ES2865269T3 - Cepa de Lactobacillus salivarius, una composición que la comprende y usos de la misma - Google Patents

Abstract

Una cepa aislada de Lactobacillus salivarius depositada en la "Colección Española de Cultivos Tipo (CECT)" con el número de referencia CECT 9145.

Description

DESCRIPCIÓN

Cepa de Lactobacillus salivarius, una composición que la comprende y usos de la misma

Campo técnico

La presente invención proporciona una nueva cepa aislada del microorganismo Lactobacillus salivarius, composiciones que la comprenden y usos de la misma en la prevención y/o tratamiento de enfermedades infecciosas, en particular, de enfermedades infecciosas provocadas por Streptococcus agalactiae, más en particular de la septicemia neonatal, infección ginecológica y/o mastitis.

Antecedentes de la técnica

La septicemia neonatal contribuye sustancialmente a la morbilidad y mortalidad neonatal y es un desafío importante para la salud pública global en todo el mundo. Según la edad de inicio, la septicemia neonatal se divide en septicemia de inicio precoz (SIP) y septicemia de inicio tardío (SIT). La SIP se ha definido de forma variable según la edad de inicio, produciéndose bacteriemia o meningitis bacteriana a <72 h en lactantes hospitalizados en la unidad de cuidados intensivos neonatales frente a <7 días en lactantes nacidos a término. La SIP refleja infecciones transplacentarias o, con más frecuencia, ascendentes del tracto genitourinario materno, mientras que la SIT se asocia con el entorno nosocomial o comunitario posnatal, con una incidencia máxima que se ha indicado que está entre los días 10 y 22 después del nacimiento (Van den Hoogen et al., 2010).

Uno de los microorganismos implicados con mayor frecuencia en la SIP, teniendo en cuenta tanto a los lactantes nacidos a término como a los prematuros juntos, es S. agalactiae (estreptococos del grupo B, EGB). Mujeres, hombres y niños de todas las edades tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo pueden ser colonizados por EGB sin tener ningún síntoma. El tubo digestivo, la vagina y la uretra sirven como depósitos para los EGB. Además del estado de portador asintomático, el EGB también puede provocar infecciones maternas, incluyendo infecciones de las vías urinarias, vulvovaginitis, displasia del cuello uterino, endometritis, infección intraamniótica e infecciones de heridas (Muller, et al., 2006; Savini et al., 2013). La tasa de colonización materna es, aproximadamente, 18% (que varían entre 12 y 28%), independientemente de los países o la situación socioeconómica de las mujeres exploradas. Recién nacidos con infección neonatal por EGB, ya sea como SIP o como SIT, pueden presentar enfermedad respiratoria (54 %), septicemia sin foco (27 %) y/o meningitis (15 %).

La prevención usada más habitualmente para la infección por EGB es la quimioprofilaxis intraparto (profilaxis antibiótica intraparto, IAP) con antibióticos para madres con colonización por ^eG^b conocida o estado desconocido. En relación con IAP, las mayores preocupaciones son las crecientes tasas de resistencia a los antibióticos entre los microorganismos clínicamente relevantes y el impacto en la adquisición, composición y desarrollo de la microbiota del lactante.

Otra estrategia contra el EGB ha sido la búsqueda de una vacuna. Sin embargo, las vacunas conocidas no confieren protección contra todos los serotipos de EGB. Incluso si se desarrolla una vacuna eficaz para prevenir la infección por EGB en el futuro, es necesaria una alternativa, ya que no todas las mujeres estarán inmunizadas y la vacuna puede no ser eficaz en mujeres que den a luz prematuramente.

Algunos estudios han evaluado el potencial de diferentes cepas de bacterias del ácido láctico o sus metabolitos para inhibir el crecimiento de S. agalactiae (De Gregorio et al., 2014). Aunque se han realizado esfuerzos, los resultados in vitro no se correlacionan con los resultados in vivo en infecciones del tracto urogenital (De Gregorio et al., 2014), lo que señala la importancia de los ensayos clínicos en seres humanos en los esfuerzos por erradicar S. agalactiae durante el embarazo.

El EGB también es responsable de la mastitis (inflamación de la ubre) en rumiantes, tales como el ganado bovino, y provoca una disminución de la cantidad y calidad de los productos lácteos producidos. Por otra parte, el ganado bovino puede ser una reserva de cepas de S. agalactiae que pueden provocar enfermedades y la muerte en los lactantes. El EGB también es responsable de la mastitis en seres humanos.

Por lo tanto, existe la necesidad de una prevención eficaz de la colonización por EGB, de una prevención de infecciones provocadas por dichas bacterias en mamíferos y de enfoques terapéuticos en el tratamiento de enfermedades provocadas por dicho microorganismo tales como la septicemia neonatal.

Sumario de la invención

Los inventores han encontrado una cepa de L. salivarius que antagoniza EGB y previene la infección por EGB in vivo.

La cepa de la invención es una cepa probiótica segura con la capacidad in vitro e in vivo para erradicar el EGB del tracto intestinal y genitourinario de mujeres embarazadas y/o sus bebés lactantes.

Los inventores han descubierto además que la cepa identificada (a) producía grandes cantidades de ácido láctico, (b) era capaz de producir peróxido de hidrógeno; y (c) en comparación con otras cepas, se encontró que la cepa de la invención mostraba la mejor combinación de adherencia a las células epiteliales, coagregación con EGB e inhibición de cepas de EGB en cocultivos de caldo.

En un ensayo clínico centrado en la erradicación rectal y vaginal del EGB en mujeres embarazadas mediante el uso de la cepa probiótica de la presente invención, se encontró que la cepa de la invención permitió una reducción notable en la tasa de mujeres colonizadas por EGB y condujo a una fuerte reducción en el uso de antibióticos durante el periodo del periparto.

Por tanto, el primer aspecto de la presente invención se refiere a una cepa aislada de L. salivarius depositada en la "Colección Española de Cultivos Tipo (CECT)" con el número de referencia CECT 9145. Esta cepa también se denomina "la cepa de la invención".

La cepa de Lactobacillus salivarius V4II-90 se aisló de un exudado vaginal de una mujer en España y se depositó, según el Tratado de Budapest, en la "Colección Española de Cultivos Tipo (CECT)" de la Universidad de Valencia C.P. 46980 Catedrático Agustín Escardino n.° 9 Paterna, Valencia (España), con el número de referencia CECT 9145. Fue depositada por el depositante Casen Recordati, S.L. (Autovía de Logroño, km 13300, 50180 Utebo, Zaragoza, España) el 26 de abril de 2016. La cepa fue identificada por el depositante con la referencia V4II-90 y recibió el número de referencia CECT 9145. Además, se declaró viable.

En la presente invención, los términos V4II-90 y CECT 9145 se usan indistintamente.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un cultivo bacteriano que comprende la cepa del primer aspecto de la invención. El cultivo bacteriano puede ser un cultivo bacteriano puro.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a la cepa aislada según el primer aspecto de la invención o al cultivo bacteriano del segundo aspecto de la invención para su uso como medicamento.

Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a la cepa aislada del primer aspecto de la invención o al cultivo puro bacteriano del segundo aspecto de la invención para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad infecciosa. Los inventores han descubierto que la cepa de la invención tiene actividad antimicrobiana contra cepas de S. agalactiae: in vitro contra cepas de recién nacidos con septicemia neonatal y contra cepas de mujeres embarazadas; y también in vivo en mujeres embarazadas.

Como se ilustrará en los ejemplos a continuación, la cepa del primer aspecto de la invención también se puede usar como probiótico según las directrices de la FAO, que son las directrices emitidas por la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura.

La cepa de la invención es segura, sobrevive después del tránsito por el tubo digestivo y puede aislarse después de la ingesta oral en el intestino y vías vaginales en mujeres embarazadas.

Por lo tanto, un quinto aspecto de la presente invención se refiere al uso de la cepa aislada del primer aspecto de la invención o el cultivo puro bacteriano del segundo aspecto de la invención como un probiótico, un producto nutracéutico, un preparado alimenticio o un complemento alimenticio.

La cepa de la invención se puede suministrar como ingrediente de una composición que comprende vehículos u otros ingredientes. Por lo tanto, un sexto aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la cepa del primer aspecto de la invención o el cultivo bacteriano del segundo aspecto de la invención como ingrediente activo, junto con cantidades adecuadas de excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Como se ilustra en los ejemplos, la cepa L. salivarius CECT 9145 es una cepa segura que presenta propiedades probióticas. Por este motivo, se puede administrar en forma de un producto comestible que comprende una cantidad eficaz de la cepa de la invención junto con cantidades adecuadas de otros ingredientes comestibles (es decir, compuestos que se pueden comer de forma segura).

Por lo tanto, un séptimo aspecto de la presente invención es un producto comestible que comprende una cantidad eficaz de la cepa del primer aspecto de la invención (L. salivarius CECT 9145) o un cultivo bacteriano del segundo aspecto de la invención como ingrediente activo, junto con cantidades adecuadas de otros ingredientes comestibles. Los expertos en la materia saben que los lactobacilos se pueden usar como vectores de administración de vacunas o como adyuvantes. Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de la cepa del primer aspecto de la invención, o el cultivo bacteriano del segundo aspecto de la invención, o la composición farmacéutica del sexto aspecto de la presente invención como vector de administración de vacunas o, como alternativa, como adyuvante.

Un octavo aspecto de la presente invención se refiere a un dispositivo médico que comprende una cantidad eficaz de la cepa del primer aspecto de la invención, el cultivo bacteriano del segundo aspecto de la invención o la composición farmacéutica del sexto aspecto de la invención como ingrediente activo.

Un noveno aspecto de la presente invención se refiere a un método para obtener un mutante o una variante del mismo de la cepa de L. salivarius CECT 9145, que comprende usar la cepa depositada como se define en el primer aspecto de la invención como material de partida y aplicar mutagénesis, en donde el mutante obtenido conserva o mejora la actividad de la cepa parental depositada para prevenir o tratar una enfermedad infecciosa, en particular una enfermedad infecciosa provocada por S. agalactiae.

Un décimo aspecto de la presente invención se refiere a un kit que comprende una cantidad eficaz de la cepa del primer aspecto de la invención, del cultivo bacteriano del segundo aspecto de la invención o de la composición farmacéutica del sexto aspecto de la invención.

Una realización particular de la invención se refiere al uso de la cepa aislada, el cultivo bacteriano, la composición farmacéutica o el producto comestible de la presente invención en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad infecciosa, en una realización particular, la enfermedad infecciosa provocada por S. agalactiae.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1. Muestra la fuerte coagregación entre L. salivarius V4II-90 y una cepa de S. agalactiae.

FIG. 2. Análisis electroforético del producto de PCR de la región de 148 pb del gen de ARNr 16S con el uso de los cebadores S.agalacFWI y S.agalacRVI obtenidos de Streptococcus peroris DSM 12493 (carril 1); Streptococcus mitis DSM 12643 (carril 2); Streptococcus oralis CECT 907 (carril 3); Streptococcus parasanguinis DSM 6778 (carril 4); Streptococcus bovis dSm 20564 (carril 5); Streptococcus uberis DSM 20564 (carril 6); Streptococcus salivarius CECT 805 (carril 7); Streptococcus thermophilus, ATCC 19987 (carril 8); Streptococcus pneumoniae 0566 (carril 9); Streptococcus dysgalactiae DSM 20662 (carril 10). "M", marcador de peso molecular HyperLader™ IV (Bioline); "CP", control positivo, S. agalactiae, DSMZ 2134; "CN", control negativo. Esta figura es una imagen inversa de los geles de agarosa que contienen tinción de gel de ácido nucleico Gel Red™ 10 000X (Biotium). "pb", par de bases.

FIG. 3. Límite de detección del sistema de PCR en tiempo real, utilizando una serie de diluciones de diez veces de ADN de S. agalactiae DSMZ 2134 como patrón.

FIG. 4. Evaluación cualitativa de S. agalactiae (EGB) en muestras de hisopado rectales (barras grises) y vaginales (barras negras) tomadas con frecuencia regular de participantes que inicialmente dieron positivo para EGB y recibieron la administración oral de L. salivarius V4II-90 (109 ufc/diariamente) (n = 25). "ufc", unidad de formación de colonias.

FIG. 5. Concentración (UFC/ml) de S. agalactiae (EGB) en muestras de hisopado vaginales tomadas regularmente de A) Mujeres con resultado negativo para EGB (n = 18) sin administración oral de L. salivarius V4II-90 (109 ufc/diariamente); B) Mujeres con resultado positivo para EGB (n = 14) sin administración oral de L. salivarius V4II-90; y C) mujeres con resultado positivo para EGB (n = 25) en el grupo de probióticos (109 ufc de L. salivarius V4II-90 diariamente).

FIG. 6. Concentración media (UFC/ml) de S. agalactiae (EGB) en muestras de hisopado vaginales tomadas regularmente hasta el parto de mujeres con resultado positivo para EGB que tomaron109 ufc de L. salivarius V4II-90 diariamente. Las diferencias estadísticamente significativas entre muestras tomadas en diferentes momentos de muestreo se indican con letras (prueba post-hoc de Bonferroni).

Descripción detallada de la invención

Todos los términos que se usan en el presente documento en esta solicitud, salvo que se indique otra cosa, se entenderán en su significado habitual, como se conoce en la técnica. Otras definiciones más específicas para determinados términos como se usan en la presente solicitud son como se establecen a continuación y tienen por objeto aplicarse de manera uniforme a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones salvo que una definición establecida de forma expresa de otro modo proporcione una definición más amplia. Las definiciones proporcionadas en el presente documento se incluyen con fines de comprensión y se espera que se apliquen a lo largo de la descripción, las reivindicaciones y los dibujos.

Resulta evidente que, al usar la cepa depositada como material de partida, la persona experta en la técnica puede, de forma rutinaria, por mutagénesis convencional o técnicas de reaislamiento, obtener mutantes adicionales o variantes de los mismos que conservan o mejoran las características y ventajas relevantes descritas en el presente documento de la cepa de la invención. En una realización del primer aspecto de la presente descripción, el mutante se obtiene usando tecnología de ADN recombinante. En otra realización del primer aspecto de la descripción, el mutante se obtiene mediante mutagénesis aleatoria. Por lo tanto, la descripción abarca también un mutante o variante de la cepa depositada de L. salivarius CECT 9145.

Un "mutante de una cepa bacteriana o una variante de la misma" en la presente descripción abarca bacterias obtenidas por mutación, variación o recombinación de cada una de las cepas, siempre que las bacterias resultantes tengan la capacidad de ser activas contra infección por S. agalactiae o capaz de prevenir enfermedades provocadas por S. agalactiae en animales, incluyendo seres humanos. Es decir, las bacterias resultantes conservan o mejoran la actividad para tratar o prevenir la septicemia de inicio precoz o la septicemia de inicio tardío. En una realización particular de la descripción, el mutante es un mutante modificado genéticamente obtenido por mutagénesis clásica (es decir, usando agentes químicos o físicos) o por técnicas de ingeniería genética.

La cepa de Lactobacillus salivarius CECT 9145, o cualquier mutante o variante de la misma, como se hace habitualmente con productos microbiológicos, se puede suministrar en forma de cultivo bacteriano de la cepa. Este cultivo, así como las bacterias aisladas como se definen en el primer aspecto de la invención, puede usarse como ingrediente de una composición farmacéutica, así como un ingrediente de cualquier producto comestible, tal como un complemento alimenticio.

En una realización particular del primer aspecto de la invención, la cepa aislada de Lactobacillus es el Lactobacillus salivarius depositado en la "Colección Española de Cultivos Tipo (CECT)" con el número de referencia CECT 9145. La cepa aislada, el cultivo bacteriano y la composición farmacéutica de la presente invención son para usar en cualquier mamífero, incluyendo rumiantes y seres humanos.

En una realización del cuarto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, la enfermedad infecciosa está provocada por una cepa de Streptococcus. En otra realización del cuarto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, la enfermedad infecciosa está provocada por una cepa de S. agalactiae.

En la presente invención, las expresiones EGB y S. agalactiae se usan indistintamente.

En otra realización del cuarto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, la enfermedad infecciosa es la septicemia. En otra realización del cuarto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, la enfermedad infecciosa es la septicemia neonatal. En otra realización del cuarto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, la enfermedad infecciosa es la septicemia de inicio precoz.

En otra realización del cuarto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, la enfermedad infecciosa es una infección ginecológica.

Las infecciones ginecológicas son habituales entre mujeres de todas las edades. Entre las infecciones ginecológicas en las que se puede usar la cepa del primer aspecto de la invención o el cultivo bacteriano del segundo aspecto de la invención o la composición farmacéutica del sexto aspecto de la presente invención para su tratamiento o prevención, se incluyen las siguientes: vulvovaginitis, displasia del cuello uterino, endometritis, endometriosis e infección intraamniótica.

"Vaginitis" se refiere a una inflamación de la vagina generalmente debido a una infección que puede dar lugar a flujo, prurito y dolor, y con frecuencia se asocia con una irritación o infección de la vulva. En este último caso, el trastorno se denomina "vulvovaginitis".

Se sabe que varios tipos de vaginitis afectan habitualmente a las mujeres, entre ellos la vaginitis bacteriana (que puede estar provocada por S. agalactiae) y vaginitis inespecífica.

La vaginitis inespecífica es una enfermedad de la vagina provocada por un desequilibrio de la flora bacteriana natural. Un cambio en la flora bacteriana normal, incluyendo la reducción de lactobacilos, que puede deberse al uso de antibióticos, cambios hormonales o desequilibrio del pH, permite que las bacterias dañinas se afiancen y se multipliquen. Este tipo de vaginitis es extremadamente habitual, en particular entre las mujeres en edad fértil.

La endometritis es la inflamación o irritación del revestimiento del útero (el endometrio). La endometritis es provocada por una infección del útero y es más probable que se produzca después de un aborto espontáneo o un parto. También es habitual después de un parto prolongado o una cesárea.

La infección intraamniótica (IIA), también conocida como corioamnionitis, es una inflamación de las membranas fetales (amnios y corion) debida a una infección bacteriana. Normalmente, es el resultado de bacterias que ascienden al útero desde la vagina y, con frecuencia, se asocia con un parto prolongado.

