KR100357668B1 - 헬리코박터 필로리에 대해 항균활성을 갖는 락토바실러스애시도필러스 에이치 와이 2177, 락토바실러스 카제이에이치 와이2743 및 그를 이용한 유산균 제제, 발효유 - Google Patents

헬리코박터 필로리에 대해 항균활성을 갖는 락토바실러스애시도필러스 에이치 와이 2177, 락토바실러스 카제이에이치 와이2743 및 그를 이용한 유산균 제제, 발효유 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헬리코박터 필로리에 대해 항균활성을 갖는 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177, 락토바실러스 카제이 HY 2743 및 그를 이용한 유산균 제제, 발효유에 관한 것으로서, 위염, 위궤양의 원인균으로 알려진 헬리코박터 필로리에 대해 항균활성, 우레아제활성억제, 위내 정착억제, 인터루킨-8 생성억제 능력을 갖으며, 나아가 이를 이용하여 발효유, 유산균식품, 정장제 등의 제품으로 제조하여 섭취할 경우, 헬리코박터 필로리의 감염에 의한 위염, 위궤양, 십이지장궤양의 예방과 치료가 가능한 효과를 갖는다. 또한, 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743이 함께 하였을 경우에는 항균활성에 있어 유기적인 상승효과 즉, 시너지 효과가 있다.

Description

헬리코박터 필로리에 대해 항균활성을 갖는 락토바실러스 애시도필러스 에이치 와이 2177, 락토바실러스 카제이 에이치 와이 2743 및 그를 이용한 유산균 제제, 발효유{Lactobacillus acidophilus HY 2177, Lactobacillus casei HY 2743 having antibiotic activation for Helicobacter pylori and Lactobacillus product thereof}
본 발명은 위궤양의 원인균으로 알려진 항균활성을 갖는 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177, 락토바실러스 카제이 HY 2743 및 그를 이용한 유산균 제제, 발효유에 관한 것이다.
일반적으로 만성 위십이지장 질병과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려진 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)는 1983년 워렌(Warren)과 마샬(Marshall)이 환자의 위 유문부로부터 분리하여 보고되었다(J. R. Warren and B. J. Marshall : Lancet, 1273-1275, 1988). 상기 헬리코박터 필로리는 위점막 상피세포간 접합부에서 서식하면서 만성적인 위궤양을 유발하는 그람(Gram) 음성 간균으로서, 위점막에서 만곡형 또는 S자형의 간균으로 관찰되며, 크기는 0.4∼1.25㎛ 정도이다. 헬리코박터 필로리의 가장 특이한 생화학적 특성은 요소를 암모니아와 이산화탄소로 분해하는 효소(urea amidohydrolase)인 우레아제(urease)의 매우 강한 생산능이 있다는 것이다. 따라서, 상기 헬리코박터 필로리 균은 위점막의 혈장 삼출액이나 조직액내에 있는 요소를 분해하여 균체주위를 알칼리성으로 만듦으로써 위내 강산을 중화하는 것으로 알려져 있다.
상기 헬리코박터 필로리의 또 다른 특징은 균체의 한쪽 혹은 양쪽에 막으로 둘러싸인 플라겔라(flagella)가 하나씩 또는 타래뭉치로 존재하고 있어서 끈적끈적한 환경에서도 이동할 수 있다는 것이다. 헬리코박터 필로리의 운동성은대장균(E. coli)이 움직일 수 없는 점도를 가진 점액보다 약 20배 이상의 점액에서도 움직일 수 있는 것으로 알려져 있다. 이런 특성 때문에 살리실레이트(salicylate)나 에탄올(ethanol) 같은 화합물 외에는 침투하기가 어려운 위점액층을 뚫고 들어갈 수 있고 점액내에서도 자유로이 이동하면서 위상피세포의 접합부에 쉽게 부착할 수 있는 것으로 알려져 있다.
헬리코박터 필로리의 정확한 오염경로나 전염원에 대하여서는 아직까지 정확히 증명된 바는 없지만 경구적 방법에 의하여 전달·감염되는 것으로 추정되고 있다. 또한, 우리나라 성인의 약 80%정도가 이 균에 감염되었으나 임상증상을 나타내지 않고 있다가, 어떠한 발병촉진인자의 영향으로 만성적인 위십이지장 궤양을 유발하는 것으로 알려져 있다. 이런 위궤양, 위염, 십이지장 궤양의 치료제로는 시메티딘, 라니티딘, 파모티딘 등의 H2 수용체 길항제, 오메프라졸 등의 프로톤 펌프 저해제 등이 있다. 이들은 치료효과는 높지만 주로 위산 분비 억제에 대한 약리작용을 가지고 있어 재발율도 높다. 이는 헬리코박터 필로리를 직접 제거하지 않기 때문으로 추정되고 있다.
