FR2875406A1 - Souche de lactobacillus acidophilus ayant des proprietes analgesiques au niveau du systeme gastro-intestinal - Google Patents

Souche de lactobacillus acidophilus ayant des proprietes analgesiques au niveau du systeme gastro-intestinal Download PDF

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Abstract

L'invention propose l'utilisation d'au moins une souche de Lactobacillus acidophilus pour préparer un support administré à l'homme ou à des animaux dans un but analgésique au niveau du système gastro-intestinal.

Description

SOUCHE DE LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS AYANT DES PROPRIETES
ANALGESIQUES AU NIVEAU DU SYSTEME GASTRO-INTESTINAL
La présente invention a pour objet l'utilisation d'au moins une souche de Lactobacillus acidophiles pour préparer un support administré à l'homme ou à des animaux dans un but analgésique au niveau du système gastrointestinal.
Parmi les microorganismes, en particulier parmi les bactéries, certains ont une influence positive sur le système immunitaire, notamment les bactéries lactiques et les bifidobactéries, et sont qualifiées de bactéries ou souches probiotiques .
D'une manière générale, par bactérie ou souche probiotique, on entend un microorganisme non pathogène qui ingéré vivant, exerce un effet bénéfique sur la santé ou la physiologie de l'hôte. Ces souches probiotiques ont généralement la capacité de survivre au passage à travers la partie supérieure du tube digestif. Elles sont non pathogènes, non toxiques et exercent leur action bénéfique pour la santé, d'une part via les interactions écologiques avec la flore résidente du tube digestif et d'autre part via leur capacité à influencer le système immunitaire de manière positive sur le GALT ( tissu immunitaire associé à l'intestin) . Selon la définition des probiotiques, ces bactéries lorsqu'elles sont données en nombre suffisant ont la capacité de progresser vivantes le long de l'intestin, cependant elles ne traversent pas la barrière intestinale et leurs effets primaires se situent donc au niveau de la lumière et/ou de la paroi du tractus gastro-intestinal. Elles font alors parties de la flore résidente pendant la période d'administration. Cette colonisation (ou colonisation transitoire) permet aux bactéries probiotiques d'exercer un effet bénéfique, tel que la répression de micro- organismes potentiellement pathogènes présents dans la flore et des interactions avec le système immunitaire de l'intestin.
Les souches probiotiques les plus utilisées, notamment dans les produits laitiers, sont principalement des bactéries et des levures, des genres suivants Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Bifidobacterium spp. et Sacharomyces spp.. Parmi les effets probiotiques répertoriés pour ces bactéries, on peut citer par exemple l'amélioration de la tolérence au lactose, la prévention ou le traitement d'infections gastrointestinales et urogénitales, la réduction de cancers, la réduction du taux de cholestérol sanguin. Toutefois il faut mettre l'accent sur le fait que toutes les souches des genres décrits plus haut, prises individuellement, n'ont pas ces effets mais seulement certaines d'entreelles qui doivent être soigneusement selectionnées.
Afin de répondre aux exigences des industriels il est devenu nécessaire de trouver des souches ou mélange de souches qui soient performantes et qui permettent d'apporter une solution aux douleurs ressenties au niveau gastro-intestinal, et souvent exprimées comme un inconfort intestinal, en particulier le syndrome de l'intestin irritable (encore appelé IBS pour Irritable Bowel Syndrome en langue anglaise), ou aux douleurs provoquées par l'inflammation au niveau gastro-intestinal, en particulier au cours de colites ou de diarrhées.
Aussi le problème que se propose de résoudre la présente invention est de fournir une souche de bactéries probiotiques ayant des propriétés analgésiques.
Dans ce but la présente invention propose l'utilisation d'au moins une souche de Lactobacillus acidophilus pour préparer un support administré à l'homme ou à des animaux dans un but analgésique au niveau du système gastro-intestinal.
L'invention propose également un procédé de sélection d'un microorganisme pour préparer un support administré à l'homme ou à des animaux dans un but analgésique au niveau du système gastro-intestinal comprenant les étapes suivantes: i) mettre en contact le microorganisme à tester avec au moins une cellule épithéliale; ii) détecter l'expression des récepteurs opioïdes et / ou des récepteurs cannabinoïdes au niveau d'au moins une cellule épithéliale.
