IT201800009755A1

IT201800009755A1 - Nuovi probiotici utili per eradicare l'infezione da helicobacter pylori

Info

Publication number: IT201800009755A1
Application number: IT102018000009755A
Authority: IT
Inventors: Berardino Vaira
Original assignee: Berardino Vaira
Priority date: 2018-10-24
Filing date: 2018-10-24
Publication date: 2020-04-24
Also published as: US20210379125A1; EP3870195B9; CN113453697A; CA3117467A1; WO2020083983A1; EP3870195A1; ES2955400T3; HUE063305T2; PL3870195T3; EP3870195B1; EP3870195C0; CN113453697B

Description

DESCRIZIONE

CAMPO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione riguarda il campo dei microorganismi probiotici e il loro uso in medicina, in particolare, nel trattamento e nella prevenzione di infezioni batteriche. L’invenzione riguarda inoltre la modificazione di microrganismi probiotici allo scopo di migliorare la loro efficacia terapeutica, in particolare nell’area di trattamento e prevenzione dell’infezione da Helicobacter pylorì.

STATO DELL’ARTE

Helicobacter pylorì è un microrganismo gram negativo, acidofilo e capnofilo che ha trovato il suo rifugio nello stomaco umano e si è evoluto insieme all’uomo. Ad oggi, questa specie infetta più del 50% della popolazione globale adulta (Hooi). La colonizzazione della mucosa gastrica stimola un’intensa risposta immunitaria e infiammatoria locale e sistemica, che, insieme a sostanze tossiche prodotte dai batteri, causa ulcerazione peptica nel 10%-20% degli individui infettati e cancro gastrico nell’1%-3% (Suerbaum S, Michetti P).

L’eradicazione dellinfezione può essere raggiunta mediante trattamento con un inibitore della pompa protonica (“proton pump inhibitor”, PPI) associato ad antibiotici come amoxicillina, claritromicina, un nitroimidazolo, un fluorochinolone e tetraciclina, usati spesso in combinazione (Malfertheiner) . L’uso durevole di questi antibiotici ha finito per selezionare ceppi chemioresistenti, con una conseguente consistente riduzione dei tassi di guarigione. Inoltre, la somministrazione di antibiotici determina spesso effetti avversi che in molti casi possono portare alla sospensione del trattamento (Alba).

La somministrazione di microrganismi probiotici (probiotici) in aggiunta ai classici protocolli di cura ha recentemente assicurato alcuni miglioramenti del successo terapeutico in termini di aumento delle percentuali di eradicazione e riduzione di effetti indesiderati (Dang). I probiotici usati più frequentemente appartengono ai generi Lactobacillus e Bifidobacterium. Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium lactis sono le specie impiegate più frequentemente poiché la loro somministrazione agli esseri umani è stata considerata sicura (Dang, Borriello). Questi organismi sono acidofìli e resistenti alla bile; essi aderiscono alle cellule in vitro e possono esercitare un’attività battericida contro H. pylori producendo acidi, batteriocine ecc., cfr. ad es. US2016/0279180. Ceppi di Bifìdobacterium animalis lactis (LAFTI® B94, Lallemand Health Solutions) sono anche usati per trattare malattie diverse daH’infezione da H.pylori, ad es. sindrome dell’intestino irritabile. I probiotici possono anche migliorare la risposta immunitaria a patogeni dell’intestino. L’immunomodulazione può essere raggiunta inibendo immunocid a produrre citochine pro-infiammatorie e/o stimolandoli a secernere citochine antinfiammatorie (Foligne). Tuttavia, i risultati ottenuti in quest’area sono stati discordanti, con eradicazione migliorata di H.pylori in alcuni studi e nessun effetto significativo in altri (Cekin). In particolare, sono state riportate grandi variazioni di attività su H.pylori tra Lactobacillus acidophilus e Bifìdobacterium animalis lactis di diverse origini, evitando pertanto una generalizzabilità di attività tra questi ceppi (Dang). La suscettibilità dei probiotici agli antibiotici comunemente usati nel trattamento di H.pylorì è anche un fattore limitante l’efficacia nella vita reale della terapia combinata probiotico /antibiotico; in particolare, le specie di Lactobacillus, incluso L, acidophilus, sono generalmente sensibili ad amoxicillina - che è la chiave di tutti i protocolli terapeutici per l’eradicazione di H.pylori - e claritromicina (Stsepetova). B. lactis è anche sensibile a amoxicillina (Morovic) . La suscettibilità all'eritromicina (rappresentante i macrolidi) è intermedia, ossia bassa; ma i livelli di macrolidi nello stomaco (dopo la somministrazione di una dose terapeuticamente efficace) sono con tutta probabilità molto maggiori delle loro concentrazioni inibitorie minimali (“minimal inhibitory concentration”,MIC) contro H. pylort Ceppi di Bifidobacterìum si sono rivelati sensibili in modo variabile alla claritromicina, il che può spiegare il loro limitato successo come adiuvanti per questo antibiotico nel trattare l’infezione da Hpylori. (Collado). Combinazioni di probiotici tra cui le specie di Lactobacillus e Bifidobacterìum sono state usate come adiuvante al trattamento antibiotico dell’infezione da H.pylori, tuttavia anche in questo caso con risultati discordanti (articolo di rassegna in McFarland).