이에, 1994년 2월 NIH에서는 헬리코박터 필로리 감염환자에게 초기 또는 재발 여부에 상관없이 위산 분비 억제제에 부가적인 항균제 치료를 권고하고 있다. 또한, 헬리코박터 필로리의 제균이 소화성 궤양의 새로운 치료법으로 대두되고 있다. 나아가, 최근에는 비스무스 제제, 아목시실린, 메트로니다졸 또는 비스무스 제제, 테트라사이클린, 메트로니다졸을 소화성 궤양환자에 동시에 투여하는 삼중요법을 통해 80% 내외의 치료효과를 얻었다는 보고가 있다.
그러나 상기한 항생제 치료는 일반적인 감염증 치료에 사용되는 항생제보다 많은 양이 처방되며 투여기간도 대부분 장기간이여서 새로운 내성균주가 나타날 위험성이 높으며, 부작용의 발생 가능성도 내재한다.
따라서 최근에는 항생물질을 대신하여 천연물이나 유산균을 이용한 헬리코박터 필로리의 제균이 시도되고 있다. 태백(Tabak) 등은 백리향(thyme)에서(J. of Applied Bacteriology, 1996, 80, 667∼672), 디커(Diker)와 하셀릭(Hascelik)은 차(tea)로부터 헬리코박터 필로리에 대한 항균활성을 보고하였으며(Letters in Applied Microbiology, 1994, 19, 299∼300), 미돌로(Midolo) 등은 유산균으로부터(J. of Applied Bacteriology, 1995, 79, 475∼479), 바티아(Bhatia) 등은 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus)로부터 헬리코박터 필로리에 대한 항균활성을 확인하였다(J. of Clinical Microbiology, 1989, Oct., 2328∼2330). 네슬레는 락토바실러스 애시도필러스 균주를 헬리코박터 필로리 제균을 위한 항 위염제, 항 궤양제에 이용하였으나(JP 94-98782), 바졸리(Bazzoli) 등은 20명을 대상으로 한 임상실험에서 네슬레의 락토바실러스 애시도필러스를 8주간 장기투여한 결과 헬리코박터 필로리의 제균에 유효성 있는 결과를 얻지 못한 것으로 보고하였다(Gastroenterology, 1992, 102, A38). 와가모도 제약주식회사는 프로바이오틱스로서 락토바실러스 살리바리우스와 락토바실러스 브레비스를 항위염제, 항궤양제 및 발효식품의 유효성분으로 이용하였다(JP 97-241173).
그러나 상기 특허의 경우는 위내정착성과 위염발생기작 중의 인터루킨-8 생성억제에 대한 결과로 헬리코박터 필로리에 대한 항균활성이나 우레아제 활성억제 등 헬리코박터 필로리에 대한 직접적인 제균 효과에는 접근하지 못하는 문제점이 있었다.
이에 본 발명은 상기한 문제점을 감안하여 이를 해결하고자 이루어지게 된 것으로서, 본 발명의 목적은 위염, 위궤양의 원인균으로 알려진 헬리코박터 필로리에 대해 항균활성, 우레아제활성억제, 위내 정착억제, 인터루킨-8 생성억제 능력을 갖는 유산균을 제공하고, 이를 유효성분으로 한 위염, 위궤양, 십이지장궤양의 예방과 치료제를 제공하는 데에 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 헬리코박터 필로리에 대해 항균활성을 갖는 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177, 락토바실러스 카제이 HY 2743 및 그를 이용한 유산균 제제는 사람으로부터 분리, 보존되고 있는 락토바실러스속, 비피도박테리움속, 엔테로코커스속의 유산균 중에서 국내 위궤양환자로부터 분리한 헬리코박터 필로리 KS 51 균주에 대한 항균활성을 갖는 유산균을 선발하고, 상기 선발된 유산균들에 대해 헬리코박터 필로리의 우레아제 활성억제 능력과 위내 정착성 억제능력을 갖는 유산균을 재선발하고, 헬리코박터 필로리에 의한 위염발생 기작에 관계하는 인터루킨-8의 생성억제 능력을 비교 측정하여 최종 선발한 것이다.
도 1은 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743에 의한 헬리코박터 필로리 우레아제 활성억제율을 비교 도시한 그래프,
도 2는 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743의 헬리코박터 필로리 위내 정착억제 효과를 도시한 그래프,
도 3a 및 도 3b는 각각 헬리코박터 필로리 감염에 의해 유도되는 인터루킨-8 생성에 대한 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743의 억제효과를 도시한 그래프,
도 4는 헬리코박터 필로리에 대한 항균활성에 있어서 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743의 혼합배양에 의한 상승효과를 도시한 그래프이다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.
본 발명자들은 사람으로부터 분리, 보존하고 있던 락토바실러스속, 비피도박테리움속, 엔테로코커스속의 유산균 중에서 국내 위궤양환자로부터 분리한 헬리코박터 필로리 KS 51 균주에 대한 항균활성을 갖는 유산균을 선발하였다. 이 유산균들에 대해 헬리코박터 필로리의 우레아제 활성억제 능력과 위내 정착성 억제능력을 갖는 유산균을 재선발하였다. 그리고 헬리코박터 필로리에 의한 위염발생 기작에 관계하는 인터루킨-8의 생성억제 능력을 비교 측정하여 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177(Lactobacillus acidophilusHY 2177, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC 11142호, 기탁년월일 : 2000. 2. 11.)과 락토바실러스 카제이 HY 2743(Lactobacillus caseiHY 2743, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁번호 : KFCC 11143호, 기탁년월일 : 2000. 2. 11.)을 최종 선발하였다.