L'invention a pour avantage de proposer des vertus indiscutables et qui viennent enrichir la palette des souches disponibles.
L'invention a pour autre avantage de pouvoir être utilisée dans un but thérapeutique ou prophylactique au niveau du système gastro-intestinal.
L'invention est particulièrement avantageuse lorsqu'elle est administrée à l'homme ou à des animaux dans un but thérapeutique ou prophylactique au niveau du système gastro-intestinal, notamment au niveau de la réduction de la douleur ressenties dans le cas du syndrome de l'intestin irritable ou dans le cas de la douleur provoquée par des réactions inflammatoires ou au niveau de la régulation de l'inflammation intestinale.
L'invention est également avantageuse car elle permet de réguler le transit intestinal en modulant la sécrétion et la motricité digestive, lorsqu'elle est administrée à l'homme ou à des animaux dans un but thérapeutique ou prophylactique.
La présente invention a encore pour avantage de conserver toutes ses propriétés lorsqu'elle est incorporée dans un support pharmaceutiquement acceptable ou dans un produit alimentaire.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront clairement à la lecture de la description et des exemples donnés à titre purement illustratifs et non limitatifs qui vont suivre.
La présente invention a pour objet l'utilisation d'au moins une souche de Lactobacillus acidophilus pour préparer un support administré à l'homme ou à des animaux dans un but analgésique au niveau du système gastrointestinal.
Le Lactobacillus acidophilus utilisé selon l'invention est une souche Gram-positif. Avantageusement il s'agit d'une souche catalase négative, avec un métabolisme homofermentaire donnant lieu à la production d'acide lactique.
Le Lactobacillus acidophilus utilisé selon l'invention peut également produire une bactériocine, comme par exemple la lactacine, active contre d'autres microorganismes.
De préférence il s'agit d'un Lactobacillus acidophilus présentant une bonne résistance à la pepsine, dans des conditions de pH acide, une bonne résistance à la pancréatine et une bonne tolérance aux sels biliaires.
De préférence, on utilisera un Lactobacillus acidophilus qualifié d'hydrophobe c'est à dire qui présente une forte affinité pour les solvants organiques hydrophobes polaire ou non polaire, comme par exemple le n-Décane, le chloroforme, l'hexadécane ou le xylène.
Le Lactobacillus acidophilus préféré selon l'invention est le Lactobacillus acidophilus PTA-4797. Cette souche de Lactobacillus acidophilus a été déposée par Rhodia Chimie, 26, quai Alphonse Le Gallo, 92 512 BOULOGNE-BILLANCOURT cedex France, conformément au Traité de Budapest auprès de la Collection américaine des Cultures de Microorganismes (ATCC) où elle est enregistrée sous le numéro de dépôt PTA-4797.
Dans le cadre de la présente utilisation selon l'invention, l'analgésie au niveau du système gastro-intestinal est avantageusement médiée via les récepteurs opioïdes et / ou les récepteurs cannabinoïdes.
Les récepteurs aux opioïdes décrits sont au nombre de trois: S, x, et p. Ils appartiennent à la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G qui sont composés de sept hélices transmenbranaires. La partie intracellulaire du récepteur est en contact avec la protéine G qui lui est associée et qui peut varier selon le type d'agonistes utilisés avec toutefois une prédominance pour les protéines Gai3>Gai2>Gaii.
Les récepteurs aux opioïdes, en particulier le récepteur p, ont plusieurs fonctions. La principale est un rôle analgésique mis en évidence par l'utilisation d'agonistes spécifiques de ce récepteur passant la barrière hémato-méningée du type 13-endorphine ou morphinique. La seconde fonction de ce récepteur au niveau du tractus digestif est de diminuer le transit intestinal en inhibant la sécrétion et la motricité digestive. Enfin, les récepteurs aux opioïdes sont également impliqués dans la régulation de l'inflammation intestinale.
Le récepteur p pour les opioïdes est présent dans le système nerveux central mais également en périphérie. Sa présence a été détectée dans la majorité des organes vitaux de l'organisme humain: la rate, le foie, le rein, l'intestin grêle, et le colon en particulier dans le système nerveux intestinal au niveau des neurones des plexus sous-muqueux et mésentériques, mais également, in vitro, au niveau des lymphocytes, des monocytes/macrophages et des cellules épithéliales.