Pertanto, rimane la necessità di rendere disponibili trattamenti efficaci dell’infezione da H.pylori che prevedano l’uso di agenti probiotici. Una necessità particolare è quella di trovare probiotici stabilmente efficaci, ossia che mostrano livelli di attività stabili e riproducibili, in particolare quando usati in combinazione con specifiche terapie antibiotiche. Un’ulteriore necessità è quella di migliorare l’efficacia di miscele di antibiotici note nel trattamento di H.pylori, ad es. mediante forte potenziamento e/o sinergie della velocità totale di eradicazione di H.pylori. Un’ulteriore necessità è quella di identificare agenti in grado in modo affidabile di ottenere una riduzione dei dosaggi di antibiotico usato in protocolli di trattamento per infezione da H.pylori, senza pregiudicare il livello di attività dell'antibiotico. Un’ulteriore necessità è quella di identificare agenti in grado in modo affidabile di ottenere una riduzione degli effetti collaterali di antibiotico usato in protocolli di trattamento per infezione da H.pylori, senza pregiudicare il livello di attività dell’antibiotico .

SOMMARIO

Sono stati ora ottenuti nuovi cloni probiotici che mostrano un’attività particolarmente elevata contro l’infezione da Helicobacter pylori. I nuovi cloni sono stati derivati da Lactobacillus acidophilus, ceppo LA- 14 e Bifidobacterium animalis lactis, ceppo BI-04, che sono entrambi resistenti per natura a levofloxacina e metronidazolo. I presenti nuovi cloni sono resistenti agli antibiotici amoxicillina e/o claritromicina, che sono tipicamente usate nel trattamento di infezione da Helicobacter pylori: questo li rende ideali per il co -trattamento di infezione da Helicobacter pylori in combinazione con detti antibiotici. La stabilità dei livelli di resistenza dei nuovi cloni a specifici antibiotici è stata verificata. Sono qui divulgati effetti sinergici di combinazioni reciproche dei nuovi probiotici, così come il loro marcato contributo agli effetti di inibizione di H.pylori di antibiotici come claritromicina o amoxicillina.

DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Figura 1: Metodo della diluizione in terreno broth (metodo gold standard) usando scatole a scacchiera da 96 pozzetti.

Figura 2: schema di diluizioni della scacchiera: In colonna 1: diluizioni scalari di antibiotici (amoxicillina o claritromicina) . In colonna 2: diluizioni scalari di surnatanti miscelati ( L.acidophilus o B.lactis dalla coltura in terreno broth durante la notte). Da colonna 3 a 12: diverse combinazioni di concentrazioni di surnatante e antibiotico. Pozzetto A 12: controllo positivo

Figura 3: Semine a forma di croce per sinergia batteriostatica

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

Con il termine “clone” usato qui si intende una frazione di microrganismi derivati per selezione da una popolazione originaria più ampia di microrganismi; rispetto alla popolazione originaria, i microrganismi del clone mostreranno caratteristiche più omogenee; il termine “clone” comprende inoltre possibili “subcloni” ottenuti mediante ulteriore selezione/ i da un clone precedente; il termine “selezione” usato qui non esclude la possibilità che avvenga modifica strutturale o genetica di microrganismi durante il processo di selezione, in modo tale che la popolazione di cloni finale possa includere microrganismi non originariamente presenti nella popolazione originaria. I termini "clone” o “cloni” sono qui indifferentemente riferiti a uno qualsiasi dei nuovi cloni dell’invenzione, se non diversamente specificato; ai cloni dell’invenzione ci si può anche riferire come a “i presenti cloni”, “i cloni della presente invenzione”, “i probiotici dell’invenzione”, “i microrganismi probiotici dell’invenzione”, “i presenti probiotici”, “i microrganismi probiotici della presente invenzione”, tutti questi sono usati come sinonimi.

In qualsiasi momento sia usato qui, con il termine “associazione” si intende la co-presenza e/o l’uso congiunto degli oggetti associati.

I termini “co-trattamento” o “trattamento combinato” sono qui sinonimi e si riferiscono a un trattamento che usa due o più agenti attivi, come specificato nel contesto.

Con il termine “co-formulazione” o “co-formulato” si intende la formulazione di due o più ingredienti stesso prodotto.

Quando usato in riferimento ai presenti cloni, con il termine “resistenza all’antibiotico” si intende la resistenza del clone all’attività dell’antibiotico che inibisce la crescita; questa proprietà è anche indicata come “non-suscettibilità” o “chemioresistenza”, usati qui tutti come sinonimi.

