KR100474942B1

KR100474942B1 - 헬리코박터 파이로리의 생육을 저해하는 김치 유산균 및 이를 함유하는 위장 보호 고기능성 식품

Info

Publication number: KR100474942B1
Application number: KR10-2001-0027077A
Authority: KR
Inventors: 김창곤; 조장현; 이영선; 김명국; 윤원태
Original assignee: (주)유진사이언스
Priority date: 2001-05-17
Filing date: 2001-05-17
Publication date: 2005-03-08
Also published as: JP2004524859A; KR20020088516A; WO2002092790A1; CN1514875A

Abstract

본 발명은 헬리코박터 파이로리(Helicobactor pylori)의 생육을 저해하는 김치 유산균 및 이를 함유하는 식품에 관한 것으로, 특히 헬리코박터 파이로리의 위장에의 부착을 억제하고 생육을 저해하는 김치 유산균을 함유하는 위장 보호 고기능성 식품에 관한 것이다.

본 발명의 김치 유산균은 위점막 조직에 서식하는 헬리코박터 파이로리의 위장에의 부착을 저해하고 생육을 억제하여 헬리코박터 파이로리의 박멸, 및 재감염 방어에 매우 효과적이다. 또한 상기 김치 유산균을 함유하는 위장 보호 고기능성 식품은 헬리코박터 파이로리로 인한 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양의 예방 및 치료에 효과적이다.

Description

헬리코박터 파이로리의 생육을 저해하는 김치 유산균 및 이를 함유하는 위장 보호 고기능성 식품 {KIMCHI LACTIC ACID BACTERIA GROUP HINDERING GROWTH OF HELICOBACTOR PYLOLI AND HIGH FUNCTIONAL FOOD PROTECTING GASTROENTERIC DISORDER THEREWITH}

본 발명은 헬리코박터 파이로리(Helicobactor pylori)의 생육을 저해하는 김치 유산균 및 이를 함유하는 위장 보호 고기능성 식품에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 위점막 조직에 서식하는 헬리코박터 파이로리의 위장에의 부착을 저해하고 생육을 억제하는 김치 유산균을 함유하여 헬리코박터 파이로리로 인한 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양의 예방 및 치료에 효과적인 고기능성 식품에 관한 것이다.

위장 질환은 전 세계적으로 가장 많이 발생하는 질병 중의 하나로 이의 치료를 위해 사용되는 의약품이 현재 단일품목으로서 가장 큰 시장을 형성하고 있다(항궤양제 158 억 달러(1999)).

1983 년 호주의 미생물학자인 마샬(Marchall)과 와렌(Warren)은 최초로 B 형 위염환자의 위점막 생검조직에서 만곡성 세균을 발견하고, 상기 세균을 배양하여 캠필로박터 종(campylobacter genus)과 연관된 새로운 종임을 규명한 이래, 헬리코박터 파이로리와 위염 및 소화성궤양 등의 상부위장관 질환 간의 연관성에 대한 활발한 연구가 이루어져 왔다. 헬리코박터 파이로리는 그람음성의 간균으로서 얇은 막으로 둘러싸인 편모를 가지고 있으며, 다량의 유레아제(urease)를 방출하고 대변-구강 경로를 통하여 전파되는 것으로 알려져 있으며, 94 년에는 세계보건기구(WHO)가 확실한 발암인자라고 밝혀 세계적으로 주목을 받고 있는 병원균이다.

현재 헬리코박터 파이로리에 의한 질병의 발병기전은 음식물과 함께 위 내강에 들어온 세균이 강한 운동성을 가진 편모를 이용하여 위점액층을 뚫고 들어가서 위점액층 내 위상피세포층 상부와 세포간 접합부에 서식하면서 다량의 유레아제를 분비하여 점액층을 알카리성으로 변화시킴으로써 가스트린에 의한 위산분비 촉진을 비정상적으로 과다하게 유도하여 결국 염증 및 궤양을 초래하는 것으로 밝혀져 있다. 또한 헬리코박터 파이로리가 위 선암(gastric adenocarcinoma) 발명의 중요한 위험요소임을 규명한 최근의 연구보도에 따라 국제보건기구에서는 헬리코박터 파이로리를 제 1 군 발암물질로 지정하였다.