균주 특성
락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743을 앰알에스(MRS) 배지에서 37℃, 24시간 배양했을 때의 생리학적 특성을 이하의 표 1에 나타내었다.
락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743의 생리학적 특성
락토바실러스 애시도필러스HY 2177 락토바실러스 카제이HY 2743
세포의 형태 간균 간균
그람 염색 양성 양성
집락 형태크기색조 원형직경 0.5∼2.0mm유백색 원형직경 0.5∼1.5mm유백색
우유 응고성카탈라제베타-갈락토오스 분해효소알라-글루코오스 분해효소산소의 영향 +-+-통성혐기성 +-++통성혐기성
당 이용성에리스리톨리보스아도니톨갈락토오스글루코오스프럭토오스만노스람노스만니톨솔비톨알부틴에스큘린살리신세로비오스말토오스락토오스멜리비오스슈크로오스트레할로스이눌린멜레지토스라피노스아미돈투라노오스타가토오스아라비톨 -+-++++-+++++++++++++----- -++++++-++++++++-++-+--++-
항균활성
락토바실러스 애시도 필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743을 12% 탈지분유에 0.1% 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후, 억제환 방법에 따라 헬리코박터 필로리에 대한 항균활성을 측정하였다. 그 결과 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177는 약 18.9±1.5 mm의 억제환을, 락토바실러스 카제이 HY 2743은 약 14.2±1.0 mm의 억제환을 나타내 다른 유산균에 비해 헬리코박터 필로리에 대한 항균활성이 높다. (후술하는 실시예 1 참조)
그리고 락토바실러스 애시도필러스 HY2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743의 혼합배양이 헬리코박터 필로리에 대한 항균활성이 단독배양에 비해 항균활성에 있어 상승효과를 가져옴을 확인하였다. (후술하는 실시예 6 참조)
헬리코박터 필로리 우레아제 활성억제 효과
락토바실러스 애시도 필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743을 12% 탈지분유에 0.1% 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후, △pH 방법에 의해 헬리코박터 필로리 우레아제 활성억제효과를 측정하였다. 락토바실러스 애시도 필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743이 헬리코박터 필로리 우레아제 활성을 약 90% 정도 억제하는 것으로 나타났다. (후술하는 실시예 2 참조)
헬리코박터 필로리의 위내 정착억제 효과
락토바실러스 애시도 필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743을 12% 탈지분유에 0.1% 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 헬리코박터 필로리가 위상피 세포인 AGS 세포에 정착할 때 이 유산균 배양액의 정착 억제효과를 예방과 치료측면에서 측정하였다. 예방측면에서 AGS 세포에 유산균을 먼저 투여한 후 헬리코박터 필로리를 감염시킨 경우, 락토바실러스 애시도 필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743이 70% 이상의 정착억제율을 나타내었다. 치료측면에서 AGS 세포에 헬리코박터 필로리를 먼저 감염시키고 유산균을 투여한 경우는 락토바실러스 애시도 필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743이 50% 이상의 정착억제율을 나타냈다. (후술하는 실시예 3 참조)
헬리코박터 필로리 감염에 의해 유도되는 인터루킨-8 생성억제 효과
헬리코박터 필로리의 감염에 의해 유도, 생성되는 인터루킨-8에 대해 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743의 억제 효과를 ELISA방법(Quantikine™ Human IL-8 Immunoassay kit, R&D systems Europe Ltd.)으로 측정하였다. 그 결과 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743이 헬리코박터 필로리와 함께 배양된 경우는 헬리코박터 필로리 감염에 의해 유도 생성되는 IL-8의 양을 약 85%와 90% 이상 억제하는 것으로 나타났다. (후술하는 실시예 4 참조)
동물실험을 통한 헬리코박터 필로리 감염 억제효과 확인
헬리코박터 필로리 감염에 대한 유산균의 예방과 치료효과를 4주령의 BALB/c 마우스를 통해 확인하였다. 그 결과 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743을 먼저 투여하여 헬리코박터 필로리의 감염을 예방한 경우, 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177 균주는 생균수와 우레아제 활성 측정 결과 각각 93%와 90%의 예방율을 나타냈다. 락토바실러스 카제이 HY 2743의 경우는 생균수와 우레아제 활성 측정 결과 모두 90%의 예방율을 나타냈다.
또한, 헬리코박터 필로리를 먼저 감염시킨 후 선발유산균을 투여한 치료측면에서, 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177를 투여한 경우 생균수와 우레아제 활성 측정 결과 각각 87%와 83%의 치료율을 나타냈다. 락토바실러스 카제이 HY 2743을 투여하여 감염된 헬리코박터 필로리를 제균한 경우는 생균수와 우레아제 활성 측정 결과 각각 83%와 77%의 치료효과를 확인하였다.
