ES2568955T3 - Microorganismos metabólicamente activos y métodos para su producción - Google Patents

Microorganismos metabólicamente activos y métodos para su producción Download PDF

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Abstract

Una preparación que comprende bacterias acidolácticas viables metabólicamente activas y un sustrato de crecimiento que comprende una mezcla de oligosacáridos y polisacáridos, y monosacáridos y disacáridos, proteínas y péptidos, donde la bacteria en la preparación presenta un estado de crecimiento casi en equilibrio caracterizado por que la población de bacterias se mantiene en el intervalo de 108 a 109 células viables por mililitro cuando se almacena a aproximadamente 4 ºC y a pH controlado en el intervalo de 3,8-4,5 durante un periodo de al menos 5 meses, donde la cantidad total de azúcares está en el intervalo de entre 20 mg/ml a 40 mg/ml y donde la cantidad total de azúcares reductores está en el intervalo de entre 5 mg/ml a 20 mg/ml cuando se mide utilizando el método de Nelson-Somogyi, y donde las bacterias acidolácticas comprenden Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei y Enterococcus faecium.

Description

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DESCRIPCION
Microorganismos metabolicamente activos y metodos para su produccion Campo de la invencion
La invencion se refiere a una preparacion de bacterias metabolicamente activas, y a sus usos, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades. La invencion se refiere tambien a un sustrato de crecimiento para microorganismos que comprende una mezcla de azucares simples y complejos y a un proceso para la fabricacion de preparaciones de microorganismos metabolicamente activos usando este sustrato de crecimiento.
Antecedentes de la invencion
Los organismos microbiologicos se usan frecuentemente como suplementos alimenticios. Un ejemplo son las bacterias probioticas, que se sabe que tienen efectos beneficiosos sobre la microflora intestinal aumentando la resistencia a enfermedades infecciosas tales como la diarrea. Los probioticos tambien han mostrado estar implicados en la modificacion de la qmmica de la sangre y en la inmunomodulacion (veanse las referencias citadas en el apartado de Beneficios potenciales para la salud en la seccion de referencias).
Las bacterias probioticas se pueden encontrar en productos lacteos tales como yogur y las especies conocidas por tener beneficios para la salud incluyen las de los generos Enterococcus y Lactobacillus. Sin embargo, los productos lacteos probioticos tienen una vida media corta. Los probioticos tambien estan disponibles para el consumidor en la forma de polvos o comprimidos. Una aplicacion adicional de los probioticos se refiere al uso en alimentacion animal.
Los metodos actuales para almacenar cultivos bacterianos usan normalmente la liofilizacion, denominada tambien criodesecacion. En este proceso, se elimina el agua del organismo mediante sublimacion y el organismo se puede revivir tras la adicion de agua. Sin embargo, las bacterias criodesecadas no son metabolicamente activas y se sabe bien que los productos criodesecados pierden normalmente mucho de su resiliencia tras unas pocas semanas de almacenamiento a temperatura ambiente (Fonseca y col. y Murga y col).
Ademas, muchos probioticos comerciales no parecen contener todas las especies mencionadas en las etiquetas y, cuando las bacterias estan presentes, las cantidades de bacterias viables son a menudo muy bajas (J. Hamilton- Miller).
Los presentes inventores han determinado ahora que pueden prepararse preparaciones estables de bacterias viables metabolicamente activas mediante el uso de un sustrato de crecimiento concreto que contiene cantidades equilibradas de hidratos de carbono complejos y simples. En contraste con los probioticos de la tecnica anterior, las preparaciones proporcionadas de acuerdo con la presente invencion, comprenden cantidades elevadas de bacterias estables y activas que se pueden mantener durante un almacenamiento a largo plazo. Charalampopoulos y col. (lnt J Food Microbiol. 25 de abril de 2003;82(2):133-41) describen el nivel de azucares reductores en extractos de cereales y evaluan el efecto de los constituyentes de cereales sobre la supervivencia de celulas bacterianas.
Descripcion de la invencion
En un primer aspecto, la invencion proporciona una preparacion que comprende bacterias acidolacticas viables metabolicamente activas y un sustrato de crecimiento que comprende una mezcla de oligosacaridos y polisacaridos, y monosacaridos y disacaridos, protemas y peptidos, donde la bacteria en la preparacion presenta un estado de crecimiento casi en equilibrio caracterizado por que la poblacion de bacterias se mantiene en el intervalo de 108 a 109 celulas viables por mililitro cuando se almacena a aproximadamente 4 °C y a pH controlado en el intervalo de 3,8-4,5 durante un periodo de al menos 5 meses, donde la cantidad total de azucares esta en el intervalo de entre 20 mg/ml a 40 mg/ml y donde la cantidad total de azucares reductores esta en el intervalo de entre 5 mg/ml a 20 mg/ml cuando se mide utilizando el metodo de Nelson-Somogyi, y donde las bacterias acidolacticas comprenden Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei y Enterococcus faecium.