헬리코박터 파이로리에 의한 감염은 한국을 비롯한 개발도상국에서 특히 많이 발생하는 것으로 보고되어 있으며, 백 등의 보고에 의하면 한국인 정상인의 약 80 % 이상이 헬리코박터 파이로리에 감염되어 있는 것으로 추정된다(백승철 등, 대한미생물학회지, 25:45-52, 1990). 따라서 헬리코박터 파이로리 감염에 대한 치료 및 예방방법의 개발이 매우 시급한 실정이다.

상기와 같은 미생물 감염에 의한 질병을 치료하기 위한 방법으로 현재 항생제를 이용한 화학요법이 주로 실시되고 있으며, 이 방법의 광범위한 사용은 단기적인 측면에서는 효과적일 수 있으나 항생제의 지속적인 사용으로 인한 항생제 내성균주의 출현 등의 위험이 있다는 문제점이 있다.

또한 헬리코박터 파이로리에 대한 항균요법으로 Rauws 등은 비스무트(bismuth) 제제와 아모시실린(amoxicillin), 메트로니다졸(metronidazole)의 세가지 항균제를 투여하여 치료성과를 발표하였고(Rauws EAJ, Langenberg W, Houthoff JH, Zanen HC and Tytgat GHJ, Gastroenterol, 94:33~40, 1988), Borody 등은 비스무트 제제와 테트라아식린(tetracycline), 메트로니다졸을 소화성 궤양 환자에게 투여하여 80 % 내외의 치료성과를 발표하였으며(Borody T, Lenne j ane Moore-Jones D, Gastroenterol, 98:A24, 1990), 이로부터 헬리코박터 파이로리 감염증의 치료에 이 세 가지 항균제의 병용투여가 가장 일반적으로 사용되고 있다. 하지만 항균요법의 지속적인 사용으로 인해 설사, 역류성 식도염 발생, 장내 정상적인 균총 억제, 내성균주 출현 등의 다양한 부작용이 발생하는 것으로 보고되고 있다.

최근 위·장관 질환의 예방과 치료에 있어 유산균 발효물질의 기능에 대해 관심이 증대되고 있고, 특히 사람 병원균의 생육을 저해할 수 있는 프로바이오틱 락토바실러스(probiotic Lactobacillus)에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 이들 유산균들은 발효산물로서 유산, 초산, 및 과산화수소뿐만 아니라 박테리오신과 관련된 항균물질을 생산한다. Marie-Helen Coconier 등은 생체 밖에서 헬리코박터 파이로리에 대한 항균물질을 생산하는 사람의 락토바실러스 에시도필러스 LB(Lactobacillus acidophilus strain LB)를 배양하여 이 배양액의 상등액이 생체 밖에서 사람의 장관세포에 대한 헬리코박터 파이로리의 부착을 저해하고 유레이즈(urease)의 활성을 억제 할뿐만 아니라 헬리코박터 펠리스(H. felis)가 생쥐에 감염되는 것을 저해하는 성질을 확인하였다(Marie-Helen Coconier et al., Environ. Microbiol, Nov.4573~4580, 1998).

또한 Yuji Aida M.T. 등은 락토바실러스 살리바리우스(L. salivarius)의 구강투여를 통해 무균의 뮤린(murine)에 대한 헬리코박터 파이로리의 감염이 저해되는 것을 확인하였고, 미국특허 제5,578,392호에는 락토바실러스 존슨니(L. johnsonii)가 장관세포에 대한 헬리코박터 파이로리의 부착을 저해하는 기능에 대하여 기재하고 있다.

또한 Canducci 등은 라베프라졸(rabeprazol), 클라리트로마이신(clarithromycin), 아모시실린을 사용한 항균요법과 병행하여 사람의 락토바실러스 에시도필러스 배양액의 불활성제제를 처방함으로써 헬리코박터 파이로리의 박멸률을 증대시키는 결과를 얻었다(Canducci F. et al., Aliment Pharmacol. Ther, 14:1625~1629, 2000).

또한 대한민국 출원번호 제 1999-0040387 호에는 헬리코박터 파이로리에 대한 항체와 함께 헬리코박터 필로리에 대해 억제능을 나타내는 유산균인 락토코커스 sp. HY 49, 락토바실러스 카제이 HY 2782 및 비피도박테리아 롱검 HY 8001 등을 함유한 식품에 대하여 기재하고 있다.