Les récepteurs aux cannabinoïdes, appelés CB1 et CB2, appartiennent à la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G qui sont composés de sept hélices transmenbranaires. Ils sont exprimés essentiellement par le système nerveux central et périphériques pour CB1 et les cellules de la réponse immunitaires pour CB2. II existe deux ligands endogènes de ces récepteurs aux cannabinoïdes, chez l'humain, qui sont produits naturellement par les cellules épithéliales intestinales.
Les récepteurs aux cannabinoïdes CB1 exprimés par le système nerveux entérique seraient à l'origine d'un ralentissement du péristaltisme de l'estomac et de l'intestin grêle et d'une inhibition de la sécrétion gastrique. D'autres fonctions anti- diarréhiques et anti-cancéreuses des récepteurs aux cannabinoïdes sont supposées.
Dans le cadre de la présente utilisation selon l'invention, l'analgésie au niveau du système gastro-intestinal est médiée de préférence via les récepteurs pour les opioïdes et / ou les récepteurs CB1 et / ou les récepteurs CB2.
Le support mis en oeuvre au cours de l'utilisation selon l'invention est de préférence un support pharmaceutiquement acceptable ou un produit alimentaire.
Par support pharmaceutiquement acceptable, on entend entre autre un support sous forme de comprimés, de tablettes, de gellules, de pommades, de suppositoires ou de solutions buvables.
De préférence le support mis en oeuvre au cours de l'utilisation selon l'invention est un produit alimentaire tel qu'un complément alimentaire, une boisson ou une poudre à base de lait. De préférence il s'agit d'un produit laitier d'origine animale ou végétale.
Par produit laitier on entend un milieu comprenant du lait d'origine animale et/ou végétale. A titre de lait d'origine animale on peut citer le lait de vache, de brebis, de chèvre, ou de bufflesse. A titre de lait d'origine végétale on peut citer toute substance fermentescible d'origine végétale qui peut être utilisée selon l'invention notamment provenant de graine de soja, de riz ou de céréales.
Encore plus préférentiellement le support utilisé selon l'invention est un lait fermenté ou un lait maternisé.
La souche de Lactobacillus acidophilus utilisée pour préparer un support selon l'invention peut se présenter sous forme d'une suspension bactérienne, avant ou après congélation, sous forme de concentrés, soit sous forme sèche, lyophilisée, ou congelée. En effet quelle que soit la forme utilisée, la souche peut être congelée.
La souche de Lactobacillus acidophilus utilisée pour préparer un support selon l'invention peut contenir différents additifs ajoutés au cours de son séchage ou au cours 35 de sa lyophilisation.
La souche de Lactobacillus acidophilus utilisée selon l'invention peut comprendre de 106 à 1012 CFU de bactéries / g de support, et plus particulièrement de 106 à 1012 CFU de bactéries / g de support. Le terme CFU signifie colony forming units selon l'expression technique anglaise. Par gramme de support, on entend de préférence le produit alimentaire ou le support pharmaceutiquement acceptable, et de préférence 109 à 1012 CFU I g pour la forme lyophilisée.
La souche de Lactobacillus acidophilus utilisée pour préparer un support selon l'invention peut se présenter sous forme d'un mélange avec des bactéries lactiques. Les bactéries lactiques susceptibles de convenir selon l'invention incluent toutes les bactéries lactiques usuellement mises en oeuvre dans l'industrie agro-alimentaire ou pharmaceutique.
A titre indicatif les bactéries lactiques les plus utilisées, et qui sont présentes dans les ferments, sont celles appartenant aux genres Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Bifidobacterium, Brevibacterium, Carnobacterium, Enterococcus, Micrococcus, Vagococcus, Staphylococcus, Bacillus, Kocuria, Arthrobacter, Proprionibacterium et Corynebacterium. Ces bactéries lactiques sont utilisées seules ou en mélanges. Cette liste n'est pas exhaustive.
