ES2873075T3

ES2873075T3 - Cepas probióticas de Lactobacillus plantarum para las infecciones del tracto urinario

Info

Publication number: ES2873075T3
Application number: ES16704579T
Authority: ES
Inventors: Gutierrez Jonathan Santas; Castellana Jordi Cune; Mallen Elisabet Lazaro
Original assignee: AB Biotics SA
Current assignee: AB Biotics SA
Priority date: 2015-02-11
Filing date: 2016-02-09
Publication date: 2021-11-03
Anticipated expiration: 2036-02-09
Also published as: EP3064072A1; EP3261723B1; EP3261723A1; WO2016128414A1

Abstract

Una composición que comprende una cantidad eficaz de al menos una cepa de Lactobacillus plantarum, en donde al menos la cepa de Lactobacillus plantarum se selecciona del grupo que consiste en: la cepa CECT8675, la cepa CECT8676, la cepa CECT8677, la cepa CECT8678 y un mutante de cualquiera de las cepas depositadas, en donde el mutante se obtuvo mediante el uso de la cepa depositada como material de partida y mediante mutagénesis, y en donde el mutante obtenido retiene o potencia al menos la capacidad de la cepa depositada de antagonizar el patógeno urogenital Staphylococcus saprophyticus.

Description

DESCRIPCIÓN

Cepas probióticas de Lactobacillus plantarum para las infecciones del tracto urinario

La presente invención se refiere a los campos de la medicina y la microbiología y, en particular, a nuevas cepas de Lactobacillus plantarum para su uso como probiótico en beneficio de la salud humana y animal. La presente invención incluye una formulación probiótica mejorada que se usa como producto alimenticio, suplemento alimenticio, alimento médico, medicamento, producto farmacéutico, producto veterinario y producto de higiene personal, y los usos de los mismos.

Antecedentes de la técnica

Probióticos

El concepto de microorganismos probióticos nació de la hipótesis del Premio Nobel Elie Metchnikoff, quien sugirió que el consumo de bacterias capaces de fermentar (comúnmente bacterias productoras de ácido láctico) tiene un efecto positivo sobre la microbiota del colon, al reducir la presencia de toxinas bacterianas y otras actividades microbianas, las cuales tienen un impacto negativo en la salud humana.

"Los probióticos son microorganismos vivos los cuales, administrados en cantidades adecuadas, confieren un beneficio para la salud del hospedero". En la actualidad, existen muchas referencias sobre la utilidad de los probióticos para tratar varios trastornos gastrointestinales. Además, algunos estudios sugieren que los probióticos pueden modular el sistema inmunológico, prevenir las alergias y las enfermedades relacionadas.

Las bacterias probióticas deben cumplir diferentes requisitos relacionados con la ausencia de toxicidad, viabilidad, capacidad de colonización y los efectos beneficiosos. Las propiedades de cada cepa bacteriana son únicas y no pueden extrapolarse a otras cepas de la misma especie (ARAYA, M., y otros, Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food - Joint FAO/WHO Working Group, FAO/WhO, Editor 2002, Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization: Ontario, Canada). Por tanto, es importante encontrar aquellas cepas que tengan un mejor desempeño en todos los requerimientos de los probióticos.

Aunque el concepto de probióticos se asoció con la flora microbiana intestinal, los estudios realizados ya en 1987 mostraron que este concepto también podría extenderse al tracto urinario. Algunos grupos científicos han desarrollado esta idea desde hace algunos años, lo cual culminó con la identificación de algunas cepas de Lactobacillus las cuales son útiles para tratar complicaciones del tracto urinario [REID, G. y otros. Examination of strains of lactobacilli for properties which may influence bacterial interference in the urinary tract. J. Urol. 1987, Vol.

138, páginas 330-335].

C istitis o infección del tracto urinario (ITU)

Información general

La cistitis es una infección aguda de la vejiga urinaria o del riñón, la cual es más común en las mujeres que en los hombres. Existen diferentes entidades clínicas relacionadas con la cistitis, a saber, la cistitis aguda, pielonefritis aguda (o infección del riñón), ITU no complicada (o cistitis aguda o pielonefritis que ocurren en las mujeres premenopáusicas sanas, no embarazadas sin antecedentes de tracto urinario anormal), las llamadas ITU complicadas (o infección en pacientes con enfermedades funcionales, metabólicas o anatómicas, como la obstrucción, el embarazo, la diabetes, vejiga neurogénica, insuficiencia renal, la inmunosupresión, las cuales pueden aumentar el riesgo de fracaso del tratamiento o resultados graves) y la ITU recurrente (ITUr) [HOOTON, T.M. Clinical practice. Uncomplicated urinary tract infection. N. Engl. J. Med. 2012, Vol. 366, No. 11, páginas 1028-1037; GRABE, M. y otros. European Association of Urology (EAU). Guidelines on urological infections. EAU. Marzo de 2013]. La recurrencia de ITU (o ITU recurrente) ocurre debido a una recaída o una reinfección. Una recaída es cuando no se ha podido curar la infección original con (o sin) tratamiento. La reinfección es cuando la infección original se eliminó mediante el tratamiento (por ejemplo, antibióticos) pero vuelve a ocurrir en unas semanas. Una recaída es causada por el mismo microorganismo infeccioso que estaba presente antes del tratamiento inicial, generalmente debido a una resistencia del microorganismo al tratamiento farmacológico. Una reinfección es un nuevo episodio de bacteriuria con un microorganismo diferente al original (por ejemplo, bacteriuria con especies de S. saprophyticus cuando la infección original fue causada por E. coli), aunque también puede ocurrir una reinfección con el mismo organismo que causó la infección original. En este último caso, la característica principal que diferencia una reinfección de una recaída es que los episodios individuales de reinfección suelen estar separados por un intervalo libre de síntomas de al menos un mes después de que se suspenden los antibióticos y la orina no muestra un crecimiento bacteriano. [SALVATORE, S. y otros. Urinary Tract Infections in Women. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2011, Vol. 156, páginas 131-136].

Epidemiología

En cuanto a la incidencia o prevalencia de ITU, se encuentran entre las más frecuentes las infecciones bacterianas en las mujeres. Se estima que alrededor del 40-60 % de las mujeres premenopáusicas desarrollarían al menos una ITU en su vida. En general, la incidencia media estimada por año de una ITU en las mujeres es de 2,1 % en la infancia, 3 % en la niñez, 15,2 % para las mujeres adultas de 17-39 años, 11,4 % para las mujeres premenopáusicas (de 40-59 años) y 9,7 % para las mujeres posmenopáusicas (de 60-79 años) [FOX^mAⁿ, B. y B^rO^wN. P. Epidemiology of urinary tract infections: transmission and risk factors, incidence, and costs. Infect. Dis. Clin. North. Am. 2003, Vol. 17, No. 2, páginas 227-241]. En mujeres jóvenes sexualmente activas y en mujeres posmenopáusicas, la incidencia de ITU no complicada se estima entre 0,5-0,7 y 0,07 por persona-año, respectivamente [HOOTON, T.M. y otros. A prospective study of risk factors for symptomatic urinary tract infection in young women. N. Engl. J. Med. 1996, Vol. 335, No. 7, páginas 468-474; JACKSON, S. L. y otros. Predictors of urinary tract infection after menopause: a prospective study. Am. J. Med. 2004, Vol. 117, No. 12, páginas 903-11]. En términos generales, la prevalencia de la cistitis en hombres es menor que en mujeres, y es más común en mujeres que en hombres durante la juventud y la edad adulta. Sin embargo, la prevalencia de ITU en los hombres y mujeres de edad avanzada es casi igual. Se estima una incidencia anual de 6-8 ITU por cada 10000 hombres de 21-50 años [ULLERYD, P. y otros. Febrile urinary tract infection in men. Int. J. Antimicrob. Agents. 2003, Vol. 22, Suppl. 2, páginas 89-93].

Etiología

De acuerdo con la Sociedad de Enfermedades Infecciosas de América y la Sociedad Europea de Microbiología y Enfermedades Infecciosas, en general, el espectro microbiano de cistitis y pielonefritis no complicadas en las mujeres consiste en Escherichia coli (75-95 %) [GUPTA, K. y otros. International clinical practice guidelines for the treatment of acute uncomplicated cystitis and pyelonephritis in women: A 2010 update by the Infectious Diseases Society of America and the European Society for Microbiology and Infectious Diseases. Clinical Infectious Diseases.

1 Marzo 2011, Vol. 52, No. 1, e103-e120].

Aunque los datos pueden variar considerablemente en función de la población en estudio, en particular del país, y del sexo y la edad, se proponen microorganismos tales como Staphylococcus saprophyticus, Proteus mirabilis y Klebsiella pneumoniae como los segundos agentes causales más frecuentes de ITU. Por ejemplo, en las ITU que afectan a mujeres suecas en el rango de 15-29 años, se ha propuesto que S. saprophyticus está presente en el 14,7 % de los episodios de ITU, lo cual es especialmente relevante en mujeres sexualmente activas [ERIKSSON, A. y otros. The relative importance of Staphylococcus saprophyticus as a urinary tract pathogen: distribution of bacteria among urinary samples analyzed during 1 year at a major Swedish laboratory. APMIS. 2012, Vol. 121, páginas 72 78]. También se ha reportado que P. mirabilis y K. pneumoniae, pueden estar presentes en el 3 % y el 5,9 % de los casos en la población sueca en general. En otros países europeos, los datos también apoyan la relevancia de estos microorganismos como los segundos agentes causantes más frecuentes de ITU [GARC^íA-GARC^íA, M.I. y otros. In vitro susceptibility of community-acquired urinary tract pathogens to commonly used antimicrobial agents in Spain: a comparative multicenter study (2002-2004). J. Chemotherapy. 2007, Vol. 19, páginas 263-270].

Tratamiento de ITU

Los agentes recomendados con más frecuencia para el tratamiento de la ITU no complicada en las mujeres incluyen los siguientes antibióticos [GUPTA, K. y otros, supra; GRABE, M. y otros, supra],

1. - cotrimoxazol, también conocido como trimetoprim-sulfametoxazol (TMP-SMX), 160/800 mg (1 tableta de doble concentración) por vía oral dos veces al día durante 3 días;

2. - nitrofurantoína monohidrato/macrocristales, 100 mg por vía oral dos veces al día durante 5-7 días; y, 3. - fosfomicina-trometamol, 3 g por vía oral en dosis única.

Sin embargo, en general, el uso de los antibióticos conduce a una mayor presencia de microorganismos resistentes a los fármacos, lo cual no es una excepción en el caso de las ITU.

Por ejemplo, las relaciones de resistencia de TMP-SMX están en aumento, especialmente fuera de los Estados Unidos. De hecho, la Asociación Europea de Urología ya no lo recomienda como agente de tratamiento de primera línea, especialmente si las tasas de resistencia local son < 20 %, si se sabe que la cepa infectante es susceptible a ella o si se ha utilizado para el tratamiento de la ITU en los 3 meses anteriores. Se estima que en España solo el 66,1 % de las muestras clínicas de E. coli son sensibles a este antibiótico [ANDREU, A., y otros. Etiología y sensibilidad a los antimicrobianos de los uropatógenos causantes de la infección urinaria baja adquirida en la comunidad. Estudio nacional multicéntrico. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 2005, Vol. 23, No. 1, páginas 4-9].

Por otro lado, la nitrofurantoína no puede considerarse un tratamiento útil a corto plazo (hasta 3 días) y solo se recomienda para tratamientos entre 5 a 7 días, lo cual pueden comprometer la adhesión al tratamiento. Aunque se reporta que la resistencia a la nitrofurantoína permanece baja (3-11 %), se considera que no es eficaz contra microorganismos tales como P. mirabilis y especies de Klebsiella /KAHLMETER, G. An International survey of the antimicrobial susceptibility of pathogens from uncomplicated urinary tract infections: the ECO.SENS Project. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2003, Vol. 51, páginas 69-76]. Además, el uso de la nitrofurantoína en Europa se discute de manera controvertida debido a sus efectos secundarios potencialmente peligrosos después de una exposición prolongada (polineuropatía, neumonía intersticial y hepatitis) [HUMMERS-PRADIER, E. y otros. Urinary tract infections in adult general practice patients. British Journal of general practice. 2002, Vol. 52, páginas 752-761].

Por lo tanto, la fosfomicina-trometamol se selecciona comúnmente como la primera opción de tratamiento debido a su amplio espectro de acción y su efectividad contra E. coli. Además, tiene la ventaja de que se administra en una sola dosis, lo cual asegura altas tasas de adhesión al tratamiento y, en consecuencia, disminuye la probabilidad de resistencias a los antibióticos. Sin embargo, una limitación en el uso de la fosfomicina-trometamol es que, en algunas poblaciones, aunque es muy eficaz contra E. coli, la eficacia contra otros patógenos causantes, como las cepas de S. saprophyticus, es baja. Por ejemplo, GARCÍA-GARCÍA MI, y otros supra, reportaron que la tasa de susceptibilidad de S. saprophyticus a fosfomicina en la población española fue solo del 56,3 % en 2002 y disminuyó a 20,6 % en 2004, mientras que en el mismo período la susceptibilidad de E. coli fue superior al 97 % [GARCÍA-GARCÍA, MI, y otros supra]. Además, en comparación con E. coli, la actividad de la fosfomicina puede ser menor frente a otros agentes responsables de las ITU, como P. mirabilis (76 %) y K. pneumoniae (78,5 %). Esta eficacia reducida puede atribuirse a un aumento de la resistencia a los antibióticos de estos uropatógenos, lo cual puede esperarse que aumente en los próximos años.

En resumen, tanto el riesgo de ITU de por vida como la incidencia de episodios de ITU recurrentes, principalmente entre las mujeres, son altos. En general, el uso de antibióticos conduce a una mayor presencia de microorganismos resistentes a los fármacos, lo cual no es una excepción en el caso de las ITU. De hecho, como se discutió anteriormente, existe el problema del aumento de los principales patógenos causantes de las ITU que muestran resistencia a los agentes empíricos de primera línea para la cistitis aguda no complicada, a saber, la fosfomicina y el TMP-SMX. También como ya se ha comentado, los episodios de ITUr requieren en la mayoría de los casos de ciclos repetidos de tratamiento antimicrobiano. De hecho, la profilaxis antibiótica a largo plazo es el método más común para el manejo actual de las ITUr, con la importante limitación de las crecientes resistencias antimicrobianas mencionadas.

Todos estos factores hacen que el tratamiento y la prevención de las ITU sean cada vez más problemáticos. En consecuencia, actualmente se necesitan estrategias de tratamiento y prevención sin antibióticos, novedosas, seguras y eficaces, solas o en combinación con antibióticos.