따라서 헬리코박터 파이로리의 위장에의 부착을 억제하고 생육을 저해할 수 있는 물질 및 방법에 대한 연구가 더욱 요구되고 있는 실정이고, 상기 물질을 포함하는 식품 및 약제에 대한 연구가 필요하다.

따라서 본 발명은 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하고 위장에의 부착을 저해할 뿐만 아니라 주요 유산균 공급원인 김치로부터 분리하여 전통식품인 김치에 기능성을 부가할 수 있는 위장 보호 고기능성 김치 유산균을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 김치 유산균을 함유하여 헬리코박터 파이로리로 인한 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양의 예방 및 치료에 효과적인 위장 보호 고기능성 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 김치 유산균을 함유하여 헬리코박터 파이로리로 인한 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양의 예방 및 치료에 효과적인 위장 보호 고기능성 김치를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 김치 유산균을 함유하여 헬리코박터 파이로리로 인한 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양의 예방 및 치료용 약제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하고 위장에의 부착을 저해하는 김치 유산균을 제공한다.

또한 본 발명은 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하는 김치 유산균을 함유하는 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양의 예방 및 치료에 효과적인 위장 보호 고기능성 식품을 제공한다.

또한 본 발명은 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하는 김치 유산균을 함유하는 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양의 예방 및 치료에 효과적인 위장 보호 고기능성 김치를 제공한다.

또한 본 발명은 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하는 김치 유산균을 함유하는 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양의 예방 및 치료용 약제를 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

김치는 배추와 무 등 김치재료와 김치발효에 참여하는 여러 유산균의 기능이 복합적으로 나타나 항 돌연변이와 항암 효과 등 여러 유용한 기능들을 보유하고 있는 것으로 알려져 있으며, 한국인의 장 건강에 기여하는 대표적인 유산균 공급원이다. 김치 발효에 관여하는 미생물로는 락토바실러스 플랜타룸(L. plantarum), 락토바실러스 브레비스(L. brevis), 락토코커스(Lactococcus), 루코노스탁(Leuconostoc), 스트렙토코커스(Streptococcus), 페디오코커스(Pediococcus) 등이 있으며 발효단계에 따라 전체 균총을 형성하는 균의 종류와 구성비율이 변하게 된다.

본 발명자들은 상기와 같은 사실을 바탕으로 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하는 김치 유산균에 대한 연구수행 중, 김치 발효과정에 관여하는 미생물 중에 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하는 동시에 헬리코박터 파이로리의 위장 벽에의 부착을 저해하는 특성이 있는 김치 유산균이 존재함을 확인하고 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)의 생육을 억제하고 위장에의 부착을 저해하는 김치 유산균을 제공한다.

상기 김치 유산균은 통상의 방법으로 제조한 김치를 1∼40 ℃에서 보관하면서 90 일, 또는 pH가 약 3.0이 되는 시기까지 진행시키면서 분리·동정하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 1∼25 ℃의 온도에서는 90 일 동안 숙성시키고, 30∼40 ℃의 온도에서는 30 일 동안 숙성시키면서 분리하는 것이다.

상기 유산균은 통상의 방법으로 제조한 김치로부터 채취한 시료를 MRS 한천배지에 도말·배양하여 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하는 588 종의 김치 유산균을 선발하고, 이를 대상으로 헬리코박터 파이로리의 위의 부착을 저해하는 김치 유산균을 순차적으로 선발하는 단계를 거쳐 분리된 것이다.

따라서 상기 김치 유산균은 김치 발효과정에서 생성되는 유산균 중에서 루코노스탁(Leuconostoc) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 루코노스탁 속 EUG4427(KCCM-10274), 락토바실러스 속 EUG6017(KCCM-10273), 락토바실러스 속 EUG4066(KCCM-10270), 락토바실러스 속 EUG4048(KCCM-10271), 및 락토바실러스 속 EUG6404(KCCM-10272)으로 이루어지는 군으로부터 1 종 이상 선택되는 것이다.

상기의 루코노스탁 속 또는 락토바실러스 속 김치 유산균은 위점막 조직에 서식하는 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하고 위장에의 부착을 저해할 뿐만 아니라, 헬리코박터 파이로리의 박멸, 및 재감염 방어에 매우 효과적이다.