La displasia del cuello uterino se refiere a cambios anómalos en las células de la superficie del cuello uterino (la parte inferior del útero), considerados precancerosos. La displasia del cuello uterino puede ser provocada por algunos carcinógenos producidos por determinadas bacterias. La flora bacteriana anómala mixta también podría influir en la aparición y el crecimiento del cáncer de endometrio uterino.

En otra realización del cuarto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, la enfermedad infecciosa es la mastitis. En una realización particular, la mastitis es la mastitis de un rumiante; en particular es la mastitis de las vacas. En otra realización particular, la mastitis es la mastitis de una mujer.

La mastitis es la inflamación del tejido mamario y provoca dolor mamario, hinchazón, calor y enrojecimiento. La mastitis afecta con mayor frecuencia a mujeres que están amamantando (mastitis de la lactancia), pero puede ocurrir en mujeres que no están amamantando. En mujeres lactantes, puede producirse en el puerperio temprano o en cualquier momento durante la lactancia.

En otra realización del cuarto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, la enfermedad infecciosa se selecciona de una infección de las vías urinarias, bacteriemia (presencia de bacterias en la sangre), septicemia (provocada por bacteriemia), meningitis (inflamación del tejido que rodea el cerebro y la médula espinal, denominado meninges), endocarditis (también denominada endocarditis infecciosa, que es una inflamación del revestimiento interno del corazón), infección de la piel y tejidos blandos u osteomielitis (infección e inflamación del hueso, puede ser aguda y puede desarrollarse a una afección crónica) provocada por S. agalactiae.

En la presente invención, la infección de las vías urinarias incluye la infección de los riñones, uréteres, vejiga y uretra provocada por S. agalactiae.

El cuarto aspecto de la presente invención también se puede formular como el uso de la cepa aislada del primer aspecto de la invención o del cultivo bacteriano como se define en el segundo aspecto de la invención, para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad infecciosa.

El cuarto aspecto de la presente invención también se puede formular como un método para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad infecciosa en donde el método comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la cepa aislada del primer aspecto de la invención o del cultivo bacteriano como se define en el segundo aspecto de la invención, a un sujeto que lo necesite.

En otra realización del cuarto aspecto de la invención, la enfermedad es septicemia, en particular septicemia neonatal y más en particular septicemia de inicio precoz.

Como alternativa, en otra realización del cuarto aspecto de la invención, la enfermedad es una infección ginecológica; en una realización particular, la enfermedad es vulvovaginitis, displasia del cuello uterino, endometritis, endometriosis o infección intraamniótica.

Como alternativa, en otra realización del cuarto aspecto de la invención, la enfermedad es mastitis. La mastitis puede ser mastitis humana, de rumiantes o de ganado bovino.

En la presente invención los términos "sujeto", "paciente" e "individuo" se usan indistintamente.

En la presente invención, la infección provocada por S. agalactiae se produce en un sujeto de cualquier edad, sexo o raza.

En la presente invención el sujeto es un mamífero, tal como un ratón, rata, cobaya, conejo, perro, gato, rumiante, caballo, primate o ser humano. En una realización particular es un rumiante; en una realización más particular es un bovino, cabra u oveja. En otra realización particular, es un ser humano. En una realización más particular, el ser humano es una mujer, más preferentemente una mujer embarazada. En otra realización particular, el sujeto es un recién nacido.

En la presente invención, la expresión "infección provocada por Streptococcus agalactiae" comprende infección asintomática, infecciones de las vías urinarias, vulvovaginitis, displasia del cuello uterino, endometritis, endometriosis, infección intraamniótica, infección neonatal y mastitis. En una realización particular, la infección es una septicemia de inicio precoz. En otra realización particular, la infección es una septicemia de inicio tardío. En una realización particular, la infección neonatal SIP o SIT comprende enfermedad respiratoria, septicemia sin foco y/o meningitis, entre otras.

La infertilidad y la subfertilidad (la condición de ser menos fértil de lo normal, pero aún capaz de efectuar la fecundación) también pueden ser causadas por una infección de Streptococcus agalactiae en machos y hembras. Por lo tanto, la cepa del primer aspecto de la invención, o el cultivo bacteriano del segundo aspecto de la invención, o la composición farmacéutica del sexto aspecto de la presente invención, se puede usar para tratar o prevenir la infertilidad y la subfertilidad.

Como adyuvante, la cepa del primer aspecto de la invención puede estimular el sistema inmunitario aumentando su respuesta a una vacuna que comprende agentes de vacuna de otras enfermedades infecciosas.

En la presente memoria descriptiva, el término "vector" significa que el microorganismo de la invención puede comprender otros antígenos de vacuna de otras enfermedades infecciosas y actuar como un sistema de administración de los mismos.

La cepa del primer aspecto de la invención, o el cultivo bacteriano del segundo aspecto de la invención, o la composición farmacéutica del sexto aspecto de la presente invención, puede usarse en un sujeto colonizado y/o infectado por S. agalactiae (para la prevención o el tratamiento de la enfermedad), siendo el sujeto un animal incluyendo, pero sin limitación, un ser humano. Por tanto, la "composición farmacéutica" también puede ser una composición veterinaria cuando se administra a un sujeto que no sea un ser humano. En una realización preferida, la composición farmacéutica es una composición veterinaria para rumiantes, especialmente para bovinos y vacas. La expresión "farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, se refiere a compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, dentro del alcance del criterio médico razonable, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de un sujeto (p. ej., un ser humano) sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable. Cada vehículo, excipiente, etc., también debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación. Los vehículos, excipientes, etc. adecuados se pueden encontrar en los textos farmacéuticos convencionales e incluyen, a modo de ejemplo, conservantes, aglutinantes, humectantes, emolientes y antioxidantes.

El término "excipiente" se refiere a una sustancia que ayuda en la absorción de la composición farmacéutica o medicamento de la invención, estabiliza dicha composición farmacéutica o ayuda en la preparación de la misma en el sentido de darle consistencia o proporcionarle aromas que la hagan más apetecible o que tenga un sabor agradable. De este modo, los excipientes podrían tener la función de mantener juntos los ingredientes, tales como almidones, azúcares o celulosas, por ejemplo; la función de endulzar; la función de actuar como colorante; la función de proteger el medicamento, tal como aislarlo del aire y/o la humedad, por ejemplo; la función como relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación, sin excluir excipientes de otro tipo no mencionado en este párrafo.

Otra realización del sexto aspecto de la invención se refiere a la composición farmacéutica que comprende además un conservante.

Se entiende por "conservante" una sustancia que mantiene las propiedades del medicamento al inhibir la contaminación por gérmenes; puede ser un conservante iónico o no iónico. El conservante utilizado no será tóxico, será químicamente estable y será compatible con la cepa de la presente invención. Los conservantes conocidos en la técnica actual se pueden usar como conservantes, por ejemplo, conservante puede referirse al ácido benzoico, benzoato sódico, ácido ascórbico, sorbato potásico, metilparabeno, etilparabeno o butilparabeno. Se entiende por "gérmenes" cualquier célula que pueda crecer y multiplicarse en la composición de la invención que no sea la cepa de la invención, por ejemplo, otras bacterias, hongos y levaduras.

Otra realización del sexto aspecto de la invención se refiere a la composición farmacéutica que comprende además un antioxidante.

El término "antioxidante" se refiere a la sustancia que es capaz de retardar o evitar la oxidación. Los agentes antioxidantes conocidos en la técnica actual se pueden usar como agentes antioxidantes, por ejemplo, tocoferol, ácido ascórbico, ascorbato de sodio, ácido tartárico, butilhidroxianisol, ácido cítrico, vitamina A o vitamina E.

Las expresiones "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz", como se usa en el presente documento, significa una cantidad de un agente activo (ingrediente; es decir, una cepa bacteriana, en la presente invención es la cepa L. salivarius CECT 9145 lo suficientemente alta para proporcionar el beneficio deseado, ya sea el tratamiento o la prevención de la enfermedad, pero lo suficientemente baja para evitar efectos secundarios graves dentro del alcance del criterio médico. La dosis particular del compuesto administrado según la presente invención estará determinada, por supuesto, por las circunstancias particulares en torno al caso, incluyendo el compuesto administrado, la vía de administración, la afección particular que se trate y consideraciones similares.

En un aspecto de la presente invención, la cantidad terapéuticamente eficaz se compone de 108 ufc/dosis a 1010 ufc/dosis. En otro aspecto más, se administra en un régimen de dosificación de 109 ufc/dosis al día una vez durante varias semanas.

En una realización particular de las composiciones farmacéuticas del sexto aspecto de la invención y del producto comestible del séptimo aspecto de la invención, la cantidad eficaz de la cepa se compone de 108 ufc/dosis (de composición o producto comestible) a 1010 ufc/dosis de composición o producto comestible. Para los fines de la invención, cualquier intervalo dado incluye los puntos finales tanto inferior como superior del intervalo. Por tanto, las cantidades eficaces en realizaciones particulares son cualquier múltiplo de 1 a 9 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9) de 108 ufc/dosis, de 109 ufc/dosis y de 1010 ufc/dosis. La cantidad indicada como ufc/dosis se refiere a las unidades formadoras de colonias de la cepa de la invención por dosis de composición farmacéutica o producto comestible (en particular, complemento alimenticio).

En otra realización particular, la "cantidad eficaz" de la cepa de la invención se compone de 108 ufc/dosis a 1010 ufc/dosis, y se administra o recomienda en un régimen de dosificación de 1 a 3 dosis que contienen la "cantidad eficaz" al día. En una realización, la cepa de la invención se administra en un régimen de dosificación de 109 ufc una vez al día. La cantidad eficaz de la cepa de la invención se puede administrar durante varias semanas al sujeto, en una realización particular, en un régimen de dosificación de 109 ufc/dosis al día una vez durante varias semanas. En el caso de que el sujeto sea una mujer embarazada colonizada o infectada por S. agalactiae, el régimen de dosificación de la cepa de la invención se puede administrar en cualquier momento del embarazo hasta que se erradique el S. agalactiae. La cepa de la invención se puede administrar hasta el nacimiento del niño. En una realización particular, dicha mujer embarazada recibe la dosis de la cepa de la invención a partir de la semana 20 de gestación, por lo tanto, la primera dosis se puede administrar a los 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 o 42 semanas de embarazo, en una realización particular, la mujer embarazada recibe al menos un mes de tratamiento con la cepa de la invención.

Dicha mujer embarazada puede ser colonizada o infectada por S. agalactiae en el tubo digestivo o el aparato reproductor. La erradicación del S. agalactiae en dicha mujer se puede medir mediante pruebas rutinarias conocidas por el experto en la materia en el tubo digestivo y/o el aparato reproductor.

La composición farmacéutica puede estar en forma de solución, suspensión, composiciones liofilizadas u otras composiciones orales secas (para reconstituir con un vehículo líquido o consumirse directamente), comprimidos, pastillas, cápsulas, etc. En una realización particular, la composición farmacéutica es para administración oral, vaginal, intramamaria, rectal, anal, intravenosa, intraarterial, parenteral, intracraneal, tópica, respiratoria o nasal. En una realización más particular, la composición farmacéutica se puede formular como una composición tópica. Dichas composiciones farmacéuticas tópicas pueden adaptarse para aplicarse sobre la piel y mucosa en forma de: una dispersión vesicular no iónica, emulsión, crema, loción, gel, aerosol, crema-gel, gel-crema, suspensión, dispersión, polvo, barra sólida, toallita, cataplasma, espuma, aerosol, aceite, pomada, líquido, jabón, compresa higiénica, óvulo, tampón pesario, supositorio vaginal o cualquier otra forma conocida en la técnica de cosmética y farmacia. En una realización particular, la composición de la invención se formula en forma de gel y se administra por vía vaginal o cervicouterina mediante una cánula.

En una realización más particular, la composición de la invención es para administración genital, en particular a la vulva, la vagina o el cuello uterino.

En una realización más particular, la composición farmacéutica es una composición intramamaria para aplicar directamente en la zona de la mama con inflamación debida a mastitis. Los expertos en la técnica seleccionarán vehículos y/o excipientes adecuados para formular la composición farmacéutica como se desee. Otras realizaciones incluyen composiciones para la vía oral, vaginal, intramamaria, rectal, intravenosa, intraarterial, parenteral, intracraneal, tópica, respiratoria o nasal.

Bien la composición (de cualquier tipo) que comprende la cepa de L. salivarius CECT 9145 o un mutante o variante de la misma o bien dicha cepa o el cultivo bacteriano pueden estar en forma de preparación criodesecada o liofilizada.

La composición farmacéutica de la invención puede contener adyuvantes.

El término "adyuvante" se refiere a cualquier sustancia que potencie la respuesta de una sustancia determinada. En la presente invención, dicho término se refiere a cualquier sustancia que potencie los efectos de la composición farmacéutica de la invención; se puede referir a cualquier adyuvante conocido por el experto en la técnica.

La composición farmacéutica de la presente invención también puede comprender un prebiótico, fibra; vitamina, mineral, metal, oligoelemento, componente de origen vegetal; componente de origen fúngico, carotenoide, antioxidante o cualquier combinación de los mismos.

Las composiciones pueden comprender un prebiótico y/o una fibra. Como se usa en el presente documento, el término "prebiótico" incluye sustancias o compuestos que afectan de manera beneficiosa al mamífero hospedador al promover selectivamente el crecimiento y/o la actividad de una o más bacterias probióticas en el tubo digestivo del mamífero hospedador, manteniendo de este modo la salud normal o mejorando la salud del hospedador. Normalmente, los prebióticos son carbohidratos, (tales como oligosacáridos), pero el término "prebiótico" como se usa en el presente documento no excluye los que no sean carbohidratos. Muchas formas de "fibra" presentan cierto nivel de efecto prebiótico.

Los ejemplos no limitantes de prebióticos adecuados para su uso en la composición de la presente invención incluyen inulina, ispágula, fructo-oligosacáridos, oligofructosa, galacto-oligosacáridos, isomalto-oligosacáridos xilooligosacáridos, oligosacáridos de soja, gluco-oligosacáridos, manano-oligosacáridos, arabinogalactano, arabinxilano, lactosacarosa, gluconanano, lactulosa, polidextrosa, oligodextrano, gentioligosacárido, oligosacárido péctico, goma xantana, goma arábiga, hemicelulosa, almidón resistente y sus derivados, y mezclas y/o combinaciones de los mismos.

Como se usa en el presente documento, el término "fibra" significa polímeros de carbohidratos, incluyendo los que se encuentran de forma natural en los alimentos cuando se consumen, los que se hayan obtenido a partir de materias primas alimentarias mediante medios físicos, enzimáticos o químicos y polímeros de carbohidratos sintéticos, que son resistentes a la digestión y absorción en el intestino delgado y tienen fermentación parcial en el intestino grueso.

Los ejemplos no limitantes de fibra y polímeros de carbohidratos análogos adecuados para su uso en la composición de la presente invención incluyen pectinas, ispágula, goma guar, goma xantana, alginatos, goma arábiga, fructooligosacáridos, inulina, agar, betaglucanos, quitinas, dextrinas, lignina, celulosas, polisacáridos distintos de almidón, carragenina y mezclas y/o combinaciones de los mismos. En una realización, la fibra son polímeros de glucosa, preferentemente los que tienen cadenas ramificadas. Otros ejemplos no limitantes de fibras adecuadas incluyen oligosacáridos, tales como inulina y sus productos de hidrólisis conocidos habitualmente como fructo-oligosacáridos, galacto-oligosacáridos, xilo-oligosacáridos y oligo derivados del almidón.

La fibra se puede proporcionar en cualquier forma adecuada. Un ejemplo no limitante está en forma de material vegetal que contiene la fibra. Los ejemplos no limitantes de materiales vegetales adecuados incluyen espárragos, alcachofa, cebolla, trigo, achicoria, pulpa de remolacha, residuos de estos materiales vegetales y mezclas de los mismos.

Las composiciones de la presente invención pueden comprender opcionalmente uno o más vitaminas. Cuando determinadas vitaminas, minerales, metales, elementos y similares se incluyen como componentes adicionales en formas de cápsula, comprimido y polvo. La cantidad total de vitamina o vitaminas, en peso, si se proporciona en una premezcla sobre o en un vehículo adecuado, puede comprender de aproximadamente 1 % a aproximadamente 50 %, como alternativa de aproximadamente 1 % a aproximadamente 40 % y, como alternativa de aproximadamente 2 % a aproximadamente 30 %, en peso de la composición. Por lo tanto, cuando las vitaminas, minerales, metales y elementos se ilustran en el presente documento como % en peso de una composición, dicho % en peso incluye cualquier vehículo presente. Con respecto al porcentaje en peso de una vitamina dada como porcentaje de una premezcla o mezcla de vehículo-vitamina, dichos porcentajes pueden variar en gran medida según la vitamina y la cantidad de vitamina deseada, como entendería un experto en la materia. En general, sin embargo, para vitaminas en o sobre un vehículo, la vitamina puede comprender, como porcentaje en peso de vitamina con respecto a vehículo, de aproximadamente 0,0001 % a aproximadamente 50 %, como alternativa de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 45 %, como alternativa de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 40 %, en peso de la composición de vitamina-vehículo.