Tratamientos alternativos para el manejo de ITU

La técnica describe otros productos que se utilizan actualmente para la prevención y el tratamiento de ITUr, como los extractos de arándano rojo. Estas bayas son ricas en proantocianidinas (PAC), es decir, taninos capaces de prevenir la expresión de las fimbrias P del uropatógeno E. coli, lo cual inhibe la síntesis de la pared celular bacteriana y la expresión celular de moléculas de adhesión a la mucosa urogenital. Algunos hallazgos indican que los productos que contienen arándanos podrían estar clínicamente asociados con un efecto protector contra las ITU [SENGUPTA, K. y otros. A Randomized, double blind, controlled, dose dependent clinical trial to evaluate the efficacy of a proanthocyanidin standardized whole cranberry (Vaccinium macrocarpon) powder on infections of the urinary tract. Current Bioactive Compounds. Marzo de 2011, Vol. 7, No 1, páginas 39-42]. Sin embargo, estas observaciones no están respaldadas por los resultados de algunos ensayos clínicos [BARBOSA-CESNIK, C. y otros. Cranberry juice fails to prevent recurrent urinary tract infection: results from a randomized placebo-controlled trial. Clinical Infectious Diseases. 2011, Vol. 52, No. 1, páginas 23-30]. Entonces, la evidencia científica general está lejos de ser concluyente.

Los lactobacilos están presentes en la flora vaginal, en donde desarrollan diversas funciones esenciales para el mantenimiento del equilibrio fisiológico vaginal y la prevención de las infecciones. La flora "normal" del tracto reproductivo está dominada numéricamente por especies de Lactobacillus que mantienen el pH ácido natural de la vagina, actúan como una barrera natural contra los patógenos y producen compuestos antimicrobianos que inhiben la colonización y/o el crecimiento excesivo de los microorganismos patógenos. Sin embargo, se reconoce que la composición de la microbiota puede variar de un día a otro incluso en mujeres sin indicación de infecciones, debido a la influencia de varios factores tales como: los cambios hormonales (es decir, los ciclos menstruales), la anticoncepción orientada a biomateriales, el contacto sexual, las prácticas de higiene femenina, el consumo de antibióticos, el estado nutricional, la competencia microbiana interespecífica o el comensalismo. Las enfermedades urogenitales en las mujeres a menudo se caracterizan por una alteración en la flora local desde el predominio de lactobacilos hasta los patógenos oportunistas. Las enfermedades urogenitales incluyen la vaginosis, vaginitis o ITU. Por ejemplo, la vaginosis bacteriana es una enfermedad común caracterizada por un cambio en la microbiota vaginal de lactobacilos protectores a bacterias patógenas como Gardnerella vaginalis y Mycoplasma hominis. De manera similar, la vaginitis es una alteración de la flora vaginal, generalmente causada por un crecimiento excesivo o una infección de las especies de Candida o Trichomonas. La vaginitis en comparación con la vaginosis da lugar además a una inflamación vulvovaginal.

Se ha postulado que los lactobacilos pueden usarse para el tratamiento de las enfermedades vaginales. Por ejemplo, se han estudiado formulaciones probióticas para su uso en el tratamiento de la vaginosis bacteriana (VB) [LARSSON, P.G. y otros. Extended antimicrobial treatment of bacterial vaginosis combined with human lactobacilli to find the best treatment and minimize the risk of relapses. BMC Infectious Diseases. 2011. Vol. 11, página 223]. El estudio muestra que el tratamiento agresivo de la paciente con un tratamiento antibiótico repetido con clindamicina y metronidazol junto con cápsulas de gelatina vaginal que contienen diferentes cepas de lactobacilos, puede proporcionar una cura duradera. Sin embargo, en este estudio no hay control sin probióticos, por lo cual no se pueden evaluar las diferencias en la eficacia y en el riesgo de recaída entre el tratamiento combinado y el uso de antibióticos habituales.

Sin embargo, existe incertidumbre sobre si la aplicación vaginal de lactobacilos reduce la tasa de infección en mujeres propensas a la cistitis [BAERHEIM, A. y otros. Vaginal application of lactobacilli in the prophylaxis of recurrent lower urinary tract infection in women. Scand. J. Prim. Health Care. 1994. Vol. 12, páginas 239-243].

AQUILEA INTIMUS es un probiótico oral compuesto por dos cepas de lactobacilos, es decir, Lactobacillus rhamnosus GR-1®, aislado a partir de la uretra de una mujer sana, y Lactobacillus reuteri RC-14®, aislado a partir de la vagina de una mujer sana. Se ha demostrado una vez más que estas dos cepas probióticas son eficaces para el tratamiento de la vaginosis bacteriana [MARTINEZ, R.C.R. y otros. Improved cure of bacterial vaginosis with single dose of tinidazole (2 g), Lactobacillus rhamnosus GR-1, and Lactobacillus reuteri RC-14: a randomized, double blind, placebo control trial. Canadian Journal of Microbiology. 2009, Vol. 55, páginas 133-138]. Otro estudio reportó que una composición oral que comprende las mismas cepas aumentó el efecto de la terapia con metronidazol para la vaginosis bacteriana [ANUKAM, K. y otros. Augmentation of antimicrobial metronidazole therapy of bacterial vaginosis with oral probiotic Lactobacillus rhamnosus GR-1 and Lactobacillus reuteri RC-14: randomized, doubleblind, placebo controlled trial. Microbes and infection. 2006. Vol. 8. páginas 1450-1454].

Sin embargo, estas cepas no demostraron eficacia en la reducción de la incidencia de ITUr como se reportó en un ensayo aleatorizado, doble ciego, de no inferioridad en 252 mujeres posmenopáusicas con ITUr [BEEREPOT, M.A. y otros. Lactobacilli vs antibiotics to prevent urinary tract infections: a randomized, double-blind, noninferiority trial in post-menopausal women. Archives of Internal Medicine. 2012, Vol. 172, No. 9, páginas 704-712]. Como se muestra en la Tabla 2 del artículo de referencia, no se observó diferencia estadísticamente significativa entre la incidencia de ITUr en las mujeres después de 12 meses de profilaxis con L. reuteri RC-14® y L. rhamnosus GR-1® vs profilaxis con TMP-SMX. La cepa Lactobacillus rhamnosus GR-1® también se describe en la Patente europea EP 1137423 B1, en una composición probiótica junto con al menos otra cepa probiótica de Lactobacillus, a saber, Lactobacillus fermentum B-54 (ATCC55884). En particular, el documento EP 1137423 B1 ilustra cómo la ingestión oral de lactobacilos por una mujer que presenta una ITU sintomática crónica puede reducir la presencia de Enterococcus faecalis en la orina y los exudados vaginales. Sin embargo, el estudio se realizó en una sola persona y no hubo ningún grupo de control que consumiera placebo. Además, no hay información sobre si la administración de lactobacilos puede reducir la presencia de los principales agentes causantes de la ITU, a saber, E. coli, S. saprophyticus y/o P. mirabillis. Por lo tanto, la eficacia de la composición de lactobacilos para el tratamiento de la ITU es cuestionable.

La técnica también describe los resultados de un estudio de caso, sin grupo de placebo, realizado en 9 mujeres y de un ensayo de fase 2 aleatorizado, controlado con placebo, con 100 mujeres con antecedentes de ITUr (es decir, uno o más episodios de ITU en los 12 meses anteriores) para evaluar la seguridad y eficacia de los supositorios vaginales de Lactobacillus crispatus cepa GAI 98332 [UEHARA, S. y otros. A pilot study evaluating the safety and effectiveness of Lactobacillus vaginal suppositories in patients with recurrent urinary tract infection. International Journal of Antimicrobial Agents. 2006. Vol. 28, No. 1, páginas S30-S34; STAPLETON, A.E. y otros. Randomized, placebo-controlled phase 2 trial of a Lactobacillus crispatus probiotic given intravaginally for prevention of recurrent urinary tract infection. Clin. Infect. Dis. Mayo de 2011. Vol. 52, No. 10, páginas: 1212-1217, respectivamente]. La cepa GAI 98332 de L. crispatus se aisló a partir de la vagina de mujeres sanas. En ambos estudios, se observó una reducción significativa en el número de ITUr causadas por E. coli. Sin embargo, ambos estudios guardan silencio con respecto a las recurrencias causadas por otros patógenos de la ITU, así como al antibiótico utilizado para el tratamiento convencional.

Otro probiótico comercializado es Isadin a Barcilus®, un probiótico vaginal de cápsula blanda con excipientes emolientes y lubricantes, que se utiliza en pacientes con candidiasis vulvovaginal e infecciones vaginales de diversas causas. Isadin a Barcilus® está compuesto por la cepa P17630 de Lactobacillus plantarum. No se han encontrado reportes sobre su eficacia para el tratamiento de la ITU.

Por lo tanto, aunque podría esperarse que las cepas de lactobacilos puedan ser efectivas en la prevención y el tratamiento de las enfermedades vaginales, su efectividad en el manejo de las ITU está lejos de haber sido demostrada.

Descripción detallada de la invención

El problema a resolver por la presente invención es proporcionar composiciones y remedios útiles para la prevención y/o el tratamiento de las infecciones del tracto urinario.

Como se mencionó anteriormente, la técnica anterior ha descrito cepas probióticas que pueden ser útiles para tratar enfermedades urogenitales tales como la vaginosis bacteriana, pero no la UTI. Los inventores encontraron cepas de bacterias del ácido láctico que son útiles para el tratamiento de las infecciones del tracto urinario y también pueden combinarse con tratamientos antimicrobianos convencionales.

La invención es como se define en las reivindicaciones. Por tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona una composición para su uso en la prevención y/o tratamiento de las infecciones del tracto urinario que comprende (i) una cantidad eficaz de al menos un agente antimicrobiano que es activo contra patógenos del tracto urogenital, y (ii) una cantidad eficaz de al menos una cepa de bacterias del ácido láctico, en donde la cepa tiene resistencia no transmisible al agente antimicrobiano y en donde (i) y (ii) se formulan en una forma de administración única o separada.

El término "cantidad eficaz" (o "cantidad terapéuticamente eficaz") como se usa en este documento, significa una cantidad del agente lo suficientemente alta para proporcionar el beneficio deseado, es decir, prevenir, retrasar el inicio o reducir la progresión, pero lo suficientemente baja para evitar efectos secundarios graves dentro del alcance del juicio médico, administrada sola o en combinación con un agente terapéutico adicional a una célula, tejido o sujeto. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual (o agente activo) administrado solo, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan como resultado el efecto terapéutico, ya sea que se administren en combinación, en serie o simultáneamente.

El término "antimicrobiano" tiene en la presente invención el significado normal en el campo, a saber, un agente que elimina los microorganismos o inhibe su crecimiento. Además, pueden agruparse de acuerdo con los microorganismos contra los que actúan principalmente, por ejemplo, contra las bacterias (antibacterianos) y contra los hongos (antifúngicos).

Se entiende por "resistencia al agente antimicrobiano" la capacidad de un microorganismo de crecer en presencia del agente antimicrobiano. En general, la resistencia puede tomar la forma de una mutación genética espontánea o inducida, o la adquisición de genes de resistencia a partir de otras especies bacterianas mediante la transferencia horizontal de genes por conjugación, transducción o transformación. La resistencia se considera "no transmisible", como se usa en la presente descripción, cuando el riesgo potencial de propagación lateral u horizontal de esta resistencia a otros microorganismos es mínimo.

En una modalidad particular, al menos un agente antimicrobiano comprende un compuesto adecuado para prevenir y/o tratar ITU. Los agentes para prevenir y/o tratar las ITU son antibióticos e ingredientes naturales con efecto antimicrobiano. Los antibióticos de elección común para el tratamiento de las ITU son, sin limitación, la nitrofurantoína, trimetoprim-sulfametoxazol, pivmecilinam, fosfomicina, nitrofurantoína, quinolonas, tetraciclinas, penicilinas y betalactámicos. En una modalidad de preferencia, al menos un agente antimicrobiano es la fosfomicina. En una modalidad de preferencia, al menos un agente antimicrobiano es una fluoroquinonolona y, particularmente, la norfloxacina.

En otra modalidad particular, al menos un agente antimicrobiano es un producto o un ingrediente natural para tratar ITU. Los productos e ingredientes naturales para tratar ITU incluyen, sin limitación, los extractos, jugos y compuestos aislados a partir de materiales vegetales, como por ejemplo, las frutas y hierbas. En una modalidad particular, el ingrediente natural se obtiene a partir de arándanos (Vaccinum macrocarpon), arándano (V. myrtilis), arándano Europeo (V. oxycoccus), arándanos (V. corymbosum), arándano rojo (V. vitis-idaea), otras hierbas o frutas, y extractos y zumos de uva (por ejemplo, a partir del café, té, hibisco, Orthoshipon sp., Juniperus sp., Aloe sp., salvia, Equisetum sp., Lavandula sp., betula, manosa), berberina, arbutina y/o vitaminas, en particular, la vitamina C o B. En una modalidad particular, al menos una cepa de bacterias del ácido láctico tiene la capacidad de antagonizar al patógeno urogenital Staphylococcus saprophyticus, en donde la capacidad de la cepa de antagonizar al patógeno urogenital se determina mediante las siguientes etapas:

(i) frotar uniformemente la cepa patógena urogenital en placas que contienen el medio Tripticasa Soya Agar y hacerla crecer hasta la confluencia en una incubadora de CO²a 37 °C y 5 % de CO²;

(ii) colocar dos secciones cilíndricas de 6 mm de diámetro de una placa de agar confluente sembrada uniformemente con las células en contacto con la placa sembrada con el patógeno urogenital, al confrontar tanto (a) el lado crecido de la sección de un cilindro contra la placa sembrada con el patógeno urogenital; y (b) el lado no crecido de la otra sección del cilindro contra la placa sembrada con el patógeno urogenital; e incubar durante la noche a 37 °C;

(iii) medir al día siguiente las zonas de inhibición al colocar la placa de agar sobre una regla plana; y,

(iv) calcular la actividad inhibidora del crecimiento (IC) al restar el diámetro del cilindro (DC) al diámetro de la zona de inhibición (DZI) medido en centímetros y dividir esta diferencia por 2, de acuerdo con la fórmula IC = (DZI-DC)/ 2.

El término "zona de inhibición", como se usa en este documento, se refiere a una zona alrededor de la cepa de bacterias del ácido láctico de interés donde el crecimiento del patógeno se reduce parcial o totalmente en comparación con el crecimiento del patógeno en ausencia de la cepa de bacterias del ácido láctico de interés.

Se considera que las cepas de bacterias del ácido láctico tienen la capacidad de antagonizar al patógeno urogenital Staphylococcus saprophyticus, en donde esta capacidad está determinada por las etapas descritas anteriormente, cuando la cepa de bacterias del ácido láctico tiene una actividad inhibidora del crecimiento (IC) que puede medirse mediante la inspección visual. En una modalidad particular, la IC de las bacterias del ácido láctico de interés es de 0,5 mm. En otras modalidades particulares, la IC es de 1 mm, 2 mm, 3 mm o más.

Se sabe que otros patógenos distintos de S. saprophyticus son los principales agentes causantes de las infecciones del tracto urogenital, es decir, Proteus mirabilis, Escherichia coli y Klebsiella pneumonia. La composición de la invención también es útil para prevenir y/o tratar infecciones del tracto urinario causadas por estos patógenos.

