ES2898876T3 - Composición que comprende una nueva cepa de Lactobacillus salivarius y método para la prevención y el tratamiento de otitis e infecciones respiratorias de vías altas - Google Patents

Abstract

Cepa de Lactobacillus salivarius PS7 (CECT9422) o cepa que tiene al menos una identidad del 99% con la secuencia de ARNr 16S de la cepa de L. salivarius PS7.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición que comprende una nueva cepa de Lactobacillus salivarius y método para la prevención y el tratamiento de otitis e infecciones respiratorias de vías altas

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de cepas probióticas, en particular a una nueva cepa probiótica de Lactobacillus salivarius, a composiciones que la comprenden, a su obtención y a su uso para la prevención y el tratamiento de enfermedades, en particular otitis e infecciones respiratorias de vías altas.

Antecedentes de la invención

La otitis media aguda (OMA) es una de las infecciones bacterianas más comunes y el motivo principal de tratamiento antibiótico en la niñez (Hendley, 2002). La trompa de Eustaquio es más corta en niños que en adultos, lo que permite que entren fácilmente bacterias y virus en el oído medio, dando como resultado otitis media aguda. Bacterias tales como Streptococcus pneumoniae (strep) y Haemophilus influenzae (H. flu) representan aproximadamente el 85% de los casos de otitis media aguda y los virus el 15% restante. Aproximadamente el 70% de niños experimenta al menos un episodio de otitis a los 2 años de edad, y el 20-30% padece OMA recurrente (Pichichero, 2000). La OMA recurrente (OMAr) provoca malestar en los niños y sus familias, y plantea una carga económica en la sociedad (Klein, 2001).

Las infecciones respiratorias de vías altas (IRVA), también conocidas como resfriado común, son una de las enfermedades más comunes, que conducen a más visitas al médico y ausencias del colegio y trabajo que cualquier otra enfermedad cada año. La mayoría de niños menores de 2 años experimentan varias IRVA durante el primer año de vida, y un cuarto padece infecciones recurrentes o prolongadas en países desarrollados. Los resfriados, provocados por un virus que inflama las membranas en el revestimiento de la nariz y garganta, pueden ser el resultado de más de 200 virus diferentes. Sin embargo, entre todos los virus del resfriado, los rinovirus provocan la mayoría de resfriados. Otros tipos de virus incluyen coronavirus, virus paragripal, adenovirus, enterovirus y virus respiratorios sinciciales. Los virus provocan una reacción inmunitaria. Esto, a su vez, provoca un aumento de la producción de moco, el hinchamiento del revestimiento de la nariz, haciendo difícil respirar y provocando congestión, estornudos y tos por el aumento de moco que gotea por la garganta. Las infecciones respiratorias de vías altas también son un factor de riesgo prominente para la otitis media aguda.

Las IRVA conducen a una prescripción inapropiada de antibióticos en la práctica pediátrica, ya que los antibióticos no son eficaces contra los virus. El uso inapropiado y extendido de antibióticos puede conducir al desarrollo de resistencia bacteriana y a la alteración del equilibrio normal de la microbiota humana, facilitando la colonización de patógenos y reduciendo la disponibilidad de vacunas para virus.

De manera similar, el tratamiento antibiótico y la profilaxis contra la recaída de OMA conducen inevitablemente al desarrollo de microorganismos resistentes a antibióticos y alteraciones en el equilibrio de la microbiota normal de las vías respiratorias altas, lo que facilita adicionalmente la colonización de patógenos (Brook y Gober, 2000).

La Organización Mundial de la Salud define a los probióticos como microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio para la salud en el huésped. Los probióticos más comúnmente usados son las especies de Lactobacillus y Bifidobacterium, seguidos por los géneros Streptococcus, Enterococcus, Propionibacterium, Bacillus y Escherichia coli. Además, algunas especies de levaduras se usan como probióticos, por ejemplo, Saccharomyces boulardii y Saccharomyces cerevisiae se usan frecuentemente para tratar trastornos gastrointestinales. Los productos probióticos pueden formularse como cápsulas, comprimidos, polvos (que están regulados como complemento alimenticio) y un componente alimenticio (por ejemplo, yogures, kéfires) o como fármaco. Los probióticos pueden ejercer una amplia variedad de efectos beneficiosos, tales como equilibrio de la microbiota intestinal del huésped e interacción con el sistema inmunitario innato y adaptativo, lo que puede fomentar la resistencia contra patógenos.

En los últimos años, los probióticos se han usado ampliamente en estados de salud de infecciones de los aparatos respiratorio, gastrointestinal y genitourinario, alergias, enterocolitis necrotizante en prematuros, cólico infantil, enfermedades autoinmunitarias y síndrome del intestino irritable (SII). Las terapias con probióticos ofrecen una opción atractiva para reestablecer el equilibrio microbiano y prevenir enfermedades infecciosas, incluyendo otitis (Niittynen et al., 2012). Los mecanismos de probióticos que contribuyen a la interferencia microbiana con patógenos pueden incluir competición por nutrientes esenciales y sitios de adhesión en la superficie epitelial, la producción de bacteriocinas y otras sustancias inhibidoras, y la potenciación de la inmunidad sistémica y de la mucosa (Popova et al., 2012).

El documento WO2006/007526 describe un método para tratar o prevenir infecciones respiratorias y otitis media aguda en niños, que comprende la administración de una cepa de Bifidobacterium y un probiótico promotor de la adherencia tal como una especie de Lactobacillus.

El documento WO2016/0077190 describe el uso de una especie de Lactobacillus en una composición para administración respiratoria para prevenir las secuelas inflamatorias patógenas de las infecciones respiratorias virales.

El documento WO2015/093937 describe el uso de una cepa de Lactobacillus salivarius para el tratamiento de mastitis.

El documento WO 00/78322 A2 divulga una combinación de bacterias de ácido láctico el uso de la misma para la prevención y el tratamiento de infecciones y estados inflamatorios, pero no menciona otitis o enfermedades del tracto respiratorio.

Cohen Robert et al., se relaciona con e luso de prebióticos y probióticos en la prevención de otitis media aguda (OMA) en niños de alto riesgo.

El documento WO 2007/144334 A1 divulga el uso de una combinación de Streptococus salivarius y Lactobacillus rhamnosus para la prevención y el tratamiento de otitis media.

La otitis, en particular la otitis media aguda (OMA), y la infección respiratoria de vías altas (IRVA) son problemas de salud extendidos entre niños pequeños, y se necesitan con urgencia estrategias preventivas y de tratamiento. Estudios previos han demostrado que los probióticos reducen la aparición IRVA y OMA en niños sanos, pero las mismas cepas no han logrado prevenir tales estados o reducir el estado de portador nasofaríngeo de patógenos causales en niños muy propensos a otitis. Por tanto, existe la necesidad de nuevos tratamientos de otitis e infecciones respiratorias de vías altas, particularmente en niños propensos a otitis.

Breve descripción de la invención

Se ha aislado y caracterizado una cepa probiótica de Lactobacillus salivarius aislada de una muestra vaginal de una mujer sana útil para la prevención y/o el tratamiento de otitis y otros estados de las vías respiratorias altas, tales como infecciones respiratorias de vías altas. Tal como se muestra en los ejemplos, la cepa de Lactobacillus salivarius PS7 de la invención puede reducir la aparición de episodios de otitis media aguda (OMA) en niños que padecen OMA recurrente (niños propensos a otitis) y/o el estado de portador del conducto auditivo externo de patógenos de otitis, lo que muestra un alto potencial para la prevención en tal población muy predispuesta. La cepa de Lactobacillus salivarius PS7 se ha depositado y se le ha dado el número de registro CECT9422.

En un aspecto, la presente invención se refiere a una cepa de Lactobacillus salivarius PS7 tal como se define en la reivindicación 1.

En otro aspecto, la cepa es Lactobacillus salivarius PS7.

La invención también se refiere a una composición que comprende una cepa tal como se definió anteriormente, ya su uso como probiótico.

En otro aspecto, la invención se refiere a las cepas o la composición tal como se definió anteriormente para su uso para la prevención y/o el tratamiento de otitis o infecciones respiratorias de vías altas (IRVA), preferiblemente en el tratamiento y/o la prevención de otitis media aguda (OMA).

Las cepas y composiciones de la invención son especialmente útiles para el tratamiento y/o la prevención de otitis o infecciones respiratorias de vías altas en niños propensos a otitis.

En otro aspecto, la invención se refiere a productos farmacéuticos que comprenden una cantidad eficaz de las cepas tal como se definió previamente, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables.

En otro aspecto, la invención se refiere a un producto comestible que comprende una cantidad eficaz de la cepa tal como se definió anteriormente, junto con otros componentes comestibles. Preferiblemente, el producto comestible se selecciona de un complemento alimenticio, un producto nutricéutico o un producto lácteo.

Dibujos

Figura 1.- Ensayo de PCR para la detección del gen estructural de la bacteriocina Abp118. Carril 1: marcador (Hyperladder™ 100bp, BIOLINE). Carril 2: control positivo. Carril 3: control negativo. Carriles 4, 5 y 6: L. salivarius PS7.

Figura 2.- Estabilidad de cultivos de L. salivarius PS7 liofilizados (línea roja) cuando se almacenan a temperatura ambiente.