Un primo oggetto della presente invenzione sono nuovi cloni di specifici ceppi di microrganismi probiotici, detti cloni essendo selezionati e isolati per la prima volta dalla presente Richiedente. I ceppi di microrganismi probiotici, fonte dei presenti cloni sono Lactobacillus acidophilus, ceppo LA- 14 e Bifidobacterium animalis lactis, ceppo BI-04. I nuovi cloni, oggetto dell’invenzione, sono i seguenti:

- Lactobacillus acidophilus LA- 14, clone LAA8, con numero di deposito: DPS RE RSCIC 5;

- Lactobacillus acidophilus LA- 14, clone LAC6, con numero di deposito: DPS RE RSCIC 6;

- Bifidobacterium animalis lactis BI-04, clone BLAC86, con numero di deposito: DPS RE RSCIC 7;

- Bifidobacterium animalis lactis BI-04, clone BLA8, con numero di deposito: DPS RE RSCIC 8; e

- Bifìdobacterium animalis lactis BI-04, clone BLC6, con numero di deposito: DPS RE RSCIC 9.

I cinque cloni della presente invenzione sono caratterizzati per prima cosa dai loro numeri di deposito. Sono inoltre caratterizzati dalla loro origine tassonomica, essendo derivati specificamente dai ceppi: Lactobacillus acidophilus LA- 14 o Bifìdobacterium animalis lactis BI-04. Questi ceppi sono disponibili in commercio e possono essere ottenuti ad es. da Florafit® Probiotics, Dupont Nabisco (B. animalis lactis Bl-04 (ATCC: SD5219) e L.acidophilus La- 14 (ATCC: SD5212) o da Prolife® Vis, Zeta Farmaceutici). I termini LAA8, LAC6, BLAC86, BLA8 e BLC6 sono nuovi e usati qui dalla Richiedente per indicare ciascuno dei diversi cloni dell’invenzione. I cloni depositati di cui sopra possono anche essere caratterizzati mediante il loro sequenziamento genetico, come descritto in dettaglio nella sezione sperimentale.

I cloni della presente invenzione sono inoltre caratterizzati dalle loro attività farmacologiche. Essi hanno infatti alcune proprietà interessanti, ossia: (a) una considerevole attività contro Helicobacter pylorì; (b) un’inaspettata attività sinergica su Helicobacter pylori quando usati in combinazioni reciproche; (c) una resistenza considerevolmente elevata (ossia non suscettibilità) agli antibiotici (in particolare claritromicina e/o amoxacillina) , usati comunemente per l’eradicazione di Helicobacter pylorì il che li rende massimamente utili in un trattamento combinato di infezione da Helicobacter pylorì in associazione con detti antibiotici; (d) un effetto adiuvante inaspettatamente elevato nell'inibire la crescita di infezione da Helicobacter pylori, quando usati in associazione con detti antibiotici.

L'attività dei presenti cloni nell'inibire la crescita di H.pylori può essere valutata mediante metodi convenzionali, ad es. seminando il clone interessato su una coltura solida di H. pylori e verificando la formazione /estensione di una zona di inibizione di crescita in corrispondenza del sito di semina; come esempio alternativo, l’attività dei cloni può essere valutata mediante il “metodo della diffusione da pozzetto in agar” (“agar well diffusion method”), in cui le sospensioni probiotiche sono inserite in pozzetti scavati in piastre di agar sulle quali è coltivato H.pylori. Dopo l'incubazione sono rilevabili zone di Inibizione.

Si può valutare la sinergia tra due o più dei presenti cloni nell 'inibire la crescita di H.pylori evidenziando effetti più che additivi dei cloni combinati rispetto ai cloni separati; la valutazione può essere fatta mediante metodi convenzionali, ad es. seminando separatamente i cloni interessati in aree che si sovrappongono parzialmente di una coltura solida di H.pylori (cfr. semina a forma di croce) e confrontando la formazione/ estensione di una zona di inibizione di crescita in corrispondenza dei siti di semina, sia nelle aree che si sovrappongono che in quelle che non si sovrappongono. Tutte le combinazioni dei presenti nuovi cloni sono parte della presente invenzione; combinazioni preferite sono quelle comprendenti:

(i) uno o più tra Lactobacillus acidophilus LA- 14 clone LAA8 (numero di deposito: DPS RE RSCIC 5); e Lactobacillus acidophilus LA- 14 clone LAC6 (numero di deposito: DPS RE RSCIC 6); e

(ii) uno o più tra Bifidobacterium animalis lactis BI-04 clone BLAC86 (numero di deposito: DPS RE RSCIC 7); Bifidobacterium animalis lactis BI-04 clone BLA8 (numero di deposito: DPS RE RSCIC 8); e Bifidobacterium animalis lactis BI-04 clone BLC6 (numero di deposito: DPS RE RSCIC 9).