Las composiciones de la presente invención pueden comprender vitamina D. Los ejemplos no limitantes de vitamina D adecuados para su uso en la presente invención incluyen vitamina D3 (colecalciferol), vitamina D2 (ergocalciferol) y combinaciones de los mismos. Los ejemplos adicionales no limitantes incluyen metabolitos de vitamina D, incluyendo calcidiol, calcitriol y combinaciones de los mismos. La vitamina D puede proceder de fuentes naturales o sintéticas, incluyendo de un extracto de Solanum glaucophylum (malacoxylon), Trisetum flavescens (avena amarilla) o Cestrum diurnum. Se pueden usar vitamina D pura y/o glucósidos de la vitamina D. La composición de la presente invención puede comprender de aproximadamente 50 UI a aproximadamente 500000 UI, como alternativa de aproximadamente 500 UI a aproximadamente 500000 UI, como alternativa de aproximadamente 1000 UI a aproximadamente 500000 UI de colecalciferol, por dosis diaria, como alternativa de aproximadamente 2000 UI a aproximadamente 100000 UI, como alternativa de aproximadamente 10000 UI a aproximadamente 50000 UI y como alternativa de aproximadamente 20000 UI a aproximadamente 40000 UI, por dosis diaria, de colecalciferol. La composición farmacéutica también puede comprender vitamina D2 (ergocalciferol). La composición puede comprender de aproximadamente 50 UI a aproximadamente 500000 UI, como alternativa de aproximadamente 500 UI a aproximadamente 500000 UI, como alternativa de aproximadamente 1000 UI a aproximadamente 500 000 UI y, como alternativa de aproximadamente 5000 UI a aproximadamente 500000 UI de vitamina D2, por dosis diaria de la composición. Cuando están presentes, las composiciones pueden comprender de aproximadamente 1,25 pg a aproximadamente 12,5 mg, como alternativa de aproximadamente 12,5 pg a aproximadamente 12,5 mg, como alternativa de aproximadamente 25 pg a aproximadamente 12,5 mg y como alternativa de aproximadamente 125 pg a aproximadamente 12,5 mg de vitamina D3 y/o D2, por dosis diaria de la composición.

La composición farmacéutica de la presente invención también puede comprender vitamina C. La forma preferida de vitamina C para usar en la composición es como ácido ascórbico o el equivalente de una sal de ácido ascórbico o el equivalente de un derivado de ácido ascórbico. En una realización particular, la forma de vitamina C es como ascorbato de calcio. La vitamina C puede estar en forma de liberación inmediata o en forma de liberación sostenida. Cuando están presentes, las composiciones pueden comprender de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 2000 mg, como alternativa de aproximadamente 80 mg a aproximadamente 1500 mg y como alternativa de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 1000 mg de vitamina C, por dosis diaria de la composición.

La composición farmacéutica de la presente invención también puede comprender vitamina A y/o caroteno. La vitamina A y el caroteno se pueden obtener de fuentes animales o vegetales. La forma animal se divide entre retinol y deshidrorretinol, mientras que el caroteno vegetal se puede dividir en cuatro grupos muy potentes: alfa-caroteno, beta-caroteno, gamma-caroteno y cripto-caroteno. Los ejemplos no limitantes de la vitamina A útiles en la presente invención incluyen vitamina A, retinol, palmitato de retinilo, acetato de retinilo, propionato de retinilo, beta-caroteno, alfa-caroteno, beta-criptoxantina y mezclas de los mismos. Cuando la vitamina A o una de las formas de vitamina A está presente, las composiciones comprenden de aproximadamente 100 UI a aproximadamente 10000 UI, como alternativa de aproximadamente 300 UI a aproximadamente 5000 UI, como alternativa de aproximadamente 400 UI a aproximadamente 2000 UI y como alternativa de aproximadamente 500 UI a aproximadamente 1000 UI de vitamina A y/o una forma de la misma, por día de la composición. La cantidad de especies de vitamina A puede expresarse como UI o como EAR (equivalente de actividad del retinol), que es igual a una cantidad equivalente de retinol en microgramos. Por ejemplo, 10000 UI de vitamina A equivalen a 3000 EAR o 3000 pg de retinol. Cuando la vitamina A (retinol) está presente, las composiciones pueden comprender de aproximadamente 30 pg a aproximadamente 4545 pg, como alternativa de aproximadamente 90 pg a aproximadamente 1500 pg, como alternativa de aproximadamente 120 pg a aproximadamente 600 pg y como alternativa de aproximadamente 150 pg a aproximadamente 300 pg de vitamina A (retinol), por dosis diaria de la composición.

La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender una o más vitaminas B. Los ejemplos no limitantes de vitamina B útiles en la presente invención incluyen vitamina B1 (tiamina), vitamina B2 (riboflavina), vitamina B3 (niacina), vitamina B5 (ácido pantoténico), vitamina B6 (piridoxina, piridoxal o piridoxamina), vitamina B7 (biotina), vitamina B9 (ácido fólico), vitamina B12 (cianocobalamina) y mezclas de las mismas.

Cuando la vitamina B1 está presente, las composiciones pueden comprender de aproximadamente 200 pg a aproximadamente 50 mg, como alternativa de aproximadamente 400 pg a aproximadamente 20 mg y como alternativa de aproximadamente 500 pg a aproximadamente 10 mg de vitamina B1, por dosis diaria de la composición.

Cuando la vitamina B2 está presente, las composiciones pueden comprender de aproximadamente 100 pg a aproximadamente 200 mg, como alternativa de aproximadamente 200 pg a aproximadamente 100 mg y como alternativa de aproximadamente 500 pg a aproximadamente 50 mg de vitamina B2, por dosis diaria de la composición.

Cuando la vitamina B3 está presente, las composiciones pueden comprender de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg, como alternativa de aproximadamente 2 mg a aproximadamente 250 mg y como alternativa de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 100 mg de vitamina B3, por dosis diaria de la composición.

Cuando la vitamina B5 está presente, las composiciones pueden comprender de aproximadamente 500 |jg a aproximadamente 1000 mg, como alternativa de aproximadamente 1000 jg a aproximadamente 500 mg y como alternativa de aproximadamente 2000 jg a aproximadamente 100 mg de vitamina B5, por dosis diaria de la composición.

Cuando la vitamina B6 está presente, las composiciones pueden comprender de aproximadamente 200 jg a aproximadamente 500 mg, como alternativa de aproximadamente 500 jg a aproximadamente 250 mg y como alternativa de aproximadamente 1000 jg a aproximadamente 100 mg de vitamina B6, por dosis diaria de la composición.

Cuando la vitamina B7 está presente, las composiciones pueden comprender de aproximadamente 1 jg a aproximadamente 200 jg, como alternativa de aproximadamente 2 jg a aproximadamente 100 jg y como alternativa de aproximadamente 5 jg a aproximadamente 50 jg de vitamina B7, por dosis diaria de la composición. Cuando la vitamina B9 está presente, las composiciones pueden comprender de aproximadamente 50 jg a aproximadamente 2000 jg, como alternativa de aproximadamente 100 jg a aproximadamente 1000 jg y como alternativa de aproximadamente 200 jg a aproximadamente 500 jg de vitamina B9, por dosis diaria de la composición.

Cuando la vitamina B12 está presente, las composiciones pueden comprender de aproximadamente 0,5 jg a aproximadamente 3000 jg, como alternativa de aproximadamente 1 jg a aproximadamente 1500 jg y como alternativa de aproximadamente 2 jg a aproximadamente 750 jg de vitamina B12, por dosis diaria de la composición.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir minerales, metales y elementos. Los ejemplos no limitantes de minerales, metales y elementos útiles en las composiciones de la presente invención incluyen: hierro, yodo, cinc, cobre y selenio. Cuando están presentes, los minerales, metales y/o elementos están comprendidos entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 50 % en peso de la composición y, como alternativa, entre aproximadamente 2 % y aproximadamente 30 %, en peso de la composición.

Como se usa en el presente documento, los componentes derivados de plantas pueden incluir plantas medicinales, incluyendo las usadas en medicina tradicional nativa americana, china y japonesa, extractos de plantas medicinales y componentes activos aislados de plantas de la flor, las hojas, los tallos, las raíces y las semillas de plantas.

La composición farmacéutica de la presente invención también puede comprender componentes de origen fúngico que se sabe que tienen efectos beneficiosos con respecto a mejorar la respuesta inmunitaria a las afecciones respiratorias. Los ejemplos no limitantes de dichos componentes de origen fúngico incluyen los obtenidos de: setas Maitake y Shiitake (Grifóla frondosa y Lentinus edodes respectivamente) y la seta Reishi (Ganoderma lucidum); levadura (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii) y extractos de la pared celular de células de levadura y mohos, Los componentes de origen fúngico pueden incluir extractos de partículas completas, molidas, de corte tosco y superfinas, extractos micelares y mezclas de los mismos, del hongo. En una realización particular, el componente de origen fúngico puede comprender un extracto de hongo comestible.

La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender al menos un polifenol. Los ejemplos no limitantes de fuentes de polifenoles útiles en la presente invención incluyen extracto de té, extracto de romero, ácido rosmarínico, extracto de café, ácido cafeico, extracto de cúrcuma, extracto de arándano, extracto de semilla de uva y mezclas de los mismos. Los polifenoles tienen actividad antioxidante y efectos antiinflamatorios. Cuando están presentes, las composiciones pueden comprender de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 90 %, como alternativa de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 35%, como alternativa de aproximadamente 1 % a aproximadamente 15 %, como alternativa de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 % y como alternativa de aproximadamente 3 % a aproximadamente 10 % de un polifenol, en peso de la composición.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender un carotenoide. Cuando está presente un carotenoide, el carotenoide se selecciona del grupo que consiste en luteína, astaxantina, zeaxantina, bixina, licopeno y mezclas de los mismos.

Cuando está presente un antioxidante, los ejemplos no limitantes de dichos antioxidantes incluyen tocoferoles (vitamina E), vitamina C, vitamina A, CoQ10, carotenoides de materiales derivados de plantas, selenio o cualquier combinación de los mismos.

La cepa de la presente invención (Lactobacillus salivarius CECT 9145) (o cualquier mutante o variante del mismo de la descripción), tiene propiedades probióticas. Se trata entonces de una cepa probiótica con capacidad de tratar y/o prevenir una infección provocada por S. agalactiae. Como probiótico, esta cepa (o cualquier mutante o variante de la misma) es capaz de resistir el entorno del tubo digestivo, se adhiere bien al epitelio intestinal (como se demostró con la adhesión a las células Caco-2 y las células HT-29), no produce compuestos tóxicos, tiene actividad anti-S. agalactiae y no es tóxica para los animales.

El término "probiótico" debe entenderse en el sentido de la presente invención como microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio para la salud del hospedador. Los beneficios conocidos de la administración entérica de microorganismos probióticos incluyen una mejor defensa del hospedador contra la enfermedad, mejorando las propiedades de la microbiota endógena y aumentando la resistencia a la colonización de la microbiota dañina. Se ha sugerido que los probióticos desempeñan una función importante en la formación o establecimiento de una microbiota intestinal bien equilibrada en bebés o adultos que reciben altas dosis de antibióticos. Se han recomendado bacterias del ácido láctico y Bifidobacterium, especialmente cepas específicas del género Lactobacillus para su uso como probióticos.

La cepa del L. salivarius CECT 9145, cualquier mutante o variante de la misma, así como cualquier cultivo que la comprenda, puede ser un ingrediente de cualquier producto o composición comestible, por lo tanto, puede ser junto con cantidades adecuadas de otros ingredientes comestibles. En este producto o composición comestible, la cepa de L. salivarius CECT 9145 estará en una cantidad eficaz para promover el efecto deseado. Como se ha indicado anteriormente, la cantidad eficaz se compone en particular de (e incluye) 108 ufc/dosis de producto comestible a 1010 ufc/dosis de producto comestible, preferentemente 109 ufc/dosis. En una realización particular, el producto comestible se selecciona del grupo que consiste en un producto lácteo, un yogur, una cuajada, un queso, una leche fermentada, una leche en polvo, un producto fermentado a base de leche, un producto fermentado a base de carne, un helado, un producto fermentado a base de cereales, una bebida, un aperitivo, una harina, un chicle, un dulce, un alimento dulce, un alimento para mascotas, alimento veterinario, un complemento alimenticio o dietético, un alimento funcional, nutracéutico, alimento enriquecido, una fórmula de nutrición clínica, un complemento nutricional, una fórmula para mujeres embarazadas, una fórmula para ancianos y una fórmula para bebés (incluyendo fórmula para recién nacidos y prematuros).

En una realización particular es un alimento para rumiantes, más en particular, alimento para bovinos.

En una realización particular, el producto comestible es un complemento alimenticio que comprende una cantidad eficaz de la cepa como se ha definido anteriormente (L. salivarius CECT 9145) como ingrediente activo junto con cantidades adecuadas de otros ingredientes comestibles. En una realización particular, dicha cantidad eficaz de la cepa se compone de 108 ufc/dosis de composición a 1010 ufc/dosis de composición. En otra realización particular, el complemento alimenticio comprende una cantidad eficaz de la cepa que consiste en L. salivarius CECT 9145. En otra realización particular, el complemento alimenticio comprende una cantidad eficaz de 108 ufc/dosis de composición a 1010 ufc/dosis de composición de la cepa que consiste en L. salivarius CECT 9145.

Las expresiones "complemento alimenticio" o "complemento dietético" se usan en el presente documento como sinónimos y se refieren a composiciones comestibles destinadas a proporcionar nutrientes que de otra manera pueden no consumirse en cantidades suficientes o estar ausentes (por ejemplo, en lactantes, mujeres embarazadas, personas mayores, etc.). Estos complementos incluyen, entre otros, vitaminas, minerales, ácidos grasos, fibra y aminoácidos.

El término "nutracéutico" se refiere a un alimento (o parte de un alimento) que proporciona beneficios médicos o para la salud, incluyendo la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad.

La composición farmacéutica de la presente invención también puede comprender, en otra cepa probiótica de bacterias o levadura, o cualquier combinación de las mismas, tal como cualquier miembro del género Bifidobacterium, Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Bacillus, Torulaspora y levaduras, con propiedades probióticas conocidas.

Entre los Lactobacillus, pueden ser ejemplos no limitantes Lactobacillus acidophilus, L. bulgarius, L. gasseri, L. plantarum, L. casei, L. johnsonii, L. gallinarum, L. amylovorus, L. brevis, L. rhamnosus, L. paracasei, L. crispatus, L. helveticus, L. reuteri, L. GG, L derbrueckii, L. fermentum, L. lactis, L. vaginalis, L. gastricus, L. antri, L. kalixensis, L. kefiranofaciens y L. ultunensis.

La composición farmacéutica puede comprender otra cepa de L. salivarius.

Entre el género Bifidobacterium, los ejemplos no limitantes pueden ser Bifidobacterium bifidum, B. longum, B. adolescentis, B. infantis, B. breve, B. catenulatum, B. animalis, B. angulatum, B. rumiantum, B. gallicum, B. magnum, B. chocrinum, B. cuniculi, B. pseudolongum, B. suis, B. pseudocatenulatum, B. angulatum, B. merycicum, B. gallinarum, B. pullorum, B. boum, B. thermacidophillum, B. thermophillum, B. minimum, B. indicum, B. coryneforme y B. asteroides.

Como se ha explicado anteriormente, otros microorganismos que pueden estar comprendidos en la composición farmacéutica son los de los géneros Streptococcus, Lactococcus, Bacillus o Torulaspora o levaduras, siempre que presenten propiedades probióticas, tales como Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Torulaspora delbrueckii, T. hansenii, T. lactis, T. marxianus y T. lodderae.

Adicionalmente, la cepa como se ha definido anteriormente, es decir, la L. salivarius CECT 9145 o un mutante o variante de la misma, así como cultivos que la comprenden, también se puede usar en un dispositivo médico una vez formulado como ingrediente en un producto considerado por las autoridades como un dispositivo médico o una composición de dispositivo médico. Por tanto, la cepa como se ha definido anteriormente se puede aplicar directamente o como ingrediente de un dispositivo médico. El dispositivo médico comprende una cantidad eficaz de la cepa de la invención junto con cualquier excipiente y/o vehículo aceptable y/o cualquier otro componente que defina el dispositivo médico (es decir: cualquier soporte o tela tejida o no tejida). En una realización particular, el dispositivo médico comprende una cantidad eficaz de la cepa que consiste en L. salivarius CECT 9145.

La expresión "dispositivo médico" significa, según lo definido por la Directiva europea 2007/47/EC, cualquier producto, instrumento, dispositivo, aparato, programa informático, material o artículo usado en el ámbito médicosanitario y regulado por la Directiva europea 90/385/CEE de dispositivo médico implantable activo, 98/79/CE de dispositivos médicos para diagnóstico in vitro y 93/42/CEE para dispositivos médicos generales. Los dispositivos médicos están incluidos en las tecnologías sanitarias. Se usan en seres humanos para el diagnóstico, la prevención, el control, el tratamiento o el alivio de una enfermedad, para la compensación de una deficiencia; para investigación, sustitución o modificación de la anatomía o un proceso fisiológico; y para la regulación de la anticoncepción. Los productos sanitarios de la presente invención se refieren a composiciones o formulaciones ("composiciones de productos sanitarios"), o a productos o dispositivos que comprenden dichas composiciones o formulaciones, que comprende una cantidad eficaz de la cepa como se ha definido anteriormente (L. salivarius CECT 9145) como ingrediente activo. La expresión "composición de dispositivo médico" se usa en el presente documento para identificar las composiciones según la invención, composiciones que, como tales (en sí mismas), son clasificadas por las autoridades sanitarias competentes como dispositivos médicos.

El dispositivo médico de la presente invención permite la aplicación o administración de la cepa de la invención a una superficie tisular deseada, por ejemplo, con el fin de tratar o cuidar farmacéuticamente y/o mediante el propio dispositivo médico la superficie sobre la que se aplica. En algunas realizaciones, la composición que comprende la cepa de la invención es clasificada en sí misma por las autoridades como producto sanitario. En otras realizaciones particulares de los dispositivos médicos, corresponden a artículos sanitarios que incluyen telas tejidas o no tejidas, en las que la cepa de la invención se distribuye de forma homogénea a lo largo de la superficie de la tela. Esta distribución se puede realizar, opcionalmente, con la ayuda de un disolvente. El disolvente también se puede secar opcionalmente después de distribuir de forma total o parcial la capa o el recubrimiento de la composición que comprende la cantidad eficaz de la cepa, sobre la superficie de la tela, obteniendo de este modo telas con las propiedades conferidas por la cepa según la invención.

Un noveno aspecto de la presente invención se refiere a un método para obtener un mutante de la cepa de L. salivarius CECT 9145, que comprende usar la cepa depositada como material de partida y aplicar mutagénesis, en donde el mutante obtenido conserva o mejora la actividad de la cepa depositada parental para prevenir o tratar enfermedades provocadas por S. agalactiae. Los métodos para obtener un mutante son los conocidos por el experto en la materia.