Figura 3.- Estabilidad de cultivos de L. salivarius PS7 liofilizados cuando se almacenan a 4°C.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

En la presente descripción:

El término “probiótico” significa un microorganismo que ejerce efectos beneficiosos sobre la salud del huésped. Puede ser un medicamento o complemento alimentado con microorganismos vivos que afecta beneficiosamente al huésped mejorando su equilibrio microbiano, una preparación microbiana que contiene bacterias vivas o muertas, o una combinación de ambas.

El término “cepa” se conoce bien en el campo y significa un subtipo o una variante genética de un microorganismo. Una “cepa mutante” quiere decir que es diferente del tipo natural en una o más (nuevas) características provocadas por mutación/mutaciones.

El término “otitis” significa inflamación del oído. En el caso de otitis media, existe inflamación del oído medio caracterizada por la acumulación de líquido infectado en el oído medio, abultamiento de la membrana del tímpano, dolor en el oído y, si la membrana del tímpano se perfora, drenaje de material purulento (pus) en el conducto auditivo externo.

El término “ infección respiratoria de vías altas” significa una infección de la parte superior del aparato respiratorio que está por encima de los pulmones. Una infección respiratoria de vías altas puede deberse a varias infecciones virales o bacterianas. Estas infecciones pueden afectar a la garganta (faringitis), nasofaringe (nasofaringitis), senos paranasales (sinusitis), laringe (laringitis), tráquea (traqueítis) o bronquios (bronquitis).

El término “cantidad eficaz”, tal como se usa en el presente documento, significa una cantidad de un agente activo lo suficientemente alta para proporcionar el beneficio deseado, pero lo suficientemente baja para evitar efectos secundarios graves.

Cepa probiótica PS7

La cepa de Lactobacillus salivarius según la invención se denomina Lactobacillus salivarius PS7 o L. salivarius PS7. L. salivarius PS7 se ha depositado por Probisearch SLU, Calle Santiago Grisolía 2, Tres Cantos, España según el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con el Fin del Procedimiento de Patentes en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) el 18 de julio de 2017, y se le ha dado el número de registro CECT9422.

La presente invención también se refiere a cepas de L. salivarius que tienen al menos una identidad del 99% con la secuencia de ARNr 16S de la cepa de L. salivarius PS7 que se describe en los ejemplos (referencia Stackebrandt y Goebel, 1994: “Taxonomic Note: A Place for DNA-DNA Reassociation and 16s rRNA Sequence Analysis in the Present Species Definition in Bacteriology” Int. J. Syst. Bacteriol. 44:846-849).

En una realización preferida, la cepa según la presente invención tiene una identidad del 100% con la secuencia de ARNr 16S de L. salivarius PS7, es decir, la cepa según la presente invención es la cepa de Lactobacillus salivarius PS7.

A partir de la cepa de Lactobacillus salivarius PS7 depositada, el experto en la técnica puede obtener de manera rutinaria, mediante técnicas convencionales de mutagénesis o reaislamiento, mutantes o derivados adicionales de la misma que conservan las características y ventajas relevantes descritas en el presente documento de la cepa PS7. En el contexto de la presente divulgación, el término “un mutante de la misma” se refiere a cepas mutantes obtenidas usando las cepas depositadas como material de partida, conservando y potenciando dichas cepas mutantes las propiedades terapéuticas de las cepas originales. El experto en la técnica decidirá sobre el método adecuado que va a emplearse para determinar la actividad terapéutica de las cepas, en particular el tratamiento y/o la prevención de otitis e infecciones respiratorias de vías altas, tales como las descritas en los ejemplos de la presente solicitud.

Las cepas de la invención, tal como se demuestra en los ejemplos, son muy resistentes a las condiciones del entorno gastrointestinal de mamíferos (entorno ácido, altas concentraciones de lisozimas, sales biliares y peróxido de oxígeno), pudiendo, por tanto, sobrevivir el paso a través del TGI. Las cepas también tienen buena adhesión al epitelio intestinal, lo que les permite permanecer en el tracto intestinal y ejercer sus efectos probióticos.

En la presente invención, se prefieren microorganismos vivos tal como se definió anteriormente, ya que producen una serie completa de antígenos, se reproducen para aumentar el número de tales organismos en el entorno intestinal u otros tejidos del cuerpo para fomentar la interacción con la mucosa, y pueden adherirse a los tejidos intestinales u otros del cuerpo para estimular mejor una respuesta inmunitaria de la mucosa.

Composición

Preferiblemente, la cepa de L. salivarius PS7 de la invención está comprendida en una composición, tal como una composición nutritiva, un complemento nutritivo, una composición farmacéutica o una composición nutricéutica, preferiblemente una composición nutritiva o un complemento nutritivo, o un medicamento. Preferiblemente, la composición de la invención comprende la cepa de L. salivarius PS7 de la invención y un portador o excipiente fisiológicamente aceptable y/o componentes adicionales tal como se describe adicionalmente a continuación. Preferiblemente, la cepa de L. salivarius según la invención está presente en forma liofilizada.

Puede usarse cualquier excipiente o portador fisiológicamente aceptable tal como se conoce en la técnica. Los excipientes o portadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, maltodextrina, almidón (resistente), celulosa o derivados de celulosa, por ejemplo, metilcelulosa, estearato de magnesio, ácido esteárico, sacarina de sodio, talco, carbonato de magnesio y similares.

La composición según la invención puede comprender además probióticos, aparte de la cepa de L. salivarius tal como se describió anteriormente. Los probióticos tienen efectos beneficiosos sobre el sistema inmunitario, por lo tanto, la combinación con probióticos tendrá un efecto superior sobre el sistema inmunitario. Preferiblemente, los probióticos adicionales se seleccionan del grupo que consiste en Lactobacillus y Bifidobacterium.

La composición de la presente invención puede contener además prebióticos. Los prebióticos pueden respaldar el crecimiento de probióticos antes de que se vuelvan no replicantes. “Prebiótico” significa sustancias alimenticias no digeribles que fomentan el crecimiento de microorganismos y/o probióticos beneficiosos para la salud en los intestinos. No se descomponen en el estómago y/o intestino delgado ni se absorben en el tracto GI de la persona que los ingiere, pero se fermentan por la microbiota gastrointestinal y/o por probióticos. Preferiblemente, pueden seleccionarse del grupo que consiste en oligosacáridos, opcionalmente que contienen fructosa, galactosa, manosa; fibras alimenticias, en particular fibras solubles, fibras de soja; inulina; o mezclas de los mismos. Los prebióticos preferidos son fructooligosacáridos, galactooligosacáridos, isomaltooligosacáridos, xilooligosacáridos, arabino-xilooligosacáridos, mananoligosacáridos, oligosacáridos de soja, glicosilsacarosa, lactosacarosa, lactulosa, palatinosaoligosacáridos, maltooligosacáridos, gomas y/o hidrolizados de las mismas, pectinas y/o hidrolizados de las mismas.

La cantidad eficaz de unidades formadoras de colonias (ufc) para cada cepa en la composición de la invención se determinará por el experto y dependerá de la formulación final. Por ejemplo, en productos comestibles, la cepa de la invención está presente en una cantidad de desde aproximadamente 105 ufc/g hasta aproximadamente 1012 ufc/g, preferiblemente en una cantidad de desde aproximadamente 107 ufc/g hasta aproximadamente 1012 ufc/g, más preferiblemente en una cantidad de desde aproximadamente 109 ufc/g hasta aproximadamente 1012 ufc/g. Todas las cantidades se expresan como peso seco en gramos.

El término UFC se refiere a “unidades formadoras de colonias”. La cuantificación de bacterias en una muestra dada se logra de manera rutinaria contando el número total de unidades formadoras de colonias (UFC) hechas crecer sobre una placa de agar a partir de diluciones en serie, expresadas como UFC por gramo o ml de la muestra original. Esto proporciona una estimación del número de células presentes basándose en la interpretación experta del número de colonias sobre una placa.

En una realización preferida, la composición según la invención es una composición nutritiva o un complemento nutritivo. El complemento según la invención puede estar en forma de un polvo, un comprimido (incluyendo comprimido masticable) o una cápsula. La composición nutritiva según la invención puede ser cualquier producto alimenticio o bebida. Preferiblemente, la composición, especialmente el complemento nutritivo, según la invención comprende además un excipiente o portador fisiológicamente aceptable. En una realización preferida, la composición o el complemento es un polvo, empaquetado en un envase (preferiblemente un sobre), que comprende de 1 a 10 g, más preferiblemente de 1,5 a 7 g, lo más preferiblemente de 2 a 5 g. Preferiblemente, cada envase contiene una única dosis.

Si la composición según la invención se usa como complemento alimenticio, puede administrarse como tal, puede mezclarse con un líquido bebible adecuado, tal como agua, yogur, leche o zumo de frutas, o puede mezclase con alimento sólido o líquido. En este contexto, el complemento alimenticio puede estar en forma de comprimidos, píldoras, cápsulas, gránulos, polvos, suspensiones, sobres, pastillas, caramelos, barritas, jarabes y formas de administración correspondientes, habitualmente en forma de una dosis unitaria.