Il livello di resistenza (non suscettibilità) dei presenti cloni a un dato antibiotico può essere valutato come la minima concentrazione inibitoria (“minimum inhibìtory concentration”, MIC) dell’antibiotico sulla crescita del clone interessato: un’elevata MIC denota un’elevata resistenza del clone interessato. La resistenza agli antibiotici mostrati dai presenti cloni è particolarmente vantaggiosa poiché riguarda antibiotici attualmente usati per l’eradicazione dell’infezione da H.pylori, in particolare amoxicillina, claritromicina e loro derivati; il raggiungimento di questo risultato è persino più notevole se si considera che le specie Lactobacillus e Bifidobacterium sono normalmente sensibili a tali antibiotici. Contrariamente alla prassi in altri trattamenti medici, la resistenza ad antibiotico tipica dei presenti cloni probiotici è desiderabile poiché consente di usarli nel co-trattamento con rantibiotico senza esserne inibiti; persino dopo l’eradicazione dell’infezione da H.pylori, la resistenza acquisita ad antibiotico del presente probiotico rimane benefica per il paziente poiché le specie in questione ( Lactobacillus , Bifidobacterium) sono componenti naturali della flora intestinale e sono in essa facilmente integrate in forma resistente, proteggendo pertanto la funzione intestinale del paziente anche in caso di trattamenti antibiotici futuri. Come supportato nella sezione sperimentale, tutti i cloni presenti sono caratterizzati da un’elevata resistenza verso l’amoxicillina e/o la claritromicina e loro derivati; i cloni dell’invenzione hanno mostrato un livello di resistenza ad antibiotico (espressa come MIC del corrispondente antibiotico sulla crescita del clone pertinente) maggiore di 5 μΜ/mL, il che è generalmente considerato un elevato livello di resistenza ad antibiotico. Specificamente, è stato riscontrato che i cloni LAA8 e BLA8 erano altamente resistenti all' amoxicillina; è stato riscontrato che i cloni LAC6 e BLC6 erano altamente resistenti alla claritromicina; è stato riscontrato che il clone BLAC86 era altamente resistente a sia amoxicillina sia claritromicina. A causa del suo più ampio spettro di resistenza ad antibiotico, il clone BLAC86 è particolarmente preferito in questa invenzione.

L’effetto adiuvante dei presenti cloni sull’attività di antibiotici nell’inibizione della crescita di H.pylori può essere valutato mediante metodi standard, tipicamente confrontando la MIC dell’antibiotico su H.pylori in assenza in confronto a in presenza del clone interessato, in cui una diminuzione della MIC corrisponde a un aumento dell’attività battericida; come supportato nella sezione sperimentale, i presenti cloni hanno causato un marcato aumento dell’attività battericida degli antibiotici testati, ossia una diminuzione da 100 a 1000 volte della corrispondente MIC. Questo effetto è di particolarmente importanza poiché consente, all’interno di un trattamento combinato probioticoantibiotico, di sostanzialmente ridurre la quantità di antibiotico somministrato senza provocare una riduzione di efficacia della velocità di eradicazione di H.pylorì, la minore quantità di antibiotico somministrato ha evidenti vantaggi in termini di rischio ridotto di accumulo di antibiotico / effetti collaterali per il paziente e rischio ridotto di formazione di ceppi di H.pylori resistenti all’antibiotico a vantaggio del paziente e dell’ambiente.

Un ulteriore oggetto della presente invenzione è fornire microrganismi probiotici della presente invenzione, mai isolati e/o caratterizzati prima, per l’uso in medicina. Un ulteriore oggetto della presente invenzione è fornire microrganismi probiotici della presente invenzione per l’uso nel trattare o nel prevenire qualsiasi condizione che richiede la somministrazione di un microrganismo probiotico, in cui l’uso dei presenti cloni implica speciali vantaggi in termini di stabilità e elevato livello di resistenza a trattamenti antibiotici futuri o contemporanei. L’invenzione contempla inoltre un metodo per trattare o prevenire una condizione che richiede la somministrazione di un microrganismo probiotico, comprendente la somministrazione dei microrganismi probiotici qui sopra descritti a un paziente umano o animale che ne necessita. Esempi di condizioni che richiedono trattamento probiotico sono: alterazioni nella flora intestinale e malattie gastrointestinali associate, condizioni indebolite in seguito a malattie che colpiscono il sistema gastrointestinale, malattie che comportano una riduzione o sbilanciamento dell’assimilazione del cibo, ipersensibilità o intolleranza a ingredienti alimentari, ecc.

Un ulteriore oggetto dell’invenzione è fornire i presenti microrganismi probiotici per l’uso nel trattare o prevenire infezioni da Helicobacter pylorì. Analogamente, l’invenzione contempla un metodo per tratare o prevenire infezioni da Hélicobacter pylon, comprendente la somministrazione dei microrganismi probiotici qui sopra descritti a un paziente che ne necessita. Analogamente l’invenzione include l’uso dei presenti microrganismi probiotici per la produzione di un medicinale per tratare o prevenire infezioni da Helicobacter pylon.

Come qui riportato, i nuovi cloni probiotici della presente invenzione sono efficaci neH’inibire la crescita di H.pylori quando usati come tali, o quando usati in combinazione l’uno con l’altro, o quando usati in combinazioni con un trattamento antibiotico di infezione da H. pylon.