Un décimo aspecto se refiere a un kit que comprende una cantidad eficaz de la cepa del primer aspecto de la invención, el cultivo bacteriano del segundo aspecto de la invención o la composición farmacéutica del sexto aspecto de la invención.

En una realización particular, el kit puede comprender una dosis semanal, mensual u otra periódica de la cepa del primer aspecto de la invención. Como ejemplo ilustrativo, un kit que comprende una dosis semanal puede comprender siete composiciones distintas que comprenden el probiótico (siete dosis diarias). Como otro ejemplo, un kit que comprende una dosis mensual puede comprender treinta composiciones distintas que comprenden la cepa del primer aspecto de la invención.

En caso de que la cepa del primer aspecto de la invención esté liofilizada, el kit de la invención puede contener un agente de resuspensión comestible, tal como agua.

En una realización particular, el kit está configurado para facilitar el cumplimiento de la dosificación. Por ejemplo, los kits pueden ser particularmente ventajosos con el fin de garantizar que el sujeto reciba la administración de la cantidad eficaz de la cepa de la invención en el horario indicado de forma apropiada. Las tarjetas de blíster u otros dispositivos contenedores configurados de forma apropiada pueden ser particularmente adecuados para ilustrar claramente la secuencia o el momento de administración de los diversos componentes. El equipo se puede obtener como una tarjeta, o en cajas de cuatro, seis, siete (p. ej., un suministro semanal) u ocho tarjetas envasadas juntas. Adicionalmente, pueden obtenerse equipos mensuales o de otro tipo.

El kit que comprende el cultivo bacteriano del segundo aspecto de la invención puede comprender cualquier medio que permita el cultivo correcto de la cepa de la invención, tal como medio de cultivo, complementos o antibióticos. La presente invención también se refiere al uso del kit del décimo aspecto de la invención para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad, preferentemente provocada por una cepa de Streptococcus, más preferentemente por S. agalactiae, en donde, en una realización particular cualquiera de las enfermedades mencionadas anteriormente, en una realización más particular es septicemia, más preferentemente septicemia neonatal y más preferentemente es septicemia de inicio precoz. En otra realización particular, la enfermedad provocada por S. agalactiae es una infección ginecológica o mastitis (en donde en una realización es mastitis en rumiantes, tales como bovinos y vacas y en otra realización es mastitis humana). La presente invención también se refiere al uso de la cepa aislada, el cultivo bacteriano, la composición farmacéutica y el producto comestible de la presente invención en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad infecciosa, preferentemente provocada por una cepa de Streptococcus, en una realización particular, la enfermedad infecciosa está provocada por S. agalactiae, en una realización más particular en cualquiera de las enfermedades infecciosas descritas en el presente documento.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprender" y las variaciones de la palabra, no tienen por objeto excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Asimismo, la palabra "comprender" abarca el caso de "que consiste en". Objetos, ventajas y características adicionales de la invención resultarán evidentes para los expertos en la materia tras examinar la descripción o pueden aprenderse mediante la puesta en práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo ilustrativo y no se pretende que sean limitantes de la presente invención. Los signos de referencia relacionados con los dibujos y puestos entre paréntesis en una reivindicación, son únicamente para intentar aumentar la inteligibilidad de la reivindicación y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la reivindicación. Asimismo, la presente invención abarca todas las combinaciones posibles de realizaciones particulares y preferidas descritas en el presente documento.

Ejemplos:

Materiales y métodos:

1. Evaluación de la microbiota vaginal de mujeres fértiles con resultado positivo para EGB y con resultado negativo para EGB (mujeres no embarazadas y embarazadas)

1.1. Mujeres participantes

Un total de 54 mujeres fértiles (30 mujeres no embarazadas y 24 mujeres embarazadas), de entre 25 y 35 años participaron en este estudio. Todas las voluntarias dieron su consentimiento informado por escrito al protocolo, que había sido aprobado (protocolo 10/017-E) por el Comité Ético de Investigación Clínica de1Hospital Clínico San Carlos de Madrid (España). En relación con las mujeres no embarazadas, se recogieron 4 muestras de exudado vaginal en un ciclo menstrual (días 0, 7, 14 y 21). Las mujeres embarazadas proporcionaron una única muestra en la semana 35-37 de embarazo. Todas las mujeres afirmaron estar completamente sanas.

1.2. Aislamiento microbiano, enumeración e identificación

Las muestras se diluyeron en agua con peptona y se extendieron sobre placas de agar con ácido nalidíxico de Columbia (CNA), Mac Conkey (MCK), cloranfenicol de dextrosa Sabouraud (SDC), Gardnerella (GAR) y Mycoplasma (BioMerieux, Marcy l'Etoile, Francia) para el aislamiento selectivo y la cuantificación de los principales agentes implicados en las infecciones vaginales. También se extendieron sobre placas de agar de m Rs (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) complementado con L-cisteína (0,5 g/l) (MRS-C) o sangre de caballo (5 %) (MRS-B) para el aislamiento de lactobacilos. Las placas se incubaron durante 48 h a 37 °C en condiciones aeróbicas, excepto para los MRS-C y MRS-B, que se incubaron de forma anaeróbica (85 % de nitrógeno, 10 % de hidrógeno, 5 % de dióxido de carbono) en una estación de trabajo anaeróbica (DW Scientific, Shipley, Reino Unido). En paralelo, todas las muestras se enriquecieron con caldo de cultivo Todd Hewitt (Oxoid, Basignstoke, Reino Unido) para facilitar el aislamiento de Streptococcus agalactiae.

Inicialmente, se realizó identificación de las cepas bacterianas mediante secuenciación del fragmento de 470 pares de bases (pb) del gen de ácido desoxirribonucleico ribosómico (ADNr) 16S amplificado por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) usando los cebadores pbl16 (5'-AGAGTT^t G^a T^c C^t GGCTCAG-3') (SEQ ID NO: 1) y mbl16 (5'-GGCTGCTGGCACGTAGTTAG-3') (SEQ ID NO: 2) (Kullen et al., 2000). Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 96 °C durante 30 s, 48 °C durante 30 s y 72 °C durante 45 s (40 ciclos) y una extensión final a 72 °C durante 4 min. Los amplicones se purificaron usando el equipo Nucleospin® Extract II (Macherey-Nagel, Düren, Alemania) y se secuenciaron en la Unidad de Genómica de la Universidad Complutense de Madrid, España. Las secuencias resultantes se usaron para buscar secuencias depositadas en la base de datos de EMBL usando el algoritmo BLAST y la identidad de los aislados se determinó en función de las puntuaciones más altas (>99 %). La identificación de las levaduras y la confirmación de las identificaciones iniciales del ADNr 16S se realizó mediante MALDI-TOF (VITEK MS, BioMerieux) en las instalaciones de Probisearch (Tres Cantos, España). En resumen, se aplicó puntualmente una parte de una colonia bacteriana (~1 jl) directamente sobre una placa de muestras MALDI. A continuación, se cubrió con 1 j l de una solución saturada de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico en acetonitrilo (28 %) y se dejó secar a temperatura ambiente. Para cada aislado, se construyó un espectro medio con perfiles espectrales de al menos 50 m/z y se usó para la identificación por comparación con los espectros contenidos en la base de datos Myla (Biomerieux). La identificación se definió como una coincidencia del 99-100 % con los valores de m/z específicos de la especie en la base de datos.

La identificación de aislados de S. agalactiae también se confirmó mediante el uso de una prueba de aglutinación de látex (kit de agrupación de estreptococos, Oxoid).

Se aislaron un total de 89 cepas diferentes de Lactobacillus de las muestras de hisopado vaginales y, posteriormente, se sometieron a genotipado de amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD) para evitar la duplicación de aislados. Los perfiles de RAPD se obtuvieron usando el cebador OPL5 (5'-ACGCAGGCAC-3') (SEQ ID NO: 3), como se describe en Ruiz-Barba et al. (2005).

Las cepas de Lactobacillus se cultivaron de forma rutinaria en medio MRS-C a 37 °C en condiciones aeróbicas. Cuando fue necesario, se cultivaron en anaerobiosis como se ha descrito anteriormente. Las cepas de Lactobacillus se almacenaron a 80 °C en caldo de cultivo MRS-C que contenía glicerol al 15 % (vol/vol).

2. Actividad antimicrobiana contra cepas de S. agalactiae

Se usó un método de superposición (Magnusson y Schnürer, 2001) para determinar la capacidad de las cepas de lactobacilos para inhibir el crecimiento de 12 cepas diferentes de S. agalactiae, 6 aisladas de sangre o líquido cefalorraquídeo en casos clínicos de septicemia neonatal (Hospital Universitario Ramón y Cajal, Madrid, España) y las 6 restantes de muestras vaginales de mujeres embarazadas (colección propia). Se realizó usando placas de agar MRS, en las que se inocularon las cepas de lactobacilos como líneas de aproximadamente 2 cm de longitud y se incubaron a 37 °C durante 48 h. A continuación, las placas se superpusieron con las cepas indicadoras de S. agalactiae vehiculadas en 10 ml de caldo de cultivo de infusión de cerebro y corazón (BHI, Oxoid) complementado con agar blando (0,7%), a una concentración de ~1034 unidades formadoras de colonias (ufc)/ml. Las placas superpuestas se incubaron a 37 °C durante 48 h y, a continuación, se examinaron para determinar las zonas claras de inhibición (>2 mm) alrededor de las estrías de lactobacilos. Todos los experimentos que analizaban la actividad inhibidora se realizaron por triplicado.

3. Producción de bacteriocinas

Las cepas de Lactobacillus se cultivaron en caldo de cultivo MRS a 37 °C hasta la fase estacionaria temprana (A620 ~1,0). El cultivo se centrifugó a 12000x g durante 10 min a 4 °C y el sobrenadante se neutralizó a 6,2 con NaOH 1 M, se calentó a 100 °C durante 5 min y se esterilizó por filtración a través de filtros de tamaño de poro de 0,22 jm (Millipore, Bedford, Estados Unidos). La actividad bacteriocinogénica de los sobrenadantes sin células se determinó mediante un ensayo de difusión en pocillos de agar. Se colocaron alícuotas (100 jl) de los sobrenadantes en pocillos (7 mm de diámetro) cortados en placas de agar BHI enfriadas previamente sembradas (105 *ufc/ml) con las cepas indicadoras de S. agalactiae. Las placas se mantuvieron a 4 °C durante 2 h y, a continuación, se incubaron en condiciones óptimas para el crecimiento del indicador.

4. Producción de peróxido de hidrógeno

La producción de peróxido de hidrógeno por las cepas de Lactobacillus se probó inicialmente siguiendo el procedimiento descrito por Song et al. (1999). En placas de agar MRS complementadas con 0,25 mg/ml de tetrametilbencidina (TMB; Sigma, San Luis, Estados Unidos) y 0,01 mg/ml de peroxidasa de rábano picante (HRP, Sigma) se inoculó la cepa y se incubaron de forma anaeróbica durante 2 días a 37 °C. Se sabe que e1HRP oxida TMB en presencia de peróxido de hidrógeno para formar un pigmento azul en la colonia productora de H2O2. En paralelo, el peróxido de hidrógeno también se midió mediante una modificación del método cuantitativo de Yap y Gilliland (2000). La cepa se cultivó anaeróbicamente en 10 ml de caldo de cultivo MRS durante 24 h a 37 °C. Las células se recogieron mediante centrifugación a 12000 x g durante 10 min a 4 °C, se lavó dos veces con tampón de fosfato de potasio (50 mM, pH 6) y se resuspendió en 9 ml del mismo tampón complementado con glucosa 5 mM. La suspensión celular (0,5 ml) se inoculó en un tubo que contenía 9 ml del tampón que contenía glucosa. Después de una incubación a 37 °C durante 24 h en aerobiosis, las células se retiraron por centrifugación a 12000 xg durante 10 min a 4 °C y se analizó el peróxido de hidrógeno de los sobrenadantes. En resumen, Se mezclaron 5 ml de sobrenadante con 100 j l de o-dianisidina acuosa al 1 % (Sigma) y 1 ml de HRP acuosa al 0,001 %. Los tubos se incubaron durante 10 min a 37 °C y la reacción se detuvo añadiendo 0,2 ml de HCl 4 N. La lectura de absorbancia

(A400 nm) y el contenido de peróxido se cuantificó comparando los valores obtenidos con los de una curva patrón de H2O2. En los ensayos de H2O2, se usaron Lactobacillus acidophilus CECT 903T y Lactobacillus gasseri c Ec T 5714 como control positivo.

5. Producción de ácido láctico

La producción de ácido láctico por las cepas de Lactobacillus se determinó en caldo de cultivo MRS (pH 6,2). Se usó un inóculo del uno por ciento de un cultivo MRS durante una noche y se procedió a la incubación durante 24 h a

37 °C de forma anaeróbica. Las células se eliminaron por centrifugación a 12000 x g durante 5 min y se cuantificó la concentración de ácido L y D-láctico en los sobrenadantes usando un equipo enzimático (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante. También se midieron los valores de pH de los sobrenadantes. Todos estos ensayos se realizaron por triplicado y los valores se expresaron como la media ± DT.

Se usó L. salivarius CECT 5713 como control positivo (alta producción de ácido L-láctico en caldo de cultivo MRS) (Martin et al., 2006).

6. Agregación conjunta entre los lactobacilos y las cepas de S. agalactiae

Los ensayos agregación conjunta se diseñaron basándose en métodos de los que se ha informado previamente

(Reid et al., 1990). Las suspensiones bacterianas se ajustaron a una A600 de 0,6. Se mezclaron de forma independiente alícuotas de 10 ml de cada una de las cepas de Lactobacillus con 10 ml de cada una de las cepas de

S. agalactiae y se incubaron a 37 °C durante 4 h y 16 h. Las suspensiones se observaron a continuación bajo un microscopio de contraste de fases después de la tinción de Gram.

7. Cocultivos en caldo de los lactobacilos y las cepas de S. agalactiae

Para probar la actividad anti-S. agalactiae de los lactobacilos en un formato de ensayo de caldo de cultivo, en tubos que contenían 20 ml de caldo de cultivo MRS se inocularon conjuntamente 1 ml de un cultivo de cepa de Lactobacillus (7 log-iü ufc/ml) y 1 ml de una cepa de S. agalactiae (7 log-iü ufc/ml). Posteriormente, Los cultivos se incubaron durante 6 h a 37 °C en condiciones aeróbicas. Inmediatamente después de la inoculación conjunta y después del periodo de incubación, se recogieron alícuotas, se diluyeron en serie y se sembraron en placas MRS-C y placas de agar CHROMagar StrepB (CHROMagar, París, Francia) para la enumeración selectiva de lactobacilos y estreptococos, respectivamente. La asignación taxonómica correcta se confirmó mediante análisis MALDI-TOF como se ha descrito anteriormente.

8. Ensayos de adherencia a células epiteliales intestinales y vaginales

La adherencia de los lactobacilos a células HT-29 y Caco-2 se examinó según lo descrito por Coconnier. et al.

(1992). De forma rutinaria, las células se cultivaron en medio DMEM (PAA, Linz, Austria) que contenía glucosa

25 mM, piruvato de sodio 1 mM y complementado con suero de ternero fetal termoinactivado al 10% (30 min,

56 °C), L-glutamina 2 mM, preparación de aminoácidos no esenciales al 1 %, penicilina 100 U/ml y estreptomicina

100 mg/ml. Para los ensayos de adherencia, se cultivaron HT-29 y Caco-2 hasta la confluencia en 2 ml de medio desprovisto de antibióticos. Aproximadamente 10 días después de la confluencia, 1 ml del medio se reemplazó con

1 ml de suspensión de Lactobacillus (108 ufc/ml en DMEM). Los cultivos inoculados se incubaron durante 1 h a 37 °C en CO2 al 5 %. A continuación, la monocapa se lavó cinco veces con PBS estéril, se fijó con metanol, se tiñó con tinción de Gram y se examinó por microscopia. Se contaron los lactobacilos adherentes en 20 campos microscópicos aleatorios para cada prueba. Se usaron Lactobacillus rhamnosus GG y Lactobacillus casei imunitass como controles positivos y negativos debido a su potencial adhesivo alto y bajo, respectivamente (Martin et al., 2005).

Se realizó adherencia a las células epiteliales vaginales recogidas de mujeres premenopáusicas sanas como se ha descrito anteriormente (Boris et al., 1998).9

9. Adherencia y/o degradación de la mucina

La adhesión de las cepas de lactobacilos a la mucina se determinó según el método descrito por Cohen y Laux (1995) con algunas modificaciones. En resumen, se inmovilizaron 100 pl de una solución (1 mg/ml) de mucina porcina (Sigma) en solución salina de Hanks tamponada con HEPES (HH) en placas de microvaloración de poliestireno (Maxisorp; Nunc, Roskilde, Dinamarca) después de incubación durante una noche a 4 °C. Los pocillos se lavaron dos veces con 250 pl de HH. En paralelo, Las bacterias se cultivaron durante una noche a 37 °C en caldo de cultivo MRS y los sedimentos bacterianos de fracciones de 1 ml se obtuvieron por centrifugación y se lavaron con

HH. A continuación, se añadieron 10 pl de carboxifluoresceína 10 mM (Sigma) a los sedimentos y las suspensiones bacterianas se incubaron durante 20 min a 37 °C. Posteriormente, las células bacterianas se lavaron 3 veces con

HH y, finalmente, se resuspendieron en 1 ml de HH. A continuación, se añadió a cada pocillo una suspensión de

50 |jl de las bacterias marcadas con fluorescencia (~ 5 x 107 ufc). Después de la incubación durante 1 h a 37 °C, las placas se lavaron dos veces con 250 j l de HH para eliminar las células no adheridas y se incubaron durante 1 h a 60 °C en presencia de 50 j l de dodecil sulfato sódico (SDS) al 1 %-NaOH 0,1 M para liberar y lisar los microorganismos unidos. La fluorescencia se midió en un lector de microplacas de fluorescencia (Tecan Austria GMBH, Salzburgo, Austria). La adhesión se evaluó como el porcentaje de fluorescencia conservada en los pocillos después de las etapas de lavado en comparación con la presente en las alícuotas bacterianas marcadas añadidas originalmente a los pocillos. Se usó L. reuteri CR20 como control positivo (fuerte adherencia a la mucina) (Martin et al., 2009). Los ensayos se realizaron por duplicado.