따라서, 헬리코박터 필로리의 감염에 대해 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743을 사용한다면 높은 예방, 치료효과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명이 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능함은 물론이다.
실시예 1
헬리코박터 필로리에 대한 항균활성을 갖는 유산균의 분리
정장제와 발효유에 사용되는 유산균을 대상으로 헬리코박터 필로리에 대한 항균활성을 비교하였다. 유산균의 헬리코박터 필로리에 대한 항균활성 측정에는 실린더법(cylinder method)을 사용하였다. 유산균은 12% skim milk에 106 cfu/ml의 농도로 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 먼저 판(plate)당 4개의 실린더(cylinder)를 세우고 실린더(cylinder) 바깥쪽에 브루셀라 한천(brucella agar)을 25ml씩 부어주고 응고시켰다. 109 cfu/ml의 헬리코박터 필로리를 블루셀라 한천(brucella broth)에 현탁하여 3㎖의 블루셀라 소프트 한천(brucella soft agar)에 170㎕씩 가하였다. 헬리코박터 필로리를 가한 블루셀라 소프트 한천(brucella soft agar)을 먼저 제작한 배지 위에 부어준 후 37℃ CO2 배양기에서 응고시켰다. 실린더(Cylinder)를 제거하고 홀(hole)에 유산균 배양액 170㎕를 가하였다. 37℃ CO2 배양기에서 24∼48시간 배양한 후 나타난 억제환의 크기를 측정, 비교하였다. 이때 실린더(cylinder)는 지름이 8.1㎜의 것을 사용하였다.
이하의 표 2에서 보는 바와 같이 락토바실러스 의 경우는 균주에 따라 차이가 있으나 대부분의 균주가 헬리코박터 필로리에 대해 항균활성을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 그러나 비피도박테리아(Bifidobacteria)와 스트렙토코커스(Streptococcus)의 경우는 항균활성이 나타나지 않았다. 락토바실러스 중에서는 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177이 18.9±1.5, 락토바실러스 애시도필러스 HY 2185가 15.6±1.7, 락토바실러스 카제이 HY 2743이 14.2±1.0, 락토바실러스 플란타룸 HY 2207이 13.8±0.9의 억제환을 보였다. 따라서 헬리코박터필로리에 대해 우수한 항균활성을 나타내는 유산균주로 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177, 락토바실러스 애시도필러스 HY 2185, 락토바실러스 카제이 HY 2743, 락토바실러스 플란타룸 HY 2207을 선발하였다.
헬리코박터 필로리에 대한 유산균의 항균활성 (n=6)
Strains Average±S.D.(mm) Strains Average ±S.D.(mm)
Lactobacillus acidophilusHY 2105 9.5±0.3 Enterococcus faeciumHY 4127 8.1±0.0
Lactobacillus acidophilusHY 2177 18.9±1.5 Enterococcus faeciumHY 4104 8.1±0.0
Lactobacillus acidophilusHY 2109 8.9±0.6 Enterococcus fecalisHY 4393 8.1±0.0
Lactobacillus acidophilusHY 2185 15.6±1.7 Enterococcus fecalisHY 4326 8.1±0.0
Lactobacillus acidophilusHY 2122 8.1±1.1 Streptococcus thermophilusHY 7006 8.1±0.0
Lactobacillus bulgaricusHY 2345 9.2±0.7 Streptococcus thermophilusHY 7014 8.1±0.0
Lactobacillus bulgaricusHY 2350 8.7±1.2 Lactococcus lactisHY 7229 8.1±0.0
Lactobacillus caseiHY 2726 9.8±0.5 Lactococcus lactisHY 7241 8.1±0.0
Lactobacillus caseiHY 2772 9.2±0.3 Bifidobacterium longumHY 8012 8.1±0.0
Lactobacillus caseiHY 2743 14.2±1.0 Bifidobacterium longumHY 8077 8.1±0.0
Lactobacillus gaceriHY 2992 9.8±0.2 Bifidobacterium longumHY 8001 8.1±0.0
Lactobacillus cryspatusHY 2830 8.8±0.4 Bifidobacterium bifidumHY 8217 8.1±0.0
Lactobacillus brevisHY 2505 9.3±0.5 Bifidobacterium bifidumHY 8240 8.1±0.0
Lactobacillus plantarumHY 2207 13.8±0.9 Bifidobacterium infantisHY 8405 8.1±0.0
Lactobacillus plantarumHY 2255 8.2±0.6 Bifidobacterium breveHY 8644 8.1±0.0
실시예 2
헬리코박터 필로리 우레아제 활성억제 효과
항균활성을 통해 선발한 4 종(strain)의 유산균을 대상으로 헬리코박터 필로리 우레아제 활성억제효과를 측정하였다. 헬리코박터 필로리를 블루셀라 한천(brucella agar)에서 2일간 배양한 후, 20mM PBS 완충액(buffer)(pH 7.0)에서 2번 씻어내고(washing), 4℃에서 6분간 초음파 분해(sonication)하였다. 110 ×g에서 10분간 원심분리한 후, 상등액을 수거하여 헬리코박터 필로리 원-우레아제(crude-urease)로 사용하였다. 유산균은 12% 스킴 밀크(skim milk)에 106 cfu/ml의 농도로 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 유산균의 헬리코박터 필로리 우레아제 활성억제능 비교는 먼저 13.6ml 우레아 브로스(urea broth)에 1.6ml의 유산균 배양액을 첨가한 후, pH를 6.5로 보정하였다. 여기에 800㎕의 우레아제를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 반응시키면서 30분 간격으로 pH의 변화를 확인하였다.