Non sono previste specifiche limitazioni riguardo ai dosaggi e agli schemi di somministrazione dei presenti microrganismi probiotici; questi possono essere facilmente adattati in funzione della specifica necessità del paziente (entità/ corso della malattia, condizioni generali del paziente, ecc.). Come esempio non limitativo, dosaggi giornalieri dei presenti microrganismi probiotici saranno compresi tra 10<^9 >e 5x10<^ >unità formanti colonia (CFU)/ giorno, preferibilmente tra 5x1 0<^9 >e 2.5x10<^11 >CFU/giomo, più preferibilmente tra 8x10<^9 >e 1,5x10<^11 >CFU/giomo, ad esempio può essere menzionato circa 10<^10>; quando uno o più microrganismi probiotici sono usati in combinazione, gli intervalli di dosaggio di cui sopra sono da intendersi essere riferiti alla totalità dei microrganismi usati.

Quando usati in un co-trattamento di infezione da H.pylori con agenti antibiotici, i presenti metodi ottengono lo speciale vantaggio di contare su microrganismi probiotici che sono altamente resistenti agli antibiotici comunemente usati in questo campo, tipicamente claritromicina, amoxicillina e loro derivati. Non è prevista alcuna specifica limitazione riguardo a formulazione, dosaggi e regimi: ad esempio, l’antibiotico può essere co-formulato con il probiotico nella stessa forma di dosaggio, o può essere formulato separatamente attraverso una forma di dosaggio indipendente: nell’ultimo caso il trattamento può essere eseguito assumendo le forme di dosaggio separate in qualsiasi ordine e a qualsiasi distanza di tempo l’una dall’altra, purché possano essere ottenute concentrazioni piasmatiche che si sovrappongono almeno parzialmente dei due agenti. Anche nel caso di terapia combinata, non sono previste limitazioni specifiche riguardo a possibili do saggi /regimi: possono essere variati ampiamente a seconda del corso /gravità della malattia e delle condizioni del paziente. Esemplificazioni non limitative di dosaggi giornalieri sono quelle presentate sopra.

Un ulteriore oggetto dell’invenzione è rappresentato da composizioni e relative forme di dosaggio, caratterizzate dal contenere i presenti microrganismi probiotici e dall’essere adatte alla somministrazione a un paziente umano o animale. Per la preparazione delle composizioni e forme di dosaggio, il presente microrganismo probiotico può essere generalmente fornito in forma liquida o solida, ad esempio sospeso in un mezzo acquoso o adsorbito su un supporto adeguato, ad es. un granulato, ecc. Le composizioni finali possono essere in forma di composizione farmaceutica, integratore alimentare o alimenti integrati, ciascuno contenente i corrispondenti eccipienti accettabili da un punto di vista farmaceutico/alimentare e/o ingredienti, ben noti nel settore. Quando in forma di composizioni farmaceutiche o integratori alimentari, le composizioni possono essere somministrate senza limitazione attraverso qualsiasi via di somministrazione; tuttavia, considerando il sito intestinale di azione degli attuali probiotici, la via di somministrazione preferita è quella orale. In quest’ultimo caso, tutte le forme di dosaggio note adatte alla somministrazione orale sono contemplate dalla presente invenzione; forme di dosaggio esemplificative sono, senza limitazione: compresse, capsule, microcapsule, pillole, pastiglie, confetti, polveri, granulati, microgranulati, palline (pellets), film bioadesivi, soluzioni, sospensioni, emulsioni, microemulsioni, gel, sciroppi, elisir, gomma da masticare, gocce, spray, aerosol e simili. Quando in forma di alimenti integrati, le composizioni saranno somministrate per via orale in qualsiasi forma possibile, in presenza di consueti ingredienti alimentari, a seconda dell’alimento scelto; esempi di possibili alimenti sono bibite, succhi di frutta, yogurt, creme, creme spalmabili, formaggi, snack, barrette e simili.

Per eseguire i trattamenti combinati probiotico-antibiotico, tutte le composizioni a cui ci si riferisce sopra possono comprendere, oltre ai microrganismi probiotici dell’invenzione e agli eccipienti/ ingredienti/ alimenti citati, uno o più antibiotici diretti al trattamento dell’infezione da H.pylori ; detti antibiotici sono scelti preferibilmente tra claritromicina, amoxicillina e loro derivati, gli ultimi essendo qui indicati con “antibiotici da claritromicina” o “antibiotici da amoxicillina” .

Per i trattamenti combinati probiotico-antibiotico, la presente composizione può anche essere fornita all’utente in forma di kit di parti, in cui il kit comprende una fornitura dei presenti microrganismi probiotici e una fornitura separata di un antibiotico diretto contro Helicobacter pylori Le forniture di cui sopra possono essere fomite per somministrazione separata o congiunta. Per la somministrazione separata, il kit potrebbe essere ad es. in forma di blister contenenti una o più unità di dosaggio contenenti il probiotico dell’invenzione, e una o più unità di dosaggio contenenti l’antibiotico, dove le diverse forme di dosaggio sono rese identificabili all’utente; il kit può includere uno o più blister tra cui le diverse forme di dosaggio possono essere variamente distribuite. Per la somministrazione congiunta, il kit può ad es. includere mezzi che consentono all’utente di miscelare estemporaneamente il probiotico e l’antibiotico nello stesso veicolo prima della somministrazione, consentendo pertanto una somministrazione contemporanea semplificata di entrambi gli agenti.