Modo de administración

La composición usada en el presente método se administra preferiblemente por vía entérica, más preferiblemente por vía oral. La composición según la invención puede administrarse en una única dosis diaria o múltiples dosis al día, tal como al menos 2 dosis al día, al menos 3 dosis al día, al menos 4 dosis al día. Preferiblemente, la composición según la invención se administra más de una vez al día. En una realización especialmente preferida, la composición según la invención se administra en 2 ó 3 dosis al día, lo más preferiblemente en 3 dosis al día. Preferiblemente, la cepa de la invención se administra en una cantidad de 105 ufc/dosis a aproximadamente 1012 ufc/dosis, preferiblemente en una cantidad de desde aproximadamente 107 ufc/dosis hasta aproximadamente 1012 ufc/dosis, más preferiblemente en una cantidad de desde aproximadamente 109 ufc/dosis hasta aproximadamente 1012 ufc/dosis. Mediante el término “por dosis” quiere decirse que esta cantidad de microorganismo se proporciona a un sujeto o bien al día o bien por ingesta, preferiblemente al día. El experto en la técnica podrá ajustar la dosis terapéuticamente eficaz y/o la dosis profilácticamente eficaz de manera apropiada.

En aplicaciones profilácticas, las composiciones según la invención se administran a una persona susceptible a, o de otro modo en riesgo de, un trastorno en una cantidad que es suficiente para reducir al menos parcialmente el riesgo de desarrollar ese trastorno. Una cantidad de este tipo se define como “una dosis profilácticamente eficaz”. De nuevo, las cantidades precisas dependen de varios factores, tales como el estado de salud y el peso del niño, y del efecto de la matriz alimenticia.

En una realización de la invención, la cepa o composición de la invención se administra a un niño. En una realización preferida, el niño tiene edad preescolar. En algunas realizaciones preferidas, el niño tiene entre aproximadamente 3 años y aproximadamente 5 años de edad.

En una realización, el niño es un niño propenso a otitis. Preferiblemente, el niño padece o es susceptible a padecer otitis y/o infecciones respiratorias de vías altas.

Efectos beneficiosos

Tal como resulta evidente mediante los ejemplos a continuación, las cepas y composiciones de la invención son seguras y tienen un efecto beneficioso importante. En un estudio clínico, las cepas de la invención disminuyeron en un 86% el número de episodios de OMA durante una intervención de 6 meses de niños propensos a otitis en comparación con el periodo de 6 meses antes de la intervención. También redujo la mediana de duración de episodios de OMA cuando se produjo OMA. Finalmente, las cepas de la invención redujeron el número de episodios de infecciones respiratorias de vías altas en niños que recibieron el probiótico.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación y caracterización de la cepa PS7

1.1. Aislamiento a partir de muestra vaginal e identificación (especie y cepa)

Se aisló Lactobacillus salivarius PS7 en el marco de un estudio para evaluar la diversidad bacteriana del grupo Lactobacillus en la leche materna y la vagina de mujeres sanas y comprender su posible translocación desde el intestino. Las mujeres se inscribieron en este estudio según los siguientes criterios: (a) mujeres sanas sin estados presentes o pasados subyacentes (incluyendo mastitis); (b) embarazo a término normal; y (c) ausencia de problemas perinatales del lactante y/o de la madre (incluyendo mastitis). Las muestras de leche, muestras vaginales y muestras rectales se recogieron de manera aséptica en tubos estériles y bastoncillos de algodón el día 7 después de la entrega y se mantuvieron a 4°C hasta la entrega al laboratorio, que se produjo en el plazo de las tres primeras horas después de la recogida. El estudio del que se aisló esta cepa se aprobó por el Comité Ético sobre Investigación Clínica del Hospital Clínico (Madrid).

El material biológico contenido en las muestras vaginales y rectales se resuspendió en 1 ml de agua peptonada. Las diluciones de las muestras con agua peptonada se sembraron en placa por triplicado sobre placas de agar de Man, Rogosa y Sharpe (MRS, Oxoid, Basingstoke, R.U.) complementada con L-cisteína (0,5 g/l) (MRS-Cys), que se incubaron de manera anaerobia (el 85% de nitrógeno, el 10% de hidrógeno, el 5% de dióxido de carbono) en una estación de trabajo anaerobia (MINI-MACS, DW Scientific, Shipley, R.U.) a 37°C durante 48 h.

Los aislados se examinaron mediante microscopía de contraste de fase para determinar la morfología celular y la reacción de tinción de Gram, y se sometieron a prueba para determinar las actividades oxidasa y catalasa y, además, el buen crecimiento (>108 UFC/ml) en caldo de MRS incubado a 37°C durante hasta 24 h.

La cepa se aisló de una muestra vaginal y se identificó a nivel de especie como Lactobacillus salivarius mediante amplificación por PCR de una sección de una región variable del gen de ARNr 16S usando los cebadores pbl16 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', SEQ ID NO: 1) y mbl16 (5'-GGCTGCTGGCACGTAGTTAG-3', SEQ ID NO: 2) (Kullen et al. 2000). Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 96°C durante 30 s, 50°C durante 30 s y 72°C durante 45 s (35 ciclos) y una extensión final a 72°C durante 4 min. Se purificaron los fragmentos amplificados usando el aparato NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel Gmb; Düren, Alemania) y se secuenciaron usando los cebadores citados anteriormente en un secuenciador automatizado ABI 377A (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.). Las secuencias se compararon con las depositadas en la base de datos EMBL usando el algoritmo BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

La identificación se confirmó mediante espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriztiempo de vuelo (MALDI-TOF) usando un instrumento Vitek-MS™ (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia) en las instalaciones de Probisearch (Tres Cantos, España). En resumen, se colocó directamente una porción de una colonia bacteriana (~1 pl) sobre una placa de muestra para MALDI. Entonces, se cubrió con 1 pl de una disolución saturada de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico en acetonitrilo (28%), y se dejó secar a temperatura ambiente. Se construyó un espectro medio con al menos perfiles de espectros de 50 m/z y se usó para la identificación por comparación con los espectros contenidos en la base de datos Myla (Biomerieux). Se definió la identificación como una concordancia del 99-100% con los valores de m/z específicos de especie en la base de datos.

La cepa pudo diferenciarse de otras cepas de L. salivarius de la propia colección mediante genotipado por ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD) y análisis de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE).

1.2. Supervivencia después del tránsito a través de un modelo gastrointestinal in vitro

La supervivencia de la cepa se sometió a prueba en un modelo in vitro del estómago e intestino delgado humanos basándose en lo descrito por Marteau et al. (1997). Se diluyó leche materna tratada por UHT (25 ml) que contenía aproximadamente 109 UFC/ml de la cepa sometida a prueba en 5 ml de una disolución de electrolitos estéril que contenía 6,2 g/l de NaCl, 2,2 g/l de KCl, 0,22 g/l de CaCl2 y 1,2 g/l de NaHCO3 para simular la dilución in vivo por la saliva. Entonces, se añadieron 5 ml de jugo gástrico porcino y se incubó la muestra a 37°C con agitación. La curva de pH en el compartimento similar al estómago se controló para reproducir los valores encontrados en monogástricos después del consumo de yogur (Conway et al. 1987): pH 5,0 al inicio, pH 4,1 a los 20 min, pH 3,0 a los 40 min y pH 2,1 a los 60 min. Se tomaron fracciones sucesivamente de este compartimento a los 20, 40, 60 y 80 min de una manera que simula el vaciado gástrico normal (Marteau et al. 1997). Después de ajustar su pH a 6,5 ± 0,2 con NaHCO31 M, se mezclaron con 10 ml de una disolución de electrolitos estéril que contenía 5 g/l de NaCl, 0,6 g/l de KCl, 0,3 g/l de CaCl2, el 4% de bilis porcina y el 7% de pancreatina (Sigma), que simula el contenido del jugo duodenal. Después de 120 min de exposición sucesiva a estas condiciones, se determinó la supervivencia bacteriana sembrando en placa las muestras sobre placas de agar MRS, que se incubaron de manera anaerobia a 37°C durante 48 h. Todos estos ensayos se realizaron por cuadruplicado y los valores se expresaron como la media ± DE.

Resultados: la viabilidad de la cepa después de la exposición a condiciones que simulan las encontradas en el tracto gastrointestinal fue alta (51,53%; tabla 1).

1.3. Determinación del espectro antimicrobiano

Se usó un método de superposición previamente descrito (Magnusson y Schnürer, 2001; Martín et al., 2005; Martín et al., 2006) para determinar la capacidad de la cepa para inhibir el crecimiento de diferentes bacterias implicadas en casos de otitis media aguda, incluyendo varias cepas (n=55) de las siguientes especies: Haemophilus influenza, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Moraxella catharralis, Alloiococcus otitis, Actinomyces europaeus, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa. Algunas de las cepas pertenecían a la colección propia mientras que el resto de las cepas se proporcionaron por la Dr. Patricia Ruiz Garbajosa (Servicio de Microbiología, Hospital Universitario Ramón y Cajal (Madrid)). Las placas superpuestas con indicadores bacterianos se incubaron a 37°C durante 48 h y, entonces, se examinaron para determinar zonas de inhibición alrededor de las vetas de la cepa. Todos los experimentos que sometían a ensayo la actividad inhibidora se realizaron por triplicado.

