는 이후 mRNA 및 아편유사제의 μ수용체 및/또는 대마초제제의 수용체의 단백질을 정량하는 것이 가능하도록 채취되어 액체 질소에 담가 졌다.
2/ 아편유사제의 μ수용체 및/또는 대마초제제의 수용체의 메신저 RNA 검출 및 정량
실시간 PCR
배양액 내의 상피세포주들의 총 RNA는 컬럼 추출 키트(Macherey-Nagel)에 의해 유리되었다. 간단히 말하면, 1%의 β-메르캅토-에탄올을 함유하는 용해버퍼 내로 분쇄되고, 모든 불필요물질을 제거하도록 제1타입의 컬럼을 통과시켰다. DNA 분해효소(DNase)로 처리한 후 RNA는 실시간 PCR(ABPrism 7000, Perkin)에 의해 증폭된 상보적인 DNA로 아편유사제의 μ수용체 또는 대마초제제의 수용체에 특이적인 프라이머를 이용하여 60℃의 혼성화 온도에서 역전사되었다:
- 아편유사제의 μ수용체(MOR)(센스: ATgCCAgTgCTCATCATTAC, 안티센스: gATCCTTCgAAgATTCCTgTCCT) 및 레퍼런스 유전자: β-액틴(센스:TCACCCACACTgTgCCCATCTACgA, 안티센스: CAgCggAACCgCTCATTgCCAATg);
- CB1 대마초제제 수용체 센스: CCT AGA TGG CCT TGC AGA TAC C; CB1 안티센스: TGT CAT TTG AGC CCA CGT ACA G; CB2 센스: GCT AAG TGC CCT GGA GAA CGT; CB2 안티센스: TCA GCC CCA GCC AAG CT.
3/결과
실험결과는 도 1 내지 3에 나타내었다. 실험결과는 목적 유전자(β-액틴)/아편유사제의 μ수용체(MOR) 및/또는 대마초제제 수용체(CB1, CB2) 사이의 비율로 표현되었다.
아편유사제의 μ수용체 및/또는 대마초제제 수용체는 ATCC HTB-38 상피세포주 내에서 발현되었다(도 1 내지 3).
젖산균주(Lactobacillus strain)와 같은 일부 미생물은 아편유사제의 μ수용체 및/또는 대마초제제 수용체의 mRNA의 발현을 유발할 수 있다.
실험결과는 배양액 내의 상피세포들에 의해 아편유사제의 μ수용체 및/또는 대마초제제 수용체의 발현을 현저하게 유발하였음을 보여준다.
상기 유발은 호산성 젖산균주에 대해 특히 강했다.
도 1 및 2는 상피세포들을 호산성 젖산균주와 3시간 동안 배양시킨 후 아편유사제의 μ수용체(도 1) 및 CB1 수용체(도 2)의 mRNA의 기초 발현 수치에서 약 1000배의 증가가 관찰되었음을 보여준다.
도 3은 상피세포들을 호산성 젖산균주와 3시간 동안 배양시킨 후 CB2 수용체(도 3)의 mRNA의 기초 발현 수치에서 약 100배의 증가가 관찰되었음을 보여준다.
이와 반대로, 공생 대장균(E. coli)과는 아편유사제의 μ수용체의 유발이 검출되지 않았다(도 1). 호산성 젖산균주에 의한 아편유사제의 수용체 및/또는 대마초제제 수용체의 유발은 10ng/ml의 TNF-α에 의해 획득된 것과 같은 양이었다.
실시예 2
1/물질 및 방법
박테리아 균주. 본 발명에 따른 호산성 젖산균 NCFM 균주가 deMan, Rogosa Sharpe (MRS) broth(Becton Dickinson) 내에서 37℃로 밤새 혐기성으로 배양되었다. 시험관 실험을 위해 박테리아는 대수증식기(exponential phase)에 다다른 때 사용되었다. 배양 순도는 동물 접종에 앞서 그람 염색법으로 평가되었다.
동물 및 임상 감염. 동물실험은 라일(Lille)의 공인된 시설 파스퇴르 인스티튜트에서 정부 지침에 따라 수행되었다. Balb/c 생쥐는 우리당 5마리씩 수용되었고 12시간 일광 사이클 아래 자유로운 표준 생쥐 사료 및 물꼭지가 제공되었다. 동물들은 14일간 위 튜브 급식에 의해 하루 한번씩 0.5% CMC(카복시메틸 셀룰로오스, Sigma)에 재서스펜션화된 호산성 젖산균주 109 CFU를 주입받았다. 동물들은 경추골절로 희생시켰다. 동물들로부터 모든 결장을 적출하여 두 부분으로 절단하였다. 한 조각은 4%의 파라포름알데히드 산에 밤새 고정시켜 파라핀에 담갔다. 결장의 두번째 조각은 아편유사제의 μ수용체(MOR), 대마초제제의 수용체(CB1, CB2) 및 염증 TNFα, KC 및 IL-1β mRNA의 정량에 사용되었다.