또한 사람의 장 또는 우유의 발효제품으로부터 유래한 유산균이 아닌 한국인의 주요 유산균 공급원인 김치로부터 기능성을 보유한 유산균을 선발함으로써 전통 식품인 김치에 기능성을 부가할 수 있을 뿐만 아니라 기능성 유산균의 공급원을 다양화 할 수 있는 효과가 있다.

또한 본 발명은 루코노스탁 속, 또는 락토바실러스 속 김치 유산균을 함유하여 헬리코박터 파이로리로 인한 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양의 예방 및 치료에 효과적인 위장 보호 고기능성 식품을 제공하는 것이다.

상기 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하고 위장에의 부착을 저해하는 김치 유산균을 음료, 발효유 등의 식품에 스타터로서 배양액, 또는 동결건조한 유산균 분말의 형태로 함유하는 기능성 식품은 유산균의 기능을 저해하지 않는 제형이면 무관하며, 영양성분의 필요량, 소비자의 선호도 등에 따라 통상적으로 식품 제조에 사용되는 식품 첨가물을 첨가할 수 있다.

본 발명의 김치 유산균을 함유하는 기능성 식품으로는 음료, 발효유, 두부, 된장, 청국장, 젤리 등이 있으며, 상기 식품들은 헬리코박터 파이로리로부터 위장 보호하는 고기능성 식품으로 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양을 예방 및 치료할 수 있다.

또한 본 발명은 상기의 루코노스탁 속, 또는 락토바실러스 속 김치 유산균을 함유하여 헬리코박터 파이로리로 인한 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양의 예방 및 치료에 효과적인 위장 보호 고기능성 김치를 제공하는 것이다.

상기 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하고 위장에의 부착을 저해하는 김치 유산균을 함유하는 김치는 통상의 김치 제조방법에 있어서, 김치 양념에 헬리코박터 파이로리의 생육을 저해하는 김치유산균의 스타터(starter)로서 김치 유산균의 배양액, 또는 동결건조한 유산균 분말을 가하여 제조할 수 있으며, 품질의 유지를 위해서는 동결건조한 유산균 분말을 가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 김치 유산균을 함유하는 김치는 헬리코박터 파이로리로부터 위장 보호하는 고기능성 김치로, 김치 섭취만으로도 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양을 예방 및 치료할 수 있다.

상기 김치 유산균을 포함하는 위장 보호 고기능성 김치는 유산균의 기능을 저해하지 않는 온도, pH, 제형 등의 조건에서 제조되는 것이면 무관하며, 영양성분의 필요량, 소비자의 선호도 등에 따라 통상적으로 김치 제조에 사용되는 첨가물을 첨가할 수 있다.

또한 본 발명은 루코노스탁 속, 또는 락토바실러스 속 김치 유산균을 함유하여 헬리코박터 파이로리로 인한 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양의 예방 및 치료용 약제를 제공할 수 있다.

상기 김치 유산균을 함유하는 약제는 겔제, 현탁제, 분무제, 정제, 또는 액제로 제형하여 달리 할 수 있으며, 이는 헬리코박터 파이로리로부터 위장 보호하여 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양을 예방 및 치료할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하는 김치 유산균의 분리

김치 유산균 중 생체 밖에서 헬리코박터 파이로리의 생육을 저해하는 유산균을 선발하기 위하여 본 실시예에서는 김치 유산균을 분리하는 단계, 및 헬리코박터 파이로리 생육억제 유산균을 분리하는 단계를 거쳐 실험하였다.

(김치 유산균 분리)

통상의 방법으로 김치를 제조하여 1 ℃, 4 ℃, 8 ℃, 10 ℃, 15 ℃, 20 ℃, 25 ℃, 30 ℃, 35 ℃, 및 40 ℃에서 보관하면서 90 일, 또는 pH가 3.0이 되는 시기까지(1∼25 ℃ : 90 일, 30∼40 ℃ : 30 일 동안 숙성) 매 24 시간 또는 48 시간마다 시료를 채취하였다. 상기 채취한 시료를 10²∼10⁶으로 희석하고 MRS 한천배지에 도말한 후, 평판배지를 37 ℃, 72 시간 배양하였다.