선발된 유산균들에 대해 헬리코박터 필로리 우레아제 활성억제효과를 측정하여 도 1에 나타내었다. 이때 사용한 헬리코박터 필로리 원-우레아제(crude-urease)의 단백질(protein) 함량은 0.52∼0.61㎎/㎖ 정도였다. 선발 유산균의 헬리코박터 필로리 우레아제 활성억제 효과를 측정한 결과, 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743만이 헬리코박터 필로리 우레아제 활성도 억제하는 것으로 나타났다. 도 1에 도시된 바와 같이, 대조군이 반응 2시간 후 pH 8.7 정도로 우레아제 활성에 의해 pH가 높아지는데 반해, 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743이 우레아제에 첨가된 경우는 반응 2시간 후에도 pH가 6.7 정도를 유지하고 있었다. 따라서, 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743에 의해 헬리코박터 필로리의 우레아제 활성이 약 90% 정도 억제됨을 확인하였다.
실시예 3
AGS cell을 이용한 헬리코박터 필로리 위내 정착억제 효과
헬리코박터 필로리에 대해 항균활성효과를 나타낸 유산균 4 종(strain)에 대해 헬리코박터 필로리의 위내 정착억제효과를 다음과 같이 예방과 치료의 관점에서 확인하였다. 유산균은 12% 스킴 밀크(skim milk)에 106 cfu/ml의 농도로 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 실험에 사용하였다. 먼저 예방효과는 AGS 셀(cell)(105cells/well)을 6 배지(well)에서 부착시켜 유산균 배양액과 RPMI 1640(10% FBS) 배지를 넣고 3시간 동안 반응시켰다. 헬리코박터 필로리를 배지(well)당 106 세포(cells) 접종하여 1시간 동안 부착시키고, 판 쉐이커(plate shaker)를 이용하여 3번 세척한 후 멸균증류수 1ml를 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 균체를 수거하여 원심분리한 셀 펠릿(cell pellet)에 우레아 브로스(urea broth) 1ml를 넣고 37℃에서 1시간 반응시키고 흡광도(560nm)를 측정하였다. 치료효과는 AGS 셀(cell)(105cells/well)을 6 배지(well)에서 부착시켜 헬리코박터 필로리를 well당 106cells 접종하여 3시간 동안 부착시켰다. 유산균 배양액과 RPMI 1640(10% FBS) 배지를 넣고 1시간 동안 반응시키고, 판 쉐이커(plate shaker)를 이용하여 3번 세척한 후 멸균증류수 1ml를 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 셀(Cell)을 수거하여 원심분리한 셀 펠릿(cell pellet)에 우레아 브로스(urea broth) 1ml를 넣고 37℃에서 1시간 반응시키고 흡광도(560nm)를 측정하였다. 이때 대조군으로는 12% 스킴 밀크(skim milk)를 사용하였다.
도 2에서 보는 바와 같이 예방적 측면에서 유산균이 먼저 투여된 경우는 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743만이 70% 이상의 헬리코박터 필로리 정착억제효과를 나타냈으며, 헬리코박터 필로리가 감염된 후 유산균이 투여된 치료적 측면에서도 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743만이 50%이상의 정착 억제효과를 나타내었다. 따라서, 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743만이 헬리코박터 필로리에 대한 항균활성, 우레아제 활성억제, 위내 정착 억제에 대한 능력을 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 4
헬리코박터 필로리 감염에 의해 유도되는 인터루킨-8 생성억제 효과
헬리코박터 필로리의 감염에 의해 유도되는 위상피세포에서의 인터루킨-8 생성에 대해 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743의 생성억제 효과를 측정하였다.
헬리코박터 필로리를 10㎖의 PBS 완충액(buffer)으로 씻어낸 후, 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743과 함께 4℃, 9,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 각각의 셀 펠릿(cell pellet)을 1㎖의 Han's F12 배지에 현탁하고 각 현탁액의 소량을 취하여 1:50으로 희석한 뒤 660nm에서 현탁도를재어 균 농도를 실험 조건에 맞추었다.