Por tanto, en una modalidad particular, al menos una cepa de bacterias del ácido láctico también tiene la capacidad de antagonizar los patógenos urogenitales Proteus mirabilis, Escherichia coli o Klebsiella pneumonia. El EJEMPLO 4 de trabajo de este documento proporciona una descripción detallada de un ensayo adecuado para medir la capacidad de la cepa de bacterias del ácido láctico de interés de antagonizar estos patógenos.

En una modalidad particular de más preferencia aún, al menos una cepa de bacterias del ácido láctico tiene también la capacidad de antagonizar los patógenos urogenitales Proteus mirabilis, Escherichia coli y Klebsiella pneumonia. El EJEMPLO 4 de trabajo de este documento proporciona una descripción detallada de un ensayo adecuado para medir la capacidad de la cepa de bacterias del ácido láctico de interés de antagonizar estos patógenos.

Se prefiere que la cepa de bacterias del ácido láctico como se describe en este documento sea una cepa de bacterias del ácido láctico aislada.

Como entenderá el experto en el presente contexto, el término "aislado" se refiere a que la cepa de bacterias del ácido láctico está aislada de su entorno natural, es decir, no está presente en su entorno natural.

En base al ensayo detallado descrito en este documento (véase el EJEMPLO 4 para el ensayo de actividad antagonista), el experto en la materia puede repetir rutinariamente este ensayo para determinar objetivamente si una cepa de bacterias del ácido láctico de interés antagoniza los patógenos urogenitales. Es importante señalar que las descripciones y condiciones del ensayo de actividad antagonista descritas en las etapas (i)-(iv) anteriores y en el EJEMPLO 4 no limitan el alcance de la invención. El ensayo es adecuado para probar la capacidad de las cepas de bacterias del ácido láctico de interés de antagonizar los patógenos urogenitales Staphylococcus saprophyticus, Proteus mirabillis, Escherichia coli o Pseudomonas pneumoniae. Los expertos en la técnica saben que los patógenos pueden mostrar una tolerancia diferente a la actividad inhibidora de las bacterias del ácido láctico en dependencia de la cepa patógena utilizada para realizar los ensayos y su resistencia. Por tanto, el alcance de la invención incluye cepas de bacterias del ácido láctico que muestran una actividad inhibidora contra cualquier cepa de Staphylococcus saprophyticus, Proteus mirabillis, Escherichia coli o Pseudomonas pneumoniae.

La cepa de bacterias del ácido láctico es la cepa de Lactobacillus plantarum seleccionada del grupo que consisten en: la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT8675, la cepa depositada con el número de acceso CECT8676, la cepa depositada con el número de acceso CECT8677; la cepa depositada con el número de acceso CECT8678, y un mutante de cualquiera de las cepas depositadas, en donde el mutante se ha obtenido mediante el uso de la cepa depositada como material de partida y al aplicar mutagénesis, y en donde el mutante obtenido retiene o mejora al menos la capacidad de la cepa depositada de antagonizar el patógeno urogenital Staphylococcus saprophyticus. En modalidades particulares, la composición comprende combinaciones de dos, tres o cuatro cepas, seleccionadas del grupo que consiste en: la cepa CECT8675, la cepa CECT8676, la cepa CECT8677, la cepa CECT8678 y mutantes de las mismas. En otra modalidad particular más, la composición comprende una cantidad eficaz de L. plantarum CECT8675 y L. plantarum CECT8677.

Los inventores proporcionan nuevas cepas de bacterias del ácido láctico, particularmente del género Lactobacillus. La provisión de estas cepas es el resultado de extensos estudios de diferentes cepas de bacterias del ácido láctico aisladas a partir de seres humanos sanos. La cepa de Lactobacillus plantarum F2032, Lactobacillus plantarum cepa F3164, Lactobacillus plantarum cepa F1034 y Lactobacillus plantarum cepa F2070, se depositaron el 17 de julio de 2014, el 15 de julio de 2014, el 15 de julio de 2014 y el 15 de julio de 2014, respectivamente, en la Colección Española de Cultivos Tipo (Colección Española de Cultivos Tipo, CECT, Edificio 3 CUE, Parc Científic, Universitat de Valencia, Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980-Paterna, Valencia, España), por el depositante AB-Biotics, SA, con domicilio en Parc de Recerca UAB, Edifici Eureka, Campus UAB, despacho P2M1, 08193-Bellaterra (España).

Las cepas de L. plantarum recibieron los números de acceso CECT8677, CECT8675, CECT8678 y CECT8676, respectivamente, después de que la Autoridad Internacional de Depósito declarara la cepa como viable.

Las cepas de la presente invención se seleccionaron debido a las siguientes propiedades/capacidades distintivas:

• La capacidad de inhibir el crecimiento de S. saprophyticus, por lo cual muestra un espectro de actividad más amplio en comparación con otros probióticos disponibles comercialmente para ayudar a controlar la ITU, especialmente en donde el agente causal es este patógeno. Como se indica en la técnica anterior y en la sección de EJEMPLOS, se han usado algunas cepas de lactobacilos para el tratamiento y/o la prevención de ITU. Sin embargo, dichas cepas no muestran actividad antagonista significativa contra varios aislamientos de S. saprohyticus (ver EJEMPLO 4.1). De manera notable, las cepas CECT8677, CECT8675, CECT8678 y CECT8676 mostraron una actividad notablemente antagonista contra las tres cepas de S. saprophyticus ensayadas. De este modo, como corroboran los datos divulgados en el EJEMPLO 4.1, la capacidad de inhibir S. saprohyticus no es una característica inherente del género Lactobacillus, ni siquiera de las cepas de lactobacilos de origen uretral o vaginal, como las cepas comerciales L. rhamnosus GR-1® y L. reuteri RC-14®, respectivamente, y mucho menos una característica inherente de las cepas de L. plantarum como L. plantarum P17630, una cepa comercial probiótica. Por tanto, la presente invención proporciona cepas de bacterias de ácido láctico que tienen la capacidad de antagonizar Staphylococcus saprophyticus.

• La capacidad de inhibir el crecimiento de otros patógenos del tracto urinario, a saber, Proteus mirabilis, Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae, muestra un espectro de actividad aún más amplio contra los uropatógenos en comparación con otros probióticos disponibles comercialmente para ayudar a controlar la ITU. Como ya se mencionó anteriormente, algunas cepas de Lactobacillus se han utilizado para el tratamiento y/o la prevención de ITU. Sin embargo, dichas cepas no muestran una actividad antagonista significativa contra los aislamientos de P. mirabilis, E. coli y K. pneumoniae (véase los EJEMPLOS 4.2-4.3). De manera sorprendente, las cepas CECT8677, CECT8675, CECT8678 y CECT8676 mostraron una actividad notablemente antagónica contra ellas. Por lo tanto, como lo respaldan los datos revelados en los EJEMPLOS 4.2-4.3, la capacidad de inhibir P. mirabilis, E. coli y K. pneumoniae no es una característica inherente del género Lactobacillus, ni siquiera de las cepas de lactobacilos de origen uretral o vaginal, tales como las cepas comerciales L. rhamnosus GR-1® y L. reuteri RC-14®, respectivamente, y mucho menos una característica inherente de las cepas de L. plantarum tales como el probiótico comercial L. plantarum P17630.

• La capacidad de sobrevivir a altas concentraciones de fosfomicina, antibiótico que se usa típicamente para controlar las ITU. Como se muestra en el EJEMPLO 5, el crecimiento de las cepas CECT8677, CECT8675, CECT8678 y CECT8676 no se inhibe incluso al usar concentraciones saturadas de fosfomicina. En otras palabras, incluso cuando se utilizan altas concentraciones de fosfomicina junto con dichas cepas, la eficacia de la combinación resultante no se ve comprometida y, por tanto, puede ejercer tanto la función probiótica como la antimicrobiana. En resumen, las cepas de la presente invención pueden coadministrarse con el antibiótico fosfomicina.

• La capacidad de sobrevivir a altas concentraciones de otros antibióticos utilizados para el tratamiento de la ITU como la norfloxacina (EJEMPLO 5).

• La capacidad de sobrevivir en presencia de ingredientes activos naturales comúnmente prescritos para tratar ITU tales como los extractos de arándano y/o arándano rojo, lo cual permite que las cepas bacterianas de la presente invención sean coadministradas con dichos ingredientes activos a ITU (ver EJEMPLO 6).

• Una capacidad mejorada de agregación, como se muestra en el EJEMPLO 7, lo cual es uno de los pasos iniciales que conducen a la formación de biopelículas protectoras contra (uro)patógenos. La biopelícula permite formar una barrera protectora o 'película' que dificulta la colonización de (uro)patógenos debido a la competencia para los sitios de adhesión.

• La capacidad de producir ácidos grasos de cadena corta (AGCC), como se muestra en el EJEMPLO 8. La producción de AGCC a partir de fibras no digeribles es un rasgo probiótico interesante. Este rasgo es deseable en un probiótico porque los AGCC producidos muestran varias propiedades beneficiosas en el hospedero. Entre sus diversas propiedades, hay muy buena evidencia que respalda que el aumento de las concentraciones de AGCC potencia el crecimiento de bacterias protectoras al tiempo que limita el crecimiento de patógenos y puede mejorar la función de la barrera intestinal, especialmente en el caso del butirato [KOBOZIEV, I. y otros. Role of the enteric microbiota in intestinal homeostasis and inflammation. Free Radical Biology & Medicine. 2014, Vol. 68, páginas 122 133]. Como resultado, los AGCC pueden mejorar los síntomas asociados a enfermedades gastrointestinales adversas como la diarrea, que es un factor de riesgo importante de contaminación cruzada de patógenos intestinales a la vagina que favorece las infecciones vaginales y las ITU.

• La tolerancia a las condiciones ambientales de los tractos gastrointestinal y genitourinario y, por tanto, la capacidad para ejercer su efecto beneficioso en las ubicaciones deseadas del cuerpo, como se muestra en el EJEMPLO 9.

• La capacidad de las cepas probióticas de la presente invención para aumentar la eficacia de la fosfomicina para inhibir patógenos asociados con ITU. Como se muestra en el EJEMPLO 10 y la FIG. 9, la combinación de fosfomicina con las cepas de la presente invención, reduce significativamente la concentración de Staphylococcus saprophyticus. Por lo tanto, el uso combinado de antibióticos y probióticos puede considerarse una opción de manejo eficaz para tratar las infecciones por S. saprophyticus.

• Una amplia variedad de especies de bacterias del ácido láctico tienen una larga historia de uso aparentemente seguro. La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria ha desarrollado un sistema que otorga el estado de "Presunción Cualificada de Seguridad" (QPS) a las unidades taxonómicas con una larga historia probada de uso aparentemente seguro. Las cepas de la invención pertenecen a una especie bacteriana que tiene estado QPS (ANDREOLETTI, O. y otros. The maintenance of the list of QPS microorganisms intentionally added to food or feed. Question no: EFSA-Q-2008-006. The EFSA Journal. 2008, Vol. 923, páginas 1-48).

En resumen, se cree que ninguna técnica anterior describe cepas de Lactobacillus y particularmente cepas de Lactobacillus plantarum con las características mencionadas anteriormente. Es de destacar que las cepas de Lactobacillus plantarum CECT8677, CECT8675, CECT8678 y CECT8676 reúnen juntas todas las propiedades mencionadas anteriormente, por lo cual son adecuadas para el tratamiento de la ITU.

De manera notable, todas las cepas de la invención tienen la capacidad de antagonizar todos los siguientes patógenos urogenitales Staphylococcus saprophyticus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Proteus mirabilis. y se pueden combinar con agentes antimicrobianos, es decir, antibióticos, que se usan de forma rutinaria para tratar la ITU. Además, la cepa de la invención tuvo buena tolerancia y se puede combinar con tratamientos alternativos basados en productos e ingredientes naturales, por ejemplo, jugos y compuestos aislados a partir de materiales vegetales (frutas y hierbas) como los que pertenecen al género Vaccinum (por ejemplo, arándano); y vitaminas (por ejemplo, la vitamina C)

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende una cantidad eficaz de al menos una cepa de Lactobacillus plantarum, en donde la cepa tiene la capacidad de antagonizar al patógeno urogenital Staphylococcus saprophyticus, y en donde la capacidad de la cepa de L. plantarum de antagonizar los patógenos urogenitales se determinan mediante las siguientes etapas: (i) frotar uniformemente las cepas de patógenos urogenitales en placas que contienen el medio Tripticasa Soya Agar y se hacen crecer hasta la confluencia en una incubadora de CO²a 37 °C y 5 % de CO²; (ii) colocar dos secciones cilíndricas de 6 mm de diámetro de una placa de agar confluente sembrada uniformemente con las células de L. plantarum en contacto con la placa sembrada con el patógeno urogenital, al enfrentar tanto (a) el lado crecido de una sección del cilindro contra la placa sembrada del patógeno urogenital; y (b) el lado no crecido de la otra sección del cilindro contra la placa sembrada del patógeno urogenital; e incubar durante la noche a 37 °C; (iii) medir al día siguiente las zonas de inhibición al colocar la placa de agar sobre una regla plana; y (iv) calcular la actividad inhibidora del crecimiento al restar el diámetro del cilindro (DC) al diámetro de la zona de inhibición (DZI) medido en centímetros y dividir esta diferencia por 2, de acuerdo con la fórmula IC = (DZI-DC)/ 2.

En una modalidad particular, la actividad inhibidora del crecimiento (IC) de al menos una cepa de Lactobacillus plantarum es de 0,5 mm. En otras modalidades particulares, la IC es de 1 mm, 2 mm, 3 mm o más.

En una modalidad particular, al menos una cepa de Lactobacillus plantarum, también tiene la capacidad de antagonizar los patógenos urogenitales Proteus mirabilis, Escherichia coli o Klebsiella pneumoniae, en donde la capacidad de la cepa de antagonizar los patógenos urogenitales está determinada por las etapas definidas anteriormente.

En una modalidad particular de más preferencia, al menos una cepa de Lactobacillus plantarum, también tiene la capacidad de antagonizar los patógenos urogenitales Proteus mirabilis, Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae, en donde la capacidad de la cepa de antagonizar los patógenos urogenitales está determinada por las etapas definidas anteriormente.

Como se discutió anteriormente, se prefiere que la cepa de bacterias de ácido láctico discutida en este documento sea una cepa de bacterias de ácido láctico aislada, es decir, se prefiere que el Lactobacillus plantarum como se discutió en este documento sea una cepa de bacterias de ácido láctico aislada.

En una modalidad particular, la presente invención proporciona la composición del aspecto anterior, en donde al menos cepa de L. plantarum se selecciona del grupo que consiste en: la cepa CECT8675, la cepa CECT8676, la cepa CECT8677, la cepa CECT8678 y mutantes de la misma, en donde el mutante se ha obtenido mediante el uso de la cepa depositada como material de partida y al aplicar mutagénesis, y en donde el mutante obtenido retiene o potencia al menos la capacidad de la cepa depositada de antagonizar el patógeno urogenital Staphylococcus saprophyticus. En una modalidad más particular, al menos una cepa de Lactobacillus plantarum se selecciona del grupo que consiste en: la cepa CECT8675, la cepa CECT8676, la cepa CECT8677 y la cepa CECT8678. En modalidades particulares, la composición comprende combinaciones de dos, tres o cuatro cepas, seleccionadas del grupo que consiste en: la cepa CECT8675, la cepa CECT8676, la cepa CECT8677, la cepa CECT8678 y mutantes de las mismas. En otra modalidad particular más, la composición comprende una cantidad eficaz de L. plantarum CECT8675 y L. plantarum CECT8677.