(헬리코박터 파이로리 생육억제 유산균 분리)

말혈청(horse serum) 10 %를 함유한 브루셀라 한천배지(brucella agar)에 헬리코박터 파이로리 현탁액을 도말하여 5 분간 건조한 후, 여기에 상기 MRS 한천배지에서 배양한 유산균 집락 약 48,000 개를 Tooth-picking 방법으로 옮겨 10 % CO₂ 분압 하에서 72 시간 동안 배양한 후, 투명환을 형성하는 유산균 집락 588 개를 선발하였다.

실시예 2. 헬리코박터 파이로리의 위의 부착을 저해하는 유산균 탐색

(1 차 선발)

상기 실시예 1에서 선발된 생체 밖에서 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하는 김치 유산균 588 종에 대해 위암종 세포인 Kato Ⅲ에 헬리코박터 파이로리의 부착저해능을 조사하여 이 능력을 보유한 유산균을 선발하였다.

상기 헬리코박터 파이로리#26695는 위염과 위궤양이 있는 한국인의 위에서 분리한 균으로 경상대학교 의과대학으로부터 분양받았으며, 인체 위암종 세포인 카토 Ⅲ(Kato Ⅲ)는 한국 세포주은행으로부터 분양받았다.

1 차적으로 헬리코박터 파이로리의 균수를 측정하는 지표인, 유레이즈의 반응산물을 발색시킨 용액의 흡광도로 헬리코박터 파이로리의 수를 측정하여 부착된 헬리코박터 파이로리의 수를 10⁶ 이하로 떨어뜨리는 유산균을 선발한 결과, 하기 표 1과 같이 총 70 종이 선발되었다(A625가 1.7 이하면 Hp의 수가 10⁶ 이하로 계산됨).

구분	균명	부착 Hp 균수(부착저해능 : < 10⁶)	구분	균명	부착 Hp 균수(부착저해능 : < 10⁶)
1	Eug 12142	O	36	Eug 44251	O
2	Eug 6013	O	37	Eug 2253	O
3	Eug 6014	O	38	Eug 2613	O
4	Eug 6017	O	39	Eug 14414	O
5	Eug 0113	O	40	Eug 4416	O
6	Eug 0141	O	41	Eug 4417	O
7	Eug 0340	O	42	Eug 4418	O
8	Eug 0352	O	43	Eug 4419	O
9	Eug 0358	O	44	Eug 44115	O
10	Eug 0445	O	45	Eug 4118	O
11	Eug 0442	O	46	Eug 4427	O
12	Eug 4547	O	47	Eug 4439	O
13	Eug 8126	O	48	Eug 14449	O
14	Eug 8130	O	49	Eug 4410	O
15	Eug 4842	O	50	Eug 4414	O
16	Eug 4848	O	51	Eug 24013	O
17	Eug 8540	O	52	Eug 0618	O
18	Eug 8553	O	53	Eug 40312	O
19	Eug 9617	O	54	Eug 0317	O
20	Eug 6322	O	55	Eug 0315	O
21	Eug 6713	O	56	Eug 4034	O
22	Eug 6123	O	57	Eug 40410	O
23	Eug 6416	O	58	Eug 0412	O
24	Eug 20553	O	59	Eug 6404	O
25	Eug 14435	O	60	Eug 4047	O
26	Eug 16811	O	61	Eug 4048	O
27	Eug 16828	O	62	Eug 4049	O
28	Eug 8215	O	63	Eug 40511	O
29	Eug 8220	O	64	Eug 4056	O
30	Eug 16842	O	65	Eug 40514	O
31	Eug 8756	O	66	Eug 4065	O
32	Eug 16871	O	67	Eug 4063	O
33	Eug 9218	O	68	Eug 4066	O
34	Eug 44211	O	69	Eug 0615	O
35	Eug 2242	O	70	Eug 40614	O

(2차 선발)

1 차적으로 선발된 70 종의 균주에 대해 재현성시험과 동시에 헬리코박터 파이로리의 부착저해능이 높은 균주를 선발하였다. 헬리코박터 파이로리 부착균수가 약 10⁵ 이하로 저해시키는 유산균 35 개를 선발하고 이를 하기 표 2에 나타내었다.