L. salivarius PS7 mostró una clara actividad antimicrobiana inhibidora (zona de inhibición >2 mm alrededor de la veta) contra todos los organismos indicadores usados en este estudio.

Para dilucidar el/los compuesto(s) responsable(s) de la actividad antimicrobiana, se examinó la cepa para determinar la producción de bacteriocinas, peróxido de hidrógeno, lactato y/o acetato.

1.4. Producción de bacteriocinas

La cepa L. salivarius PS7 se hizo crecer en caldo MRS a 37°C hasta la fase estacionaria temprana (A620 ~1,0). Se centrifugó el cultivo a 12.000 g durante 10 min a 4°C, y se neutralizó el sobrenadante hasta 6,2 con NaOH 1 M, se hirvió durante 5 min y se esterilizó por filtración a través de filtros de tamaño de poro de 0,22 pm (Millipore, Bedford, EE.UU.). La actividad bacteriocinogénica de los sobrenadantes libres de células se determinó mediante un ensayo de difusión en pocillos de agar. Se colocaron alícuotas (100 pl) de los sobrenadantes en pocillos (7 mm de diámetro), se cortaron en placas de agar de BHI enfriadas previamente sembradas (105 ufc/ml) con las cepas indicadoras. Las placas se mantuvieron a 4°C durante 2 h, y luego se incubaron en condiciones óptimas para el crecimiento del indicador. Los microorganismos empleados como indicadores de actividad bacteriocinogénica fueron diferentes cepas bacterianas de las siguientes especies: Haemophilus influenza, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Moraxella catharralis, Alloiococcus otitis, Actinomyces europaeus, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa.

Dado que L. salivarius PS7 mostró actividad bacteriocinogénica contra algunas de las cepas indicadoras sometidas a prueba en este trabajo, se llevaron a cabo análisis de PCR con el fin de detectar genes estructurales relacionados con la biosíntesis de salivaricinas. En resumen, se resuspendió una colonia en 50 j l de agua estéril; luego se añadieron 50 j l de cloroformo a la suspensión; se centrifugó la mezcla a 13.000 * g durante 10 min a 4°C. Posteriormente, se usaron 5 j l de la fase acuosa como molde de ADN en los ensayos de PCR usando las siguientes parejas de cebadores: (i) SalB-for (5'-TGATAAGAAAGAATTGGCACATATAATTG-3', SEQ ID NO: 3) y SalB-rev (5'-TCTGTTTAACTACAAATATTTTGATTTGAATG-3', SEQ ID NO: 4) para salivaricina B (Qataloluk, 2001); (ii) Abp118A-for (5'-AAACGTGGTCCTAACTGTGTAGG-3', SEQ ID NO: 5) y Abp118B-rev (5'-AACGGCAACTTGTAAAACCACCAG-3', SEQ ID NO: 6) para bacteriocina Abp-118 (Flynn et al., 2002). Cada reacción de PCR (20 j l ) contenía 5 j l de la mezcla de tampón (5* MyTaq Red), 0,5 j l de cada cebador, 0,15 j l de la enzima ADN polimerasa en MyTaq Red (BIOLINE) y 13,85 j l de agua desionizada. El programa de PCR fue el siguiente: una etapa de desnaturalización inicial (95°C durante 2 min), seguido de 30 ciclos de 95°C durante 30 s, 58°C durante 30 s y 72°C durante 30 s, y una extensión final de 72°C durante 5 min. Los amplicones se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa (2%) a 90 V durante 1 h, usando un marcador de tamaño molecular de 100­ 1.013 pb (Hyperladder™ 100bp, BIOLINE) y como marcador, y tinte rojo de ácidos nucleicos en gel (Biotium) como agente de tinción, en un sistema de obtención de imágenes en gel (Gel Doc 2000, Bio-Rad).

La cepa presentó una actividad de bacteriocina notable contra las cepas Gram positivas incluidas como organismos indicadores usadas en este estudio. El análisis de PCR para detectar genes estructurales de salivaricinas conocidas reveló que esta cepa puede producir la bacteriocina Abp-118 tal como se muestra en la figura 1.

1.5. Producción de peróxido de hidrógeno

La producción de peróxido de hidrógeno por la cepa de Lactobacillus se sometió a prueba inicialmente siguiendo el procedimiento descrito por Song et al. (1999). Se inocularon placas de agar MRS complementadas con 0,25 mg/ml de tetrametilbencidina (TMB; Sigma, St. Louis, EE.UU.) y 0,01 mg/ml de peroxidasa del rábano (HRP, Sigma) con la cepa y se incubaron de manera anaerobia durante 2 días a 37°C. Se sabe que la HRP oxida a la TMB en presencia de peróxido de hidrógeno para formar un pigmento azul en la colonia productora de H2O2. En paralelo, el peróxido de hidrógeno también se midió mediante una modificación del método cuantitativo de Yap y Gilliland (2000). La cepa se hizo crecer de manera anaerobia en 10 ml de caldo MRS durante 24 h a 37°C. Se recogieron las células mediante centrifugación a 12000 * g durante 10 min a 4°C, se lavaron dos veces con tampón fosfato de potasio (50 mM, pH 6) y se resuspendieron en 9 ml del mismo tampón complementado con glucosa 5 mM. Se inoculó la suspensión celular (0,5 ml) en un tubo que contenía 9 ml del tampón que contenía glucosa. Después de una incubación aerobia a 37°C durante 24 h, se retiraron las células mediante centrifugación a 12000 *g durante 10 min a 4°C, y se sometieron a ensayo los sobrenadantes para determinar el peróxido de hidrógeno. En resumen, se mezclaron 5 ml de sobrenadante con 100 j l de o-dianisidina acuosa al 1% (Sigma) y 1 ml de HRP acuosa al 0,001%. Los tubos se incubaron durante 10 min a 37°C y se detuvo la reacción añadiendo 0,2 ml de HCl 4 N. Se determinó la lectura de la absorbancia (A400 nm) y se cuantificó el contenido de peróxido comparando los valores obtenidos con los de una curva de calibración de H2O2. En todos los ensayos de H2O2, se usó L.johnsonii La1 como control positivo.

L. salivarius PS7 fue positiva en un examen cualitativo para determinar la producción de peróxido de hidrógeno; a continuación, un ensayo cuantitativo mostró que la cantidad de H2O2 producido por esta cepa fue de 0,729 jg/m l ± 0,240 mientras que la producción de la cepa de control (L. johnsonii La1) fue mayor (7,63 jg/m l ± 0,407).

1.6. Producción de ácido láctico y ácido acético

Se determinó la producción de ácido láctico por la cepa de L. salivarius en caldo MRS (pH 6,2). Se usó el uno por ciento de inóculo de un cultivo de MRS durante la noche y se procedió a la incubación durante 24 h a 37°C de manera anaerobia (el 85% de nitrógeno, el 10% de hidrógeno, el 5% de dióxido de carbono) en una estación de trabajo anaerobia Ma CS-MG-1000 (DW Scientific, Shipley, R.U.). Se retiraron las células mediante centrifugación a 12000 * g durante 5 min y se cuantificó la concentración de ácido L y D-láctico en los sobrenadantes usando un kit enzimático (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante. También se midieron los valores de pH de los sobrenadantes. De manera similar, se cuantificó la concentración de ácido acético en los sobrenadantes de cultivo usando otro kit enzimático (Roche Diagnostics) y siguiendo las instrucciones del fabricante. En este caso, se constituyó MRS a partir de sus diferentes componentes excluyendo el acetato de sodio. Estos ensayos se realizaron por triplicado y los valores se expresaron como la media ± DE.

Resultados: L. salivarius PS7 produjo una alta concentración de ácido L-láctico a la vez que no produjo el isómero ácido D-láctico (tabla 2). También pudo detectarse una concentración significativa de ácido acético en los sobrenadantes de cultivo de la cepa (0,68 mg/ml ± 0,17).

a a . oncen rac n e c o y - c co mg m; me a ± y p e os so rena anes obtenidos de cultivos en MRS de Lactobacillus (n=4).

Cepa pH Ácido L-láctico Ácido D-láctico

L. salivarius PS7v 3,83 10,29 ± 0,70 Nd

L. rhamnosus GG 3,97 6,44 ± 0,92 Nd

L. johnsonii La1 3,96 3,95 ± 0,41 7,86 ± 1,36

L. casei imunitass 4,02 7,05 ± 0,64 Nd

Nd, no detectable.

De manera global, estos resultados muestran que L. salivarius PS7 es una cepa muy singular con un potencial muy alto para inhibir bacterias patógenas dado que puede producir simultáneamente, al menos, cuatro compuestos antimicrobianos (una bacteriocina, peróxido de hidrógeno, L-lactato y acetato).

1.7. Ensayos de coagregación

También se investigó la capacidad de la cepa para agregarse con células de las cepas relacionadas con otitis citadas anteriormente siguiendo el procedimiento de Reid et al. (1990), adaptado por Younes et al. (2012). Este ensayo se basa en cocultivos en medios de caldo y técnicas de microscopía óptica.

L. salivarius PS7 mostró un gran potencial de coagregación con cepas bacterianas implicadas en otitis media, particularmente con aquellas que pertenecen a los géneros Streptococcus, Alloiococcus, Enterococcus y Staphylococcus. Este mecanismo puede prevenir la interacción de tales patógenos con sus células diana humanas.