El potencial de las cepas de lactobacilos para degradar la mucina gástrica (HGM; Sigma) in vitro se evaluó por duplicado siguiendo el procedimiento desarrollado por Zhou et al. (2001).

10. Supervivencia después del tránsito por un modelo gastrointestinal in vitro

La supervivencia de las cepas se probó en un modelo in vitro del estómago e intestino delgado humanos basado en el descrito por Marteau et al. (1997). Se diluyeron alícuotas (25 ml) que contenían aproximadamente 109 ufc/ml de la cepa ensayada en 5 ml de una solución electrolítica estéril que contenía 6,2 g/l de NaCl, 2,2 g/l de KCI, 0,22 g/l de CaCl2 y 1,2 g/l de NaHCO3 para simular la dilución in vivo por saliva. A continuación, Se añadieron 5 ml de jugo gástrico porcino y la mezcla se incubó a 37 °C con agitación. La curva de pH en el compartimento similar al estómago se controló para reproducir los valores encontrados en monogástricos después del consumo de yogur (Conway et al. 1987): pH 5,0 al inicio, pH 4,1 a los 20 min, pH 3,0 a los 40 min y pH 2,1 a los 60 min. Las fracciones se tomaron sucesivamente de este compartimento a los 20, 40, 60 y 80 min, de una manera que simule el vaciado gástrico normal (Marteau et al. 1997). Después de ajustar su pH a 6,5 ± 0,2 con NaHCO3 1 M, se mezclaron con 10 ml de una solución electrolítica estéril que contenía 5 g/l de NaCl, 0,6 g/l de KCl, 0,3 g/l de CaCh, 4 % de bilis porcina y 7% de pancreatina (Sigma), lo que simula el contenido del jugo duodenal. Después de 120 min de exposición sucesiva a estas condiciones, se determinó la supervivencia bacteriana colocando las muestras en placas de agar MRS, que se incubaron anaeróbicamente a 37 °C durante 48 h. Se usó L. salivarius CELA2 como control positivo debido a su alta resistencia a condiciones de tipo gastrointestinal (Martin et al., 2009). Todos estos ensayos se realizaron por cuadruplicado y los valores se expresaron como la media ± DT.

11. Resistencia/susceptibilidad a los antibióticos

Las concentraciones inhibidoras mínimas (CIM) de los 16 antibióticos incluidos en este estudio (gentamicina, kanamicina, estreptomicina, neomicina, tetraciclina, eritromicina, clindamicina, cloranfenicol, ampicilina, penicilina, vancomicina, virginiamicina, linezolid, trimetoprim, ciprofloxacina y rifampicina) se determinaron mediante un método de microdilución usando placas Vet-MIC para bacterias del ácido láctico (Instituto Nacional Veterinario de Suecia, Upsala, Suecia), como se ha descrito anteriormente (Langa et al., 2012). Las placas se incubaron a 37 °C durante 48 h y la CIM se definió como la concentración más baja a la que no se observó crecimiento. Los valores de CIM se compararon con los parámetros de corte microbiológicos establecidos por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA, 2012) para especies de Lactobacillus.

12. Inducción de profagos

Para descartar la presencia de fagos que pongan en peligro la viabilidad de la cepa, se llevó a cabo inducción de profagos como se ha descrito anteriormente (Langa et al. 2012). Se trataron cultivos exponenciales de las cepas de lactobacilos (~DO600 0,4) con 0,25, 0,5 (concentración inhibidora mínima; CIM) y 1 jg/ml de mitomicina C (concentración final), y se continuó la incubación durante hasta 5 h. Se colocaron alícuotas de los sobrenadantes en céspedes de cepas de L. salivarius supuestamente susceptibles que crecen en MRS blando (agar al 0,75 %) complementado con hemoglobina al 1 %, CaCh 10 mM y MgSO4 10 mM, colocados encima de placas con el mismo medio (agar al 1,5 %). Después de incubación durante 24 h, se registró la generación (o no) de placas de lisis. 13. Producción de aminas biógenas

La capacidad de formar aminas biógenas (tiramina, histamina, putrescina y cadaverina) se evaluó usando el caldo de cultivo de descarboxilasa y el método descrito por Bover-Cid y Holzapfel (1999). Los aminoácidos precursores (tirosina, histidina, ornitina y lisina, respectivamente) se adquirieron de Sigma. Las cepas de lactobacilos se sembraron en estrías sobre las diferentes placas de medio de descarboxilasa y se incubaron durante 4 días a 37 °C en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Un resultado positivo fue indicado por un cambio del color del medio a púrpura en respuesta al cambio de pH causado por la producción de la amina biógena más alcalina a partir del aminoácido incluido inicialmente en el medio. En paralelo, las cepas de lactobacilos se cultivaron durante 24 h en caldo MRS complementado con tirosina 10 mM (M17T), 13 mM de histidina (M17H) o agmatina 20 mM (M17A) para la detección de la producción de tiramina, histamina y putrescina, respectivamente. Los sobrenadantes se filtraron a través de una membrana de 0,2 jm de diámetro de poro, se derivatizaron y se analizaron mediante cromatografía en capa fina (TLC) siguiendo las condiciones descritas por García-Moruno et al (2005).

Además, la presencia del gen de la tirosina descarboxilasa (tdcA), el gen de la histidina descarboxilasa (hdcA) y el complejo de la agmatina desiminasa (AgdDI) se verificó mediante PCR específica usando los métodos descritos anteriormente (Le Jeune et al., 1995; Lucas y Lonvaud-Funel, 2002; Ladero et al., 2012).

14. Evaluación de seguridad in vivo de L. salivarius V4II-90

En total, L. salivarius V4II-90 fue la cepa que mostró los mejores resultados como candidata para futuros ensayos clínicos. Posteriormente, se evaluó su posible toxicidad oral aguda y por dosis repetida (4 semanas); además, también se investigó la posible translocación de esta cepa a la sangre y algunos órganos.

14.1. Estudios de toxicidad oral aguda y de dosis repetida (4 semanas)

Se aclimataron ratas macho y hembra Wistar (Charles River Inc., Marget, Kent, Reino Unido) durante 7 días antes del inicio del estudio con una evaluación del estado de salud. Las ratas se alojaron individualmente en jaulas de policarbonato con lecho de serrín y se mantuvieron en habitaciones de ambiente controlado (22 ± 2 °C y 50 % ± 10 % de humedad relativa) con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h (luz de 08.00 a 20.00 h). El alimento (dieta para roedores A03, Scientific Animal Food and Engineering, Villemoisson-sur-Orge, Francia) y el agua estuvieron disponibles a voluntad. Las ratas tenían 56 días de edad al inicio del tratamiento.

Se realizaron estudios agudos (prueba límite) y de dosis repetida (4 semanas) de acuerdo con las directrices de la Unión Europea (Reglamento del Consejo de la CE n.° 440, 2008a,b). Ambos estudios se realizaron de acuerdo con los requisitos éticos y autorizados por el Comité Oficial de Ética de la Universidad Complutense.

En el estudio agudo (prueba límite), se distribuyeron 24 ratas (12 machos, 12 hembras) en dos grupos de 6 machos y 6 hembras cada uno. Después de un ayuno nocturno, cada rata recibió leche desnatada (500 pl) por vía oral (grupo de control o grupo 1) o una única dosis oral de 1 x 1010 unidades formadoras de colonias (ufc) de L salivarius V4II-90 disueltas en 500 pl de leche desnatada (grupo tratado o grupo 2). Las dosis de los artículos de prueba y control se administraron mediante sonda. Se comprobaron los signos clínicos y la mortalidad de los animales dos veces al día (por la mañana y por la tarde). Al final de un periodo de observación de 14 días, las ratas se pesaron, se sacrificaron mediante inhalación de CO2, se desangraron y se realizaron sus necropsias.

El estudio de dosis repetida (4 semanas) (prueba límite) se realizó en 48 ratas (24 machos, 24 hembras) divididas en cuatro grupos de 6 machos y 6 hembras cada uno (grupo de control o grupo 3; grupo tratado o grupo 4; grupo de control satélite o grupo 5; y grupo tratado satélite o grupo 6). Las ratas recibieron una dosis diaria de leche desnatada (grupos 3 y 5) o 1 x 109 ufc de L salivarius V4II-90 disuelto en 500 pl de leche desnatada (grupos 4 y 6) por vía oral una vez al día durante 4 semanas. Las dosis de los artículos de prueba y control se administraron mediante sonda. Se trató a los animales aproximadamente a la misma hora cada día (aproximadamente 4-6 h en el ciclo de luz). Se retiró el alimento, pero no el agua, desde 4 h antes hasta 2 h después de la administración del artículo de control y de prueba. Se comprobaron los signos clínicos y la mortalidad de los animales dos veces al día (por la mañana y por la tarde). Todas las ratas de los grupos 3 y 4 fueron privadas de alimento durante 18 h, se pesaron, se sacrificaron mediante inhalación de CO2, se desangraron y se realizaron sus necropsias el día 29. Todos los animales de los grupos satélite (grupos 5 y 6) se mantuvieron durante 14 días más sin tratamiento para detectar la aparición tardía, la persistencia o la recuperación de los efectos tóxicos. Todas las ratas de los grupos 5 y 6 fueron privadas de alimento durante 18 h, se pesaron, se sacrificaron mediante inhalación de CO2, se desangraron y se realizaron sus necropsias el día 42.

14.2. Observaciones de animales

Todos los animales fueron observados dos veces al día para determinar su apariencia general, su comportamiento, señales de morbilidad y mortalidad (una vez antes del tratamiento y una vez al día a partir de entonces). Se observó en las ratas su estado general y el estado de la piel y el pelaje, los ojos, la nariz, la cavidad oral, el abdomen y los genitales externos, se evaluó su frecuencia respiratoria y se palparon en busca de masas. Los parámetros conductuales comprobados fueron movimientos anómalos (temblores, convulsiones y contracciones musculares), reacciones a la manipulación y comportamiento en campo abierto (excitabilidad, capacidad de respuesta al tacto y ruidos agudos), cambios en el comportamiento ordinario (cambios en el aseo, sacudir la cabeza, giros), comportamiento anómalo (autofagia, retroceso) y agresión. El peso corporal, el aumento de peso corporal y el consumo de alimentos y agua se midieron diariamente y, al final de los periodos de observación, las ratas se examinaron mediante necropsia y se registraron los pesos de los órganos.

14.3. Parámetros de prueba clínica

Se recogieron muestras de sangre para evaluación hematológica y química clínica del plexo retroorbitario de animales con anestesia ligera inducida por inhalación de CO2 después de un periodo de observación de 14 días en el estudio oral agudo y después de 4 semanas de tratamiento y 14 días de recuperación para el estudio de seguridad de 4 semanas con dosis repetidas. Se usó EDTA como anticoagulante para muestras hematológicas y se usó citrato de sodio como anticoagulante para química clínica. Se retiró el alimento durante aproximadamente 18 h antes de la extracción de sangre y las muestras se recogieron temprano en la jornada laboral para reducir la variación biológica; se proporcionó agua a voluntad.

Se evaluaron los parámetros de patología clínica (bioquímica hematológica y clínica). La mayoría de las variables hematológicas se midieron con un analizador automático de sangre completa Coulter/CELL-DYN 3500 (Abbott, Chicago, IL). Se observaron frotis de células sanguíneas con un microscopio Olympus BX41 (Olympus, Tokio, Japón).

Los parámetros de química clínica se evaluaron con un espectrofotómetro Konelab PRIME 30 (Thermofisher Scientific Inc. Waltham, MA, Estados Unidos) y parámetros bioquímicos especiales con un analizador de química clínica AU640 (Olympus, Tokio, Japón). Los parámetros de coagulación se analizaron con un analizador de coagulación Coatron M1 (Teco Medical Instruments, GMBH, Neufahrn, Alemania).

14.4. Patología anatómica

Todas las ratas fueron sacrificadas mediante inhalación de CO2 y se realizó su necropsia. La necropsia incluyó un examen macroscópico de la superficie externa del cuerpo, todos los orificios, la cavidad craneal, el cerebro y la médula espinal, la cavidad nasal y los senos paranasales, y las cavidades torácica, abdominal y pélvica y las vísceras. Se registraron descripciones de todas las anomalías macroscópicas. Se recogieron muestras de los siguientes tejidos y órganos de todos los animales en la necropsia y se fijaron en una solución neutra de formaldehído al 4 % tamponada con fosfato: glándulas suprarrenales, cerebro, corazón, íleon, yeyuno, ciego, colon, duodeno, recto, estómago, esófago, tráquea, riñones, hígado, pulmones, páncreas, bazo, piel, testículos con epidídimos, ovarios con oviductos, médula ósea, timo, glándulas tiroideas y paratiroideas, vesículas seminales, vejiga urinaria y útero. Se calcularon las relaciones en peso de órgano:cuerpo. Se procesaron todas las muestras de órganos y tejidos para examen histopatológico, se incluyeron en parafina, se cortaron con un grosor aproximado de 2 a 4 |jm y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Se recogieron portaobjetos de todos los órganos y tejidos enumerados anteriormente de todos los animales de los grupos de control y tratados.

14.5. Aislamiento de L. salivarius V4II-90 de muestras de heces y muestras de hisopado vaginales.

Una vez que se habían sacrificado las ratas, se recogió una muestra del contenido del colon y una muestra de hisopado vaginal de cada animal. Estas muestras se diluyeron e inocularon en placas de agar MRS-C. Se sometieron los aislados identificados como L. salivarius mediante MALDI-TOF a genotipado por electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) (Arroyo et al., 2010) y sus perfiles se compararon con el de L. salivarius V4II-90.

14.6. Translocación bacteriana

Se analizó la translocación bacteriana en sangre, hígado y bazo. Se cultivó sangre (50 jl) en medio de agar de Man, Rogosa, Sharpe (MRS) y se incubó a 37 °C durante 48 h de forma anaeróbica. Las muestras tisulares se homogeneizaron en agua peptonada tamponada (1 g/ml) y se cultivaron 100 j l de los homogeneizados resultantes en agar MRS como se ha mencionado anteriormente. Después de 48 h, se comprobó la presencia de lactobacilos en las placas. El crecimiento positivo en placas de agar MRS se definió por la presencia de incluso una única colonia.

14.7. Concentración total de glutatión hepático (GSH)

Se homogeneizó una parte de 100 mg de hígado de cada ratón en una solución de ácido tricloroacético al 7,5 % y se centrifugaron los homogeneizados a 3000 x g durante 10 min a 4 °C. La concentración de glutatión total se midió en los sobrenadantes usando un equipo comercial colorimétrico (OxisResearch, Portland, OR). En resumen, se añadieron 40 j l de los homogeneizados o los patrones a cada pocillo de una placa de microtitulación, junto con 40 ml de un agente reductor (tris(2-carboxietil)fosfina en HCl), 40 ml de un cromógeno (metilsulfato de 1-metil-3-cloro-7-trifluorometilquinolinio en HCl) y 40 ml de revelador de color (NaOH). Después de incubación a temperatura ambiente y en la oscuridad durante 30 min, se midió la densidad óptica a 415 nm usando un espectrofotómetro de microplacas (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA).

14.8. Análisis estadístico (estudios de toxicidad)

Todos los datos se expresan como media ± error típico de la media (ETM) de 6 determinaciones (es decir, 6 machos y 6 hembras). Las diferencias entre los grupos de control y tratados se evaluaron con un análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguido de la prueba de Dunnett (1995) y las diferencias se consideraron significativas a P < 0,05.

15. Diseño de un ensayo de PCR para la detección específica y sensible de S. agalactiae en las muestras biológicas.

15.1. Diseño de cebadores

Para diseñar cebadores específicos de especies de EGB, se analizaron secuencias de genes de ARNr 16S de diversas especies bacterianas disponibles en la base de datos de Genbank y se compararon usando los programas Emma y Showalign, incluidos en el análisis de software de código abierto gratuito EMBOSS (el paquete europeo de programas informáticos abiertos de biología molecular). Se logró amplificación específica de un fragmento de 148 pb del gen de ARNr 16S de S. agalactiae.

Las especies bacterianas en las que se analizó y comparó la secuencia génica de ARNr 16S fueron las siguientes: L. plantarum (EF85922122), Ped. Pentosaceus (CP000422), L. fermentum (EF460496), W. minor (NR040809), S. epidermidis (D83363), S. aureus (D83357), S. xylosus (D83374), E. faecalis (EF120452), E. faecium (DQ672262), S. mitis (AY281078), S. parasaguinis (AY281087), S. oralis (DQ232537), S. oralis (AY281079), S. infantis (AY485603), S. peroris (AB008314), S. salivarius (AY188352), S. bovis (AB002481), S. agalactiae (AE00948), S. agalactiae (AB596948), L. lactis (CP002365), L mesenteroides (CP000414), B. bifidum (CP001840) y B. vulgatus (NC009614).

15.2. Ensayos de PCR convencionales y en tiempo real

Todas las reacciones se configuraron usando los sistemas de detección de PCR en tiempo real CFX Connect y CFX96 Touch™ (BioRad Laboratories, Inc, Hercules, CA, Estados Unidos). El volumen de reacción para la PCR convencional fue de 25 pl y de 10 pl para la amplificación por PCR en tiempo real. Cada ciclo contenía un control negativo (agua esterilizada desionizada) y un control positivo (100 o 25 ng de S. agalactiae DSMZ 2134).

15.3. Especificidad

La especificidad de los cebadores diseñados se probó usando ADN obtenido de un panel de 6 cepas de S. agalactiae, 10 cepas de otras especies estreptocócicas y 21 cepas de especies pertenecientes a géneros relacionados. Todas las cepas se analizaron por duplicado.

En un ensayo en tiempo real, la determinación de un resultado positivo de PCR y la especificidad de la reacción, en ausencia de sondas, se realizaron basándose en la presencia de una curva de fusión. La temperatura de fusión (Tm), que es específica para cada amplicón, depende de diversos factores, incluyendo la longitud del amplicón y la secuencia de nucleótidos.