Cell population = 16.95 ×A660×(dilution factor) ×108/ ml
H. pylori = 1.084 ×16.95 ×50 ×108= 9.18 ×108
Lactobacillus = 1.408 ×16.95 ×50 ×108= 9.18 ×108
각 배지(well)는 아래 네 개의 군으로 나누고 2반복으로 처리하였다. A군은 AGS 셀(cell)만을 배양한 군이며 B군은 AGS 셀(cell)에 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743만, C군은 AGS 셀(cell)에 헬리코박터 필로리만을 처리하였다. D군은 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743 현탁액 100㎕를 첨가하여 7.5×108 cfu/㎖이 되도록 하고 한 시간 후에 헬리코박터 필로리 현탁액 100㎕를 동일한 농도로 다시 첨가하였다. 모든 군으로부터 배양으로부터 각각 0, 6, 12, 24, 36, 48 시간에 샘플(sample)을 취하여 엘리자(ELISA) 방법(Quantikine™ Human IL-8 Immunoassay kit, R&D systems Europe Ltd.)으로 측정하였다.
A : 대조군
B : 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177 (락토바실러스 카제이 HY 2743) 처리군
C : 헬리코박터 필로리 처리군
D : 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177 (락토바실러스 카제이 HY 2743)
+ 헬리코박터 필로리 처리군
1) 샘플링(Sampling)
판 배지(Plate well) 내의 배지를 수거한 뒤 4℃, 12,000rpm에서 3분간 원심분리하였다. 상등액을 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)로 옮긴 후 -70℃에 저장하였다.
2) 표준용액
RD5P(5×) 2.0㎖을 D.W.로 5배희석한 뒤 5.0㎖을 취하여 IL-8 표준 용액 vial에 첨가하여 2,000pg/㎖ 스톡(stock)을 제조하였다. 2배 희석(Two-folded dilution)에 의해 8가지 농도의 100㎕ 표준용액을 준비하였다.
3) 분석(Assay)
분석 희석액(Assay diluent) (RD1-8) 100㎕를 판 배지(plate well)에 넣고 50㎕의 샘플(sample)과 표준용액을 첨가하였다. 공(Conjugate) 용액 100㎕를 가한 후 상온에서 두 시간 반 동안 흔들었다(shaking). 판(Plate)을 400㎕의 워싱 완충액(washing buffer)로 여섯 번 씻어내고 여기에 시약(Reagent) A와 시약(Reagent) B를 각각 1:1로 섞은 기질 용액 200㎕를 첨가하였다. 판(Plate)을 30분간 정치한뒤 색 변화를 관찰하며 492 nm에서 흡광도를 관찰하였다.
헬리코박터 필로리가 위점막의 상피세포와 상호작용(interaction)할 때, 다양한 시토킨(cytokine)의 생성을 촉진하게 되는데 이 중에서도 IL-8의 생성(secretion)이 가장 현저하게 나타난다. 그리고 IL-8은 위염의 직접적인 원인이 되는 뉴트로필(neutrophil) 또는 마크로파지(macrophge)까지 유도하게 된다. 따라서 헬리코박터 필로리 감염에 의해 유도되는 IL-8의 생성을 억제하는 것이 위염발생을 억제하는 한 방법이 될 수 있다. 도 3a 및 도 3b에 도시된 바와 같이, 헬리코박터 필로리의 감염여부에 따라 생성된 IL-8의 양은 큰 차이를 보여 주었다. 헬리코박터 필로리가 없는 배양 시료에서는 10시간 경과 후에도 IL-8의 생성이 거의 없지만 헬리코박터 필로리 감염군은 2,400∼3,000 pg/ml 수준의 IL-8 생성이 관찰되었다. 그러나 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177 또는 락토바실러스 카제이 HY 2743이 헬리코박터 필로리와 함께 배양된 경우는 헬리코박터 필로리 감염에 의한 IL-8의 생성량이 400∼700 pg/ml로 감소함을 확인하였다. 따라서 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743가 헬리코박터 필로리 감염에 의해 유도생성되는 IL-8의 양을 약 85%와 90% 이상 억제하는 것을 알 수 있었다.
실시예 5
동물실험을 통한 헬리코박터 필로리 감염 예방, 치료효과의 확인
헬리코박터 필로리 감염에 대한 유산균의 예방과 치료효과를 마우스를 통해확인하였다. 실험에 사용된 BALB/c 마우스는 마우스 위장관내에 존재하여 우레아제 활성을 나타내는 헬리코박터 휄리스(Helicobacter felis)가 존재하지 않는 것만을 선별하여 사용하였다. 사용한 BALB/c 마우스는 4주령의 암컷으로 각 그룹당 30마리를 사용하였으며, 25℃, 50% 습도, SPF 조건하에서 사육하면서 실험하였다. 이때 음성 대조군으로는 헬리코박터 필로리 현탁액 대신 7.5% 중탄산나트륨 완충액(sodium bicarbonate buffer)만을 0.5ml씩 경구투여한 15마리의 마우스를 사용하였으며, 양성대조군으로는 헬리코박터 필로리를 7.5% 중탄산나트륨 완충액(sodium bicarbonate buffer)에 2∼4 ×109cfu/ml의 농도로 현탁하여 경구투여한 15마리의 마우스를 사용하였다.