TNBS 결장염 유발 및 연구 설계. MOR의 발현이 염증에 의해 조절되기 때문에(Philippe D 등, JCI 2003; Pol O 등, Mol Pharmacol 2001; Pol O 등, Curr Top Med Chem 2004), TNBS 유발 결장염을 양성 대조군으로 사용하였다. 동물실험은 파스퇴르 인스티튜트의 공인된 시설에서 정부지침에 따라 수행되었다. 동물들은 우리 당 5마리씩 수용되었고 자유로운 표준 생쥐 사료 및 물꼭지가 제공되었다. 결장유발을 위해 생쥐들은 90 내지 120분간 마취되었고, 0.9% NaCl과 100% 에탄올의 1:1 혼합물에 용해된 TNBS(40㎕, 150mg/kg)를 결장내 투여하였다. 대조군은 0.9% NaCl과 100% 에탄올의 1:1 혼합물 또는 식염수를 동일한 방법으로 주입하였다. 동물들은 TNBS 투여 4일 후 희생시켰다.
정량적인 실시간 PCR
제조사의 지시에 따라 Rneasy 키트(Macherey Nagel, Hoerdt, 프랑스)를 이용해 총 RNA가 전체 결장 조직으로부터 유리되었다. RNA 정량은 분광 광도계를 이용해 수행되었다. 20 내지 50 단위의 RNA 분해효소가 없는 DNA 분해효소 I(로셰 다이애그노스틱스 코포레이션, 인디애나폴리스, 미국)와 37℃에서 30분간 처리한 후, 단일 가닥의 cDNA를 함성하기 위해 올리고-dT 프라이머(로셰 다이애그노스틱스 코포레이션, 인디애나폴리스, 미국)가 사용되었다. SYBR 그린 마스터 믹스(Applera, Courtaboeuf, 프랑스)와 특이적인 생쥐 올리고핵산염을 이용하여 GeneAmp Abiprism 7000(Applera, Courtaboeuf, 프랑스)에서 mRNA를 정량하였다. 각 분석물에는 조정되고 주형이 없는 대조군이 포함되었다. 각 샘플은 3배화되었다. SYBR 그린 염색강도는 Abiprism 7000 SDS 소프트웨어(Applera, Courtaboeuf, 프랑스)를 이용해 분석되었다. 모든 결과는 감염되지 않은 관리유전자(housekeeping gene) β-액틴에 대해 표준화되었다.
유전자 프라이머 시퀀스 (5'→3')
β-액틴 S : 5'-gggTCAgAAggATTCCTATg-3' AS: 5'-ggTCTCAAACATgATCTggg-3'
MOR S : 5'-CCG GCA GCC CTT CCA-3' AS: 5'-GAG GCC CAC TAC ACA CAC GAT-3'
CB1 S : 5'-GCC CGC ATG GAC ATT AGG-3' AS: 5'-AGG GCC CCA GCA GAT GA-3'
CB2 S : 5'-CTC AAT TTT TT GGT CCC TAT G-3' AS: 5'-AGT CTG GCA CCG CTA AAC AAG-3'
TNF 알파 S : 5'-TgggAgTAgACAAggTACAACCC-3' AS: 5'-CATCTTTCTCAAAATTCgAgTgACAA-3'
IL-1 베타 S : 5'-gATCCACACTCTCCAgCTgCA-3' AS: 5'-CAACCAACAAgTgATATTCTCCATg-3'
KC S : 5'-ggCgCCTATCgCCAATg-3' AS: 5'-CTggATgTTCTTgAggTgAATCC-3'
MOR - CB1 - CB2 면역조직화학
면역조직화학은 호산성 젖산균주를 주입받은 생쥐들의 파라핀에 담근 결장 섹션들에 수행되었다. 처리되지 않은 동물들이 대조군으로 사용되었다. 0.1%의 4℃ 트리톤 X-100을 함유하는 PBS에서 5분간 투과화(permeabilisation)시킨 후, 섹션들은 1.5%의 일반 염소 혈청에서 15분간 및 비특이적인 항체의 흡수를 최소화하기 위해 차단버퍼(밀크 내의 1% BSA)에서 15분간 배양되었다. 조직들은 이어서 CB1(1:200, Cayman 케미컬, Ann Arbor, 미국) 또는 CB2(1:10, 알파 다이애그노스틱, 샌안토니오, 미국) 또는 MOR(1:500, Diasorin, Antony, 프랑스)에 지정된 토끼의 다클론성 일차항체와 실온에서 2 내지 12시간 동안 배양되었다. 섹션들은 이후 FITC 플루오로크롬(fluorochrome)에 결합된 Alexa 488 염소항-토끼 IgG(1:100 희석, Dako Laboratories, Trappes, 프랑스)와 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 각 단계 사이에 섹션들은 0.05% 트리톤 X-100을 함유한 PBS에서 5분간 세척되었다. 이후 슬라이드는 Hoescht 용액(0.125mg/ml)로 대조염색되고 현미경에 장착되었다. 음성 대조군은 특이적 항체 대신에 일반 토끼 혈청으로 염색한 것으로 구성되었다. 형광현미경(Leica, Bensheim, 독일) 아래에서 면역형광이 밝혀졌다. 면역반응된 상피세포의 MOR, CB1, CB2의 숫자는 5가지의 다른 고배율시야(high power field: HPF)에서 계수되었고, 상피세포 100개당에 대하여 표시되었다.