15.4. Límite de detección

Para comprobar el límite de detección de este enfoque de PCR, el ADN extraído de cultivo puro de S. agalactiae DSMZ 2134, obtenido de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ), se usó para preparar una serie de diluciones de 10 veces con una población bacteriana que variaba de 2 a 9 log-10 unidades formadoras de colonias, según lo determinado por los recuentos de placas.

15.5. Eficacia

El ADN extraído de muestras de hisopados vagino-rectales proporcionadas por voluntarias se analizó para evaluar la aplicabilidad del ensayo de PCR convencional y en tiempo real para la detección de colonización S. agalactiae en mujeres. Ambos enfoques de PCR se compararon con un enfoque de cultivo convencional y la identificación de EGB por MALDI-TOF, como se ha explicado anteriormente. Todas las muestras se analizaron por duplicado.

En el ensayo de PCR en tiempo real, la presencia o ausencia de ADN de EGB en una muestra se definió usando un valor de Ct de corte igual a 38,64 (el valor medio menos el doble de la desviación típica de las especies no diana y los controles sin molde). Se consideró que había ADN de Streptococcus agalactiae presente si se obtenía un valor de Ct inferior a 38,64.

16. Eficacia de L. salivarius V4II-90 para erradicar el EGB del tracto intestinal y vaginal de mujeres embarazadas: ensayo clínico

16.1. Diseño del ensayo

Un total de 87 mujeres embarazadas (69 mujeres con resultado positivo para EGB rectal y/o vaginal; 18 mujeres con resultado negativo para EGB rectal y vaginal al inicio de la intervención), con edades de 25-36 años, participaron en este estudio. Todas cumplieron los siguientes criterios: un embarazo normal y un estado sano. Se excluyeron las mujeres que habían ingerido complementos probióticos o que habían recibido tratamiento con antibióticos en los 30 días anteriores. Todas las voluntarias dieron su consentimiento informado por escrito al protocolo (10/017-E), que había sido aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica del Hospital Clínico San Carlos de Madrid (España).

Las voluntarias se distribuyeron en 5 grupos (3 grupos de probióticos y 2 de placebo). Todas las voluntarias en cualquiera de los grupos de probióticos (n = 55) dieron positivo para EGB y consumieron un sobre diario con ~50 mg de probiótico liofilizado (~9 log10 ufc de L. salivarius V4II-90). Los subgrupos de probióticos 1 (n = 25), 2 (n = 16) y 3 (n = 14) iniciaron la intervención en las semanas de embarazo 26, 20-24 o 30-34, respectivamente. El subgrupo de placebo 1 (n = 14) incluyó mujeres con resultado positivo de EGB (la semana de embarazo varía entre 19 y 30) que iban a recibir profilaxis antibiótica intraparto (PAI) porque habían tenido un bebé anterior que había padecido una septicemia por EGB. El subgrupo 2 de placebo (n = 18) incluyó mujeres con resultado negativo para EGB (la semana de embarazo varía entre 14 y 26). Las mujeres de ambos subgrupos de placebo recibieron un sobre diario que contenía 50 mg del excipiente usado para vehicular la cepa probiótica. En todos los casos, la intervención duró desde el inicio de la intervención hasta la semana 38, cuando se realizó la exploración recto-vaginal de EGB. Los sobres que contenían probióticos y excipientes se mantuvieron a 4 °C durante todo el estudio. Todas las voluntarias recibieron diarios para registrar el cumplimiento de la ingesta del producto del estudio. La tasa mínima de cumplimiento (% de las dosis totales de tratamiento) se estableció en 86 %.

16.2. Recogida y análisis de EGB de las muestras

Se recogieron muestras de exudado rectal y vaginal periódicamente durante el ensayo. Se diluyeron en serie y se sembraron en placas de agar Granada (Biomerieux; aislamiento de EGB hemolítico, que aparecen como colonias anaranjadas) y CHROMagar StrepB (CHROMagar; para el aislamiento de EGB hemolítico y no hemolítico, que aparecen como colonias de color púrpura). La asignación taxonómica correcta se confirmó mediante análisis de aglutinación de látex y MALDI-TOF como se ha descrito anteriormente.

En paralelo, y para evitar problemas relacionados con la sensibilidad, se usaron dos estrategias: (a) se extrajo ADN de las muestras y se sometió a los ensayos de PCR descritos anteriormente; (b) un subconjunto de muestras se sometió a una etapa de enriquecimiento con EGB en caldo de cultivo Todd-Hewitt (Oxoid). Después de 24 h a 37 °C, los cultivos en caldo se extendieron sobre placas de agar CHROMagar StrepB.

16.3. Análisis estadístico

Los datos microbiológicos se registraron como UFC/ml y se transformaron a valores logarítmicos antes del análisis estadístico. Se utilizó ANOVA de dos vías para investigar el efecto del individuo (mujer) y el tiempo de muestreo en los recuentos semicuantitativos de S. agalactiae en muestras de hisopado vaginales. La significación estadística se estableció en P<0,05. Se usó Statgraphics Centurion XVI versión 17.0.16 (Statpoint Technologies Inc, Warrenton, Virginia) para llevar a cabo análisis estadísticos.

Ejemplo 1. Evaluación de la microbiota vaginal de mujeres fértiles con resultado positivo para EGB y con resultado negativo para EGB (mujeres no embarazadas y embarazadas)

En todos los casos, se detectó crecimiento bacteriano cuando las muestras se inocularon en placas de agar MRS (2,70-8,08 log-10 ufc; media 5,36 log-10 ufc); CNA (3,00-7,92 log-10 ufc; media 5,13 log-10 ufc) y GAR (2,70-8,10 log-10 ufc; media 5,24 log-10 ufc). En total, grupos bacterianos similares crecieron en los tres medios (datos no mostrados). Solo se detectó crecimiento en placas de MCK, SDC o micoplasma en un pequeño porcentaje de muestras (desde 0 % en placas de micoplasma hasta ~40 % en placas SDC).

Pudo aislarse S. agalactiae tanto de mujeres no embarazadas (~25 %) como de mujeres embarazadas (~20 %). Se aislaron Candida albicans y otras levaduras, aproximadamente, del 7 y 36 % de las mujeres no embarazadas y embarazadas, respectivamente. En ambos grupos, Lactobacillus fue el género dominante ya que se detectó en el 92-93 % de las mujeres participantes.

En relación con las muestras proporcionadas por mujeres no embarazadas, un total de 433 aislados (incluyendo, al menos, un representante de cada colonia y morfología celular) se sometieron a análisis taxonómicos. El género Lactobacillus fue el dominante (28 % de los aislados totales), seguido de Staphylococcus, Enterococcus, Corynebacterium y Streptococcus (tabla 1). Entre los aislados, las principales especies fueron Lactobacillus crispatus (23%), Lactobacillus gasseri (24%), L. salivarius (21 %), Lactobacillus vaginalis (12%), Lactobacillus plantarum (13 %), Lactobacillus coleohominis (5 %) y Lactobacillus jensenii (2 %).

De las muestras proporcionadas por mujeres embarazadas, 120 aislados se sometieron a análisis taxonómicos. De nuevo, el género Lactobacillus fue el dominante (17% de los aislados totales), seguido de Staphylococcus, Streptococcus, levaduras y Enterococcus, (tabla 1). Entre los aislados, las principales especies fueron L. gasseri (41 %), L. casei (19 %), L. salivarius (16 %), Lactobacillus fermentum (8 %), L. vaginalis (6 %), Lactobacillus reuteri (5 %) y L. jensenii (5 %).

Ejemplo 2. Selección preliminar de las cepas de Lactobacillus:

Como se ha indicado anteriormente, las 89 diferentes cepas de lactobacilos aisladas en este estudio pertenecían a las siguientes especies: L. salivarius, L. gasseri, L. vaginalis, L. jensenii, L. crispatus, L. plantarum, L. coleohominis, L. casei, L. reuteri y L. fermentum. Entre ellas, algunas se seleccionaron en función de los siguientes criterios: (1) ausencia de S. agalactiae, Gardnella vaginalis, Candida spp., Ureaplasma spp. y Micoplasma spp. en las muestras vaginales de las que se aislaron originalmente los lactobacilos; (2) estado de presunción cualificada de seguridad (QPS) (Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria, EFSA) de las especies de Lactobacillus, ya que existía la intención de utilizarlas como complementos alimenticios; y (3) capacidad de la cepa para crecer rápidamente en caldo de cultivo MRS en condiciones aeróbicas (>1 x 106 ufc/ml después de 16 h a 37 °C). Solo 10 cepas (V3III-1, V4II-90, V7II-1, V7II-62, V7IV-1, V7IV 60, V8III-62, V111-60, V11III-60 y V11IV-60) cumplían todos los criterios y todas ellas pertenecían a la misma especie (L. salivarius). Estas cepas fueron las seleccionadas para su posterior caracterización.

Ejemplo 3. Actividad antimicrobiana y producción de posibles compuestos antimicrobianos:

Inicialmente, la actividad antimicrobiana de los 10 lactobacilos seleccionados contra las cepas de S. agalactiae se determinó mediante un método de superposición. Se observaron zonas claras de inhibición (que variaban entre 2 y 20 mm) alrededor de las estrías de lactobacilos.

En relación con los compuestos antimicrobianos que pueden ser responsables de dicha actividad, la concentración de ácido L- y D-láctico y el pH de los sobrenadantes obtenidos de los cultivos MRS de los lactobacilos se muestran en la tabla 2. La concentración global de ácido L-láctico fue similar (-10 mg/ml) en todos los sobrenadantes. Por el contrario, no se detectó ácido D-láctico en los sobrenadantes de las cepas probadas. Además, todas las cepas acidificaron el medio de caldo de cultivo MRS a un pH final de ~4 después de 16 h de incubación; entre ellas, L. salivarius V7IV-1 mostró la mayor capacidad de acidificación (pH final de 3,8).

No se pudo detectar ninguna actividad de tipo bacteriocina frente a las cepas de S. agalactiae probadas. Dos cepas (L. salivarius V4II-90 y V7IV-1) fueron capaces de producir peróxido de hidrógeno (7,29 pg/ml ± 0,69 y 7,46 pg/ml ± 0,58, respectivamente) (tabla 2).

Ejemplo 4. Agregación conjunta entre los lactobacilos y las cepas de S. agalactiae:

La capacidad de las cepas de lactobacilos para formar coagregados grandes, bien definidos, con S. agalactiae fue dependiente de la cepa. Las cepas V3III-1, V7IV-60 y V11IV-60 se agregaron conjuntamente con 5 cepas de S. agalactiae, las cepas V8III-62, V11I-60 y V11III-60 con 7, la cepa V7II-62 con 9 y las cepas V4II-90, V7II-1 y V7IV-1 con 10 (figura 1).

Ejemplo 5. Cocultivos en caldo de los lactobacilos y las cepas de S. agalactiae:

La capacidad de las cepas de lactobacilos para interferir o inhibir el crecimiento de cuatro cepas de S. agalactiae se evaluó usando cocultivos en caldo MRS. Los cocultivos con S. agalactiae no parecían afectar al crecimiento de ninguna de las cepas de L. salivarius (tabla 3). Por el contrario, la mayoría de las cepas de L. salivarius fueron capaces de interferir en mayor o menor medida con el crecimiento de las diferentes cepas de S. agalactiae incluidas en este ensayo. Entre ellas, L. salivarius V4II-90 mostró la mayor capacidad para inhibir el crecimiento de S. agalactiae ya que la presencia de dos de las cuatro cepas de S. agalactiae no fue detectable en los cocultivos y la concentración de las otras dos mostró una disminución ~2,5 log-10 después de un periodo de incubación de solo 6 h a 37 °C (tabla 3). Resulta interesante que no se pudieron detectar estreptococos viables cuando los cocultivos se incubaron durante 24 h (tabla 3).

Ejemplo 6. Ensayos de adherencia a células epiteliales intestinales y vaginales:

En este estudio, las cepas de lactobacilos probadas fueron fuertemente adhesivas a células tanto Caco-2 como HT-29, con la excepción de la cepa de control negativo (L. casei imunitass) que mostró un bajo potencial adhesivo (tabla 4). Además, todos mostraron adhesión a las células epiteliales vaginales. Entre las cepas de L. salivarius, L. salivarius V4II-90 mostró en total la mayor capacidad para adherirse a las células epiteliales tanto intestinales como vaginales (tabla 4).

Ejemplo 7. Adherencia y/o degradación de la mucina:

Las cepas de lactobacilos probadas mostraron una capacidad variable para adherirse a la mucina porcina (tabla 5). L. reuteri CR20 (cepa de control positivo) fue la cepa que mostró la mayor capacidad de adherencia seguida de L. salivarius V4II-90 y L. salivarius V7IV-1 (tabla 5). Ninguna de las cepas fue capaz de degradar la mucina gástrica in vitro.

Ejemplo 8. Supervivencia después del tránsito por un modelo gastrointestinal in vitro :

La viabilidad de las cepas después de la exposición a condiciones que simulan las que se encuentran en el tubo digestivo varió de ~64 % (L. reuteri CR20, L. salivarius V4II-90) a 30 % (L. salivarius V3III-1) (tabla 6).

Ejemplo 9. Susceptibilidad a los antibióticos:

Los valores de CIM de las cepas de lactobacilos para los 16 antibióticos ensayados se muestran en la tabla 7. Todas las cepas fueron sensibles a la mayoría de los antibióticos probados, incluyendo los que se consideran antibióticos clínicamente relevantes tales como, gentamicina, tetraciclina, clindamicina, cloranfenicol y ampicilina, que muestran CIM iguales o inferiores a los puntos de corte definidos por la EFSA (EFSA, 2012). Todas las cepas fueron resistentes a vancomicina y kanamicina, que es una propiedad intrínseca del L. salivarius a nivel de especie.

Ejemplo 10. Inducción de profagos:

Ninguno de los sobrenadantes obtenidos de las cepas de L. salivarius generaron halos de inhibición o placas de lisis relacionados con los fagos en los céspedes de ninguna de las cepas indicadoras probadas en este estudio.

Ejemplo 11. Producción de aminas biógenas:

Las cepas de L. salivarius no produjeron aminas biógenas ni albergaron los genes necesarios para la biosíntesis de este tipo de compuestos.

Ejemplo 12. Evaluación de seguridad in vivo de L. salivarius V4II-90:

12.1. Toxicidad oral aguda en ratas:

No se observaron signos clínicos anómalos, cambios conductuales, cambios en el peso corporal, hallazgos macroscópicos o cambios en el peso de los órganos. Todos los animales sobrevivieron al periodo de observación de 2 semanas. No hubo diferencias estadísticas en los pesos corporales entre los grupos. De manera similar, no se observaron diferencias estadísticamente significativas en el aumento del peso corporal, el consumo de alimento y de agua. El peso corporal, el aumento diario del peso corporal, el consumo de alimento y agua, por tanto, no se vieron afectados por el tratamiento (dosis oral única de 1 x 1010 ufc de L. salivarius V4II-90).

Los parámetros hematológicos y de química clínica evaluados 2 semanas después de la administración de la cepa como dosis única oral de 1 x 1010 ufc no fueron significativamente diferentes en comparación con los de los controles (tablas 8 y 9). No se observaron cambios relacionados con el tratamiento.

No hubo diferencias estadísticas en el peso de los órganos o las relaciones en peso de tejido:cuerpo relacionadas con la cepa de prueba (datos no mostrados). La preparación de L. salivarius V4II-90 no se asoció con ninguna incidencia de cambios macroscópicos y microscópicos. No se observaron cambios histopatológicos relacionados con el tratamiento 2 semanas después de la administración de la cepa como una dosis oral única de 1 x 1010 ufc. Por lo tanto, L. salivarius V4II-90 tiene un orden bajo de toxicidad aguda y la dosis letal oral (DL50) para ratas machos y hembras es superior a 1 x 1010 ufc.

12.2. Toxicidad oral por dosis repetidas (4 semanas) en ratas:

No se observó mortalidad. No se observaron cambios relacionados con el tratamiento en el estado general y la apariencia externa en ratas machos y hembras tratadas con dosis diaria de 1 x 109 ufc de L. salivarius V4II-90. El desarrollo de los animales durante el periodo experimental correspondió a su especie y edad. No hubo diferencias significativas en el peso corporal o el aumento de peso corporal entre los grupos tratados con L. salivarius V4II-90 en comparación con los grupos de control en ningún momento del periodo experimental. Todos los grupos tratados con L. salivarius V4II-90 consumieron cantidades similares de alimento y agua (datos no mostrados) a las de los grupos de control correspondientes.

Todos los datos hematológicos estaban dentro de los límites normales y no se observaron diferencias entre los grupos (tabla 10). Los datos de la química clínica no mostraron alteraciones relacionadas con el tratamiento al final del periodo de tratamiento de 4 semanas (tabla 11). Los valores individuales y los valores medios de los grupos se encontraban dentro de los intervalos fisiológicos. Después de 14 días sin tratamiento para detectar la aparición tardía de posibles efectos tóxicos, no hubo cambios relacionados con el tratamiento ni en los parámetros hematológicos ni en los parámetros de las pruebas clínicas (Tablas 10 y 11; grupo de control satélite o grupo 5 y grupo tratado satélite o grupo 6).

La necropsia realizada el día 29 después de la última dosis de L. salivarius V4II-90 (grupo 4) y el día 42 después de 14 días sin ningún tratamiento (grupo 6) no revelaron cambios patológicos graves ni diferencias en los pesos de los órganos en comparación con los grupos de control correspondientes. El peso medio de los órganos y la tasa de peso corporal:pesos de los órganos se presentan en la tabla 12. Después de 4 semanas de tratamiento, no hubo hallazgos histopatológicos en los órganos examinados considerados relacionados con el tratamiento en ratas machos y hembras (datos no mostrados). Tampoco hubo hallazgos histopatológicos relacionados con el tratamiento en el grupo tratado satélite (grupo 6) (datos no mostrados).

El nivel sin efectos adversos observados en este estudio de toxicidad oral con dosis repetidas (4 semanas) fue la dosis probada, es decir, 1 x 109 ufc de L. salivarius V4II-90.