1.8. Adhesión a células Caco-2/HT-29

La adherencia de la cepa a células HT-29 y Caco-2 se examinó básicamente tal como describieron Coconnier et al. (1992). De manera rutinaria, las células se hicieron crecer en medio DMEM (PAA, Linz, Austria) que contenía glucosa 25 mM, piruvato de sodio 1 mM y complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (30 min, 56°C), L-glutamina 2 mM, preparación de aminoácidos no esenciales al 1%, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 mg/ml. Para los ensayos de adherencia, se cultivaron HT-29 y Caco-2 hasta la confluencia en 2 ml de medio desprovisto de antibióticos. Aproximadamente 10 días tras la confluencia, se reemplazó 1 ml del medio por 1 ml de suspensión de Lactobacillus (108 ufc/ml en DMEM). Se incubaron los cultivos inoculados durante 1 h a 37°C en el 5% de CO2. Luego, se lavó la monocapa cinco veces con PBS estéril, se fijó con metanol, se tiñó con tinción de Gram y se examinó al microscopio. Se contaron los Lactobacillus adherentes en 20 campos microscópicos al azar para cada prueba.

La cepa mostró una gran capacidad de adhesión a células Caco-2 (697,1 ± 297,6; expresada como la media ± DE del número de Lactobacillus adheridos en 20 campos microscópicos al azar) y a células HT-29 (251,7 ± 82,3).

1.9. Producción de riboflavina/folato/cianocobalamina

Se lavaron células bacterianas de L. salivarius PS7 de un cultivo durante la noche en MRS 3 veces con solución salina, se resuspendieron en esta disolución al volumen de cultivo original y se usaron para inocular (4%; v/v) medios de cultivo libres o bien de riboflavina, de folato o bien de vitamina B12 (Difco, EE.UU.). Entonces, los medios inoculados se incubaron a 37°C durante 18 h sin agitación. Después de la incubación, se repitió este procedimiento de lavadoresuspensión y se usó la disolución celular resultante para inocular (2%; v/v) los respectivos medios libres de vitaminas recién preparados. Esta última etapa se repitió 7 veces y, después de la última incubación, se tomaron muestras para determinar las concentraciones extra e intracelulares de vitamina. Para la determinación de la concentración de folato, se mezcló una muestra (500 pl) de medio libre de vitaminas hecho crecer con bacterias con partes iguales de un tampón protector (tampón fosfato 0,1 M, pH 6,8, que contenía ácido ascórbico [1,5%; p/v]) para evitar la oxidación y degradación de las vitaminas, a la vez que se añadió ácido acético (1%; v/v) en el caso de riboflavina. Inmediatamente después de la adición de o bien el tampón protector o bien ácido acético, se centrifugaron las mezclas durante 5 min a 5.000 xg. Entonces, se recogió el sobrenadante (muestra extracelular) y se hirvió durante 5 min mientras que el sedimento se resuspendió en 500 pl de tampón protector, se hirvió durante 5 min, se centrifugó durante 6 min a 10.000 xg y también se recogió el sobrenadante correspondiente (muestras intracelulares). Todos los sobrenadantes se almacenaron a -70°C hasta que se usaron para la cuantificación de vitamina.

Se determinaron las concentraciones de folato mediante un ensayo microbiológico descrito previamente usando Lactobacillus rhamnosus NCIMB 10463 como organismo indicador (Laiño et al. 2012). En resumen, se colocaron muestras o diferentes concentraciones de ácido fólico de calidad para HPLC (Fluka BioChemica, Sigma-Aldrich, Suiza) con la cepa indicadora y se incubaron de manera estática durante 48 h a 37°C en microplacas estériles de 96 pocillos que contenían el medio libre de folato (Deltalab, Argentina). Se leyó la densidad óptica a 580 nm (DO580) usando un lector de microplacas (lector de microplacas ajustable VERSAmax, Molecular Devices, EE.UU.). La concentración de folato de las muestras se determinó comparando la DO con las obtenidas con la curva de calibración preparada usando ácido fólico comercial. Se determinaron las concentraciones de riboflavina de la misma manera pero usando L. rhamnosus ATCC 7469 como cepa indicadora hecha crecer en el medio libre de riboflavina y se confirmó mediante análisis de HPLC tal como se describió previamente (Juarez del Valle et al. 2014).

Se usó un método de referencia, el ensayo de Lactobacillus delbrueckii B12 (Horwitz 2000), para preparar extractos celulares y, luego, para analizar la producción de cobalamina.

La cepa PS7 pudo crecer en ausencia y producir vitaminas B2. Las concentraciones (media DE) de riboflavina intracelular y extracelular fueron de 165,00 ± 0,52 y 34,74 ± 3,06 ng/ml, respectivamente (concentración total: ~200 ng/ml). La cepa no produjo ni vitamina B6 ni cianocobalamina.

1.10. Adherencia a mucina porcina

La adhesión de la cepa a mucina se determinó según el método descrito por Cohen y Laux (1995) con algunas modificaciones. En resumen, se inmovilizaron 100 pl de una disolución (1 mg/ml) de mucina porcina (Sigma) en solución salina de Hanks tamponada con HEPES (HH) en placas de microtitulación de poliestireno (Maxisorp; Nunc, Roskilde, Dinamarca) después de incubación durante la noche a 4°C. Los pocillos se lavaron dos veces con 250 pl de HH. En paralelo, se hicieron crecer bacterias durante la noche a 37°C en caldo MRS y se obtuvieron los sedimentos bacterianos de fracciones de 1 ml mediante centrifugación y se lavaron con HH. Lugo se añadieron 10 pl de carboxifluoresceína 10 mM (Sigma) a los sedimentos y se incubaron las suspensiones bacterianas durante 20 min a 37°C. Posteriormente, las células bacterianas se lavaron 3 veces con HH y, finalmente, se resuspendieron en 1 ml de HH. Entonces, se añadió una suspensión de 50 pl de las bacterias marcadas de manera fluorescente (~ 5x107 UFC) a cada pocillo. Después de una incubación durante 1 h a 37°C, las placas se lavaron dos veces con 250 pl de HH para retirar células no unidas, y se incubaron durante 1 h a 60°C en presencia de 50 pl de dodecilsulfato de sodio al 1% (SDS)-NaOH 0,1 M para liberar y lisar microorganismos unidos. Se midió la fluorescencia en un lector de microplacas de fluorescencia (Tecan Austria GMBH, Salzburgo, Austria). Se evaluó la adhesión como el porcentaje de la fluorescencia conservada en los pocillos después de las etapas de lavado cuando se compara con aquel presente en las alícuotas bacterianas marcadas añadidas originalmente a los pocillos. Los ensayos se realizaron por duplicado.

La cepa PS7 mostró una gran capacidad de adherirse a mucina.

1.11. Degradación de mucina

Se evaluó el potencial de la cepa para degradar mucina gástrica (HGM; Sigma) in vitro por duplicado siguiendo el procedimiento desarrollado por Ruseler-van Embeden et al. (1995) y modificado por Zhou et al. (2001).

La cepa PS7 no pudo degradar mucina gástrica in vitro.

1.12. Antibiograma

Se determinó la CIM de los 16 antibióticos incluidos en este estudio en cultivos de L. salivarius PS7 hechos crecer durante la noche en medio de prueba con susceptibilidad a bacterias del ácido láctico (LSM) (Klare et al. 2005) y se diluyeron para obtener una densidad correspondiente al criterio 1 de McFarland (equivalente espectrofotométrico ~ 3 x 108 UFC/ml). La suspensión se ajustó adicionalmente a 3 x 105 UFC/ml con LSM, y se inocularon 100 pl a pocillos de placas de microtitulación VetCIM para bacterias del ácido láctico (Instituto Veterinario Nacional de Suecia, Uppsala, Suecia). Las placas se incubaron a 37°C durante 48 h, y se definió la CIM como la concentración más baja a la que no se observó crecimiento.

En paralelo, también se determinaron las concentraciones inhibidoras mínimas (CIM) mediante la prueba E (AB BIODISK, Solna, Suecia) siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, después de una incubación durante la noche, se comprobaron los cultivos de agar para determinar la pureza. Para la preparación de inóculos, se suspendieron colonias individuales en un tubo de cultivo de vidrio estéril que contenía 5 ml de solución salina estéril (disolución de NaCl al 0,85%) hasta que se obtuvo una densidad correspondiente a un criterio de McFarland (McF) de 0,5. Se sumergió un bastoncillo de algodón estéril en el inóculo normalizado y se usó para inocular una placa de agar. Se dejaron secar las placas inoculadas durante aproximadamente 15 min antes de la aplicación de las tiras de la prueba E con gradientes antimicrobianos preformados. Después de 24 h de incubación, se definió la CIM como el valor correspondiente al primer punto en la tira de la prueba E en el que no se produjo crecimiento a lo largo de la elipse de inhibición. Para los agentes bacteriostáticos (por ejemplo, tetraciclina, eritromicina y clindamicina), la CIM se leyó en el punto en el que se inhibió el crecimiento en un 80% (es decir, el primer punto de inhibición significativa tal como se valora a simple vista).