균명	부착 Hp 균수 (부착저해능 : ≤10⁵)
Eug 6014	O
Eug 6017	O
Eug 0340	O
Eug 0352	O
Eug 0442	O
Eug 8126	O
Eug 8130	O
Eug 8540	O
Eug 6713	O
Eug 6123	O
Eug 20553	O
Eug 8215	O
Eug 16842	O
Eug 8756	O
Eug 4416	O
Eug 4419	O
Eug 4427	O
Eug 4439	O
Eug 24013	O
Eug 0618	O
Eug 40312	O
Eug 0317	O
Eug 0315	O
Eug 40410	O
Eug 0412	O
Eug 6404	O
Eug 4047	O
Eug 4048	O
Eug 4049	O
Eug 4056	O
Eug 4065	O
Eug 4063	O
Eug 4066	O
Eug 0615	O
Eug 14439	O

(3 차 선발)

상기 2 차적으로 선발된 35 종의 유산균을 대상으로 2 차 재현성시험을 한 결과 선발된 22 개의 균주를 하기 표 3에 나타내었다.

균 명	부착 Hp 균수
Eug 6017	< 10⁴
Eug 0352	2.7 ×10⁵
Eug 8126	4.4 ×10⁴
Eug 6713	1.4 ×10⁵
Eug 6123	2.4 ×10⁴
Eug 16842	8.3 ×10⁴
Eug 8756	1.4 ×10⁴
Eug 4416	< 10⁴
Eug 4419	< 10⁴
Eug 4427	7.8 ×10⁴
Eug 0618	9.1 ×10⁴
Eug 0317	2.8 ×10⁵
Eug 0315	3.5 ×10⁵
Eug 0412	3.5 ×10⁴
Eug 6404	< 10⁴
Eug 4047	< 10⁴
Eug 4048	< 10⁴
Eug 4049	8.7 ×10⁴
Eug 4065	8.1 ×10⁵
Eug 4063	4.1 ×10⁴
Eug 4066	< 10⁴
Eug 0615	2.1 ×10⁴

실시예 3. 균주 동정

상기 실시예 1, 및 2의 방법으로 선발된 22 개의 유산균 균주를 BIOLOG kit와 Bergey’s manual의 이분동정법을 통해 동정한 결과를 하기 표 4와 같이 나타내었다.

균명	Gram	균의 형태	포자 형태	catalase	통기성(facultative bacteria)	운동성
Eug 6017	(+)	직간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 0352	(+)	직간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 8126	(+)	직간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 6713	(+)	구균성간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 6123	(+)	단간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 16842	(+)	직간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 8756	(+)	단간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 4416	(+)	단간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 4419	(+)	단간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 0618	(+)	구균성간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 0317	(+)	직간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 0315	(+)	직간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 0412	(+)	직간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 6404	(+)	직간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 4047	(+)	직간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 4048	(+)	장간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 4049	(+)	직간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 4065	(+)	직간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 4063	(+)	직간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 4066	(+)	구균성간균	(-)	(-)	(+)	(-)
Eug 0615	(+)	직간균	(-)	(-)	(+)	(-)

상기 표 4를 통하여 BIOLOG system을 통해 동정된 1 종 루코노스탁 속 균주와 Bergey's mannal의 이분동정법을 통해 동정된 21 종의 락토바실러스 속 균주가 헬리코박터 파이로리의 위의 부착을 저해하는 특성이 있음을 알 수 있었다.

(4 차 선발)

상기에서 3 차 선발된 22 개의 균주에 대해 3 차 재현성시험을 실시하여 저해능이 높은 균주 9 개를 선발하였다. 이 단계에서는 저해능이 높은 순으로 선발을 하는 것이 아니라 균의 형태별로 구분하여 형태에 따라 선발하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

균 명	부착 Hp 균수
Eug 6017	< 10⁴
Eug 8126	1.2 ×10⁵
Eug 6713	1.4 ×10⁵
Eug 4419	< 10⁴
Eug 4427	1.2 ×10⁵
Eug 6404	< 10⁴
Eug 4047	< 10⁴
Eug 4048	< 10⁴
Eug 4066	< 10⁴

(최종 선발(5 차 선발))

상기에서 선발된 9 개의 유산균 균주를 대상으로 4 차 재현성시험과 균의 형태에 따라 각 균의 형태별 1 균주씩 선발하여 하기 표 6과 같이 최종 5 개 균주를 선발하였다.