1) 예방효과
마우스에 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743을 음용수와 함께 각각 하루에 2∼5 ×1010셀(cells)로 14일간 투여한 후, 7.5% 중탄산나트륨 완충액(sodium bicarbonate buffer)에 현탁한 2∼4 ×109cfu/ml의 헬리코박터 필로리 균액을 2일 동안 마우스당 0.5ml씩 6회 연속 감염시켰다. 감염 6주 후 각 실험군의 위를 적출하여 위조직내 헬리코박터 필로리 생균수와 우레아제 활성여부를 측정함으로써 헬리코박터 필로리 감염에 대한 예방효과를 확인하였다.
2) 치료효과
헬리코박터 필로리를 7.5% 중탄산나트륨 완충액(sodium bicarbonate buffer)에 2∼4 ×109cfu/ml의 농도로 현탁하고 이 균액을 2일 동안 마우스에 0.5ml씩 6회 연속 감염시켰다. 헬리코박터 필로리가 마우스 위내 완전히 정착한 감염 6주 후 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743을 음용수와 함께 각각 하루에 2∼5 ×1010셀(cells)로 3주간 투여하였다. 투여 후 각 실험군의 위를 적출하여 위조직내 헬리코박터 필로리 생균수와 우레아제 활성을 측정함으로써 헬리코박터 필로리 감염에 대한 치료효과를 확인하였다.
3) 위조직내 헬리코박터 필로리 생균수와 우레아제 활성 측정
적출한 위조직은 위내 고형분을 제거한 후 신속히 2등분하여 ½은 10% 마혈청이 첨가된 브루셀라 브로스(brucella broth)에 침지시킨 후 균질화(homogenize)하여 브루셀라 한천 판(brucella agar plate)에 펼쳐놓았다(spreading). 판(Plate)은 습도가 높은 10% CO2배양기에서 37℃로 5∼7일간 배양한 후 나타난 컬러니(colony)를 확인하여 헬리코박터 필로리의 존재여부를 확인한다. 나머지 ½은 우레아 브로스(urea broth)에 침지시켜 습도가 높은 10% CO2배양기에서 37℃로 5일간 배양하면서 색의 변화를 관찰하여 헬리코박터 필로리의 존재여부를 판단하였다.
헬리코박터 필로리 감염에 대한 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743의 예방과 치료효과를 표 3에 나타내었다. 음성 대조군의 경우 감염 6주 후에도 헬리코박터 필로리가 전혀 감염되어 있지 않았으며, 양성 대조군의 경우는 감염 6주 후에 100%의 헬리코박터 필로리 감염율을 나타냈다. 그러나 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743을 먼저 투여하여 헬리코박터 필로리의 감염을 예방한 경우, 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177 균주는 생균수와 우레아제 활성 측정 결과 각각 93%와 90%의 예방율을 나타냈다. 락토바실러스 카제이 HY 2743의 경우는 생균수와 우레아제 활성 측정 결과 모두 90%의 예방율을 나타냈다.
또한 헬리코박터 필로리를 먼저 감염시킨 후 선발유산균을 투여한 치료측면에서, 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177를 투여한 경우 생균수와 우레아제 활성 측정 결과 각각 87%와 83%의 치료율을 나타냈다. 락토바실러스 카제이 HY 2743을 투여하여 감염된 헬리코박터 필로리를 제균한 경우는 생균수와 우레아제 활성 측정 결과 각각 83%와 77%의 치료효과를 확인하였다.
따라서 헬리코박터 필로리의 감염에 대해 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743을 사용한다면 높은 예방, 치료효과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743의 헬리코박터 필로리 감염 예방, 치료효과
그룹 측정항목 예방 치료
발생 마리수 예방율(%) 발생 마리수 치료율(%)
L.aHY 2177 생균수 2/30 93 4/30 87
우레아제 활성 3/30 90 5/30 83
L.cHY 2743 생균수 3/30 90 5/30 83
우레아제 활성 3/30 90 7/30 77
음성 대조군 생균수 0/30 100 0/30 100
우레아제 활성 0/30 100 0/30 100
양성 대조군 생균수 30/30 0 30/30 0
우레아제 활성 30/30 0 30/30 0
실시예 6
균주 혼합배양에 따른 항균활성의 상승효과
락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743의 혼합배양에 따른 항균활성의 상승효과를 다음과 같이 확인하였다. 12% 스킴 밀크(skim milk)에 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743를 0.1%씩 접종하여 37℃에서 24시간동안 혼합배양한 후, 배양액에 의한 필로리(H. pylori)의 항균활성을 실시예 1과 동일한 실린더(cylinder) 방법을 통해 확인하였다. 그리고 각 균주를 12% 스킴 밀크(skim milk)에 0.05% 접종하여 37℃에서 24시간동안 단독한 배양액을 대조군으로 사용하였으며, 실험은 3회 반복하여 실시하였다.
도 4에서 보는 바와 같이 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743의 단독 배양시 필로리(H. pylori)에 대한 항균활성은 각각 18.7 ±0.7과 15.3 ±1.1로 나타났다. 이에 비해 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743의 혼합배양에 따른 필로리(H. pylori)에 대한 항균활성은 19.0 ±0.8로 나타났다. 이 결과 필로리(H. pylori)에 대한 항균활성에 있어서 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743의 혼합배양이 단독배양에 비해 상승효과를 가져옴을 알 수 있었다.