El uso generalizado de las cepas es en forma de células viables. Sin embargo, también se puede extender a células no viables tales como los cultivos muertos o los lisados celulares (obtenidos, por ejemplo, por exposición a pH alterado, sonicación, radiación, temperatura, presión o entre otros medios para matar o lisar bacterias) o composiciones que contienen beneficiosos producidos por cualquiera de las cepas.

Las cepas de la invención se producen al cultivar (o fermentar) las bacterias en un medio artificial adecuado y en condiciones adecuadas. Por la expresión "medio artificial" para microorganismos se entiende un medio que contiene sustancias naturales y, opcionalmente, productos químicos sintéticos como el polímero polivinil alcohol que puede reproducir algunas de las funciones de los sueros. El medio artificial se esteriliza adecuadamente una vez que se mezclan las sustancias. Por consiguiente, entre las sustancias naturales, los medios artificiales adecuados habituales son los caldos nutritivos que contienen los elementos que incluyen una fuente de carbono (por ejemplo, glucosa), una fuente de nitrógeno (por ejemplo, aminoácidos y proteínas), agua y sales necesarias para el crecimiento bacteriano. Los medios de crecimiento pueden estar en forma líquida o, a menudo, mezclados con agar u otro agente gelificante para obtener un medio sólido. Los medios de crecimiento también pueden considerarse cualquier matriz alimentaria en donde las bacterias puedan crecer en condiciones adecuadas, como los ingredientes para hacer yogur.

Las cepas pueden cultivarse solas para formar un cultivo puro, o como un cultivo mixto junto con otros microorganismos, o al cultivar bacterias de diferentes tipos por separado y luego combinarlas en las proporciones deseadas. Después del cultivo, y en dependencia de la formulación final, las cepas pueden usarse como bacterias purificadas o, alternativamente, puede usarse el cultivo bacteriano o la suspensión celular, como tal o después de un postratamiento apropiado. En esta descripción, se entiende por "biomasa" el cultivo de cepas bacterianas obtenido tras el cultivo (o la fermentación como sinónimo de cultivo).

Por el término "postratamiento" se entiende en el contexto de la presente invención, cualquier procesamiento realizado sobre la biomasa con el objetivo de obtener células bacterianas almacenables. El objetivo del postratamiento es disminuir la actividad metabólica de las células en la biomasa y, por tanto, ralentizar la tasa de reacciones celulares deletéreas. Como resultado del postratamiento, las células bacterianas pueden estar en forma sólida o líquida. En forma sólida, las células bacterianas almacenadas pueden ser un polvo o gránulos. En cualquier caso, tanto la forma sólida como la líquida que contienen las células bacterianas no están presentes en la naturaleza, por lo tanto, no son de origen natural, ya que son el resultado de proceso(s) artificial(es) de postratamiento. Los procesos de postratamiento pueden requerir en modalidades particulares el uso de uno o más de los denominados agentes de postratamiento. En el contexto de la presente invención, la expresión "agente de postratamiento" se refiere a un compuesto utilizado para realizar los procesos de postratamiento descritos en el presente documento. Entre los agentes de postratamiento se incluirán, sin limitación, los agentes deshidratantes, agentes bacteriostáticos, agentes crioprotectores (crioprotectores), aditivos inertes (también conocidos como lioprotectores), material portador (también conocido como material de núcleo), etc, solos o en combinación.

Existen dos enfoques básicos para disminuir la actividad metabólica de las células bacterianas y, por tanto, dos enfoques para realizar el postratamiento. El primero es disminuir la velocidad de todas las reacciones químicas. Esto puede realizarse al reducir la temperatura por refrigeración o congelación mediante frigoríficos, congeladores mecánicos y congeladores de nitrógeno líquido. Alternativamente, también puede disminuirse la velocidad de todas las reacciones químicas al agregar sustancias que inhiben el crecimiento de las células bacterianas, a saber, un agente bacteriostático, abreviado Bstatic, el cual es un agente biológico o químico que detiene la reproducción de las bacterias, sin dañarlas, entre ellos los antibióticos bacteriostáticos y conservantes. Esto contrasta con los bactericidas, que matan las bacterias. El experto en la materia conoce el bacteriostático apropiado a utilizar. Como ejemplo de antibióticos bacteriostáticos, y sin limitación, los bacteriostáticos que limitan el crecimiento de las bacterias al interferir con la producción de proteínas bacterianas, la replicación del ADN u otros aspectos del metabolismo celular bacteriano, en las concentraciones adecuadas para mantener solo su actividad bacteriostática. También puede entenderse por agente bacteriostático cualquier agente que se añada para modificar las condiciones ambientales como el pH, la concentración de sales o el estado redox.

El segundo enfoque para realizar el postratamiento es eliminar el agua a partir de la biomasa, proceso que puede implicar la sublimación del agua mediante un liofilizador. Las técnicas adecuadas para eliminar el agua a partir de la biomasa son el secado, la liofilización, el secado por aspersión o el secado en lecho fluido.

Los tratamientos posteriores que dan como resultado una forma sólida pueden ser el secado, la congelación, la liofilización, el secado en lecho fluido o el secado por aspersión.

El postratamiento tras el cultivo de las cepas puede consistir en la congelación. En este caso, deben agregarse uno o más agentes crioprotectores. Las expresiones "agente (o aditivo) crioprotector" y "crioprotector" se utilizan indistintamente en la presente invención, y se refieren a los productos químicos que protegen las células durante la congelación y minimizan al mismo tiempo los efectos perjudiciales del aumento de la concentración de solutos y la formación de cristales de hielo que provocan una caída en el número de células viables y las consiguientes pérdidas en la producción industrial. Los agentes crioprotectores más comúnmente usados son el dimetilsulfóxido (DMSO) y el glicerol, ya sean solos o en combinación; aunque otros crioprotectores que se han usado ocasionalmente, ya sean solos o en combinación, incluyen: el polietilenglicol, propilenglicol, glicerina, betaína (o glicina betaína), polivinilpirrolidona, sorbitol, dextrano y trehalosa. Los crioprotectores clasificados por familias son: los sulfóxidos, alcoholes monohídricos y derivados, dioles y derivados, trioles, polialcoholes, mono-, di-, tri-, polisacáridos, amidas, N-alquilamidas, imidas, compuestos heterocíclicos, aminoácidos y ácidos carbónicos, proteínas, péptidos, polipéptidos, glicoproteínas y surfactantes no iónicos. Los protocolos para congelar bacterias y la selección de crioprotectores adecuados son la elección y el conocimiento de los expertos en la técnica. Básicamente, las bacterias pueden cultivarse o recolectarse convenientemente a partir de placas o inclinaciones de agar, o de cultivo en caldo y recolectarse por centrifugación. En cualquier caso, las células se suspenden generalmente en medio de crecimiento fresco que contiene el o los agentes crioprotectores. Las bacterias también pueden concentrarse por centrifugación, pero a menudo se suspenden en el medio usado y luego se diluyen al agregar un volumen igual de medio de crecimiento fresco que contiene el(los) agente(s) crioprotector(es). Luego, la mezcla de células y crioprotectores se deja durante al menos 15 minutos pero no más de 45-60 minutos para que se equilibre antes del proceso de enfriamiento. La suspensión se distribuye en viales y se enfría a una velocidad de enfriamiento adecuada.

Cuando el postratamiento luego del cultivo de las cepas es el secado, básicamente consiste en secar en un desecador al vacío sobre agentes deshidratantes como el H²SO ⁴o P²O⁵, los microorganismos suspendidos en el fluido de cultivo o resuspendidos en suero fisiológico.

El postratamiento tras el cultivo de las cepas puede consistir en la liofilización, como método de eliminación de agua. La liofilización implica la eliminación del agua a partir de las suspensiones bacterianas congeladas mediante sublimación a presión reducida. Los cultivos liofilizados se mantienen mejor a 4 °C o menos. La sublimación ocurre cuando un líquido congelado pasa directamente a un estado gaseoso sin entrar en una fase líquida. El proceso de liofilización da como resultado un producto estable y fácilmente rehidratado. Este proceso consta de tres pasos: precongelar el producto para formar una estructura congelada, el secado primario para eliminar la mayor parte del agua y el secado secundario para eliminar el agua unida. Los medios y métodos para la liofilización son conocidos en la técnica y están a disposición del experto. Debido a la variabilidad objetiva y esperada de los procesos industriales para la fabricación y aislamiento de los cultivos bacterianos liofilizados, estos últimos comúnmente contienen cierta cantidad de aditivo inerte también conocido como lioprotector. Su función es estandarizar el contenido de bacterias probióticas vivas en el producto. Se utilizan los siguientes aditivos inertes en los cultivos liofilizados disponibles comercialmente: la sacarosa, sacarosa, lactosa, trehalosa, glucosa, maltosa, maltodextrina, almidón de maíz, inulina y otros aditivos no higroscópicos farmacéuticamente aceptables. Opcionalmente, también se utilizan otros agentes estabilizantes o protectores de la congelación, como el ácido ascórbico, para formar una pasta viscosa, el cual se somete a liofilización. En cualquier caso, el material así obtenido puede triturarse hasta obtener un tamaño apropiado, incluso hasta obtener un polvo.

El postratamiento tras el cultivo de las cepas puede consistir en un secado por aspersión. El secado por aspersión es un proceso mediante el cual una formulación líquida se convierte en un polvo seco en un solo paso. El proceso se realiza típicamente atomizando primero la solución en gotitas artificialmente finas tan pequeñas como sea posible, lo cual maximiza la transferencia de calor y la tasa de vaporización del agua. El tamaño de las gotas puede variar de 20 a 180 pm en dependencia de la boquilla. Hay dos tipos principales de boquillas: la boquilla de fluido único de alta presión (50 a 300 bares) y boquillas de dos fluidos: un fluido es el líquido a secar y el segundo es gas comprimido (generalmente aire de 1 a 7 bares). A continuación, las gotitas se secan rápidamente en una cámara grande mediante el uso de gas caliente. Las partículas secas resultantes se recogen con un ciclón.

El postratamiento tras el cultivo de las cepas puede consistir en un secado en lecho fluido. En el proceso de lecho fluido, en primer lugar, se necesita un material portador (también conocido como material de núcleo) como base para el sustrato que debe secarse. El material portador puede ser, sin limitación, la celulosa. Este material portador se mantiene en el aire para permitir la aplicación del sustrato a través de una boquilla de pulverización. En comparación con el secado por aspersión, las temperaturas son más bajas. Las bacterias se pulverizan sobre el material portador disperso en forma de gotitas finas. El agua contenida privada del aire seco fluye de abajo hacia arriba a través del lecho fluido. Al mismo tiempo, la corriente de aire es responsable de la fluidización de las partículas. Posteriormente se aplica una capa protectora de la misma materia sobre el portador que está recubierto con bacterias. El revestimiento protector utilizado debe prevenir el daño celular de las bacterias al estabilizar los componentes de la membrana celular, por ejemplo, al crear una estructura porosa en el producto seco que facilita la rehidratación y contiene proteínas que proporcionan un revestimiento protector para las células. El material de revestimiento protector puede ser, sin limitación, leche desnatada y alginato de calcio. La estructura de un producto encapsulado que se logra mediante el recubrimiento de lecho fluido consta de al menos tres partes: dentro el portador o material del núcleo (esférico), la capa de recubrimiento protectora uniforme, en el exterior y entre el ingrediente activo recubierto de interés, a saber, las bacterias. A veces, se requieren múltiples capas de diferentes materiales de recubrimiento para obtener las propiedades deseadas del producto. El tamaño de las microcápsulas resultantes varía entre 200 pm y 2 mm.

Alternativamente a conservar la biomasa en forma sólida, la biomasa también puede conservarse en forma líquida. Esto se puede hacer al agregar un agente bacteriostático como se describió anteriormente para detener el crecimiento de las bacterias en el medio de cultivo o con un paso intermedio de recolección de células, al resuspender el sedimento en la solución salina con un agente bacteriostático y opcionalmente refrigerarlo.

A veces, como se describe, por ejemplo, anteriormente en el proceso de secado en lecho fluido, la preparación probiótica se somete a un proceso de inmovilización y/o recubrimiento, o encapsulación con el fin de mejorar la vida útil y/o las funcionalidades. En la técnica se conocen varias técnicas para la inmovilización, el recubrimiento o la encapsulación de las bacterias.

En consecuencia, una modalidad particular de la presente invención se refiere a al menos una cepa como se define anteriormente, por lo tanto, que incluye Lactobacillus plantarum CECT8677 o un mutante del mismo, L. plantarum CECT8675 o un mutante del mismo, L. plantarum CECT8678 o un mutante del mismo, y L. plantarum CECT8676 o un mutante del mismo, en donde la cepa o mutante del mismo ha sido fermentado en un medio artificial y sometido a un postratamiento después de la fermentación, para obtener células bacterianas, y donde las células bacterianas resultantes están en un medio líquido o en forma sólida.

En una modalidad particular, el postratamiento se selecciona del grupo que consiste en: el secado, congelación, liofilización, secado en lecho fluido, secado por aspersión y refrigeración en medio líquido. En una modalidad particular, el postratamiento es la liofilización.

Está claro que al usar las cepas depositadas como material de partida, el experto en la técnica puede, de forma rutinaria, mediante mutagénesis convencional o técnicas de re-aislamiento, obtener mutantes adicionales de las mismas que retengan o mejoren las características y ventajas relevantes aquí descritas de las cepas que forman la composición de la invención. En una modalidad particular, los mutantes se obtienen al utilizar tecnología de ADN recombinante. En otra modalidad, los mutantes se obtienen mediante mutagénesis aleatoria. Por tanto, otro aspecto de la descripción se refiere a un método para obtener un mutante de al menos una cepa de Lactobacillus plantarum, en donde la cepa de L. plantarum se selecciona del grupo que consiste en: la cepa CECT8675, la cepa CECT8676, la cepa CECT8677 o la cepa CECT8678, en donde el método comprende usar la cepa depositada como material de partida y aplicar mutagénesis, y en donde el mutante obtenido retiene o mejora adicionalmente al menos la capacidad de la cepa depositada de antagonizar el patógeno urogenital Staphylococcus saprophyticus así como otros patógenos ITU como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y/o Proteus mirabilis.

De acuerdo con las características beneficiosas descritas anteriormente de las cepas CECT8677, CECT8675, CECT8678 y/o CECT8676, otro aspecto de la invención se refiere a cualquiera de las composiciones definidas anteriormente para su uso como medicamento o como probiótico.