균 명	부착 Hp 균수
Eug 6017	< 10⁴
Eug 4427	2.5 ×10⁵
Eug 6404	2.6 ×10⁴
Eug 4048	< 10⁴
Eug 4066	< 10⁴

상기 표 6에 나타낸 최종 5 개의 균주에 대하여, 루코노스탁 속의 균주는 루코노스탁 속 EUG4427(KCCM-10274)로 명명하였고 락토바실러스 속 4종의 균주는 각각 락토바실러스 속 EUG6017(KCCM-10273), 락토바실러스 속 EUG4066(KCCM-10270), 락토바실러스 속 EUG4048(KCCM-10271), 락토바실러스 속 EUG6404(KCCM-10272)로 명명하였다.

상기의 최종 5 개의 균주는 루코노스탁 속 EUG4427(KCCM-10274)로, 락토바실러스 속 EUG6017(KCCM-10273)로, 락토바실러스 속 EUG4066(KCCM-10270), 락토바실러스 속 EUG4048(KCCM-10271), 락토바실러스 속 EUG6404(KCCM-10272)로 2001 년 5 월 16 일 한국미생물보존센터에 국제기탁하였다.

실시예 4. 김치 유산균 배양액의 헬리코박터 파이로리 생육 저해

상기 실시예 3에서 선발된 루코노스탁 속 EUG4427(KCCM-10274), 락토바실러스 속 EUG6017(KCCM-10273), 락토바실러스 속 EUG4066(KCCM-10270), 락토바실러스 속 EUG4048(KCCM-10271), 락토바실러스 속 EUG6404(KCCM-10272)을 각각 MRS 액체배지에서 37 ℃, 48 시간 동안 배양한 후 원심분리하여 상등액을 얻었다.

말형청 10 %가 첨가된 브루셀라(brucella) 한천배지 25 mL로 평판 배지를 만든 후 건조하고, 여기에 헬리코박터 파이로리의 현탁액 0.5 mL(1 ×10⁸ CFU/mL)를 도말하여 5 분간 건조하였다.

살균된 코크보러(cork borer)로 구멍을 뚫고 상기 준비한 각 균주의 원심분리 상등액을 100 ㎕씩 넣은 후, 이산화탄소 10 % 분압하에서 37 ℃, 72 시간동안 배양하여 생성된 투명환의 크기를 측정하였으며, 대조구로는 상등액 대신 MRS 액체배지로 하였고, 생체 밖에서 유산균의 헬리코박터 파이로리의 생육을 저해하는 결과는 하기 표 7에 나타내었다.

균주명	투명환의 반지름 (㎜)
대조구	0
루코노스탁 속 EUG4427(KCCM-10274)	3.0
락토바실러스 속 EUG6404(KCCM-10272)	4.5
락토바실러스 속 EUG4048(KCCM-10271)	4.0
락토바실러스 속 EUG6017(KCCM-10273)	2.5
락토바실러스 속 EUG4066(KCCM-10270)	4.0

상기 표 7을 통하여, 실시예 3에서 분리한 5 종의 김치 유산균 상등액을 배양한 결과 생성된 투명환의 반지름이 2.5∼4.5 ㎜로 본 발명 김치 유산균의 헬리코박터 파이로리의 생육저해능이 우수함을 알 수 있었다.

실시예 5. 헬리코박터 파이로리의 위암종 세포에의 부착 저해

인체 위암종 세포인 카토 Ⅲ를 FBS가 10 % 함유된 RPMI1640 배지에서 37 ℃, 이산화탄소 10 % 환경에서 배양하였다. 헬리코박터 파이로리는 말혈청 10 %가 함유된 브루셀라 평판배지에서 37 ℃, 이산화탄소 10 % 환경에서 48 시간 배양한 후 균체를 모아 식염수에 현탁하였으며, 1 ×10⁶의 카토 Ⅲ 현탁액 0.5 mL와 유산균 배양액 0.25 mL를 서서히 진탕하면서 37 ℃에서 30 분 동안 반응시켰으며, 대조구로는 배양액대신 MRS 액체배지로 하였다.