La presente invenzione è ora ulteriormente descritta in maniera non limitativa attraverso i seguenti esempi.

PARTE SPERIMENTALE

1. Isolamento di nuovi cloni resistenti ad amoxicillina e claritromicina

L.acidophilus LA- 14 e B.animalis lactis BL-04 selvatici (wildtype) (Florafit® Probiotics, Dupont Danisco) sono stati usati come materiale di partenza.

La resistenza ad Amoxicillina (MIC) era relativamente bassa, ossia 0,5 pg/ml e 0,25 pg/ml per rispettivamente L.acidophilus e B.lactis. Anche la resistenza a Claritromicina MIC era bassa, ossia 0,125 pg/ml e 0,016 μg/ml per rispettivamente L.acidophilus e B.lactis. Lo stato resistente era stabile dopo ripetuto congelamento / scongelamento e dopo liofilizzazione.

L’attività batteriostatica contro H.pylorì è stata rilevata mediante metodo della diffusione da pozzetto in agar; l’attività battericida mediante il metodo della curva time-kill (“Time-kill Curve method”) .

Abbiamo isolato cinque cloni resistenti ad antibiotico dopo aver subcoltivato i due organismi selvatici in agar MRS (De Man Rogosa Sharpe) con concentrazioni crescenti di antibiotico, partendo da 1/4 della MIC originaria fino a 8 pg/ml per amoxicillina e 6 μg/ml per claritromicina. I ceppi con i livelli più elevati possibili di resistenza sono stati subcoltivati più volte, congelati in glicerolo-broth o liofilizzati. Dopo il congelamento/liofìlizzazione, sono stati eseguiti test di farmaco suscettibilità per confermare la stabilità dei livelli di resistenza. Per sia L. acidophilus LA- 14 SIA B.animalis lactis BL-04 siamo stati in grado di identificare e isolare cloni con elevata resistenza a claritromicina o amoxacillina; inoltre, per B.animalis lactis BL-04 abbiamo potuto identificare e isolare un clone con elevata resistenza ad entrambi gli antibiotici. I cinque cloni isolati sono elencati di seguito, con l’indicazione della loro resistenza ad antibiotico (CLA=claritromicina; AMO=amoxicillina) e numero di deposito in conformità al Trattato di Budapest:

- Lactobacillus acidophilus LA- 14 clone LAA8 (resistente ad AMO) - numero di deposito: DPS RE RSCIC 5

Lactobacitus acidophilus LA- 14 clone LAC6 (resistente a CLA) - numero di deposito: DPS RE RSCIC 6

Bifidobacterium animalis lactis BI-04 clone BLAC86 (resistente ad AMO+CLA) - numero di deposito: DPS RE RSCIC 7

Bifidobacterium animalis lactis BI-04 clone BLA8 (resistente ad AMO) - numero di deposito: DPS RE RSCIC 8;

Bifidobacterium animalis lactis BI-04 clone BLC6 (resistente a CLA) - numero di deposito: DPS RE RSCIC 9.

2. Sequenziamento di DNA

I ceppi selvatici originari e i cinque cloni isolati descritti sopra sono stati sottoposti a sequenziamento di DNA. Il DNA dei ceppi originari e dei nuovi probiotici chemioresistenti è stato sequenziato dalla Dr. Greta Immobile Muraro, Polo d’innovazione di Genomica, Genetica e Biologia Società Consortile R.L., Siena, mediante il “Microbial Whole Genome Sequencing 2x150 PE su strumento Illumina MiSeq usando il kit MiSeq Reagent Micro Kit (compresi preparazione delle librerie, pulizia e quantificazione mediante Bioanalyzer Copertura fino a 100 X. Le sequenze sono anche state confrontate con quelle dei ceppi selvatici che sono depositati nella banca genomica BLAST/NCBI per testimoniare la completa assenza di DNA estraneo nei ceppi chemioresistenti mutanti.

Rispetto alla sequenza di DNA di L. acidophilus LA- 14 selvatico, i cloni di L. acidophilus resistenti all’amoxicillina ospitavano 11 siti mutati che possono portare a fino a 112 varianti fenotipiche possibili. I cloni di L.acidophilus resistenti alla claritromicina ospitavano 18 siti mutati, che possono portare a fino a 205 varianti fenotipiche. Rispetto alla sequenza di DNA del B.lactis BL-04 selvatico, il clone di B.lactis resistente ad amoxicillina e claritromicina ospitava 19 siti mutati che possono portare a fino a 199 varianti fenotipiche possibili. Non sono stati rilevati plasmidi nei ceppi originari e nei ceppi resistenti ad antibiotici.