L'invention a également pour objet un procédé de sélection d'un microorganisme pour préparer un support administré à l'homme ou à des animaux dans un but analgésique au niveau du système gastro-intestinal comprenant les étapes suivantes: i) mettre en contact le microorganisme à tester avec au moins une cellule épithéliale; ii) détecter l'expression des récepteurs opioïdes et / ou des récepteurs cannabinoïdes au niveau d'au moins une cellule épithéliale.
La ou les cellules épithéliales mises en oeuvre au cours des étapes i) ou ii) proviennent de préférence de la lignée cellulaire ATCC HTB-38, communément appelée lignée HT-29. Il s'agit d'une lignée cellulaire de cancer du côlon. Il peut également s'agir de cellules isolées et purifiées à partir de biopsie de pièces opératoires humaines.
L'étape i) est réalisée en mettant en oeuvre de préférence de 106 à 1010 CFU de microorganismes à tester avec au moins une cellule épithéliale.
La durée de mise en contact, au cours de l'étape i), peut varier de 0 heure à 24 heures, et est de préférence de 3 heures.
D'une manière générale, la mise en contact des cellules selon l'étape i) se fait dans les conditions classiques de températures, d'atmosphères modifiées et de stérilité bien connues pour l'homme du métier, en particulier dans les conditions de culture in vitro des cellules épithéliales.
L'étape ii) du procédé de sélection selon l'invention est réalisée en détectant de préférence l'expression des récepteurs pour les opioïdes et / ou des récepteurs CB1 et I ou des récepteurs CB2.
L'étape ii) du procédé de sélection selon l'invention est réalisée de préférence en détectant l'expression, et éventuellement son niveau, de l'ARN messager des récepteurs opioïdes et / ou des récepteurs cannabinoïdes, par exemple par PCR entre autre par PCR-quantitiative, ou par immunohistochimie. D'autres techniques bien connues de l'homme du métier pour la détection de l'ARNm et son dosage peuvent être utilisées.
La figure 1 représente la cinétique de l'expression de l'ARN messager des récepteurs la pour les opioïdes en fonction du temps, qui sont exprimés au niveau de cellules épithéliale ATCC HTB-38 au cours de la stimulation par 4 microorganismes différents.
La figure 2 représente la cinétique de l'expression de l'ARN messager des récepteurs CB1 en fonction du temps, qui sont exprimés au niveau de cellules épithéliale ATCC HTB-38 au cours de la stimulation par 3 microorganismes différents.
La figure 3 représente la cinétique de l'expression de l'ARN messager des récepteurs CB2 en fonction du temps, qui sont exprimés au niveau de cellules épithéliale ATCC HTB-38 au cours de la stimulation par 3 microorganismes différents.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. 20 EXEMPLES: Il Préparation des cellules épithéliales: 1-1) La lignée cellulaire de cancer du côlon HT-29 (ATCC HTB-38) est cultivée en milieu DMEM avec respectivement 20 et 10% de sérum de veau foetal à 37 C dans une atmosphère contenant 5% de CO2. La lignée ATCC HTB- 38 est mise en contact avec les différentes souches de microorganismes à tester pendant 1; 3; 4; 8; 18 ou 24 heures. Les cellules épithéliales ATCC HTB-38 sont ensuite récupérées et plongées dans l'azote liquide pour permettre de quantifier l'ARNm et la protéine des récepteurs pour les opioïdes et l ou des récepteurs cannabinoïdes.
2/ Mise en évidence et quantification de l'ARN messagers des récepteurs la pour les opioïdes et I ou des récepteurs cannabinoïdes: 2-1/ PCR en temps réel: L'ARN total des lignées de cellules épithéliales en culture est isolé par l'utilisation d'un kit d'extraction sur colonne (Macherey-Nagel). Brièvement, les cellules sont broyées dans du tampon de lyse contenant 1% de 13-mercapto-éthanol puis passés sur un premier type de colonne permettant l'élimination de l'ensemble des déchets. Après traitement par la DNAse, l'ARN sera rétro-transcrit en ADN complémentaire amplifié par PCR en temps réel (ABPrism7000, Perkin) à une température d'hybridation de 60 C en utilisant des amorces spécifiques pour les récepteurs pour les opioïdes ou les récepteurs cannabinoïdes: - pour les récepteurs pour les opioïdes Sens: ATgCCAgTgCTCATCATTAC, Antisens: gATCCTTCgAAgATTCCTgTCCT) et pour le gène de référence: la 13- actine (S: TCACCCACACTgTgCCCATCTACgA, AS: CAgCggAACCgCTCATTgCCAATg) ; - pour les récepteurs cannabinoïdes CB1 Sens CCT AGA TGG CCT TGC AGA TAC C; CB1 Anti-sens TGT CAT TTG AGC CCA CGT ACA G; CB2 Sens GCT AAG TGC CCT GGA GAA CGT; CB2 Anti-sens TCA GCC CCA GCC AAG CT.