Los resultados de las diferentes pruebas de susceptibilidad antibiótica se interpretaron según los niveles límite propuestos por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA, 2012). Según estos valores, los Lactobacillus fueron sensibles a todos los antibióticos sometidos a prueba en este estudio con la excepción de kanamicina y vancomicina (un hecho que se esperaba dado que todas las cepas de las especies L. salivarius son intrínsecamente resistentes a estos dos antibióticos) (tabla 3).

1.13. Formación de aminas biogénicas

Se evaluó la capacidad de formar aminas biogénicas (tiramina, histamina, putrescina y cadaverina) usando el caldo de descarboxilasa y el método descrito por Bover-Cid y Holzapfel (1999) y, también, mediante cromatografía de gasesespectrometría de masas. Los aminoácidos precursores (tirosina, histidina, ornitina y lisina, respectivamente) se adquirieron de Sigma.

La cepa PS7 no pudo producir aminas biogénicas.

1.14. Estimulación de células dendríticas inmaduras

Se aislaron células dendríticas (DC) inmaduras de ratón del bazo de ratones C57BL/6 hembra (6-10 semanas de edad) y se caracterizaron tal como se describió anteriormente (Lu et al. 1995). Para la propagación de DC aisladas, se cultivaron de manera rutinaria a 37°C en una atmósfera del 5% de CO2 humidificada en medio IMDM con FBS inactivado por calor al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina G 100 Ul/ml, estreptomicina 100 pg/ml y p-mercaptoetanol 20 pM (IMDM completo; todos los componentes eran de Sigma) y se complementaron con rGM-CSF de ratón 0,4 ng/ml (R&D Systems). Se cambió el medio de cultivo cada cuatro días y se retiraron granulocitos y DC maduras mediante lavados suaves, después de lo cual se repusieron los cultivos con medio nuevo que contenía rGM-CSF recién preparado (Lu et al. 1995).

Los anticuerpos monoclonales anti-IgG de ratón lA/Ed (2G9) y CD86/B7.2 (GL1), que reconocen específicamente los CMH II y b 7.2 de ratón, respectivamente, se adquirieron de PharMingen (San Diego, EE.UU.). La ficoeritrina y la estreptavidina se obtuvieron de Sigma.

Se recuperaron cultivos durante la noche en MRS-Cys de L. salivarius PS7 mediante centrifugación a 6.000 x g durante 5 min, y se lavaron dos veces con PBS. Luego, se distribuyeron 2 x 107 ufc en alícuotas de 100 pl de medio de Dulbecco modificado por Isocove (IMDM) desprovisto de antibióticos y se añadieron a 10 ml de cultivos de DC recién preparados que contenían 2 x 106 células. Se incubaron los cocultivos durante 90 min a 37°C y se incluyeron cultivos de DC no inoculados como controles negativos. Después del periodo de incubación, se lavaron las células con PBS y EDTA 2 mM y se mantuvieron durante 18 h a 37°C en IMDM completo complementado con gentamicina (250 jg/m l) y tetraciclina (10 jg/m l) para destruir las bacterias restantes. Entonces, se lavaron las células dos veces con PBS y se tiñeron con los anticuerpos anti-CMH clase II y anti-B7.2 con el fin de detectar tanto DC como la posible activación de los marcadores superficiales. La tinción se realizó según técnicas de inmunofluorescencia convencionales mientras se llevaba a cabo el marcaje de los anticuerpos con ficoeritrina siguiendo las instrucciones del fabricante (Sigma). Finalmente, se realizó análisis de citometría de flujo con un aparato FACS (Becton Dickinson, San José, CA) y se analizaron los datos resultantes con el software WinMDI 2.8. Se analizaron un total de 10.000 células a través de una ventana de adquisición de células viables determinada mediante parámetros de dispersión de luz directa y de ángulo derecho para excluir partículas subcelulares (Langa et al., 2013).

Se evaluaron los cambios fenotípicos de DC relacionados con la posible acción estimuladora de L. salivarius CECT 5713. Después de una incubación de los cocultivos de bacterias-DC (razón 10:1) durante 90 min, la morfología de las células DC cambió drásticamente. Se volvieron más irregulares con prolongaciones o dendritas visibles, que son las características principales de las DC activadas. Estos cambios morfológicos se observaron durante al menos 24 h después de la exposición a las células bacterianas. Además, los Lactobacillus potenciaron fuertemente la presentación de la molécula coestimuladora B7.2 (CD86) y el CMH clase II sobre las superficies de DC. Estos marcadores se detectaron en el 66,2 y el 68,9%, respectivamente, de las DC cocultivadas. En cambio, los valores correspondientes a DC que no se expusieron a las cepas bacterianas fueron significativamente menores (el 10,7 y el 8,8%, respectivamente).

1.15. Estabilidad después de la liofilización

Se cultivó L. salivarius PS7 en caldo MRS a 37°C en aerobiosis. Se recogieron las células de cultivos en fase estacionaria mediante centrifugación a 10.000 * g durante 10min a 4°C. Se resuspendieron los sedimentos bacterianos en leche desnatada reconstituida (10% p/v) a una concentración final que oscilaba entre 109 y 1010 UFC/ml. Se congelaron las suspensiones bacterianas a -80°C y, posteriormente, se liofilizaron en las siguientes condiciones: 2 h a -20°C, 20 h a -15°C y, finalmente, 24 h a 15°C. Se almacenaron los cultivos liofilizados a temperatura ambiente (~25°C) y a 4°C y se comprobó su viabilidad mensualmente durante un periodo de 8 meses.

No hubo diferencias en cuanto a los recuentos de bacterias vivas entre cultivos recién preparados iniciales (9,3-8,8 logi0 ufc/g) y cultivos liofilizados (9,3-8,7 logi0 ufc/g), inmediatamente después del procedimiento de liofilización. Entonces, se comprobó la estabilidad de cultivos de L. salivarius PS7 liofilizados durante el almacenamiento a temperatura ambiente o a 4°C mensualmente durante 8 meses (véanse las figuras 2 y 3, respectivamente; líneas/puntos rojos). El recuento de células viables de L. salivarius PS7 fue de ~8,0-8,6 logiü ufc/g después de 3-4 meses a temperatura ambiente. La viabilidad descendió abruptamente después de 5 meses en tales condiciones. En cambio, la viabilidad era todavía de ~ 6,8 log logiü ufc/g después de 8 meses a 4°C.

Ejemplo 2 : ensayos de toxicidad en animales

2.1. Estudios de toxicidad oral agudos y de dosis repetida (4 semanas)

Se aclimataron ratas Wistar macho y hembra (Charles River Inc., Marget, Kent, R.U.) durante 7 días antes del inicio del estudio con una evaluación del estado de salud. Las ratas se alojaron individualmente en jaulas de policarbonato con lecho de serrín y se mantuvieron en salas con el ambiente controlado (22 ± 2°C y el 50% ± el 10% de humedad relativa) con un ciclo de 12 h de luz-oscuridad (luz desde las 08:00 hasta las 20:00 h). Los alimentos (dieta para roedores A03, Scientific Animal Food and Engineering, Villemoisson-sur-Orge, Francia) y el agua estaban disponibles a voluntad. Las ratas tenían 56 días de edad al inicio del tratamiento. Se llevaron a cabo estudios agudos (prueba de límite) y de dosis repetida (4 semanas) según las directrices de la Unión Europea (Reglamento del Consejo de la CE n.° 440, 2008a,b). Ambos estudios se desarrollaron según los requisitos éticos y los autorizó el Comité Ético Oficial de la Universidad Complutense.

En el estudio agudo (prueba de límite), se distribuyeron 24 ratas (12 machos, 12 hembras) en dos grupos de 6 machos y 6 hembras cada uno. Después de un ayuno durante la noche, cada rata recibió leche desnatada (500 j l) por vía oral (grupo de control o grupo 1), o una única dosis oral de 1 x 1010 unidades formadoras de colonias (ufc) de L. salivarius PS7 disuelta en 500 j l de leche desnatada (grupo tratado o grupo 2). Se administraron dosis de los artículos de prueba y de control mediante sonda nasogástrica. Se comprobaron los animales para detectar signos clínicos y mortalidad dos veces a día (por la mañana y por la tarde). Al final de un periodo de observación de 14 días, las ratas se pesaron, se sacrificaron mediante inhalación de CO2, se desangraron y se sometieron a necropsia.

El estudio de dosis repetida (4 semanas) (prueba de límite) se llevó a cabo en 48 ratas (24 machos, 24 hembras) divididas en cuatro grupos de 6 machos y 6 hembras cada uno (grupo de control o grupo 3; grupo tratado o grupo 4; grupo de control satélite o grupo 5; y grupo tratado satélite o grupo 6). Las ratas recibieron una dosis diaria de o bien leche desnatada (grupos 3 y 5) o bien 1 x 109 ufc de L. salivarius PS7 disuelta en 500 j l de leche desnatada (grupos 4 y 6) por vía oral una vez al día durante 4 semanas. Las dosis de los artículos de prueba y de control se administraron mediante sonda nasogástrica. Los animales se dosificaron a aproximadamente el mismo momento cada día (aproximadamente 4-6 h en el ciclo de luz). Se retuvieron los alimentos, pero no el agua, desde 4 h antes hasta 2 h después de la administración de artículo de control y de prueba. Se comprobaron los animales para detectar signos clínicos y mortalidad dos veces a día (por la mañana y por la tarde). Todas las ratas de los grupos 3 y 4 se privaron de alimento durante 18 h, se pesaron, se sacrificaron mediante inhalación de CO2, se desangraron y se sometieron a necropsia el día 29. Todos los animales de los grupos satélite (grupos 5 y 6) se mantuvieron durante 14 días adicionales sin tratamiento para detectar una aparición retardada, o persistencia de, o recuperación de efectos tóxicos. Todas las ratas de los grupos 5 y 6 se privaron de alimento durante 18 h, se pesaron, se sacrificaron mediante inhalación de CO2, se desangraron y se sometieron a necropsia el día 42.