12.3. Concentración total de glutatión hepático (GSH) y posible bacteriemia:

Para determinar cambios en la defensa antioxidante debidos al tratamiento probiótico, se determinó la concentración de GSH en el hígado. No se observaron diferencias significativas en la concentración hepática de GSH entre los grupos de control y tratados (9,54 ± 1,21 frente a 9,37 ± 1,39 mmol/g, P>0,1). Esto indica que el tratamiento con L. salivarius V4II-90 no provocó tensión oxidativa en ratas y es coherente con la ausencia de bacteriemia ya que no se pudieron aislar lactobacilos de sangre, hígado o bazo de las ratas. Sugiere que la cepa probada no provoca una infección local o sistémica en ratas.

12.4. Aislamiento de L. salivarius V4II-90 de muestras de heces y muestras de hisopado vaginales:

L. salivarius V4II-90 se pudo aislar del material colónico y de muestras de hisopados vaginales de todos los animales tratados (grupos probióticos) al final del tratamiento. La concentración osciló entre 5 x 105 y 7 x 108 ufc/g de material colónico y entre 3x 103 y 23 x 106 ufc/g en los hisopos vaginales. La cepa no pudo detectarse en ninguna muestra del grupo de placebo.

Ejemplo 13. Diseño de un ensayo de PCR para la detección específica y sensible de S. agalactiae en las muestras biológicas:

En función de la comparación de secuencias mediante los programas Emma y Showalign, se diseñaron los cebadores S. agalacFWI (5'-GTTTGGTGTTTACACTAGA-'3) (SEQ ID NO: 4) y S.agalacRVI (5'-CAATTGCTCCTTTTAAATAACT-'3) (SEQ ID NO: 5) para la amplificación específica de un fragmento teórico de 148 pb del gen de ARNr 16S de S. agalactiae.

En PCR convencional, el par de cebadores específicos de EGB (S.agalacFWI y S.agalacRVI) amplificó un único amplicón de 148 pb de ADN de S. agalactiae. No se obtuvo reactividad cruzada con ADN de ninguna otra especie analizada (figura 2).

El sistema específico en tiempo real amplificó un fragmento de 148 pb, con una temperatura de fusión de 80,00 de todas las muestras de S. agalactiae analizadas. No se amplificó ningún producto homólogo de ningún otro ADN bacteriano probado. Se obtuvieron valores del ciclo umbral (Ct) entre 16,72 y 20,87 de ADN de S. agalactiae. Los valores de Ct medidos para el ADN extraído de especies no diana fueron 39,82 ± 0,59 (tabla 13). En las condiciones experimentales de los inventores, se estableció un valor de corte de la siguiente manera: Los valores de Ct por encima del correspondiente al valor medio de Ct de todas las especies no diana y controles sin molde menos el doble de su desviación típica (Ct > 38,64) se consideraron negativos para la presencia de ADN diana. En relación con el límite de detección de este enfoque de PCR, se observó que cuanto menor sea el porcentaje de ADN diana, mayores serán los valores de Ct obtenidos en la PCR en tiempo real con los cebadores específicos de especie. El límite de detección de este ensayo fue inferior a 0,005 ng de ADN diana, que corresponde a un valor de Ct de 34,34 (figura 3, tabla 14).

Cuando se analizaron muestras biológicas reales, hubo una excelente concordancia entre los resultados de la PCR convencional y los obtenidos por métodos basados en cultivos (tabla 15). La identificación por MALDI-TOF y PCR convencional (cualitativa) fueron discordantes para solo 1 muestra. Además, dos muestras que dieron positivo por PCR convencional proporcionaron un resultado negativo por PCR en tiempo real. En total, los resultados obtenidos indican que las técnicas de PCR desarrolladas en este estudio han demostrado tener una alta especificidad y sensibilidad, y, por lo tanto, constituyen métodos útiles de exploración de EGB.

Ejemplo 14. Eficacia de L. salivarius V4II-90 para erradicar el EGB del tracto intestinal y vaginal de mujeres embarazadas: ensayo clínico:

En el momento de inclusión en el estudio, se detectó EGB en muestras de hisopado rectales y vaginales obtenidas de 39 mujeres, de un total de 57 mujeres participantes, mientras que el resto de mujeres (n = 18) dieron negativo para EGB (tabla 16). Este último grupo de mujeres con resultados negativos para EGB, que no tomaron una cepa de L. salivarius (109 ufc/diario), también tuvieron cultivos de EGB negativos de muestras de hisopado rectales y vaginales tomadas regularmente a las 28, 32 y 36-38 semanas. Un grupo de mujeres con resultado positivo para EGB al comienzo del estudio (n = 14) no recibió probiótico y se descubrió que los resultados de detección rutinarios para EGB vaginal y rectal a las 28, 32 y 36-38 semanas eran todos positivos (tabla 16; figura 4).

De manera significativa, el grupo de mujeres con resultados positivos para EGB que comenzaron a usar el probiótico (109 ufc/diario) desde que se inscribieron en este estudio (a partir de las 26 semanas) también dieron positivo para EGB a las 28 semanas, pero apareció un número creciente de resultados negativos para EGB en las muestras sucesivas recogidas hasta el parto (tabla 16; figura 4). A las 30 semanas, el cultivo de muestras de hisopado rectales tomadas de cuatro mujeres de este grupo arrojó un resultado negativo y el número de estas muestras aumentó a 18 (72 % de las participantes) a las 38 semanas. Se obtuvieron resultados similares cultivando muestras de hisopado vaginales obtenidas de este grupo, aunque la proporción de mujeres que dieron negativo para EGB fue siempre ligeramente mayor cuando se analizaron las muestras de hisopado rectales que en las muestras de hisopado vaginales (tabla 16; figura 4).

Un análisis más detallado reveló que la ausencia de EGB en hisopos rectales y vaginales se detectó en el mismo tiempo de muestreo en 6 participantes entre mujeres con muestras negativas para EGB (n = 19) (una mujer a las 35 semanas y cinco mujeres a las 32 semanas). La detección de ausencia de EGB se encontró con mayor frecuencia por primera vez en muestras de hisopado rectales (11 mujeres) que en muestras de hisopado vaginales (2 mujeres) (tabla 17).

La estimación de la concentración de EGB en hisopos vaginales tomados regularmente hasta el parto de todas las participantes se muestra en la figura 5. No hubo cambios significativos tanto en las mujeres con resultados negativos para EGB (n = 18) como en las mujeres con resultados negativos para EGB (n = 14) sin la administración oral de L. salivarius V4II-90 con respecto a la estimación semicuantitativa de EGB. Sin embargo, el número de muestras de hisopado vaginales donde no se pudo detectar el EGB aumentó en los tiempos de muestreo sucesivos en el grupo que inicialmente dio positivo para GBS que tomó 109 ufc de L. salivarius V4II-90 (n = 25). Asimismo, el cambio en los recuentos bacterianos medios para S. agalactiae en las mujeres que dieron positivo y tomaron la cepa de L. salivarius dependió tanto de las mujeres como del tiempo de muestreo, pero no hubo interacción entre estos dos factores (ANOVA de dos vías; P < 0,001). El valor medio de recuentos de S. agalactiae disminuyó significativamente con el tiempo de administración de L. salivarius V4II-90 (figura 6) desde un valor medio de 5,14 ufc/ml a las 26 semanas (n = 25) a 3,80 ufc/ml a las 38 semanas (n = 9) (figura 6).

Ninguna de las mujeres que participaron en este estudio informó de ningún efecto adverso derivado de la ingesta de L. salivarius V4II-90.

CONCLUSIONES DE LOS EJEMPLOS:

En la presente invención, todos los aislamientos vaginales (de mujeres sanas embarazadas o no embarazadas) que cumplían los criterios de selección iniciales pertenecían a la misma especie: L. salivarius.

En la presente invención, ninguna de las cepas seleccionadas de L. salivarius presentaron actividad de tipo bacteriocina contra cepas de S. agalactiae. Por lo tanto, la actividad antimicrobiana que las cepas de L. salivarius seleccionadas presentaron contra S. agalactiae debe estar relacionada con la producción de otros compuestos antimicrobianos, tales como ácidos orgánicos. En nuestro estudio, L. salivarius V4II-90 (la cepa que mostró la mayor actividad anti-EGB) produjo grandes cantidades de ácido láctico y, además, fue capaz de producir peróxido de hidrógeno.

La capacidad de adherirse a las células epiteliales intestinales o vaginales o a la mucina, y de agregarse conjuntamente con posibles patógenos constituye uno de los principales mecanismos para prevenir su adhesión y colonización de superficies mucosas. En total, L. salivarius V4II-90 mostró la mejor combinación de adherencia a las células epiteliales, agregación conjunta con S. agalactiae e inhibición de cepas de S. agalactiae en cultivos conjuntos en caldo. Esta cepa mostró una alta tasa de supervivencia durante el tránsito a través de un modelo gastrointestinal in vitro, similar a la obtenida con otros L. salivarius usando el mismo modelo (Martin et al., 2006; Martin et al., 2009). La supervivencia de los lactobacilos cuando se exponen a condiciones que se encuentran en el tubo digestivo parece ser un requisito previo fundamental para una cepa probiótica cuando se busca su uso como complemento alimenticio, como era el caso.

Uno de los criterios más importantes para la selección de cepas probióticas es la evaluación de su seguridad, en particular para la población diana. En este trabajo, ninguna de las mujeres que participaron en el ensayo clínico y se adscribieron a cualquiera de los tres grupos de probióticos informó de ningún efecto adverso (por tanto, recibieron L. salivarius V4II-90 a 9 log10 ufc al día durante varias semanas). La seguridad debe evaluarse cepa a cepa ya que, aunque son poco habituales, se han informado de efectos adversos debidos al consumo de cepas de lactobacilos.

Las cepas de L. salivarius incluidas en este estudio fueron muy susceptibles a la mayoría de los antimicrobianos probados. De hecho, sus CIM fueron inferiores a los límites establecidos para los lactobacilos para siete de los ocho antibióticos necesarios para esta especie por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA, 2012). La única excepción fue la kanamicina. Se ha informado repetidas veces de la resistencia de los lactobacilos a la kanamicina y otros aminoglucósidos (tales como la neomicina o la estreptomicina), y se cree que esto es un rasgo específico de especie de L. salivarius debido a la falta de transporte mediado por citocromos de esta clase de antibióticos; las cepas de L. salivarius también fueron resistentes a la vancomicina, pero la EFSA no requiere una evaluación de la sensibilidad a la vancomicina en el caso de lactobacilos homofermentativos (incluyendo L. salivarius) ya que son intrínsecamente resistentes a este antibiótico probablemente debido a la presencia de D-Ala-D-lactato en su estructura de peptidoglucano. Como reconoce la EFSA (2012), este tipo de resistencias intrínsecas no representan un riesgo para la salud humana. Por lo tanto, L. salivarius V4II-90 y las otras cepas evaluadas en este estudio pueden considerarse seguras desde este punto de vista.

Los lactobacilos se encuentran entre las bacterias grampositivas con potencial para producir aminas biógenas; ya que estas sustancias pueden provocar varios problemas toxicológicos y/o pueden actuar como posibles precursores de nitrosaminas cancerígenas, no obstante, las cepas de L. salivarius exploradas no produjeron histamina, tiramina, putrescina o cadaverina ni albergaron los determinantes genéticos necesarios para su biosíntesis. Adicionalmente, no pudieron degradar la mucina gástrica in vitro. Por lo tanto, la cepa de la presente invención no provoca problemas toxicológicos.

TABLAS

Tabla 1. Principales géneros y especies aislados de las muestras vaginales proporcionadas por las mujeres que artici aron en el estudio.

continuación

Tabla 2. pH y concentraciones de ácido L- y D-láctico (mg/ml; media ± DT) y peróxido de hidrógeno (mg/ml; media ±

DT) en los sobrenadantes obtenidos de cultivos de MRS de los lactobacilos (n = 4).

Cepa pH Ácido L-láctico Ácido D-láctico Peróxido de hidrógeno L. salivarius V3IIl-1 4,00 9,66 ± 0,57 Nd Nd

L. salivarius V4II-90 4,01 10,03 ± 0,60 Nd 7,29 ± 0,69

L. salivarius V7II-1 4,02 9,82 ± 0,69 Nd Nd

L. salivarius V7II-62 4,01 9,76 ± 0,54 Nd Nd

L. salivarius V7IV-1 3,85 10,47 ± 0,58 Nd 7,46 ± 0,58

L. salivarius V7IV-60 4,02 9,72 ± 0,63 Nd Nd

L. salivarius V8III-62 4,04 9,91 ± 0,55 Nd Nd

L. salivarius V11I-60 4,03 9,84 ± 0,43 Nd Nd

L. salivarius V11III-60 4,07 9,61 ± 0,47 Nd Nd

L. salivarius V11IV-60 4,03 10,02 ± 0,62 Nd Nd

L. salivarius CECT 5713 3,93 10,26 ± 0,62 Nd -

El valor de pH inicial del caldo de cultivo MRS fue 6,2. ND: No detectable.

Tabla 3. Recuentos bacterianos de las cepas de S. agalactiae cuando se cocultivan con las cepas de L. salivarius en caldo de cultivo MRS durante 0, 6 y 24 h a 37 °C.

L. salivarius (cepa) S. agalactiae 0h 6h 24 h

V3III-1 RC5 7,10 6,44 Nd

RC6 7,24 7,04 Nd

V2I-80 7,10 7,04 Nd

V14I-63 7,27 7,10 Nd

V4II-90 RC5 7,04 4,48 Nd

RC6 7,23 Nd Nd

V2I-80 7,10 4,70 Nd

V14I-63 7,34 Nd Nd

V7II-1 RC5 7,15 7,27 Nd

RC6 7,15 6,70 Nd

V2I-80 7,04 7,10 Nd

V14I-63 7,35 5,65 Nd

V7II-62 RC5 7,24 7,04 Nd

RC6 6,98 7,49 Nd

V2I-80 7,35 7,92 Nd

V14I-63 7,10 6,93 Nd

V7IV-1 RC5 7,32 7,58 Nd

RC6 7,34 6,90 Nd

V2I-80 7,15 7,38 Nd

V14I-63 7,23 6,04 Nd

V7IV-60 RC5 7,24 7,32 Nd

RC6 7,32 8,06 Nd

V2I-80 7,04 7,15 Nd

V14I-63 7,35 8,34 Nd

V8III-62 RC5 7,15 7,90 Nd

RC6 7,34 7,23 Nd

(continuación)

L. salivarius (cepa) S. agalactiae 0h 6h 24 h

V2I-80 7,24 6,90 Nd

V14I-63 7,20 8,77 Nd

V11I-60 RC5 7,31 7,44 Nd

RC6 7,01 6,94 Nd

V2I-80 7,23 7,07 Nd

V14I-63 6,93 6,60 Nd

V11 III-60 RC5 7,27 6,44 Nd

RC6 6,95 6,88 Nd

V2I-80 7,28 6,52 Nd

V14I-63 7,37 6,85 Nd

V11IV-60 RC5 7,26 6,74 Nd

RC6 7,42 6,60 Nd

V2I-80 7,10 6,60 Nd

V14I-63 7,06 5,32 Nd

Cultivos de control RC5 7,20 9,32 9,34

(sin cepa de L. RC6 7,31 9,20 9,27 salivarius)

V2I-80 7,04 9,15 9,23

V14I-63 7,10 9,02 9,15

Nd: No se detectó S. agalactiae.

Tabla 4. Capacidad de los lactobacilos para adherirse a células epiteliales HT-29, Caco-2 y vaginales.

Cepa HT-29 Caco-2 Células

vaginales

L. salivarius V3III-1 877,3 ± 303,2 259,1 ± 67,1

L. salivarius V4II-90 905,2 ± 297,0 345,1 ± 72,8 ++

L. salivarius V7II-1 336,2 297,8 ± 84,5 +

L. salivarius V7II-62 911,7 ± 250,9 321,5 ± 80,2 +

L. salivarius V7IV-1 226,3 252,3 ± 67,1 +

L. salivarius V7IV-60 799,7 ± 210,1 255,9 ± 60,3 +

L. salivarius V8III-62 623,4 ± 200,2 108,7 ± 24,3

L. salivarius V11I-60 593,2 ± 191,5 121,6 ± 22,0

L. salivarius V11III-60 612,4 ± 188,2 153,2 ± 26,7

L. salivarius V11IV-60 601,6 ± 172,0 159,5 ± 23,4

L. rhamnosus GG 912,4 ± 345,0 371,5 ± 67,8 Nd

L. casei imunitass 127,4 ± 20,9 16,7 ± 7,3 Nd

Se contaron los lactobacilos adherentes en 20 campos microscópicos aleatorios para cada prueba (n = 4). Nd, no determinado.

_________________ Tabla 5. Capacidad de los lactobacilos para adherirse a la mucina porcina.

Cepa Adhesión3

L. salivarius V3III-1 9,3 ± 2,0

L. salivarius V4II-90 10,9 ± 1,8

L. salivarius V7II-1 8,9 ± 1,9

L. salivarius V7II-62 9,0 ± 1,6

L. salivarius V7IV-1 8,5 ± 1,2

L. salivarius V7IV-60 9,6 ± 1,7

L. salivarius V8III-62 3,3 ± 0,7

L. salivarius V11I-60 2,9 ± 0,8

L. salivarius V11III-60 2,4 ± 1,0

(continuación)

Cepa Adhesióna

L. salivarius V11IV-60 3,4 ± 0,8

L. reuteri CR20 11,8 ± 1,9

aValores expresados como el porcentaje de la fluorescencia conservado en los pocillos después de las etapas de lavado del ensayo.