Otro aspecto de la invención se refiere a las composiciones definidas anteriormente para su uso en la prevención y/o tratamiento de una enfermedad relacionada con alteraciones de la microbiota urogenital. Este aspecto puede formularse alternativamente como el uso de cualquiera de las composiciones de la invención para la fabricación de un producto farmacéutico, un producto veterinario, un medicamento, un producto alimenticio, un suplemento alimenticio, un alimento médico o un producto de higiene personal para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad relacionada con alteraciones de la microbiota urogenital. Este también puede formularse alternativamente como un método para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad relacionada con alteraciones de la microbiota urogenital, que comprende administrar al sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones de la invención. En incluso otras modalidades particulares, la enfermedad relacionada con alteraciones de la microbiota urogenital mencionada en todos los aspectos anteriores es la infección del tracto urinario. En incluso otras modalidades particulares, la infección del tracto urinario es la cistitis aguda, pielonefritis aguda, ITU no complicada, ITU complicada o ITU recurrente. Las composiciones de la invención son particularmente útiles para el tratamiento profiláctico de individuos susceptibles a ITU y también para el manejo terapéutico de individuos con ITU recidivante o reinfección. Las composiciones también son útiles para prevenir infecciones que ponen en peligro al feto en las mujeres embarazadas y el parto prematuro.

Las alteraciones de la microbiota urogenital pueden ser causadas, sin limitación, por cambios hormonales (es decir, ciclos menstruales), anticoncepción basada en biomateriales, contacto sexual, prácticas de higiene femenina, consumo de antibióticos, estado nutricional, competencia microbiana interespecífica, comensalismo, etc. En una modalidad particular, tal enfermedad es la vaginosis bacteriana. La vaginosis bacteriana es causada por un crecimiento excesivo de las especies bacterianas que generalmente están ausentes en la flora vaginal o se encuentran en cantidades muy pequeñas. Las especies más comunes son Gardnerella vaginalis y Atopobium vaginae. Aunque la vaginosis bacteriana puede causar secreciones vaginales inusuales y olor a pescado, la mayoría de los casos son asintomáticos. Un rasgo típico de la vaginosis bacteriana es el aumento del pH por encima de 4,5, debido a la desaparición de Lactobacilli, lo cual facilita aún más el crecimiento de otras especies bacterianas. La vaginosis bacteriana se trata con antibióticos, como el metronidazol y la clindamicina.

Otro aspecto de la invención se refiere a un producto farmacéutico, un producto veterinario, un alimento médico, un producto alimenticio, un suplemento alimenticio o un producto de higiene personal, que comprende una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones descritas en este documento junto con cantidades apropiadas de excipientes aceptables.

Por consiguiente, la composición de la invención puede prepararse en cualquier forma adecuada que no afecte negativamente a la viabilidad de las cepas que forman la composición de la invención. La selección de los excipientes y los métodos de formulación más apropiados en vista del propósito particular de la composición están dentro del alcance de los expertos en la técnica de la tecnología farmacéutica.

La composición puede administrarse por vía oral, vaginal o rectal, o al utilizar diferentes formas de administración simultáneamente (por ejemplo, por vía oral y vaginal).

En este sentido, la composición de la invención se encuentra en forma sólida o líquida y puede estar, entre otras cosas, en forma de polvos, tabletas o grageas, tabletas para chupar, preparaciones de películas, soluciones, aerosoles, gránulos, píldoras, suspensiones, emulsiones, cápsulas, comprimidos y cápsulas con revestimiento, jarabes, líquidos, elixires, dulces, chicles, supositorios, microenemas, comprimidos vaginales, cápsulas de gelatina vaginal, cremas, geles, ungüentos, lociones, tampones, servilletas, compresas, tiras fundentes, condones, pesarios, aerosoles, duchas vaginales, tintura o extractos fluidos.

En una modalidad particular, la composición de la invención se administra en combinación con otros ingredientes activos comúnmente usados para tratar ITU, en particular con un agente antimicrobiano. En apartados anteriores se define lo que se entiende por agentes antimicrobianos, entre los que habitualmente se incluyen los antibióticos y los productos e ingredientes naturales con efecto antimicrobiano. Algunas modalidades particulares de la invención son composiciones que comprenden las cepas de la invención junto con: el arándano; arándano y salvia; arándano, manosa y salvia; arándano y vitamina C; arándano, berberina, arbutina y betula; y arándano, berberina, arbutina, betula y manosa.

La composición de acuerdo con la invención puede formularse en una forma en donde las cepas de la invención sean el único agente activo. Alternativamente, la composición de la invención puede formularse mezclada con uno o más de otros agentes activos. Alternativamente, las cepas de la invención solas o formuladas mezcladas con uno o más de otros agentes activos, también pueden formularse con excipientes farmacéuticamente o veterinariamente aceptables o aditivos o ingredientes adecuados en el caso de un producto alimenticio. En una modalidad particular de la invención, la composición contiene adicionalmente uno o más agentes activos adicionales. Alternativamente, el agente o agentes activos adicionales son otras bacterias probióticas que no son antagonistas de las cepas que forman la composición de la invención. En particular, y debido a la capacidad de las cepas de la invención para sobrevivir en altas concentraciones de agentes antibióticos a los cuales las cepas de la invención son resistentes y que se usan típicamente para manejar la ITU, la composición de la invención puede administrarse en combinación con la fosfomicina en la prevención y/o el tratamiento de las ITU. Como se muestra en el EJEMPLO 5, ventajosamente, las cepas de la invención pueden coadministrarse con la fosfomicina, la cual es el tratamiento de primera línea en muchos países. Dado que la resistencia de los uropatógenos (por ejemplo, S. saprophyticus) a este antibiótico ha aumentado significativamente en los últimos años en muchos países, el uso combinado de la(s) cepa(s) probiótica(s) de la invención con la fosfomicina puede aumentar el espectro inhibidor de este antibiótico, lo cual mejora su eficacia.

Por tanto, en una modalidad particular, las composiciones de la invención se utilizan en combinación con una cantidad eficaz de un agente antimicrobiano; y más particularmente, el antibiótico es la fosmomicina.

En una modalidad particular, la composición comprende más de un agente activo, los agentes activos pueden formularse en una única forma farmacéutica, veterinaria, suplemento alimenticio o alimento médico, o en formas separadas para ser administradas secuencial o consecutivamente en cualquier orden, en donde la forma que comprende al menos una de las cepas de la presente invención, se administra antes, sustancialmente de forma simultánea, después o entre la administración de(los) otro(s) agente(s) activo(s).

Los expertos en la técnica determinarán las dosis diarias y los regímenes terapéuticos. Por ejemplo, la dosis diaria puede ser mayor durante el tratamiento de síntomas activos o puede ser menor con fines profilácticos. Un régimen terapéutico preferente se basará en la administración simultánea de las bacterias del ácido láctico y los agentes antimicrobianos u otros ingredientes activos. Sin embargo, los regímenes terapéuticos también pueden ser secuenciales, por ejemplo, al administrar primero el agente antimicrobiano o el ingrediente activo de interés y comenzar el tratamiento con la composición probiótica de acuerdo con la presente invención algunos días después. Otros regímenes terapéuticos típicos consisten en iniciar el tratamiento con la composición probiótica antes de la administración del agente antimicrobiano o el principio activo de interés.

Además, la administración puede ser crónica o intermitente, como lo considere apropiado el médico supervisor, particularmente en vista de cualquier cambio en el estado de la enfermedad o cualquier efecto secundario indeseable. La administración "crónica" se refiere a la administración de la composición de manera continua, mientras que la administración "intermitente" se refiere al tratamiento que se realiza con interrupción.

La cantidad eficaz de las unidades formadoras de colonias (ufc) para las cepas en la composición se determinará por los expertos en la técnica y dependerá de la formulación final. Por ejemplo, cuando se administra por vía oral sin ningún otro agente activo, la cantidad total de las cepas de la invención está presente en la composición en una sola dosis en una cantidad que da una dosis diaria efectiva de 107 a 1012 ufc, de acuerdo con la actual legislación, preferentemente de 109 a 1011 ufc y, cuando se administra por vía vaginal o rectal, en una cantidad que proporcione una dosis diaria eficaz de 103 a 1012 ufc, preferentemente de 105 a 1010 ufc. El término "unidad formadora de colonias" ("ufc") se define como el número de células bacterianas revelado por recuentos microbiológicos en placas de agar. Los suplementos alimenticios suelen contener cepas probióticas en una cantidad que oscila entre 107 y 1012 ufc/g. En una modalidad particular, la composición de la invención es un suplemento alimenticio para dosis diarias que comprenden entre 109-1011 ufc/g.

El término "producto farmacéutico" se entiende en su amplio significado en esta descripción, el cual incluye cualquier composición que comprenda un ingrediente activo, en este caso, las cepas de la invención preferentemente en forma de composición, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables. El término "producto farmacéutico" no se limita a medicamentos. El término "farmacéuticamente aceptable", como se usa en este documento, se refiere a compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacológicas las cuales, dentro del alcance del juicio médico sólido, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de un sujeto (por ejemplo, un ser humano) sin excesos de toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable. Cada portador, excipiente, etc. también debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la formulación. Los portadores, excipientes, etc. adecuados pueden encontrarse en los textos farmacéuticos estándar.

El término "excipiente" se entiende en su amplio significado en esta descripción, el cual incluye cualquier sustancia natural o sintética formulada junto con el ingrediente activo de un producto farmacéutico, producto veterinario, medicamento, suplemento alimenticio, alimento médico y producto de higiene personal. El(los) excipiente(s) más apropiado(s) a utilizar depende(n) de la formulación final.

Los excipientes se seleccionan, sin limitación, del grupo que comprende: aditivos/diluyentes/agentes de carga, aglutinantes, antiadherentes, desintegrantes, recubrimientos, agentes antiaglomerantes, antioxidantes, lubricantes, edulcorantes, aromas, colorantes, surfactantes y otras clases de excipientes farmacéutica y veterinariamente aceptables.

Los aditivos se seleccionan, sin limitación, del grupo que comprende: la inulina, oligofructosa, pectina, pectinas modificadas, celulosa microcristalina, lactosa, almidón, maltodextrina, sacarosa, glucosa, fructosa, manitol, xilitol, sorbitol no cristalizante, carbonato cálcico, fosfato dicálcico, otros aditivos inertes inorgánicos y orgánicos farmacológicamente aceptables, y mezclas de estas sustancias. En la forma de dosificación de suspensión oral, los aditivos o diluyentes se seleccionan del grupo que comprende: el aceite vegetal, ácido oleico, alcohol oleico, polietilenglicol líquido, otros líquidos inertes farmacológicamente aceptables o mezclas de estas sustancias.

Los aglutinantes se utilizan en formas farmacológicas sólidas, por ejemplo, para mantener juntos los ingredientes de una tableta, para asegurar que las tabletas y los gránulos puedan formarse con la resistencia mecánica requerida y para proporcionar volumen a las tabletas de baja dosis activa. Los aglutinantes en formas farmacéuticas sólidas como tabletas son: la lactosa, sacarosa, almidón de maíz (maíz), almidones modificados, celulosa microcristalina, celulosa modificada (por ejemplo, la hidroxipropil metilcelulosa (HPMC) e hidroxietilcelulosa), otros éteres de celulosa solubles en agua, la polivinilpirrolidona (PVP) también conocida como povidona, el polietilenglicol, sorbitol, maltitol, xilitol y fosfato cálcico dibásico; otros aglutinantes farmacológicamente aceptables adecuados o mezclas de estas sustancias.

Los antiadherentes se utilizan para reducir la adherencia entre el polvo (gránulos) y las caras del punzón y así evitar que se pegue a los punzones de las tabletas. También se utilizan para ayudar a evitar que las tabletas se peguen. El más utilizado es el estearato de magnesio.

Como desintegrantes y superdesintegrantes en formas farmacéuticas sólidas como las tabletas y cápsulas, se utilizan las siguientes sustancias, sin limitación: polivinilpirrolidona reticulada, almidón glicolato de sodio, carboximetilcelulosa de sodio, carboximetilcelulosa de calcio y formaldehído-caseína, otro desintegrante y superdesintegrante farmacológicamente aceptable adecuado, o sus mezclas.

Los recubrimientos en el caso de formas farmacéuticas sólidas, tales como las tabletas y los gránulos para el llenado de cápsulas, protegen los ingredientes del deterioro por la humedad en el aire, hacen que las tabletas grandes y de sabor desagradable sean más fáciles de tragar y/o en el caso de los recubrimientos entéricos aseguran que estén intactas al pasar a través de un medio ácido fuerte de jugo gástrico (pH alrededor de 1), y lo cual permite su liberación en el duodeno o el íleon (intestino delgado). Para la mayoría de las tabletas recubiertas, se usa un recubrimiento de película de éter de celulosa hidroxipropil metilcelulosa (HPMC). Ocasionalmente, se utilizan otros materiales de recubrimiento, por ejemplo, polímeros sintéticos y copolímeros como el ftalato de acetato de polivinilo (PVAP); copolímeros de acrilato de metilo-ácido metacrílico; copolímeros de metacrilato de metilo-ácido metacrílico; goma laca, zeína de proteína de maíz u otros polisacáridos; ceras o sustancias similares a las ceras como la cera de abejas, el ácido esteárico; alcoholes grasos superiores como el alcohol cetílico o estearílico; la parafina sólida; el monoestearato de glicerol; el diestearato de glicerol, o sus combinaciones. Las cápsulas están recubiertas con gelatina o hidroxipropil metilcelulosa.

Los recubrimientos entéricos controlan la velocidad de liberación del fármaco y determinan donde se liberará el fármaco en el tracto digestivo. Los materiales utilizados para los recubrimientos entéricos incluyen los ácidos grasos, ceras, goma laca, plásticos y fibras vegetales y sus mezclas, también en combinación con otros recubrimientos mencionados anteriormente.

Un antiaglomerante es un aditivo que se coloca en materiales en polvo o granulados para evitar la formación de grumos (apelmazamiento) y para facilitar el envasado, transporte y el consumo. Como agentes antiaglomerantes en formas farmacológicas sólidas como las tabletas, cápsulas o polvos, se utilizan los siguientes: el estearato de magnesio, dióxido de silicio coloidal, talco, otros agentes antiaglomerantes farmacológicamente aceptables o sus mezclas.

Los lubricantes se utilizan en formas farmacológicas sólidas, en particular en tabletas y cápsulas, para evitar que los ingredientes se agrupen y se peguen a los punzones de tabletas o la máquina de llenado de cápsulas, y también en cápsulas duras. Como lubricantes, el talco o la sílice y las grasas, por ejemplo, la estearina vegetal, el estearato de magnesio o ácido esteárico, y sus mezclas, son los lubricantes más utilizados en las tabletas o cápsulas de gelatina dura.

Se añaden edulcorantes para hacer que los ingredientes sean más agradables al paladar, especialmente en formas farmacológicas sólidas, por ejemplo, tabletas masticables, así como en formas farmacológicas líquidas, como el jarabe para la tos. Los edulcorantes pueden seleccionarse entre edulcorantes artificiales, naturales o sintéticos o semisintéticos; ejemplos no limitantes de edulcorantes son el aspartamo, acesulfamo de potasio, ciclamato, sucralosa, sacarina, azúcares o cualquier mezcla de los mismos,

Los aromas pueden utilizarse para enmascarar ingredientes activos de sabor desagradable en cualquier forma farmacológica. Los aromatizantes pueden ser naturales (por ejemplo, el extracto de frutas) o artificiales. Por ejemplo, para mejorar: (1) puede utilizarse un producto amargo, menta, cereza o anís; (2) puede utilizarse un producto salado, melocotón o albaricoque o regaliz; (3) un producto ácido, frambuesa; y (4) un producto excesivamente dulce, vainilla.