여기에 헬리코박터 파이로리의 현탁액 0.25 mL(1 ×10⁸ CFU/mL)를 첨가하여 다시 90 분 동안 반응시킨 후 식염수를 이용해 1,000 rpm, 5 분의 조건에서 3 회 세척한 후, 유레이즈의 시험을 통하여 카토 Ⅲ에 부착된 헬리코박터 파이로리의 수를 측정하였다.

유레이즈는 유레아(urea)를 분해하여 암모니아를 생성하는데, 이때 생성된 암모니아를 페놀/니트로프루사이드(phenol/nitroprusside)와 염기성 하이포클로라이트(hypochlorite)를 이용해 정량하였다. 이때 유레이즈가 존재하면 반응액은 무색에서 엷은 청색부터 담청색으로 변하고, 유레이즈의 활성은 625 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 유레이즈의 활성을 통해 헬리코박터 파이로리의 수를 계산하였으며, 이 시험의 표준 곡선은 10⁴∼10⁷사이가 직선구간으로 나타났다.

상기와 같이 측정한 실시예 3에서 선발한 5 종의 김치 유산균들의 헬리코박터 파이로리의 인체 위암종 세포에 대한 부착저해능을 하기 표 8에 나타내었다.

균주명	헬리코박터 파이로리 부착 균수 (CFU)
대조구	> 10⁷
루코노스탁 속 EUG4427(KCCM-10274)	2.5 ×10⁵
락토바실러스 속 EUG6404(KCCM-10272)	2.6 ×10⁴
락토바실러스 속 EUG4048(KCCM-10271)	< 10⁴
락토바실러스 속 EUG6017(KCCM-10273)	< 10⁴
락토바실러스 속 EUG4066(KCCM-10270)	< 10⁴

상기 표 2를 통하여, 실시예 3에서 분리한 5 종의 김치 유산균의 인체 위암종 세포인 카토 Ⅲ에 부착한 헬리코박터 파이로리의 균수가 월등히 적음을 확인함으로써, 본 발명에서 김치로부터 분리한 5 종의 유산균이 헬리코박터 파이로리의 위장으로의 부착을 억제함을 알 수 있었다.

실시예 6. 위장 보호 고기능성 김치 제조

상기 실시예 3에서 분리한 루코노스탁 속 EUG4427(KCCM-10274), 락토바실러스 속 EUG6017(KCCM-10273), 락토바실러스 속 EUG4066(KCCM-10270), 락토바실러스 속 EUG4048(KCCM-10271), 및 락토바실러스 속 EUG6404(KCCM-10272)를 동결건조한 다음 분말상태로 만든 후, 1 종 이상의 균주를 혼합하여 김치 ㎏ 당 10⁶∼10¹¹ ,적당하게는 10¹⁰ 마리를 김치 양념에 혼합하여 통상의 김치 제조방법으로 위장 보호 고기능성 김치를 제조하였다.

본 발명의 김치 유산균은 위점막 조직에 서식하는 헬리코박터 파이로리의 위장에의 부착을 저해하고 생육을 억제하여 헬리코박터 파이로리의 박멸, 및 재감염 방어에 매우 효과적이다. 또한 상기 김치 유산균을 함유하는 위장 보호 고기능성 김치는 헬리코박터 파이로리로 인한 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양의 예방 및 치료에 효과적이다.

Claims

헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)의 생육을 억제하고 위에의 부착을 저해하는 락토바실러스 속 EUG4048(KCCM-10271) 김치 유산균.
제 1 항에 있어서,

상기 김치 유산균은 김치 숙성온도 1∼40 ℃에서 김치제조 시로부터 90 일, 또는 pH가 약 3.0이 되는 시기까지 진행시키면서 분리된 헬리코박터 파이로리의 생육을 억제하고 위에의 부착을 저해하는 락토바실러스 속 EUG4048(KCCM-10271) 김치 유산균.
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상기 제 1 항 또는 제 2 항의 김치 유산균을 함유하는 헬리코박터 파이로리로 인한 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양의 예방 및 치료용 기능성 식품.
상기 제 1 항 또는 제 2 항의 김치 유산균을 함유하는 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양의 예방 및 치료용 위장 보호 고기능성 김치.
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