2.2. Observaciones

Todos los animales se observaron dos veces al día para determinar el aspecto general, el comportamiento, los signos de morbilidad y mortalidad (una vez antes del tratamiento y una vez al día después de eso). Se observaron las ratas para determinar su estado general y el estado de la piel y el pelaje, los ojos, la nariz, la cavidad oral, el abdomen y los genitales externos, se evaluaron para determinar la frecuencia respiratoria y se palparon para determinar bultos. Los parámetros de comportamiento comprobados fueron movimientos anómalos (temblor, convulsión, contracciones musculares), reacciones al manejo y comportamiento en campo abierto (excitabilidad, respuesta al tacto y a ruidos fuertes), cambios en el comportamiento habitual (cambios en el acicalamiento, agitación de la cabeza, giro), comportamiento anómalo (autofagia, movimiento hacia atrás) y agresión. Se midieron el peso corporal, el aumento de peso corporal y el consumo de alimentos y agua al día y, al final de los periodos de observación, se examinaron las ratas mediante necropsia, y se registraron los pesos de los órganos.

2.3. Parámetros de pruebas clínicas

Se extrajeron muestras de sangre para evaluación hematológica y de química clínica del plexo retroorbital de animales bajo anestesia ligera inducida por inhalación de CO2 después de un periodo de observación de 14 días en el estudio oral agudo y después de 4 semanas de tratamiento y 14 días de recuperación para el estudio de seguridad de 4 semanas de dosis repetida. Se usó EDTA como anticoagulante para muestras hematológicas y se usó citrato de sodio como anticoagulante para química clínica. Se retuvo el alimento durante aproximadamente 18 h antes de la extracción de sangre, y se recogieron muestras temprano en el día de trabajo para reducir la variación biológica; se proporcionó agua a voluntad.

Se evaluaron los parámetros de patología clínica (hematológica y de bioquímica clínica) (tabla 4). La mayoría de variables hematológicas se midieron con un analizador automatizado de sangre completa Coulter/CELL-DYN 3500 (Abbott, Chicago, IL). Se observaron extensiones de glóbulos sanguíneos con un aparato Olympus Microscopy BX41 (Olympus, Tokio, Japón). Se evaluaron los parámetros de química clínica (tabla 1) con un espectrofotómetro Konelab PRIME 30 (Thermofisher Scientific Inc. Waltham, MA, EE.UU.) y los parámetros de bioquímica especiales con un analizador de química clínica AU640 (Olympus, Tokio, Japón). Se analizaron los parámetros de la coagulación con un analizador de coagulación Coatron M1 (Teco Medical Instruments, GMBH, Neufahrn, Alemania).

2.4. Patología anatómica

Todas las ratas se sacrificaron mediante inhalación de CO2 y se sometieron a necropsia. La necropsia incluía un examen macroscópico de la superficie externa del cuerpo, todos los orificios, la cavidad craneal, el cerebro y la médula espinal, la cavidad nasal y los senos paranasales, y las cavidades torácicas, abdominales y pélvicas, y las vísceras. Se registraron las descripciones de todas las anomalías macroscópicas. Se recogieron muestras de los siguientes tejidos y órganos de todos los animales en la necropsia y se fijaron en una disolución neutra de formaldehído al 4% tamponada con fosfato: glándulas suprarrenales, cerebro, corazón, íleo, yeyuno, ciego, colon, duodeno, recto, estómago, esófago, tráquea, riñones, hígado, pulmones, páncreas, bazo, piel, testículos con epidídimos, ovarios con oviductos, médula ósea, timo, glándulas tiroideas y paratiroideas, vesículas seminales, vejiga urinaria y útero. Se calcularon las razones órgano:peso corporal. Se procesaron todas las muestras de órganos y tejidos para examen histopatológico, se incrustaron en parafina, se cortaron a un grosor aproximado de 2 a 4 p y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Se recogieron preparaciones de todos los órganos y tejidos enumerados a continuación de todos los animales de los grupos de control y tratados.

2.5. Translocación bacteriana

Se analizó la translocación bacteriana en sangre, hígado y bazo. Se cultivó sangre (50 pl) en medio de agar de Man, Rogosa, Sharpe (MRS) y se incubó a 37°C durante 48 h de manera anaerobia. Se homogeneizaron muestras de tejido en agua peptonada tamponada (1 g/ml) y se cultivaron 100 pl de los homogeneizados resultantes en agar de MRS tal como se mencionó previamente. Después de 48 h, se comprobaron las placas para determinar la presencia de Lactobacillus. Se definió el crecimiento positivo en placas de agar MRS por la presencia de incluso una única colonia.

2.6. Concentración de glutatión hepático total (GSH)

Se homogeneizó una porción de 100 mg de hígado de cada ratón en una disolución de ácido tricloroacético al 7,5% y se centrifugaron los homogeneizados a 3.000 x g durante 10 min a 4°C. Se midió la concentración de glutatión total en los sobrenadantes usando un kit comercial colorimétrico (OxisResearch, Portland, OR). En resumen, se añadieron 40 |jl de los homogeneizados o los patrones a cada pocillo de una placa de microtitulación, junto con 40 ml de un agente reductor (tris(2-carboxietil)fosfina en HCl), 40 ml de un cromógeno (metilsulfato de 1-metil-3-cloro-7-trifluorometilquinolinio en HCl) y 40 ml de revelador del color (NaOH). Después de una incubación a temperatura ambiente y en la oscuridad durante 30 min, se midió la densidad óptica a 415 nm usando un espectrofotómetro de microplacas (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

2.7. Análisis estadístico (estudios de toxicidad)

Todos los datos se expresan como media ± error estándar de la media (EEM) de 6 determinaciones (es decir, 6 machos y 6 hembras). Se evaluaron las diferencias entre grupos de control y tratados con un análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguido de la prueba de Dunnett (1995), y se consideraron diferencias significativas a P < 0,05.

Resultados

Toxicidad oral aguda en ratas

No se observaron signos clínicos, cambios de comportamiento, cambios de peso corporal, hallazgos macroscópicos o cambios en el peso de los órganos anómalos. Todos los animales sobrevivieron al periodo de observación de 2 semanas. No hubo diferencias estadísticas en los pesos corporales entre grupos. De manera similar, no se indicaron diferencias estadísticamente significativas en el aumento de peso corporal ni en el consumo de alimento y agua. Por tanto, el peso corporal, el aumento de peso corporal diario y el consumo de alimento y agua no resultaron afectados por el tratamiento (única dosis oral de 1 x 1010 ufc de L. salivarius PS7).

Los parámetros hematológicos y de química clínica evaluados 2 semanas después de la administración de la cepa como una única dosis oral de 1 x 1010 ufc no fueron significativamente diferentes en comparación con los de los controles. No se indicaron cambios relacionados con el tratamiento.

No hubo diferencias estadísticas en las razones peso de órgano o tejido:peso corporal relacionadas con la cepa de prueba (datos no mostrados). La preparación de L. salivarius PS7 no se asoció con ninguna incidencia de cambios macroscópicos y microscópicos. No se observaron cambios histopatológicos relacionados con el tratamiento 2 semanas después de la administración de la cepa como una única dosis oral de 1 x 1010 ufc. Por tanto, L. salivarius PS7 tiene un orden bajo de toxicidad aguda y la dosis letal oral (DL50) para ratas macho y hembra es mayor de 1 x 1010 ufc.

Toxicidad oral de dosis repetida (4 semanas) en ratas

No se observó mortalidad. No se observaron cambios relacionados con el tratamiento en el estado general y el aspecto externo en ratas macho y hembra tratadas con una dosis diaria de 1 x 109 ufc de L. salivarius PS7. El desarrollo de los animales durante el periodo experimental se correspondía con su especie y edad. No hubo diferencias significativas en el peso corporal o el aumento de peso corporal entre grupos tratados con L. salivarius PS7 en comparación con los grupos de control en cualquier punto de tiempo del periodo experimental. Todos los grupos tratados con L. salivarius PS7 consumieron cantidades similares de alimento y agua (datos no mostrados) a las de los grupos de control correspondientes.

Todos los datos hematológicos estaban dentro de límites normales y no se observaron diferencias entre grupos. Los datos de química clínica no mostraron alteraciones relacionadas con el tratamiento al final del periodo de tratamiento de 4 semanas. Los valores individuales y los valores medios de grupo estaban dentro de los intervalos fisiológicos. Después de 14 días sin tratamiento para detectar la aparición retardada de posibles efectos tóxicos, no hubo cambios relacionados con el tratamiento en parámetros de prueba hematológicos y clínicos.