3. Test di suscettibilità ad antibiotico

I test di suscettibilità ad antibiotico di H.pylori e dei ceppi probiotici sono stati eseguiti con il metodo della diluizione in terreno broth (metodo gold standard) usando scatole a scacchiera da 96 pozzetti (Fig. 1). I risultati ottenuti hanno indicato una resistenza allamoxicillina (MIC) di 8 μg/mL per entrambi i cloni LAA8 e BLA8, una resistenza alla claritromicina (MIC) di 6 pg/mL per entrambi i cloni LAC6 e BLC6, e una duplice resistenza ad amoxicillina/ claritromicina (MIC) rispettivamente di 8 e 6 μg/mL per il clone BLAC86; tutti questi valori indicano elevati livelli di resistenza ad antibiotico.

4. Valutazione della sinergia

Per indagare su una possibile sinergia di inibizione della crescita tra i ceppi di Lactobacillus acidophilus e Bifìdobacterium lactis scelti nel contesto della presente invenzione, abbiamo eseguito una semina a forma di croce.

Ceppi di H.pylon sono stati coltivati per 72 ore in agar selettivo a 37°C in condizioni micro-aerobiche, quindi sospese in soluzione salina sterile a una densità corrispondente allo Standard di McFarland di opacità #3 e strisciati in 3 direzioni con un bastoncino di cotone su piastra di agar MHF (Mueller Hinton Fastidious). In ciascuna piastra di agar sono stati seminati L.acidophilus LA- 14 e B.animalis lactis BL-04 lungo due linee perpendicolari; in ciascuna linea sono state seminate circa 10^10 cellule. Le piastre sono state quindi incubate a 37 °C per 48-72 ore. Successivamente, le piastre sono state esaminate per la presenza di aloni di inibizione di crescita (si veda Fig. 3).

Zone di inibizione al bordo della piastra derivano dall’attività batterio statica del singolo ceppo, quelle vicino al centro della piastra derivano dall’attività di entrambi i ceppi (Fig. 3). Se le zone di inibizione tendono ad aumentare verso il centro della piastra, l’effetto batteriostatico è sinergico. Abbiamo osservato un aumento delle zone di inibizione dal bordo verso il centro della piastra, dove i due ceppi probiotici si incontrano. Di fatto la zona di inibizione media distale era 24 mm per L.acidophilus e 10,3 mm per B. lactis; la zona di inibizione media a 1⁄2 del raggio della piastra era 29,5 mm per L.acidophilus e 19,5 mm per B. lactis.

5. Effetto adiuvante del surnatante del probiotico sull’attività dell’antibiotico

Per indagare su un possibile effetto adiuvante o favorevole di L.acidophilus LA-14 e B.animalis lactis BL-04 nei confronti dell’attività di anti-helicobacter di amoxicillina e claritromicina, abbiamo usato il metodo della scacchiera su una piastra da 96 pozzetti. Abbiamo versato 200 μl di surnatante di probiotico coltivato in terreno broth MRS nel primo pozzetto della prima fila (H1, concentrazione iniziale, 1:2) e 200 μl dell’antibiotico negli altri pozzetti della prima colonna (H2-H12); 100 μl di terreno broth Brucella - contenente 10% di siero fetale di vitello inattivato - sono stati aggiunti ai restanti pozzetti. Dopo che tutte le sostanze sono state diluite due volte in senso orizzontale, 100 μΐ del surnatante probiotico sono stati aggiunti a ciascun pozzetto della terza fila contenente diverse concentrazioni dell’antibiotico (H3-A3); successivamente, la diluizione dell’estratto è stata eseguita in senso verticale. Il pozzetto A12 era il controllo negativo (senza alcuna sostanza, Figura 2). In questo modo, ciascun pozzetto diverso dalla terza fila in giù conteneva le due sostanze a diverse concentrazioni. Batteri da colture su piastra di 48 ore sono stati sospesi in terreno broth Brucella a 108 organismi per mi. Due microlitri di sospensione di batteri sono stati fatti gocciolare in ciascuno dei 96 pozzetti contenenti le varie concentrazioni delle sostanze sotto esame. Sono state incubate micropiastre in un ambiente microaerobico a 37 °C per 24 ore. Sono state determinate le MIC come per la diluizione in terreno broth (prima pozzetto non torbido) . Tre μl di miscele sono quindi state subcoltivate da ciascun pozzetto su piastre Petri contenenti Pylori agar; le piastre Petri sono state incubate in un ambiente microaerobico a 37 °C per 3 giorni. MCB è stato considerato come la concentrazione più bassa di antibiotico le quali subcolture su agar hanno mostrato la completa assenza di crescita batterica. I risultati sono stati la media di due determinazioni. Tutti i test sono stati eseguiti in duplicato e sono stati ripetuti tre volte.