2/결과:
실험결과는 도 4 내지 13에 나타내었다.
1) 호산성 젖산균이 생체 내에서 유발한 생쥐의 결장 내의 MOR mRNA 발현 (도 4)
2주간의 호산성 젖산균 투여(하루당 109CFU) 후, 비처리된 동물에 비해 결장 내에서 MOR mRNA 발현에 24배의 증가가 있었다(p<0.05). 이러한 호산성 젖산균주에 의한 MOR mRNA의 유발은 TNBS에 의해 유발되는 결장염(도 4)에 상응하는 양성 대조군에서 발견되는 두 배의 증가에 비해 더욱 중요하다.
2) 호산성 젖산균이 생체 내에서 유발한 생쥐의 결장 내의 MOR , CB1 및 CB2 의 발현 (도 8 내지 13)
번역단계에서 MOR, CB1 및 CB2를 결장의 상피세포에 특이적으로 평가하기 위해 이들의 수용체들에 특이적으로 지정된 항체를 이용한 면역조직화학을 수행하였다. 모든 섹션들에서 MOR(60±10 vs 5±3%), CB1(60±8 vs 20±4%) 및 CB2(40±7 vs 20±5%)의 염색된 상피세포들은 대조 생쥐들에 비해 호산성 젖산균주를 주입받은 생쥐들에서 현저하게 많았다(도 8 내지 13). 녹색 착색은 관내 박테리아와 접촉한 상피조직의 표면에 위치한 상피세포에 주로 국한되었다. 제 1 항체 또는 무관한 항체를 생략한 대조군은 음성이었다.
3) 호산성 젖산균의 투여는 생쥐 결장 내의 염증 사이토카인 발현의 감소와 연관있다 (도 5 내지 7)
결장 상피세포에 의한 호산성 젖산균 유발 MOR, CB1 및 CB2 발현이 생쥐들에게 현저한 영향이 있는지 평가하기 위해 비처리된 생쥐와 14일간 호산성 젖산균주를 주입받은 생쥐의 다른 염증 사이토카인의 mRNA 수치를 비교하였다. 대조군에 비해 호산성 젖산균 처리된 동물들에서 50% 이상 감소된 염증 사이토카인 TNFα, KC 및 IL-1β mRNA 발현 수치가 관찰되었는데, 이는 호산성 젖산균주가 생쥐의 결장 내의 염증 사이토카인의 물리적 발현을 적어도 부분적으로는 상피세포에 의한 MOR, CB1 및 CB2의 과현상을 통해 감소시킨다는 것을 가리킨다.
실시예 3
1/물질 및 방법
생체 내에서, 결장 상피세포 HT-29 또는 Caco-2가 0 내지 6시간 동안 다른 장내 유익균 또는 박테리아(100박테리아:세포)와 함께 배양되었다: 호산성 젖산균(NCFM), L. 살리바리우스 ( UCC118 ), L. 파라카세이 ( LPC37 ), 공생 대장균, 유착성-침습성 대장균(LF82). 장내 유익균에 의한 아편유사제의 μ수용체(MOR) 및 대마초제제의 수용체(CB1 ,CB2)의 발현 유발에서의 NF카파B 반응의 역할은 특이적 억제제, 카페인산 펜에틸에스테르(CAPE)에 의해 HT-29 세로를 사전처리 함으로써 시험되었다. 결합된 G 단백질의 발현 유발자인 TNF알파(10ng/ml, 2시간)가 양성 대조군으로 사용되었다. 수용체들(MOR, CB1 ,CB2)의 체외 발현 유도를 위해 가장 효과적인 장내 유익균을 선택한 후, 15일 동안 109CFU의 장내 유익균을 경구 투여함으로써 BAlb/c 생쥐(n=10)로 체내 연구가 실시되었다. 실시간 PCR 및 면역조직화학에 의해 상피세포 및 생쥐 결장내에서 MOR, CB1 및 CB2의 발현이 평가되었다. 염증 사이토카인(TNFα, KC 및 IL-1β) mRNA는 실시간 PCR에 의해 생쥐 결장 내에서 평가되었다.