La necropsia realizada el día 29 después de la última dosis de L. salivarius PS7 (grupo 4) y el día 42 después de 14 días sin ningún tratamiento (grupo 6) no reveló ningún cambio patológico macroscópico ni ninguna diferencia en los pesos de los órganos en comparación con los grupos de control correspondientes. Después de 4 semanas de tratamiento, no hubo hallazgos histopatológicos en los órganos examinados considerados en relación con el tratamiento en ratas macho y hembra. Tampoco hubo hallazgos histopatológicos relacionados con el tratamiento en el grupo tratado satélite (grupo 6).

El nivel de efectos adversos no observados en este estudio de toxicidad oral de dosis repetida (4 semanas) fue la dosis sometida a prueba, es decir 1 x 109 ufc de L. salivarius PS7.

Concentración de glutatión hepático total (GSH)

Con el fin de determinar cambios en la defensa antioxidante debidos al tratamiento con probióticos, se determinó la concentración de GSH hepático. No se observaron diferencias significativas en la concentración de GSH entre los grupos de control y tratados (9,67±1,42 frente a 9,71±1,56 mmol/g, P>0,1). Esto indica que el tratamiento con L. salivarius PS7 no provocó estrés oxidativo a las ratas y es coherente con la ausencia de bacteriemia dado que no pudieron aislarse Lactobacillus de la sangre, del hígado ni del bazo de las ratas. Sugiere que la cepa sometida a prueba no provocó infecciones ni locales ni sistémicas en ratas.

Ejemplo 3: Tratamiento y prevención de otitis en niños

3.1. Sujetos

Se incorporaron niños propensos a otitis (n=64) con edades desde los 10 meses hasta los 6 años (sus padres eran principalmente profesores de universidad, científicos del CSIC o profesionales sanitarios). Los criterios de inclusión fueron al menos cuatro episodios de OMA durante los 12 meses anteriores, o al menos tres episodios durante los 6 meses anteriores (del Castillo et al., 2012). Se excluyeron los niños con medicación habitual, con enfermedades crónicas, síndrome de Down, hendidura del labio o paladar, o que ya estaban citados para una timpanostomía o adenoamigdalectomía durante el estudio. Aquellos que se habían sometido a una timpanostomía o adenoamigdalectomía durante los 6 meses anteriores también se excluyeron, a menos que hubieran padecido al menos tres episodios de OMA desde las operaciones. Los padres firmaron su consentimiento informado después de recibir información sobre el estudio.

3.2. Intervención con L. salivarius PS7

Este estudio se llevó a cabo entre septiembre de 2012 y abril de 2015. Durante la intervención de 6 meses, los niños consumieron al día ~1*109 ufc de las bacterias probióticas L. salivarius PS7. Preferiblemente, se dio instrucciones a los padres de que abrieran el sobre y lo vaciaran en leche o en un producto lácteo. Los padres registraron diariamente en un estudio diario si el niño había recibido la dosis diaria. El cumplimiento (%) se contó como el número de dosis realmente recibidas por los niños dividido entre el número de días de seguimiento. El uso de antibióticos (con la excepción del tratamiento de un episodio de OMA) u otros productos que contenían bacterias probióticas fue un criterio de exclusión durante el estudio.

Las variables de desenlace primario fueron la aparición y la duración de los episodios OMA. Los criterios de valoración secundarios fueron la frecuencia de estado de portador de patógenos en el conducto auditivo externo.

3.3. Exámenes clínicos

Al inicio, se recogió información básica sobre la salud, la nutrición, el entorno y la historia de otitis/enfermedades respiratorias del niño mediante un cuestionario cumplimentado por los padres. Un médico experimentado examinó a los niños al inicio, a la mitad (3 meses) y al final (6 meses) del estudio. Durante estas “visitas médicas”, que se programaron en momentos en los que el niño no tenía síntomas de OMA, se realizaron un examen físico general y una otoscopia neumática, y se tomó una muestra del conducto auditivo externo para el análisis bacteriano.

Se pidió a los padres que trajeran a su hijo a su médico respectivo cada vez que sospecharan de OMA. Se diagnosticó OMA según criterios clínicos definidos, cuando se indicaron simultáneamente evidencias de efusión del oído medio, anomalías de la membrana timpánica que indican una inflamación, y al menos un síntoma de una infección aguda (fiebre, dolor de oído, otorroea, etc.). La presencia de efusión del oído medio se detectó en la otoscopia neumática. La duración del episodio de OMA se definió basándose en la duración de síntomas existentes después del diagnóstico de OMA, con la amoxicilina como antibiótico de elección para el tratamiento de OMA.

3.4. Métodos microbiológicos

La microbiota de muestras del conducto auditivo externo se evaluó de manera cuantitativa (densidad) y cualitativa. Se tomaron muestras del canal con un bastoncillo de algodón libre de medio. Entonces, se añadió 1 ml de agua peptonada y el bastoncillo de algodón, que se agitó con vórtex. Se inoculó el material resuspendido en diferentes medios de agar (incluyendo CNA de Columbia y placas de agar de chocolate). Las placas se incubaron durante hasta 48 h, o bien en aerobiosis o bien en el 5% de CO2, a 37°C. Se registraron el número y la morfología de las colonias bacterianas y, al menos, se identificó un representante de cada morfología de colonia mediante análisis de MALDI-TOF usando un instrumento Vitek-MS™ (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia) en las instalaciones de Probisearch (Tres Cantos, España). Se definió la identificación como una concordancia del 99-100% con los valores de m/z específicos de especie en la base de datos.

Resultados

Un total de 64 niños que cumplieron los criterios de inclusión se inscribieron y recibieron el tratamiento probiótico. Tres niños (~4,6%) abandonaron (uno debido a la toma de antibióticos; uno debido a timpanostomía; uno debido a alergia a la proteína de la leche de vaca); por tanto, 62 niños completaron el estudio. El cumplimiento durante el estudio fue excelente: el porcentaje de dosis ingeridas por los niños fue de >96%.

Se diagnosticó al menos un episodio de OMA en el 36% de los niños. Cabe destacar que tal porcentaje fue notablemente menor del 65-72% notificado entre los niños propensos a otitis que fueron atendidos por los mismos médicos en el mismo periodo y que no recibieron la cepa probiótica. El porcentaje es también mucho menor que el observado en estudios anteriores con otras cepas probióticas, tales como L. rhamnosus GG (Hatakka et al., 2007; Tapiovaara et al., 2014). El número de episodios de OMA durante la intervención de 6 meses en comparación con el periodo de 6 meses antes de la intervención disminuyó en un 86%.

Cuando se produjo OMA, la mediana de duración de episodios de OMA fue de 3,2 días, que también es mucho menor en comparación con niños no tratados (6,0 días) o con los resultados obtenidos en los ensayos con probióticos previos (5,6 días). El número de tratamientos antimicrobianos disminuyó >60% en los niños que recibieron el probiótico con respecto a otros niños propensos a otitis que acudieron a los mismos médicos. El número de episodios de otras infecciones respiratorias de vías altas fue <2,0 entre los niños que recibieron el probiótico (en comparación con >4,6 en el resto de los niños).

De manera global, la densidad microbiana en el conducto auditivo externo disminuyó notablemente a lo largo del periodo de intervención, desde >3 log-10 ufc en el momento 0 (todos los cultivos fueron positivos en este momento de muestreo) hasta <2 logi0 ufc al final de la intervención (siendo el 29% de los cultivos negativos). Más específicamente, la prevalencia de Haemophilus influenza, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Moraxella catharralis, Alloiococcus otitis, Actinomyces europaeus, Staphylococcus aureus y/o Pseudomonas aeruginosa se redujo drásticamente (o desapareció) en los niños participantes.

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Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Cepa de Lactobacillus salivarius PS7 (CECT9422) o cepa que tiene al menos una identidad del 99% con la secuencia de ARNr 16S de la cepa de L. salivarius PS7.

2. Cepa según la reivindicación 1, en la que la cepa es Lactobacillus salivarius PS7.

3. Composición que comprende una cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

4. Composición según la reivindicación 3, para su uso como probiótico.

5. Composición según la reivindicación 3, para su uso como agente de prevención y/o terapéutico.

6. Composición para su uso según la reivindicación 5, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de otitis o infecciones respiratorias de vías altas (IRVA).

7. Composición para su uso según la reivindicación 6, para su uso en la prevención y/o tratamiento de otitis.

8. Composición para su uso según la reivindicación 7, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de otitis media aguda (OMA).

9. Composición para su uso según las reivindicaciones 6, 7 u 8, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de otitis o infecciones respiratorias de vías altas en niños propensos a otitis.

10. Composición para su uso según la reivindicación 6, para su uso en la prevención y/o tratamiento de infecciones respiratorias de vías altas.

11. Producto farmacéutico que comprende una cantidad eficaz de la cepa según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables.

12. Producto comestible que comprende una cantidad eficaz de la cepa según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, junto con otros componentes comestibles.

13. Producto comestible según la reivindicación 12, que se selecciona de un complemento alimenticio, un producto nutricéutico o un producto lácteo.