I risultati ottenuti sono i seguenti:

La MIC di claritromicina verso il ceppo di H.pylori era 12 μg/ml (MBC: 24 μg/ml). La MIC di amoxicillina era 0,25 μg/ml (MBC: 0,5 pg/ml). Quando il surnatante di probiotico è stato aggiunto agli antibiotici, abbiamo osservato una forte riduzione dei valori di sia MIC sia MBC:

- la MIC di claritromicina è diventata 0, 125 μg/ ml, quasi 1 / 100 della MIC originaria (allo stesso modo, MBC è diventata 0,25 μg/ml) - la MIC di amoxicillina è diventata 0,00025 μg/ml, 1/ 1000 della MIC originaria (allo stesso modo, MBC è diventata 0,0005 μg/ml).

Pertanto l’attività di antibiotico contro H. pylori è aumentata di 100 volte (claritromicina) e 1000 volte (amoxicillina).

I dati di cui sopra si riferiscono a L.acidophilus LA- 14; risultati equivalenti si sono riscontrati per B.lactis BL-04.

Riassumendo, i presenti ceppi di L.acidophilus e B.lactis hanno dimostrato di aumentare l’attività antimicrobica di contro H. pylorì enormemente. Inoltre, essi hanno mostrato una forte sinergia antibatterica contro H.pylori quando testati insieme in vitro. Il sequenziamento di DNA dimostra la totale assenza di plasmidi. Il numero di mutazioni nucleo tidiche di entrambe le specie chemioresistenti le configura come nuove varianti, completamente diverse dai cloni originari.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Microrganismi probiotici scelti nel gruppo costituito da: Lactobacillus acidophilus LA-14 clone LAA8 (numero di deposito: DPS RE RSCIC 5); - Lactobacillus acidophilus LA-14 clone LAC6 (numero di deposito: DPS RE RSCIC 6); Bifidobacterium animalis lactis BI-04 clone BLAC86 (numero di deposito: DPS RE RSCIC 7); Bifidobacterium animalis lactis BI-04 clone BLA8 (numero di deposito: DPS RE RSCIC 8); e Bifidobacterìum animalis lactis BI-04 clone BLC6 (numero di deposito: DPS RE RSCIC 9), e loro combinazioni.
2. Microrganismi probiotici in combinazione secondo la rivendicazione 1, comprendenti: uno o più tra Lactobacillus acidophilus LA-14 clone LAA8 (numero di deposito: DPS RE RSCIC 5); e Lactobacillus acidophilus LA-14 clone LAC6 (numero di deposito: DPS RE RSCIC 6); e uno o più tra Bifidobacterium animalis lactis BI-04 clone BLAC86 (numero di deposito: DPS RE RSCIC 7); Bifidobacterìum animalis lactis BI-04 clone BLA8 (numero di deposito: DPS RE RSCIC 8); e Bifidobacterìum animalis lactis BI-04 clone BLC6 (numero di deposito: DPS RE RSCIC 9).
3. Microrganismi probiotici come descritti in rivendicazioni 1 -2, per uso in medicina.
4. Microrganismi probiotici come descritti in rivendicazione 3, per l’uso nel trattare o prevenire una condizione medica che reagisce a somministrazione di probiotici.
5. Microrganismi probiotici secondo la rivendicazione 4, per l’uso nel trattare o prevenire infezioni da Helicobacter pylori.
6. Microrganismi probiotici per l’uso secondo la rivendicazione 5, in associazione a un trattamento antibiotico diretto contro le infezioni da Helicobacter pylori
7. Microrganismi probiotici per l’uso secondo la rivendicazione 6, in cui detta associazione comprende un trattamento con antibiotici amoxacillina e/ o claritromicina.
8. Microrganismi probiotici per l’uso secondo le rivendicazioni 6-7, in cui l’antibiotico usato nel trattamento associato è somministrato congiuntamente al microrganismo probiotico o separatamente da esso.
9. Composizione comprendente uno o più microrganismi prò biotici come descritti in rivendicazioni 1-2, in associazione a eccipienti accettabili da un punto di vista farmaceutico e/o ingredienti per uso alimentare.
10. Composizione secondo la rivendicazione 9, comprendente inoltre uno o più antibiotici diretti contro infezioni da Helicobacter pylori.
1 1. Composizione secondo la rivendicazione 10, comprendente gli antibiotici amoxacillina e/ o claritromicina.
12. Composizione secondo le rivendicazioni 9-1 1, in una forma adatta alla somministrazione orale.
13. Composizione secondo la rivendicazione 12, in una forma scelta nel gruppo costituito da: compresse, capsule, microcapsule, pillole, pastiglie, confetti, film adesivi, polveri, granulati, soluzioni, sospensioni, emulsioni, microemulsioni, liposomi, gel, sciroppi, elisir, gomma da masticare, gocce, spray, aerosol.
14. Kit di parti comprendente una fornitura dei microrganismi prò biotici descritti nelle rivendicazioni 1-2, e una fornitura separata di un antibiotico diretto contro Helicobacter pylori.
15. Kit di parti secondo la rivendicazione 14 nella forma di un blister comprendente una o più forme di dosaggio contenenti i microrganismi probiotici descritti nelle rivendicazioni 1-2, e una o più forme di dosaggio contenenti un antibiotico diretto contro Helicobacter pylori.