실시예 7
발효유 제조
탈지분유를 이용하여 무지유고형분 함량을 8∼20 중량%로 조정한 원료유를 72∼75℃에서 15초간 살균하였다. 살균된 원료유를 일정온도까지 냉각시킨 후 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743을 106 cfu/ml의 농도로 접종하여 pH 4∼5가 될 때가지 배양하였다. 배양완료 후 배양액을 냉각시켰다. 한편 과즙농축액 0.1∼50 중량% 식이섬유 0.1∼20 중량%, 포도당 0.5∼30 중량%, 올리고당 0.1∼15 중량%, 칼슘 0.001∼10 중량%, 비타민 0.0001∼5 중량% 등을 녹여 시럽을 제조하였다. 이렇게 제조된 시럽을 살균한 후 냉각하여 상기 배양액과 일정비율로 혼합, 교반하여 균질화 시킨 후 용기에 포장하여 발효유를 제조하였다. 이렇게 제조된 발효유는 관능검사 결과 풍미, 물성, 전체적인 맛에 있어서 양호한 결과를 보였다.
실시예 8
유산균 균말 제조
락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743을 MRS 브로스(broth)에 106 cfu/ml의 농도로 접종하여 37℃에서 18∼24시간 동안 pH-조절 발효(pH-control fermentation)를 실시하였다. pH 조절(control)은 30% NaOH를 중화제로 하여 pH 5.7 ±0.2로 실시하였다. 배양완료 후 4℃에서 10,000 ×g로 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 5% 스킴밀크(skim milk)에 2.5% 유장(whey), 5% 수크로오스(sucrose)가 함유된 보호제와 동량으로 혼합된 후 동결건조기를 통해 분말화 하였다. 이렇게 제조된 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743의 건조균말은 모두 1 ×1011cfu/g 이상의 생균수를 나타내었다.
실시예 9
유산균 제제 제조
실시예 7에서 제조한 유산균 균말을 이용하여 유산균 식품, 정장제 등의 유산균 제제를 제조하였다. 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743의 건조 균말 20 중량%에 올리고당 10 중량%, 무수포도당 20 중량%, 결정과당 5 중량%, 비타민 C 2 중량%,, 과일분말향 5 중량%, 알로에 5 중량%, 식이섬유 15 중량%, 차전자피 18 중량%를 혼합하여 스틱 또는 병에 일정량 분주하여 포장하였다. 이렇게 제조된 유산균 제제는 5 ×108cfu/g 이상의 생균수를 유지하였다.
상기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 헬리코박터 필로리에 대해 항균활성을 갖는 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177, 락토바실러스 카제이 HY 2743 및 그를 이용한 유산균 제제, 발효유는 위염, 위궤양의 원인균으로 알려진 헬리코 박터 필로리에 대해 항균활성, 우레아제활성억제, 위내 정착억제, 인터루킨-8 생성억제 능력을 갖는 효과가 있으며, 나아가 이를 이용하여 발효유, 유산균식품, 정장제 등의 제품으로 제조하여 섭취할 경우, 헬리코박터 필로리의 감염에 의한 위염, 위궤양, 십이지장궤양의 예방과 치료가 가능한 효과를 갖는다.
또한, 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743이 함께 하였을 경우에는 항균활성에 있어 유기적인 상승효과 즉, 시너지 효과가 있다.

Claims (9)

  1. 헬리코박터 필로리에 대한 항균활성, 우레아제활성억제, 위내 정착억제, IL-8 생성억제 능력을 갖는 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177 균주.
  2. 헬리코박터 필로리에 대한 항균활성, 우레아제활성억제, 위내 정착억제, IL-8 생성억제 능력을 갖는 락토바실러스 카제이 HY 2743 균주.
  3. 삭제
  4. 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177 균주를 유효성분으로 하여 위염, 위궤양, 십이지장궤양에 효능이 있는 유산균 제제.
  5. 락토바실러스 카제이 HY 2743 균주를 유효성분으로 하여 위염, 위궤양, 십이지장궤양에 효능이 있는 유산균 제제.
  6. 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743 균주가 혼합된 것을 유효성분으로 하여 위염, 위궤양, 십이지장궤양에 효능이 있는 유산균 제제.
  7. 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177 균주를 유효성분으로 하여 위염, 위궤양, 십이지장궤양에 효능이 있는 발효유.
  8. 락토바실러스 카제이 HY 2743 균주를 유효성분으로 하여 위염, 위궤양, 십이지장궤양에 효능이 있는 발효유.
  9. 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743 균주가 혼합된 것을 유효성분으로 하여 위염, 위궤양, 십이지장궤양에 효능이 있는 발효유.
KR1020000007982A 2000-02-19 2000-02-19 헬리코박터 필로리에 대해 항균활성을 갖는 락토바실러스애시도필러스 에이치 와이 2177, 락토바실러스 카제이에이치 와이2743 및 그를 이용한 유산균 제제, 발효유 KR100357668B1 (ko)

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