Excepto las sustancias auxiliares de la clase de excipientes, la formulación de la presente invención puede contener otras sustancias nutritivas o farmacológicamente activas seleccionadas del grupo que comprende: antibióticos; jugo de arándano; vitaminas, tales como la vitamina C (o ácido ascórbico) en una forma química, sal o derivados farmacéuticamente aceptables; minerales en la presentación de una forma química nutritiva y farmacológicamente aceptable; y L-aminoácidos. Con respecto a la preparación de las formulaciones de la presente invención, está dentro del alcance del experto en la técnica y dependerá de la formulación farmacológica final. Por ejemplo, y sin limitación, cuando la forma farmacológica final es sólida oral, como las tabletas, cápsulas, polvo, gránulos, suspensión oral, etc., el proceso para la preparación de las formas farmacológicas sólidas de la formulación incluye la homogeneización de: (1) el(los) ingrediente(s) o ingrediente(s) activos, que comprenden al menos una o más bacterias probióticas postratadas de la invención en una cantidad eficaz; (2) con uno o más excipientes para formar una mezcla homogénea que, por ejemplo, de acuerdo con los requisitos, se somete a lubricación con estearato de magnesio u otros lubricantes, lo cual produce la forma farmacológica final en polvo. Dicho polvo homogéneo se introduce en cápsulas de gelatina ordinarias o, alternativamente, en cápsulas gastrorresistentes. En el caso de las tabletas, se fabrican mediante la compresión directa o granulación. En el primer caso, se prepara una mezcla homogénea de principios activos y excipientes adecuados como la lactosa anhidra, el sorbitol no cristalizante y otros. En el segundo caso, las tabletas se procesan sobre la mezcla en forma granulada. Los gránulos se preparan mediante un proceso de granulación de los ingredientes activos de la formulación con aditivos, aglutinantes, desintegrantes adecuados y una pequeña cantidad de agua purificada. Dichos gránulos preparados se tamizan y secan hasta que el contenido de agua sea <1 % p/p.

En cuanto al proceso para la preparación de las formas farmacológicas líquidas (por ejemplo, la suspensión oral), implica la homogeneización del(los) ingrediente(s) activo(s) de la formulación que comprende al menos una o más bacterias probióticas postratadas de la invención en una cantidad eficaz en un diluyente líquido inerte (aditivo) tal como varios aceites vegetales como por ejemplo el aceite de girasol, soja u oliva; el ácido oleico; alcohol oleico; los polietilenglicoles líquidos como el PEG 200, PEG 400 o PEG 600; u otros líquidos inertes farmacológicamente aceptables. El proceso además implica el tratamiento de una mezcla homogénea con uno o más procesos seleccionados del grupo que comprende: (1) la estabilización de la formulación, mediante la adición y la homogenización de estabilizadores de la suspensión como la cera de abejas, dióxido de silicio coloidal, etc; (2) la edulcoración de la formulación; por adición y homogeneización del edulcorante; (3) aromatizar la formulación, mediante la adición y homogeneización del aromatizante. Tales formas de la formulación pueden contener también otros excipientes o ingredientes, normalmente empleados en la técnica.

El producto farmacéutico puede adoptar diferentes formas o nombres en dependencia de la vía de aprobación del producto y también del país. Por ejemplo, un medicamento es un producto farmacéutico particular. Un alimento médico es otro producto farmacéutico particular. Los términos "alimento medicinal" o "alimento para fines médicos especiales" se utilizan en algunos países para referirse a un alimento especialmente formulado y destinado al manejo dietético de una enfermedad que tiene necesidades nutricionales distintivas que no pueden satisfacerse únicamente con una dieta normal. Están definidos en las regulaciones como las Enmiendas a la Ley de Medicamentos Huérfanos de 1988 de la Administración de Alimentos y Medicamentos en los Estados Unidos y la Directiva de la Comisión 1999/21/EC en Europa. Los alimentos medicinales son distintos de la categoría más amplia de suplementos alimenticios y de los alimentos tradicionales que llevan una declaración de propiedades saludables. De este modo, en una modalidad particular, la composición de la invención es un alimento medicinal.

A menudo, las composiciones de bacterias probióticas, como la descrita en este documento, se consideran suplementos alimenticios. Un suplemento alimenticio, también conocido como suplemento dietético o suplemento nutricional, se considera otro producto farmacéutico particular. Se trata de un preparado o producto destinado a complementar la dieta, elaborado a partir de compuestos habitualmente utilizados en los alimentos, que aportan nutrientes o ingredientes beneficiosos que no suelen ingerirse en la dieta habitual o no pueden consumirse en cantidades suficientes. En su mayoría, los suplementos alimenticios se consideran productos alimenticios, pero a veces se definen como medicamentos, productos naturales para la salud o productos nutracéuticos. En el sentido de la presente invención, los suplementos alimenticios también incluyen los nutracéuticos. Los suplementos alimenticios se venden normalmente "sin receta", es decir, sin prescripción. Si el suplemento alimenticio adopta la forma de pastilla, cápsula, tableta o polvo, comprende excipientes que son los mismos que se utilizan en los medicamentos. Sin embargo, un suplemento alimenticio también puede adoptar la forma de un producto alimenticio enriquecido con algunos nutrientes (por ejemplo, una barra o yogur). De este modo, en una modalidad particular, la composición de la invención es un suplemento alimenticio.

Si la composición de acuerdo la invención es un suplemento alimenticio, puede administrarse como tal, puede mezclarse con un líquido potable adecuado, como el agua, yogur, leche o zumo de frutas, o puede mezclarse con alimentos sólidos o líquidos. En este contexto, el suplemento alimenticio puede estar en forma de tabletas o pastillas, píldoras, cápsulas, gránulos, polvos, suspensiones, parches, caramelos, barras, jarabes y formas de administración correspondientes, normalmente en la forma de dosis unitaria. Preferentemente, el suplemento alimenticio que comprende la composición de la invención se administra en forma de tabletas, grageas, cápsulas o polvos, fabricados en procesos convencionales de preparación de complementos dietéticos.

Las cepas de la invención también pueden incluirse en una variedad de productos alimenticios, tales como los productos lácteos (un yogur, un queso, una leche fermentada, una leche en polvo, un producto fermentado a base de leche, un helado, un producto a base de cereal fermentado, un polvo a base de leche), pan, barras, untables, galletas y cereales, una bebida, diferentes tipos de aceite o un aderezo. El término "producto alimenticio" se usa en este documento en su significado más amplio, el cual incluye cualquier tipo de producto, en cualquier forma de presentación, que pueda ingerirse por un animal, pero excluye los productos farmacéuticos y veterinarios. Ejemplos de otros productos alimenticios son los productos cárnicos (por ejemplo, las salchichas o pastas para untar), chocolate para untar, rellenos y glaseados, chocolate, confitería, productos horneados (tartas, pasteles), salsas y sopas, jugos de frutas y blanqueadores de café. Los productos alimenticios particularmente interesantes son los suplementos alimenticios y las fórmulas infantiles. El producto alimenticio comprende preferentemente un material portador tal como las gachas de avena, alimentos fermentados con ácido láctico, almidón resistente, fibras dietéticas, carbohidratos, proteínas y proteínas glicosiladas. En una modalidad particular, las cepas de la invención están encapsuladas o recubiertas. Por tanto, en una modalidad particular, la composición de la invención es un producto alimenticio.

Algunas de las formas mencionadas anteriormente se consideran dispositivos médicos en algunos países; por ejemplo, cápsulas vaginales, tampones u otros tipos de aplicadores. Así, en una modalidad particular, la composición de la invención es un dispositivo médico.

En otra modalidad particular, la composición de la invención es un producto de higiene personal, el cual puede venderse "sin receta" en un supermercado o en una farmacia. Ejemplos de productos de higiene personal son los tampones, compresas higiénicas, toallas higiénicas, pañales, jabones, champús, geles, ungüentos, cremas, aerosoles y lociones.

En particular, la composición de la invención está en forma de tabletas intravaginales mucoadhesivas desintegrables que se aplican intravaginalmente mediante el uso de un dispositivo aplicador.

Por tanto, debe entenderse que la composición de la invención es útil en el tratamiento de la ITU y otras enfermedades relacionadas del tracto urogenital independientemente de la forma de la composición; es decir, independientemente de que se trate de un producto farmacéutico, un medicamento, un producto alimenticio, un suplemento alimenticio, un alimento médico o un producto de higiene personal.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variaciones no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Los objetos, ventajas y características adicionales de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras el examen de la descripción o pueden aprenderse mediante la práctica de la invención. Además, la presente invención cubre todas las combinaciones posibles de las modalidades particulares y de preferencia descritas en el presente documento. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan en el presente documento con fines ilustrativos y sin pretender limitar la presente invención.

Breve descripción de las figuras

FIG. 1. Patrones de electroforesis de campo pulsado de ADN genómico digerido con Sfi-I y Sma-I (de izquierda a derecha): Lactobacillus plantarum P17630, L. plantarum CECT8675, L. plantarum CECT8676, L. plantarum CECT8677, L. plantarum CECT8678, y el marcador molecular de ADN (M).

FIG. 2. RAPD de (de izquierda a derecha): L. plantarum CECT8676, L. plantarum CECT8678, la cepa probiótica comercial L. plantarum P17630 y el marcador molecular de ADN (Marcador).

FIG. 3. Gráfico de Barras con Columnas Apiladas que muestra la actividad acumulativa antagonista de L. plantarum CECT8675, CECT8676, CECT8677, las cepas ^cE^cT8678 y las cepas comerciales de L. plantarum P17630, L. reuteri RC-14® y L. rhamnosus GR-1®, las cuales se utilizaron como controles, contra 3 cepas diferentes de Staphylococcus saprophyticus. Este gráfico de barras proporciona una presentación visual que se muestra como una barra/columna apilada separada. Cada barra/columna apilada resulta de agrupar el IC o la actividad inhibidora ("IC (mm)") medida en milímetros para cada una de las cepas citadas anteriormente, así como para cada cepa de control mencionada, contra las cepas DSM20229, DSM4853 y DSM4852 de S. saprophyticus. En este gráfico, la cepa probada para la actividad antagonista contra S. saprophyticus aparece a lo largo del eje horizontal; y la altura de la barra apilada corresponde al valor IC acumulativo de cada cepa probada. Por consiguiente, cada barra apilada representa la actividad IC acumulativa de cada cepa probada contra las cepas DSM20229, DSM4853 y DSM4852 de S. saprophyticus acumuladas una encima de la otra. La altura de la barra apilada resultante muestra el resultado combinado.

La FIG. 4 muestra los halos (también conocidos como placas o zonas de inhibición) de las cepas de L. plantarum CECT8675, CECT8676, CECT8677 y CECT8678 de la invención y las cepas comerciales de L. plantarum P17630. Las cepas L. reuteri RC-14® y L. rhamnosus GR-1® se utilizaron como controles contra el patógeno Staphylococcus saprophyticus DSM4582. Como se muestra en la FIG. 4 los tamaños más grandes de los halos, que representan las zonas claras o zonas de inhibición del crecimiento del patógeno S. saprophyticus DSM4582, se obtuvieron para las cepas de la invención en comparación con las cepas de control, cuando se colocaron sobre una placa de S. saprophyticus DSM4582 crecido hasta la confluencia. Esto significa una actividad antagonista más potente de las cepas de la invención en comparación con las cepas utilizadas comercialmente.

FIG. 5. Gráfico de Barras con Columnas Apiladas que muestra la actividad acumulativa antagonista de L. plantarum CECT8675, CECT8676, CECT8677, cepas CECT8678, y las cepas comerciales de L. plantarum P17630, L. reuteri RC-14® y L. rhamnosus GR-1®, que se utilizaron como controles contra 2 cepas diferentes de Proteus mirabilis. Cada barra/columna apilada resulta de agrupar la IC o la actividad inhibidora ("IC (mm)") medida en milímetros para cada una de las cepas antes citada así como para cada cepa de control probada, contra las cepas CECT5350 y CECT4168 de P. mirabilis. La cepa probada para la actividad antagonista contra P. mirabilis aparece a lo largo del eje horizontal; y la altura de la barra apilada corresponde al valor IC acumulativo de cada cepa probada. Por consiguiente, cada barra apilada representa la actividad IC acumulada de cada cepa probada contra las cepas CECT5350 y CECT4168 de P. mirabilis acumuladas una encima de la otra. La altura de la barra apilada resultante muestra el resultado combinado.

FIG. 6. Gráfico de Barras con Columnas Apiladas que muestra la actividad acumulativa antagonista de L. plantarum CECT8675, CECT8676, CECT8677, CECT8678, y las cepas comerciales L. plantarum P17630 L. reuteri RC-14® y L. rhamnosus GR-1® que se utilizaron como controles contra 2 cepas diferentes de E. coli. Cada barra/columna apilada es el resultado de agrupar la IC o la actividad inhibidora ("IC (mm)") medida en milímetros para cada una de las cepas probióticas citadas anteriormente, así como para cada cepa de control probada, contra las cepas CECT434 y DSM10650 de E. coli. En este gráfico, la cepa probada para la actividad antagonista contra E. coli aparece a lo largo del eje horizontal; y la altura de la barra apilada corresponde al valor IC acumulativo de cada cepa probada. Por consiguiente, cada barra apilada representa la actividad IC acumulativa de cada cepa probada contra las cepas CECT434 y DSM10650 de E. coli acumuladas una encima de la otra.

La FIG. 7 muestra la actividad antagonista global frente a los patógenos ITU más relevantes. Las cepas de la invención muestran una actividad de espectro antagonista general superior.

FIG. 8. Gráficos de Barras con Columnas para las cepas CECT8675, CECT8676, CECT8677, CECT8678 que muestran la compatibilidad de cada cepa con el extracto de arándano y con la vitamina C, ingredientes activos comúnmente utilizados para formular productos para el tratamiento de ITU en un estudio in vitro.

FIG. 9. Uso combinado de un antibiótico (fosfomicina) y probiótico (L. plantarum CECT8677) contra Staphylococcus saprophyticus. Resultados expresados como log¹⁰de las unidades de formación de colonias (UFC) por mL de S. saprophyticus cuando se incuba A) sin antibiótico o probiótico (control positivo), B) con antibiótico (fosfomicina) o C) con antibiótico (fosfomicina) y probiótico (L. plantarum CECT8677).