Tabla 6. Porcentaje (%) de lactobacilos iniciales (109ufc/ml) que sobrevivieron a condiciones similares a las del tubo ___________________________________________ digestivo.___________________________________________

Fracción de vaciado gástricoa

Cepa 20 min 40 min 60 min 80 min % total L. salivarius V3III-1 9,4 ± 0,4 12,1 ± 0,5 5,0 ± 0,3 3,7 ± 0,1 30,2 L. salivarius V4II-90 16,9 ± 0,6 21,3 ± 1,7 16,5 ± 0,9 9,3 ± 0,5 64,3 L. salivarius V7II-1 14,8 ± 0,4 23,7 ± 2,4 14,3 ± 1,4 7,0 ± 0,4 59,8 L. salivarius V7II-62 14,3 ± 2,0 12,0 ± 1,3 11,5 ± 0,7 12,7 ± 1,5 50,5 L. salivarius V7IV-1 13,6 ± 0,8 13,5 ± 1,2 11,9 ± 1,3 9,1 ± 1,4 48,1 L. salivarius V7IV-60 12,8 ± 1,9 16,3 ± 1,5 10,7 ± 1,2 13,5 ± 1,6 53,3 L. salivarius V8III-62 7,5 ± 0,6 12,4 ± 1,0 10,8 ± 1,2 10,6 ± 1,4 41,3 L. salivarius V11I-60 8,2 ± 0,7 11,7 ± 1,4 11,3 ± 1,1 9,6 ± 1,3 40,8 L. salivarius V11III-60 7,9 ± 0,8 12,0 ± 1,2 10,2 ± 1,3 11,0 ± 1,6 41,1 L. salivarius V11IV-60 8,5 ± 0,7 12,7 ± 1,3 10,9 ± 0,9 10,2 ± 1,1 42,3 L. salivarius CELA2 15,4 ± 1,6 25,8 ± 2,9 17,0 ± 2,2 6,2 ± 0,4 64,4 aMedia ± DT. Las diferentes fracciones se tomaron del compartimento de tipo gástrico a los 0, 20, 40, 60 y 80 min y después se sometieron a la secreción de tipo intestinal.

Tabla 8. Parámetros hematológicos en ratas después del periodo de observación de 2 semanas tras una dosis oral única de L. salivarius V4II-90 en 1010 ufc.

Tabla 9. Parámetros de química clínica en ratas después del periodo de observación de 2 semanas tras una dosis oral única de L. salivarius V4II-90 en 1010 ufc.

Tabla 10. Parámetros hematológicos en ratas después de dosis orales repetidas (4 semanas) de L. salivarius V4II-90 en 109 ufc.

continuación

Tabla 10 continuación

Tromboplastina: Tiempo parcial de tromboplastina (s)

aLos datos se expresan como media ± ETM (n = 6 animales/grupo de sexo). Neutrófilos en bandas Neutrófilos en bandas (x103/ml). Tromboplastina: Tiempo parcial de tromboplastina (s).

Tabla 11. Parámetros bioquímicos en ratas después de dosis orales repetidas (4 semanas) de L. salivarius V4II-90 en 109 ufc.

Tabla 11 continuación

PA: fosfatasa alcalina

aLos datos se expresan como media ± ETM (n = 6 animales/grupo de sexo).

Tabla 12. Peso medio de los órganos y tasa de peso corporal/de órganos en ratas después de dosis orales repetidas (4 semanas de L. salivarius V4II-90 en 109 ufc.

continuación

Tabla 12 continuación

continuación

"p.c.": peso corporal; "g.s.": glándula suprarrenal. aLos datos se expresan como media ± ETM (n = 6 animales/grupo de sexo).

Tabla 13. Especificidad del sistema de PCR en tiempo real (valores de Ct obtenidos a partir de 10 ng de ADN). Nombre científico Punto de cruce (Ct) Temperatura de fusión (Tm) Streptococcus agalactiae DSM 2134 16,77 ± 1,51a 80,00 Streptococcus agalactiae M57207 18,08 ± 1,14 80,00 Streptococcus agalactiae M57730 17,97 ± 0,58 80,00 Streptococcus agalactiae M67018 16,72 ± 0,45 80,00 Streptococcus agalactiae M6836 19,07 ± 0,81 80,00 Streptococcus agalactiae M70043 20,87 ± 0,31 80,00 Streptococcus dysgalactiae DSM 20662 40,00 ± 0,00 Ninguna Streptococcus peroris DSM 12493 40,00 ± 0,00 Ninguna Streptococcus mitis DSM 12643 39,01 ± 0,54 Ninguna Streptococcus oralis CECT 907 40,00 ± 0,00 Ninguna Streptococcus parasanguinis DSM 6778 40,00 ± 0,00 Ninguna Streptococcus bovis DSM 20564 38,73 ± 0,51 Ninguna Streptococcus uberis DSM 20564 40,00 ± 0,00 Ninguna Streptococcus salivarius CECT 805 39,83 ± 0,10 Ninguna Streptococcus termophilus ATCC 19987 40,00 ± 0,00 Ninguna Streptococcus pneunoniae 0566 40,00 ± 0,00 Ninguna Bifidobacterium adolescentis HE 005 40,00 ± 0,00 Ninguna Bifidobacterium animalis subsp. lactis PS17 40,00 ± 0,00 Ninguna Bifidobacterium breve CECT 4839 40,00 ± 0,00 Ninguna Bifidobacterium infantis CECT 4551 40,00 ± 0,00 Ninguna (continuación)

Nombre científico Punto de cruce (Ct) Temperatura de fusión (Tm) Bacteroides vulgatus DSM 1447 40 ,00 ± 0,00 Ninguna Bacteroides fragilis DSM 2151 40 00 ± 0,00 Ninguna Leuconostoc citreum CECT 4025 40 00 ± 0,00 Ninguna Leuconostoc mesenteroides CECT 219 40 00 ± 0,00 Ninguna Leuconostoc fallax LMG 13177 40 00 ± 0,00 Ninguna Weissella cibaria CECT 7032 40 00 ± 0,00 Ninguna Weissella confusa CECT 4707 40 00 ± 0,00 Ninguna Lactobacillus crispatus DSMZ 20584 40 00 ± 0,00 Ninguna Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis CECT 282 37 09 ± 1,23 Ninguna Lactobacillus salivarius CECT 4063 40 00 ± 0,00 Ninguna Staphylococcus epidermidis CECT 232 40 00 ± 0,00 Ninguna Staphylococcus aureus CECT 86 4000 ± Ninguna Lactococcus lactis ATCC 10456 40 00 ± 0,00 Ninguna Pediococcus pentosaceus CECT 46595 40 00 ± 0,00 Ninguna Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae DSM 40 00 ± 0,00 Ninguna 30104

Enterococcus faecium CECT 410 4000 ± 0,00 Ninguna Enterococcus faecalis CECT 481 40 ,00 ± 0,00 Ninguna aLos valores de Ct se expresan como media ± desviación típica

Tabla 14. Límite de detección del sistema de PCT en tiempo real usando series de diez veces de ADN de S.

agalactiae DMSZ 2134 como patrón.

Dilución Valor de Ct Concentración de ADN (ng)

10-1 19,24 ± 0,02 110

10-2 20,09 ± 0,15 55

10-3 20,22 ± 0,23 27,5

10-4 21,80 ± 0,07 13,75

10-5 22,64 ± 0,04 6,8

10-6 23,48 ± 0,11 3,43

10-7 24,83 ± 0,07 1,71

10-8 25,66 ± 0,12 0,85

10-9 26,52 ± 0,01 0,42

10-10 27,66 ± 0,04 0,21

10-11 29,82 ± 0,13 0,1

10-12 30,37 ± 0,00 0,05

10-13 31,61 ± 0,10 0,02

10-14 33,18± 0,15 0,01

10-15 34,34 ± 0,21 0,005

Tabla 15. Resultados del ensayo de PCR convencional y en tiempo real para la detección de mujeres con colonización vaginal por EGB.

Muestra ^{Cultivo e identificación} Resultados de amplificación por Resultados de PCR en _{mediante MALDI-TOF} PCR convencional (pb) tiempo real (Ct) 1 148 pb 21,82 ±0,50 a 2 148 pb 33,81 ± 0,74

3 - - 40 ± 0,00

4 148 pb 20,85 ± 0,53

5 - - 40 ± 0,00

6 - - 40 ± 0,00 (continuación)

Cultivo e identificación Resultados de amplificación por Resultados de PCR en mediante MALDI-TOF PCR convencional (pb) tiempo real (Ct)

- - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 148 Pb 22,03 ± 0,53 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 148 Pb 32,28 ± 0,30 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 148 Pb 22,01 ± 1,3 - - 40 ± 0,00 - 148 Pb 35,98 ± 0,97 148 pb 40 ± 0,00 148 Pb 20,82 ± 1,26 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 148 Pb 25,30 ± 0,49 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 148 Pb 18,99 ± 0,31 148 Pb 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 148 Pb 34,40 ± 1,09 148 Pb 33,01 ± 1,74 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 148 Pb 30,12 ± 1,66 148 Pb 29,35 ± 0,42 - - 40 ± 0,00 - - 40 ± 0,00 148 Pb 30,16 ± 1,22 - - 40 ± 0,00 148 Pb 24,99 ± 1,69 (continuación)

Muestra ^{Cultivo e identificación} Resultados de amplificación por Resultados de PCR en _{mediante MALDI-TOF} PCR convencional (pb) tiempo real (Ct)

54 - - 40 ± 0,00

55 - - 40 ± 0,00

56 148 pb 29,98 ± 1,10 57 148 pb 33,70 ± 1,17

58 - - 40 ± 0,00

59 - - 40 ± 0,00

60 - - 40 ± 0,00

61 148 pb 27,54 ± 1,00

62 - - 40 ± 0,00

Aislamiento positivo de EGB; - Aislamiento negativo de EGB/detección de ADN de EGB.

aLos valores de Ct se expresan como media ± desviación típica.

Tabla 16. Evaluación cualitativa (EGB positivo/EGB negativo) de S. agalactiae en muestras de hisopado rectales y vaginales de las participantes (N = 57)._______________________________________________________________ Estado inicial de EGB Ingesta de Muestras de hisopado rectales probióticos

Negativo NO semana 12-26 28* 32** 36-38 (n = 18) EGB positivas 0 0 0 0 EGB negativas 18 17 16 18 EGB negativas (%) ^{1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0} Positivo NO semana 14-17 ^{2 3} ** 32* 36-38 (n = 14) EGB positivas 14 12 13 14

EGB negativas 0 0 0 0 EGB negativas (%) ^{0 0 0 0} Positivo SÍ semana 26 28 30 32 35 38 (n = 25) EGB positivas 25 25 21 12 9 7 EGB negativas 0 0 4 13 16 18 EGB negativas (%) ^{0 0} 16 52 64 72

Tabla 16. (continuación)

Estado inicial de EGB Ingesta de Muestras de hisopado vaginales probióticos

Negativo NO semana 12-26 28* 32** 36-38 (n = 18) EGB positivas 0 0 0 0 EGB negativas 18 17 16 18 EGB negativas (%) ^{1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0} Positivo NO semana 14-17 ^{2 3} ** 32* 36-38 (n = 14) EGB positivas 14 12 13 14

EGB negativas 0 0 0 0 EGB negativas (%) ^{0 0 0 0} Positivo SÍ semana 26 28 30 32 35 38 (n = 25) EGB positivas 25 25 25 15 10 8 EGB negativas 0 0 0 10 15 17 EGB negativas (%) ^{0 0 0} 40 60 ^{6 8} *: faltaba la muestra de una participante en este momento de muestreo.

**: faltaba la muestra de dos participantes en este momento de muestreo.

Tabla 17. Comparación de los resultados obtenidos para la evaluación cualitativa (EGB positivo/EGB negativo) de S. agalactiae en muestras de hisopado rectales y vaginales de participantes que dieron positivo para EGB y recibieron administración oral de L. salivarius V4II-90 (109ufc/diario) (n = 25).

Muestra de hisopado rectal Muestra de hisopado vaginal semana semana

Mujer 26 28 30 32 35 38 26 28 30 32 35 38 3 P P P P P P P P P P P P 9 P P P P P P P P P P P P 10 P P P P P P P P P P P P 17 P P P P P P P P P P P P 18 P P P P P P P P P P P P 21 P P P P P P P P P P P P 15 P P P P P P P P P P P N* 24 P P P P P N* P P P P P P 6 P P P P P N* P P P P P P 5 P P P P N* N P P P P P N 25 P P P P N N P P P P N N 23 P P P P N N P P P N* N N 7 P P P N* N N P P P P N N 12 P P P N* N N P P P P N N 13 P P P N* N N P P P P N N 22 P P P N* N N P P P P N N 16 P P P N N N P P P N N N 19 P P P N N N P P P N N N 1 P P P N N N P P P N N N 4 P P P N N N P P P N N N 8 P P P N N N P P P N N N 2 P P N* N N N P P P N N N 11 P P N* N N N P P P N N N 14 P P N* N N N P P P N N N 20 P P N* N N N P P P N N N

Tabla 17. (continuación)___________________________________________________________________________

Detección de ausencia de EGB en cultivos de muestras de hisopado rectales y vaginales Por primera vez en muestra de Por primera vez en muestras de hisopado Mujer Simultáneamente hisopado rectal vaginales

3

9

10 -17

18

21

15 semana 38

24 semana 38

6 semana 38

5 semana 35

25 semana 35

23 semana 32

7 semana 32

12 semana 32

13 semana 32

___________________________ (continuación)_____________________________________ Detección de ausencia de EGB en cultivos de muestras de hisopado rectales y vaginales Por primera vez en muestra de Por primera vez en muestras de hisopado Mujer Simultáneamente hisopado rectal vaginales

22 semana 32

16 semana 32

19 semana 32

1 semana 32

4 semana 32

8 semana 32

2 semana 30

11 semana 30

14 semana 30

20 semana 30

Abreviaturas: P: positiva; N: negativa. *: Solo una de las muestras (vaginal o rectal) fue negativa para EGB en ese momento de muestreo.

REFERENCIAS CITADAS EN LA SOLICITUD:

Arroyo R, et al. 2010 Clin Infect Dis 50: 1551-1558.

Boris S, et al. 1998 Infect Immun. 66: 1985-1989.

Bover-Cid S y Holzapfel WH 1999 International Journal of Food Microbiology 53: 33-41

Coconnier MH, et al. 1992 Appl Environ Microbiol 58: 2034-2039.

Conway PL, et al. 1987 Journal of Dairy Science 70: 1-12.

De Gregorio PR, et al. 2014 J Med Microbiol 63: 685-696.

EFSA. Panel on additives and products or substances used in animal feed (FEEDAP). Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance. EFSA Journal. 2012.

10, 2740.

García-Moruno E, et al. 2005 J Food Protect 68 (3): 625-9.

Kullen, M J, et al. 2000 J. Appl. Microbiol 89: 511-516.

Ladero V, et al. 2012 Food Microbiol 30 (1): 132-8.

Langa S, et al. 2012 Appl Microbiol Biotechnol. Jun; 94 (5): 1279-87.

Le Jeune C, et al. 1995 J Appl Bacteriol; 78: 316-26.

Lucas P and Lonvaud-funel A. 2002 FEMS Microbiol Lett 211: 85-9.

Magnusson J y Schnürer J. 2001 Applied and Environmental Microbiology 67: 1-5.

Marteau P, et al. 1997 Journal of Dairy Science 80: 1031-1037.

Martin R, et al. 2005 J Hum Lact; 21: 8-17.

Martin R, et al. 2006 Int J Food Microbiol 112: 35-43.

Martin R, et al. 2009 J Dairy Res. Nov 76 (4): 418-25.

Muller AE, et al. 2006 Acta Obstet Gynecol Scand 85: 1027-1037.

Reid G, et al. 1990 Current Microbiology 20: 47-52.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una cepa aislada de Lactobacillus salivarius depositada en la "Colección Española de Cultivos Tipo (CECT)" con el número de referencia CECT 9145.

2. Un cultivo bacteriano que comprende la cepa de la reivindicación 1.

3. La cepa aislada según la reivindicación 1 o el cultivo bacteriano según la reivindicación 2 para su uso como medicamento.

4. La cepa aislada según la reivindicación 1 o el cultivo bacteriano según la reivindicación 2 para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad infecciosa.

5. La cepa aislada o el cultivo bacteriano para su uso según la reivindicación 4, en donde la enfermedad infecciosa está provocada por Streptococcus agalactiae.

6. La cepa aislada o el cultivo bacteriano para su uso según la reivindicación 5, en donde la enfermedad infecciosa provocada por Streptococcus agalactiae es septicemia de inicio precoz, una infección ginecológica o mastitis.

7. La cepa aislada según la reivindicación 1 o el cultivo bacteriano según la reivindicación 2 para su uso como probiótico.

8. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la cepa según la reivindicación 1 o el cultivo bacteriano según la reivindicación 2 como ingrediente activo, junto con cantidades adecuadas de un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptables.

9. La composición farmacéutica según la reivindicación 8 que es para administración oral, vaginal, rectal, anal, intramamaria, intravenosa, intraarterial, parenteral, intracraneal, tópica, respiratoria o nasal.

10. Un producto comestible que comprende una cantidad eficaz de la cepa según la reivindicación 1 o el cultivo bacteriano según la reivindicación 2 como ingrediente activo, junto con la cantidad adecuada de otro ingrediente comestible.

11. El producto comestible según la reivindicación 10, que se selecciona del grupo que consiste en un producto lácteo, un yogur, una cuajada, un queso, una leche fermentada, una leche en polvo, un producto fermentado a base de leche, un producto fermentado a base de carne, un helado, un producto fermentado a base de cereales, una bebida, un aperitivo, una harina, un chicle, un dulce, un alimento dulce, un alimento para mascotas, un complemento alimenticio o dietético, un alimento funcional, un nutracéutico, una fórmula de nutrición clínica, un complemento nutricional, una fórmula para mujeres embarazadas, una fórmula para ancianos y una fórmula para lactantes.

12. El producto comestible según una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, en donde la cantidad eficaz (dosis) de la cepa según se define en la reivindicación 1 o del cultivo bacteriano según se define en la reivindicación 2 comprende de 108 ufc/dosis a 1010 ufc/dosis del producto comestible.

13. Un dispositivo médico que comprende una cantidad eficaz de la cepa según la reivindicación 1 o del cultivo bacteriano según la reivindicación 2 como ingrediente activo.

14. Un método para obtener un mutante de la cepa de Lactobacillus salivarius CECT 9145, que comprende usar la cepa depositada como material de partida y aplicar mutagénesis, en donde el mutante obtenido conserva o mejora la actividad de la cepa depositada parental para prevenir o tratar enfermedades provocadas por S. agalactiae.

15. Un kit que comprende una cantidad eficaz de la cepa según la reivindicación 1, el cultivo bacteriano según la reivindicación 2 o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9.