2/결과
호산성 젖산균주 및 L.살리바리우스의 균주만이 이미 배양의 첫시간부터 상피세포 내의 강한 MOR 발현을 재빨리 유도할 수 있었다. 이러한 발현유도는 TNF알파 유도 세포에서 관찰된 발현유도와 유사했다. CB1(848±180 vs 229±55, p<0.05) 및 CB2(1498±333 vs 341±163, p<0.01)에 대해, 오직 호산성 젖산균만이 이러한 수용체들의 발현을 유도하였다. CAPE에 의한 NF카파B 반응의 억제는 호산성 젖산균에 의해 일어난 상피세포의 MOR 발현의 변화를 유발하지 않았다. 체내에서, 호산성 젖산균은 MOR mRNA의 발현(24±0.75, p<0.01)을 장내 단계에서 강하게 유도한다. 면역조직화학에 의한 연구를 통해 호산성 젖산균을 주입받은 동물의 결장세포에 의한 MOR, CB1 및 CB2의 발현의 체내 유발이 확인되었다. 이러한 수용체들의 유발은 결장내 염증 사이토카인 발현의 적어도 50%의 감소와 연관된다.
3/결론
호산성 젖산균은 체외 상피세포주 및 체내 결장에서 MOR, CB1 및 CB2의 발현을 유발하는 가장 효과적인 균주이다.
본 명세서 내에 포함되어 있음.
SEQUENCE LISTING <110> DANISCO A/S <120> Strain of Lactobacillus acidophilus having analgesic properties in the gastrointestinal system <130> BCT050283 <150> FR0409966 <151> 2004-09-21 <160> 22 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 1 atgccagtgc tcatcattac 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 2 gatccttcga agattcctgt cct 23 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 3 tcacccacac tgtgcccatc tacga 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 4 cagcggaacc gctcattgcc aatg 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 5 cctagatggc cttgcagata cc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 6 tgtcatttga gcccacgtac ag 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 7 gctaagtgcc ctggagaacg t 21 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 8 tcagccccag ccaagct 17 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 9 gggtcagaag gattcctatg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 10 ggtctcaaac atgatctggg 20 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 11 ccggcagccc ttcca 15 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 12 gaggcccact acacacacga t 21 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 13 gcccgcatgg acattagg 18 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 14 agggccccag cagatga 17 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 15 ctcaattttt ctggtcccta tg 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 16 agtctggcac cgctaaacaa g 21 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 17 tgggagtaga caaggtacaa ccc 23 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 18 catctttctc aaaattcgag tgacaa 26 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 19 gatccacact ctccagctgc a 21 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 20 caaccaacaa gtgatattct ccatg 25 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 21 ggcgcctatc gccaatg 17 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide as primer <400> 22 ctggatgttc ttgaggtgaa tcc 23

Claims (9)

  1. 위장계 내의 통증완화 목적으로 인간 또는 동물들에게 투여되는 조력물질을 제조하기 위한 적어도 하나의 호산성 젖산균(Lactobacillus acidophillus)주의 용도.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 호산성 젖산균주는 ATCC에 PTA-4797로 등록된 균주 및 호산성 젖산균 NCFM으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 통증완화는 아편유사제 수용체 및/또는 대마초제제 수용체를 통해 조절되는 것을 특징으로 하는 용도.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 투여되는 조력물질은 약학적으로 수용가능한 조력물질 또는 식품인 것을 특징으로 하는 용도.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 투여되는 조력물질은 동물 또는 식물의 낙농제품인 것을 특징으로 하는 용도.
  6. i)시험될 미생물을 적어도 하나의 상피세포와 접촉시키는 단계;
    ii)적어도 하나의 상피세포 내에서의 아편유사제 및/또는 대마초제제의 수용체의 발현을 검출하는 단계
    를 포함하는 위장계 내의 통증완화 목적으로 인간 또는 동물들에게 투여되는 조력물질을 제조하기 위해 미생물을 선별하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 i) 또는 ii)단계의 적어도 하나의 상피세포가 ATCC HTB-38 세포주 또는 Caco-2 세포주로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 ii)단계는 아편유사제의 μ수용체 및/또는 CB1 및/또는 CB2 수용체를 검출함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ii)단계는 아편유사제 수용체 및/또는 대마초제제 수용체들의 메신저 RNA를 검출함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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