FIG. 10. Crecimiento de patógenos ITU en presencia o ausencia de las cepas de lactobacilos. 10A, cinética de crecimiento de Staphyloccoccus saprophyticus; 10B, cinética de crecimiento de Escherichia coli; 10C, cinética de crecimiento de Proteus mirabillis. Ae estudió la cinética de crecimiento de los patógenos A) en ausencia de probiótico como control, B) en presencia de L. plantarum CECT8675, C) en presencia de L. plantarum CECT8677 o D) en presencia de L. rhamnosus GR-1

Ejemplos

EJEMPLO 1. Aislamiento de los microorganismos

Las cepas CECT8675, CECT8676, CECT8677 y CECT8678 se aislaron a partir de heces frescas de niños de 0-9 años. Las heces se disolvieron en tampón PBS (pH 7,4), se dividieron en alícuotas y se colocaron en placas sobre MRS suplementado con diversas combinaciones de antibióticos. Las cepas se cultivaron bajo condiciones de microaerofilia (5 % de CO²) a 37 o 30 °C. El tiempo de incubación dependió de la tasa de crecimiento, pero fue normalmente de 24 horas a 3 días. El aislamiento de las cepas individuales se llevó a cabo con el mismo medio de selección, y luego se realizó la tinción de Gram para obtener una primera identificación. Una vez cultivadas, las cepas aisladas se almacenaron mediante liofilización en PBS 0,1x con leche desnatada en polvo al 15 %.

Las cepas se cultivaron inicialmente en medio MRS suplementado con 10 pg/ml de vancomicina (Sigma Chemical Co, Alemania) y se incubaron a 30 °C en condiciones anaeróbicas y pH 6,4. La tinción de Gram mostró una tinción Gram positiva clara, así como una morfología de bacilos no formadores de esporas.

EJEMPLO 2. Identificación de género y especie

La identificación a nivel de especie se realizó mediante la secuenciación del gen ARNr 16S. Brevemente, el ADN de las cepas se extrajo con resina Chelex® 100 de Bio-Rad Laboratories (Barcelona, España). La secuencia completa del gen de ARNr 16S se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante el uso los cebadores universales para eubacterias 27F y 1492R como se describió anteriormente [LANE, D.J. 16/23S rRNA sequencing. In Nucleic acid techniques in bacterial systematics (ed. Stackebrandt and Goodfellow) 1991, páginas 177-204; MUYZER, G. y otros. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Antonie van Leeuwenhoeck. 1998. Vol 73, No 1, páginas 127-141]. La integridad de los productos de PCR se comprobó en un gel de agarosa mediante el uso del colorante verde sYb R (Invitrogen, Life Technologies, Madrid, España). Los productos de PCR se secuenciaron al utilizar los cebadores 27F, 357F, 907R y 1492 [LANE, D.J. supra; MuYz ER; G. y otros. supra; OLSEN, Q.J y otros. Microbial Ecology and Evolution: A Ribosomal RNA Approach. Annual Review of Microbiology. 1986. Vol. 4, No. 1, páginas 337-365), un kit de Secuenciación de Ciclos v3.1 y un Analizador Genético 3130 XL (de Applied Biosystems, Life Technologies, Madrid, España). Las secuencias resultantes se alinearon y compararon con las presentes en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y RDP (Ribosomal Database Project, Proyecto de base de datos ribosomal). Las cepas se identificaron en función de las puntuaciones de acierto más altas.

Las cepas CECT8675, CECT8676, CECT8677 y CECT8678 se identificaron como Lactobacillus plantarum. Posteriormente las cepas se depositaron en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con los números de acceso CECT8675, CECT8676, CECT8677 y CECT8678.

Las secuencias de ARNr 16S obtenidas para las cepas CECT8675, CECT8676, CECT8677 y CECT8678, corresponden a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente.

EJEMPLO 3. Genotipado de las cepas

El genotipado de la cepa se realizó mediante la digestión genómica y la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y el ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD). La PFGE de las cepas se realizó como se describió anteriormente [RODAS, A.M. y otros. Polyphasic study of wine Lactobacillus strains: taxonomic implications. Int. J. Syst. Evol. Microbiol, 2005. Vol. 55, No. 1, páginas 197-207) al utilizar las enzimas de restricción Sfi-I y Sma-I. La RAPD se realizó de acuerdo con lo descrito por Nigatu y otros. (NIGATU, A. y otros. Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) for discrimination of Pediococcus pentosaceus and Pediococcus acidilactici and rapid grouping of Pediococcus isolates. Letters in Applied Microbiology. 1998. Vol 26, No. 6, páginas 412-6). Los patrones se compararon con L. plantarum P17630 del producto Isadin a Barcilus® como una cepa disponible comercialmente de la misma especie.

Los patrones de PFGE se representan en la FIG. 1. Puede verse claramente que el patrón de las cepas CECT8675 y CECT8677 fue diferente al de las otras cepas; mientras que el patrón de restricción de las cepas CECT8676, CECT8678 y P17630 fue muy similar entre ellas. Por lo tanto, RAPd se realizó como un método complementario para distinguir las cepas CECT8676, CECT8678 y P17630, porque es una técnica eficiente para genotipar las cepas de Lactobacillus plantarum (ver, por ejemplo, JOHANSSON, M.L. y otros. Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) for rapid typing of Lactobacillus plantarum strains. Appl. Microbiol. 1995. Vol. 21, No. 3, páginas 155-159). Los resultados se muestran en la FIG. 2 y permiten confirmar claramente que las cepas CECT8676, CECT8678 y P17630 también fueron diferentes.

EJEMPLO 4. Actividad antagonista contra los patógenos más frecuentes que causan ITU

Se estudió la capacidad de las cepas probióticas de la presente invención para inhibir el crecimiento de los patógenos más frecuentes que causan ITU, mediante la confrontación de placas de semillas de patógenos con secciones cilíndricas de las cepas probióticas. En particular, se analizaron diferentes cepas de los siguientes patógenos: Staphylococcus saprohyticus, Proteus mirabilis, Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae.

Las cepas probióticas se sembraron uniformemente en placas de agar MRS y se dejaron crecer hasta la confluencia durante 24 h a 37 °C y 5 % de CO². Las cepas de patógenos se cultivaron durante la noche en placas de TSA (Tripticasa Soya Agar) a 37 °C y 5 % de CO². Se usaron colonias aisladas de estos patógenos para preparar las suspensiones en medio de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se frotaron uniformemente en placas de TSA. Inmediatamente las secciones cilíndricas de 6 mm de diámetro de la placa de agar confluente de las cepas probióticas probadas se colocaron carril a carril en la placa sembrada con patógenos, lo cual permitió la confrontación de la placa sembrada con patógenos con el lado de agar crecido de una de las secciones cilíndricas y con el lado no crecido de la otra sección del cilindro y se incubó durante la noche a 37 °C y 5 % de CO². Luego, se midieron las zonas de inhibición al colocar la placa de agar sobre una regla plana. A continuación, se calculó la actividad inhibidora del crecimiento (IC) al restar el diámetro del cilindro (DC) al diámetro de la zona de inhibición (DZI) medido en milímetros y se dividió esta diferencia por 2, de acuerdo con la fórmula IC = (DZI-DC)/ 2. La actividad inhibidora final se calculó como un valor medio de los valores de IC para las dos secciones de cilindro mencionadas anteriormente para cada cepa probiótica, es decir, al promediar los duplicados. Los valores inferiores a 0,5 mm se consideraron sin inhibición (n.i.). Todos los experimentos se realizaron por triplicados.

Los resultados se detallan en las siguientes secciones 4.1 a 4.3 y en las Tablas 1-3. Con fines ilustrativos, se usaron los siguientes códigos de actividad en dichas Tablas: "-" significa IC<0,5 (= inhibición no cuantificable); "+" significa 0,5<IC<1; "++" significa 1 <IC<2; "+++" significa 2<IC<3; y "++++" significa IC>3. Finalmente, "n.r." significa "Valor no informado".

En consecuencia, el producto Isadin a Barcilus® se ha utilizado como referencia para comparar el rendimiento probiótico de Lactobacillus utilizado para restaurar el equilibrio microbiano del ecosistema vaginal. Como se muestra en las TABLAS 1-3, la cepa probiótica L. plantarum P17630 de Isadin a Barcilus® administrada por vía oral, la cual se ha demostrado que es eficaz en la restauración de la flora vaginal de lactobacilos y la reducción de su colonización por bacterias potencialmente patógenas, no es eficaz en la reducción de la recurrencia de ITU, en vista de la falta de actividad antagonista contra los agentes patógenos ITU, S. saprophyticus, P. mirabilis y E. coli. Por tanto, un probiótico comercial compuesto por una cepa de Lactobacillus, en particular, la cepa L. plantarum P 17630, en otras palabras, un lactobacillus de la misma especie que el de las cepas de la presente invención no ha revelado un efecto antagonista contra los patógenos causantes de ITU. Finalmente, el alimento probiótico comercial VSL #3 para el tratamiento dietético de pacientes con colitis ulcerosa, IBS, etc., que comprende también cepas de lactobacilos, no ha descrito la actividad antagonista de las cepas de la presente invención.

4.1. Actividad antagonista contra Staphylococcus saprophyticus

Se probaron cepas de lactobacilos frente a tres cepas de S. saprophyticus (CECT235, DSM4853 y DSM4852). Como se muestra en la TABLA 1, todas las cepas CECT8675, CECT8676, CECT8677 y CECT8678 de la presente invención mostraron actividad antagonista contra las tres cepas probadas de S. saprophyticus. En contraste, la cepa comercial L. reuteri RC-14® no mostró inhibición contra ninguna de las tres cepas probadas de S. saprophyticus. La cepa L. rhamnosus GR-1® pudo inhibir el crecimiento de solo una de las tres cepas probadas de S. saprophyticus; y las cepas comerciales L. plantarum P17630 y VSL #3 no pudieron inhibir una de las tres cepas de S. saprophyticus.

TABLA 1

La FIG. 3 muestra la actividad acumulativa antagonista frente a las cepas de S. saprophyticus de las cepas de la invención y de las cepas probióticas comerciales L. plantarum P17630, L. reuteri RC-14® y L. rhamnosus GR-1®. Las cuatro cepas de la invención mostraron una mayor actividad contra S. saprophyticus en comparación con las cepas comerciales.

La FIG. 4 muestra los halos (también conocidos como placas o zonas de inhibición) contra S. saprophyticus tanto de las cepas de la invención como de las cepas comerciales utilizadas como controles. Como se muestra en la FIG. 4 los tamaños más grandes de los halos se obtuvieron para las cepas de la invención, la actividad antagonista más potente de las cepas de la invención en comparación con las cepas comerciales utilizadas para comparar.

4.2. Actividad antagonista contra Proteus m irabilis

Se probaron las cepas de lactobacilos frente a dos cepas de P. mirabilis (CECT5350 y CECT4168).

Como se muestra en la TABLA 2 a continuación, todas las cepas probadas de la presente invención mostraron una actividad antagonista contra las dos cepas probadas de P. mirabilis. Este fue también el caso de L. plantarum P17630. Sin embargo, como se muestra en la FIG. 5, la actividad antagonista acumulativa de las cepas de la invención fue mayor que la de P17630. La cepa comercial L. reuteri RC-14® no mostró actividad antagonista.

TABLA 2

4.3. Actividad antagonista contra Escherichia co li y Klebsiella pneumoniae

Las cepas de lactobacilos se probaron frente a dos cepas de E. coli (CECT434 y DSM10650) y la cepa de K. pneumonia DSM11678.

Como se muestra en la TABLA 3, todas las cepas de la presente invención mostraron una actividad antagonista contra las dos cepas de E. coli ensayadas. Este no fue el caso de las otras cepas comerciales comúnmente utilizadas para tratar las enfermedades vaginales, las cuales inhibieron una o ninguna de las cepas de E. coli probadas. Esto demuestra que aunque estas cepas comerciales pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades tales como la vaginitis (L. plantarum P17630) y vaginosis (L. rhamnosus GR-1® y L. reuteri RC-14®), no son necesariamente eficaces para el tratamiento de ITU. La FIG. 6 representa la mayor actividad antagonista acumulativa contra las dos cepas de E. coli de las cepas de la invención en comparación con las cepas comerciales. Ventajosamente, todas las cepas de la presente invención también mostraron una actividad antagonista frente a la cepa de K. pneumoniae ensayada, lo cual no fue el caso de L. rhamnosus GR-1® y L. reuteri RC-14®.

TABLA 3

EJEMPLO 5. Compatibilidad de las cepas con el tratamiento antibiótico de la ITU

Se evaluó in vitro la capacidad de las cepas CECT8675, CECT8676, CECT8677 y CECT8678 de crecer en presencia de la fosfomicina, la cual se utiliza como terapia antibiótica de primera línea para el tratamiento de ITU. Se estudió la concentración inhibitoria mínima (CIM) de la fosfomicina para dichas cepas de acuerdo con la norma ISO 10932: 2010 (IDF 223: 2010) Leche y productos lácteos - Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) de los antibióticos aplicables a las bifidobacterias y a las bacterias de ácido láctico no enterocócicas (LAB) 2010) para concentraciones de hasta 1024 mg/L. El crecimiento de las cuatro cepas ensayadas no se inhibió por la presencia de la fosfomicina.

De manera similar, se estudió la tolerancia de las cepas a la norfloxacina, una fluoroquinolona sintética de primera generación que se usa ocasionalmente para tratar las ITU comunes y complicadas, mediante la misma metodología. El crecimiento de todas las cepas no se inhibió en concentraciones tan altas como 1000 mg/L.

EJEMPLO 6. Compatibilidad con los ingredientes activos utilizados para tratar las ITU

Se estudió la compatibilidad de las cepas de la invención con los ingredientes activos comúnmente utilizados para formular productos para el tratamiento de las ITU tales como el arándano y la vitamina C, in vitro.

Se prepararon diluciones que contenían 3 mg/mL de extracto de arándano (titulado en proantocianidina > 50 % de acuerdo con la Farmacopea Europea) o 1 mg/mL de vitamina C en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH=7,4) y se esterilizaron por filtración a través de 0,22 pl. Se añadió un mililitro de estas soluciones a 8 mL de medio de cultivo estéril Man, Rogosa y Sharpe (MRS). Se usó la misma cantidad de PBS sin ingredientes activos como control. Luego, también se añadió al medio un mililitro de cultivos crecidos durante la noche de las cepas de la invención (estandarizados a una concentración equivalente a un valor de McFarland de 1). Las cepas se incubaron a continuación durante 24 horas a 37 °C en 5 % de CO². El número de células viables en el medio se determinó en el tiempo 0 h y después de 24 h mediante el recuento en placa en medio sólido MRS.

Como puede verse en la FIG. 8 todas las cepas pudieron crecer en el mismo rango independientemente de la presencia de los ingredientes activos, extracto de arándano y vitamina C, lo cual no inhibió el crecimiento de ninguna de las cepas CECT8675, CECT8676, CECT8677 y CECT8678, entre las cuales, las cepas CECT8675 y CECT8677 fueron los que mostraron mayor capacidad de crecimiento.