Les résultats sont exprimés par le rapport entre le gène cible (R-actine) / récepteurs p. pour les opioïdes et I ou récepteurs cannabinoïdes.
31 Résultats: Les résultats sont présentés aux figures 1 à 3.
Les récepteurs pour les opioïdes et l ou les récepteurs cannabinoïdes sont exprimés au niveau de la lignée de cellules épithéliales ATCC HTB-38 (figures 1 à 3).
Certains microorganismes tels que la souche Lactobacillus acidophilus PTA4797 sont capables d'induire l'expression de l'ARNm des récepteurs pour les opioïdes et / ou des récepteurs cannabinoïdes.
Les résultats montrent une induction significative des récepteurs pour les opioïdes et / ou des récepteurs cannabinoïdes par les cellules épithéliales en culture.
Cette induction est particulièrement forte avec la souche Lactobacillus acidophilus PTA-4797.
Les figures 1 et 2 indiquent qu'au bout de 3 heures d'incubation des cellules épithéliales avec le Lactobacillus acidophilus PTA-4797, on observe une augmentation d'environ 1000 fois du niveau d'expression basale de l'ARNm des récepteurs pour les opioïdes (figure 1) et CB1 (figure 2).
La figure 3 indique qu'au bout de 3 heures d'incubation des cellules épithéliales avec le Lactobacillus acidophilus PTA-4797, on observe une augmentation d'environ 100 fois du niveau d'expression basale de l'ARNm des récepteurs CB2 (figure 3).
A l'inverse, aucune induction des récepteurs pour les opioïdes n'a été mise en évidence avec une souche E. col/ commensale (figure 1). L'induction des récepteurs opioïdes et l ou des récepteurs cannabinoïdes par la souche Lactobacillus acidophilus PTA-4797 est du même ordre de magnitude que celle obtenue par le TNF-a à la dose de 10ng/ml.

Claims (9)

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'au moins une souche de Lactobacillus acidophilus pour préparer un support administré à l'homme ou à des animaux dans un but analgésique au niveau du système gastro-intestinal.
2. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que la souche de Lactobacillus acidophilus est la souche déposée à I'ATCC sous le numéro PTA-4797.
3. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'analgésie est médiée via les récepteurs opioïdes et / ou les récepteurs cannabinoïdes.
4. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le 15 support administré est un support pharmaceutiquement acceptable ou un produit alimentaire.
5. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le support administré est un produit laitier d'origine animale ou végétale.
6. Procédé de sélection d'un microorganisme pour préparer un support administré à l'homme ou à des animaux dans un but analgésique au niveau du système gastro-intestinal comprenant les étapes suivantes: i) mettre en contact le microorganisme à tester avec au moins une cellule épithéliale; ii) détecter l'expression des récepteurs opioïdes et / ou des récepteurs cannabinoïdes au niveau d'au moins une cellule épithéliale.
7. Procédé selon la revendication 6 caractérisée en ce que au moins une cellule 30 épithéliale de l'étape i) ou ii) provient de la lignée cellulaire ATCC HTB-38.
8. Procédé selon l'une des revendications 6 à 7 caractérisée en ce que l'étape ii) est réalisée en détectant l'expression des récepteurs pour les opioïdes et 1 ou des récepteurs CB1 et / ou des récepteurs CB2.
9. Procédé selon l'une des revendications 6 à 8 caractérisée en ce que l'étape ii) est réalisée en détectant l'expression de l'ARN messager des récepteurs opioïdes et 1 ou des récepteurs cannabinoïdes.
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