EJEMPLO 7. Formación de agregados

La capacidad de autoagregación es una de las etapas iniciales que conducen a la formación de biopelículas protectoras contra los patógenos. La capacidad para formar agregados se evaluó mediante el control de la disminución de la densidad óptica a 620 nm de los cultivos durante la noche debido a la formación de agregados y la precipitación. El valor porcentual de la capacidad de agregación (% AC) se obtuvo mediante el uso de la siguiente fórmula: %AC=(1(DOtf/DOt0)/100, donde DOtf y DOt⁰son la densidad óptica en los tiempos final e inicial, respectivamente. La DO en los tiempos iniciales se ajustó de modo que todos los cultivos contenían un número equivalente de ufc/ml. Los cultivos combinados se prepararon mediante la mezcla de una cantidad apropiada de cepas individuales para obtener el total deseado de ufc/ml que contenía el 50 % de cada cepa.

Los resultados, como se muestra en la Tabla 4 a continuación, revelaron una buena capacidad de agregación para las cepas CECT8675, CECT8676 y CECT8677, que eran aproximadamente 2 veces más altas que las de las cepas VSL #3 y L. plantarum P17630.

TABLA 4. Capacidad de agregación (%)

EJEMPLO 8. Producción de Ácidos Grasos de Cadena Corta (AGCC)

La producción de AGCC se ensayó al incubar las cepas en medio basal suplementario con fibras cada una (inulina, pectina y fructooligosacáridos) en una cantidad específica, en condiciones de microaerofilia (5 % CO²) a 37 °C. La cantidad de AGCC se determinó mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) como se describió anteriormente [BOSCH, M. y otros. Lactobacillus plantarum CECT7527, 7528 and 7529: probiotic candidates to reduce cholesterol levels. J. Sci. Food Agric. 2014. Vol 94, No. 15, páginas 803-809].

Todas las cepas pudieron producir butirato. La mayor producción se observó para las cepas CECT8677 y CECT8678, seguidas de las cepas CECT8676 y CECT8675. Todas las cepas fueron mejores productoras de butirato que L. plantarum P17630.

EJEMPLO 9. Capacidad para sobrevivir a enfermedades gastrointestinales y vaginales

Con el fin de evaluar la resistencia de las cepas CECT8675, CECT8676, CECT8677 y CECT8678 al tracto gastrointestinal (TGI), se realizaron ensayos en condiciones que imitan el entorno del TGI de los mamíferos. De este modo, se cuantificó la supervivencia después del tratamiento con lisozima, peróxido de hidrógeno, ambiente ácido y sales biliares.

Se colocaron veinte mililitros de cultivos probióticos crecidos durante la noche de cada cepa en una placa de 96 pocillos que contenía 200 pL de medio MRS suplementado con 300 pg/ml de lisozima (Condición de lisozima en la Tabla 5), MRS suplementado con 30 pg/ml de H²O²(Condición de peróxido de hidrógeno en la Tabla 4), MRS suplementado con 0,3 % (p/v) de sales biliares (SIGMA B8756-10G, 096K1213) (Condición de peróxido de hidrógeno en la Tabla 5) o medio MRS ajustado a pH 2 (Ambiente ácido en la Tabla 5). La relación de supervivencia se determinó para cada cepa mediante la medición del aumento de la densidad óptica a 620 nm en un lector de ELISA después de un tiempo de incubación entre 0 y 6 horas, y se expresó como el porcentaje de crecimiento en comparación con el de la cepa correspondiente en MRS no suplementado (utilizado como control positivo). Los resultados se muestran en la Tabla 5 a continuación.

TABLA 5. Relación de supervivencia a las condiciones de TGI (%)

Todas las cepas pudieron crecer en las diferentes condiciones de TGI ensayadas.

Además, para evaluar la resistencia de las cepas CECT8675, CECT8676, CECT8677 y CECT8678 al ambiente vaginal, se realizaron ensayos en donde dichas cepas se incubaron en medio que simulaba el fluido vaginal. El simulador de fluido vaginal utilizado fue el descrito por Owen y otros. [OWEN, D.H. y otros. A vaginal fluid simulan! Contraception. 1999. Vol. 59, No. 2, páginas. 91-95] a la cual se añadió lisozima (4-16 mg/L). La composición final de dicho simulador de fluidos vaginales es de 3,5 g/l de NaCl, 1,4 g/l de KOH, 0,22 g/l de Ca(OH)², 0,02 g/l de BSA, 2 g/l de ácido láctico, 1 g/l de ácido acético, 0,16 g/l de glicerol, 0,4 g/l de urea y 5 g/l de glucosa; el pH se ajustó adicionalmente a 4,2 al utilizar ácido láctico. Las cepas se incubaron a 37 °C y 5 % de CO².

Todas las cepas CECT8675, CECT8676, CECT8677 y CECT8678 también pudieron crecer en el fluido vaginal. Por lo tanto, se confirmó que todas las cepas pueden vencer el TGI y urogenital y de este modo ejercer su efecto beneficioso en las ubicaciones deseadas del cuerpo.

EJEMPLO 10. Efecto combinado de la fosfomicina y las cepas probióticas

El objetivo fue estudiar la capacidad de las cepas probióticas de la presente invención para incrementar la eficacia de la fosfomicina para inhibir los patógenos asociados con ITU. Se determinó la actividad contra Staphylococcus saprophyticus. Se prepararon los cultivos de S. saprophyticus CECT235 y de la cepa probiótica L. plantarum CECT8677 en medio Triptona Soya Agar (TSA) y medio Man, Rogosa y Sharpe (MRS), respectivamente, en placa durante la noche. Después del crecimiento durante la noche de ambas bacterias, se prepararon suspensiones de S. saprophyticus y CECT8677 estandarizadas a 3E+06 CFU/mL en solución salina tampón fosfato 0,1 M (PBS).

Luego, se prepararon tubos de acuerdo con las siguientes condiciones experimentales:

1) Control positivo: Tubo que contiene 7 mL de medio IST 2 mL de PBS 1 mL de la suspensión de S. saprophyticus previamente preparada.

2) Tratamiento antibiótico: Tubo que contiene 7 mL de medio IST 1 mL de PBS 1 mL de fosfomicina (concentración final de 1 mg/L en el tubo) 1 mL de la suspensión de S. saprophyticus previamente preparada. 3) Tratamiento combinado: Tubo que contiene 7 mL de medio IST 1 mL de fosfomicina (concentración final de 1 mg/L en el tubo) 1 mL de suspensión probiótica (CECT8677) previamente preparada 1 mL de la suspensión de S. saprophyticus previamente preparada.

El medio IST consistió en 11 g de caseína hidrolizada, 3 g de peptona, 2 g de glucosa, 3 g de cloruro de sodio, 1 g de almidón soluble, 2 g de hidrogenofosfato disódico, 1 g de acetato de sodio, 0,2 g de magnesio, glicerofosfato, 0,1 g de gluconato de calcio, 0,001 g de sulfato de cobalto (II), 0,001 de sulfato de cobre (II), 0,001 g de sulfato de zinc, 0,001 g de sulfato de hierro (II), 0,002 g de cloruro de manganeso (II), 0,001 g de menadiona, 0,001 g de cianocobalamina, 0,02 g de clorhidrato de L-cisteína, 0,02 g de L-triptófano, 0,003 g de pirodoxina, 0,003 g de pantotenato, 0,003 g de nicotinamida, 0,0003 g de biotina, 0,00004 g de tiamina, 0,01 g de adenina, 0,01 g de guanina, 0,01 g de xantina, 0,01 g de uracilo y agua hasta 1 L.

Los tubos se incubaron a 37 °C en CO²al 5 % y se tomaron alícuotas de 1 mL en tiempos de 10 h y 24 h para el recuento en la placa. Se utilizó una alícuota para el recuento en la placa en medio de agar IST con el fin de contar el número total de bacterias presentes en el tubo. Se utilizó otra alícuota para el recuento en la placa en agar MRS que contenía 16 pg/mL de vancomicina para el recuento específico de bacterias probióticas. En los tubos que contenían tanto S. saprophyticus como CECT8677, la concentración de S. saprophyticus se determinó al restar el número de bacterias probióticas al recuento total de bacterias en medio IST.

Los resultados se presentan en la FIG. 9. Como se muestra en la misma, la presencia de fosfomicina no fue suficiente para reducir significativamente la concentración de S. saprophyticus. Sin embargo, cuando también se añadió el probiótico, la presencia de S. saprophyticus se redujo drásticamente. Por lo tanto, el uso combinado de antibióticos y probióticos puede considerarse una opción de manejo eficaz para tratar las infecciones por S. saprophyticus.

EJEMPLO 11. Formulación del producto en cápsulas

Las cápsulas se formularon al combinar 100 mg de las cepas probióticas liofilizadas CECT8675 y CECT8677 (1-2E+09 ufc por cápsula), 240 mg de extracto de arándano, 40 mg de vitamina C (ácido ascórbico), 70 mg de maltodextrina. Las cápsulas eran de hidroxipropil metilcelulosa (en esta descripción se hace referencia como aglutinante) y dióxido de titanio (E7171) (pigmento).

EJEMPLO 12. Formulación del producto en parches

Los parches se formularon al combinar 100 mg de las cepas probióticas liofilizadas CECT8675 y CECT8677 (1-2E+09 ufc por parche), 50 mg de extracto de arándano, 40 mg de vitamina C (ácido ascórbico) y 70 mg de maltodextrina (en esta descripción referida como aditivo).

EJEMPLO 13. Formulación del producto en viales

El producto probiótico combina los ingredientes presentes en un tapón de administración y un vial. Los tapones de administración contenían 100 mg de las cepas probióticas liofilizadas CECT8675 y CECT8677 (1-2 E+09 ufc por tapón de suministro), estearato de magnesio (2,2 mg) (en esta descripción, referido como agente antiaglomerante y antiadherente) y dióxido de silicio (0,5 mg) (referido en esta descripción como agente antiaglutinante). El vial contiene 10 mL de agua y 250 mg de extracto de arándano, 0,2 mg de ácido sórbico (conservante), sabor a fresa (0,2 mg), ácido cítrico (0,05 mg) y sucralosa 3 mg (edulcorante).

EJEMPLO 14. Estudio longitudinal de la actividad antagónica de las cepas

La actividad antagonista de la cepa de lactobacilos también se estudió en medios líquidos para tener información detallada de su actividad contra los patógenos ITU más comunes a lo largo del tiempo. Se inocularon tubos que contenían 7 mL de medio líquido más sensible a ISO (IST) suplementado con 10 g/L de glucosa con 1 mL de PBS que contenía 1E 05 UFC/mL de patógeno. Las cepas patógenas utilizadas en este ensayo fueron S. saprophyticus CECT235, E. coli CECT5350 y P. mirabilis CECT434.

Posteriormente, los tubos se inocularon con 1 mL de PBS que contenía 1E 07 CFU/mL de probiótico. Como control se utilizaron tubos inoculados con la misma cantidad de PBS, pero que no contenían probióticos. Las cepas de lactobacilos estudiadas fueron L. plantarum CECT 8675 y CECT 8677 y L. rhamnosus GR-1. La actividad antagonista de las cepas de lactobacilos contra S. saprophyticus se representa en la FIG. 10 A. Los resultados demuestran que la adición de los lactobacilos al medio redujo la cantidad de células vivas de S. saprophyticus en comparación con el medio de control que no contenía probióticos. Entre las diferentes cepas probióticas ensayadas, tanto L. plantarum CECT 8675 como CECT 8677 mostraron la mayor actividad antimicrobiana, y fueron las que redujeron con mayor eficiencia la concentración de S. saprophyticus después de 48h. De manera notable, L. plantarum CECT8677 pudo reducir la concentración de patógeno incluso durante las primeras 24 h, mientras que L. plantarum CECT8677 pudo erradicar la presencia de S. saprophyticus en el medio después de 48 h.

Todos los lactobacilos probados también pudieron reducir el crecimiento de E. coli (FIG. 10B). En este caso todas las cepas mostraron un efecto bacteriostático durante las primeras 24 horas y una leve actividad bactericida después de este período. La cepa L. plantarum CECT8677 fue la que mostró la mayor actividad antimicrobiana.

La actividad antagonista de las cepas de lactobacilos contra P. mirabillis se representa en la FIG. 10C. Las cepas L. plantarum CECT8675 y CECT8677 fueron las cepas que mostraron la mayor actividad durante las primeras 24 h. Luego de este período L. plantarum CECT8677 fue la cepa con mayor efecto antimicrobiano, la cual redujo la presencia de P. mirabilli a concentraciones aún menores a las del inicio del ensayo.

En resumen, los resultados confirman que tanto L. plantarum CECT8675 como CECT8677 muestran una buena actividad frente a los patógenos ITU, por lo cual son buenos candidatos para el tratamiento de enfermedades asociadas.

EJEMPLO 15. Fermentación y postratamiento de las cepas

La biomasa post-tratamiento utilizada como materia prima se obtuvo mediante un proceso de fabricación que incluyó las etapas de fermentación y liofilización. Se preparó un cultivo madre al inocular 80 mL de medio de cultivo ^mR^scon las cepas de L. plantarum. El medio inoculado se fermentó a 37 °C en condiciones de microaerofilias durante 48 h. El cultivo resultante se usó para inocular 600 litros de medio de cultivo MRS en una relación de aproximadamente 1-2 % de inóculo por volumen total de medio de caldo. El medio resultante se enfrió a 3-5 °C y se centrifugó para eliminar la mayor parte del agua presente en el caldo. Se añadieron crioprotectores al cultivo concentrado y la mezcla resultante se liofilizó a -45 °C.

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EP 1137423 B1 (UREX BIOTECH, INC.) 04.10.2001, reivindicación 4.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende una cantidad eficaz de al menos una cepa de Lactobacillus plantarum, en donde al menos la cepa de Lactobacillus plantarum se selecciona del grupo que consiste en: la cepa CECT8675, la cepa CECT8676, la cepa CECT8677, la cepa CECT8678 y un mutante de cualquiera de las cepas depositadas, en donde el mutante se obtuvo mediante el uso de la cepa depositada como material de partida y mediante mutagénesis, y en donde el mutante obtenido retiene o potencia al menos la capacidad de la cepa depositada de antagonizar el patógeno urogenital Staphylococcus saprophyticus.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde al menos la cepa de Lactobacillus plantarum se selecciona del grupo que consiste en: la cepa CECT8675, la cepa CECT8676, la cepa CECT8677 y la cepa CECT8678.

3. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde al menos la cepa se ha fermentado en un medio artificial y sometida a un postratamiento después de la fermentación, para obtener células bacterianas, y en donde las células bacterianas resultantes están en un medio líquido o en una forma sólida.

4. La composición de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el postratamiento se selecciona del grupo que consiste en: secado, congelación, liofilización, secado en lecho fluido, secado por aspersión y refrigeración en medio líquido.

5. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para su uso como medicamento o como probiótico.

6. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 5 en la prevención y/o tratamiento de una enfermedad relacionada con alteraciones de la microbiota urogenital.

7. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la enfermedad es una infección del tracto urinario.

8. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en combinación con una cantidad eficaz de un agente antimicrobiano.

9. Un producto farmacéutico, un producto veterinario, un alimento médico, un producto alimenticio, un suplemento alimenticio o un producto de higiene personal, que comprende una cantidad eficaz de la composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-8, junto con cantidades apropiadas de excipientes aceptables.