En un segundo aspecto, la invencion proporciona un sustrato de crecimiento para las bacterias acidolacticas que comprende una mezcla de oligosacaridos y polisacaridos, y monosacaridos y disacaridos donde la cantidad total de azucares esta en el intervalo de 20 mg/ml a 40 mg/ml y la cantidad total de azucares reductores esta en el intervalo de 5 mg/ml a 20 mg/ml cuando se mide usando el metodo de Nelson-Somogyi.
En un tercer aspecto, la invencion proporciona un metodo para preparar una preparacion estable y metabolicamente activa de bacterias acidolacticas que comprende: hacer crecer bacterias acidolacticas en un sustrato de crecimiento que comprende una mezcla de oligosacaridos y polisacaridos, y monosacaridos y disacaridos, protemas y peptidos para obtener una preparacion de bacterias acidolacticas, donde la cantidad total de azucares en el sustrato de crecimiento esta en el intervalo de 20 mg/ml a 40 mg/ml y donde la cantidad total de azucares reductores en el sustrato de crecimiento esta en el intervalo de 5 mg/ml a 20 mg/ml cuando se mide usando el metodo de Nelson- Somogyi, y enfriar la preparacion resultante a aproximadamente 4 °C, donde las bacterias acidolacticas adoptan un
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estado proximo a| equi|ibrio caracterizado por que |a poblacion de bacterias acidolacticas en |a preparacion se puede mantener en el intervalo de 10 a 10 celulas viables por mililitro cuando se almacena a aproximadamente 4 °C y a pH controlado en el intervalo de 3,8 a 4,5 durante un periodo de al menos 5 meses, donde las bacterias acidolacticas comprenden Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei y Enterococcus faecium, opcionalmente, almacenar la preparacion a aproximadamente 4 °C.
En un cuarto aspecto, la invencion proporciona un metodo para preparar una preparacion estable y metabolicamente activa de bacterias acidolacticas que comprende: anadir bacterias acidolacticas a un sustrato de crecimiento que comprende una mezcla de oligosacaridos y polisacaridos, y monosacaridos y disacaridos, protemas y peptidos, para formar una preparacion de microorganismos, donde la cantidad total de azucares en el sustrato de crecimiento esta en el intervalo de 20 mg/ml a 40 mg/ml y donde la cantidad total de azucares reductores en el sustrato de crecimiento esta en el intervalo de 5 mg/ml a 20 mg/ml, cuando se mide utilizando el metodo de Nelson-Somogyi, y donde las bacterias acidolacticas se anaden al sustrato de crecimiento a una concentracion que proporciona un estado de crecimiento proximo al equilibrio caracterizado por que la poblacion de bacterias acidolacticas en la preparacion se puede mantener en el intervalo de 108 a 109 celulas viables por mililitro cuando se almacenan a aproximadamente 4 °C y a un pH controlado en el intervalo de 3,8 a 4,5 durante un periodo de al menos 5 meses, donde las bacterias acidolacticas comprenden Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei y Enterococcus faecium y, opcionalmente, almacenar la preparacion a aproximadamente 4 °C.
En un quinto aspecto, la invencion proporciona el uso de una preparacion metabolicamente activa y estable de bacterias de acuerdo con el primer aspecto en la fabricacion de un medicamento para su uso en el tratamiento de un trastorno que afecta el equilibrio microbiano intestinal en un sujeto mairnfero.
En un sexto aspecto, la invencion proporciona el uso de una preparacion metabolicamente activa y estable de bacterias de acuerdo con el primer aspecto en la fabricacion de un medicamento para su uso en el mantenimiento del equilibrio microbiano intestinal en un sujeto mamffero.
Es una caractenstica esencial de la invencion que, en la preparacion, el cultivo bacteriano se pueda mantener en un estado de equilibrio durante al menos 5 meses a 4° a pH controlado. En este estado, la tasa de multiplicacion bacteriana se mantiene cercana a la tasa de muerte. En una realizacion preferida, la poblacion de bacterias metabolicamente activas en el estado proximo al equilibrio se mantiene en el intervalo de 108 a 109 celulas viables por mililitro.
El sustrato de crecimiento comprende una mezcla de hidratos de carbono complejos y simples (azucares). Como se usa en el presente documento, las expresiones "hidratos de carbono complejos" o "azucares complejos" incluyen oligosacaridos y polisacaridos, mientras que las expresiones "hidratos de carbono simples" o "azucares simples" incluyen monosacaridos y disacaridos.
La cantidad total de azucares en los sustratos de crecimiento esta el intervalo de 20 mg/ml a 40 mg/ml y la cantidad total de azucares reductores esta en el intervalo de 5 mg/ml a 20 mg/ml. En una realizacion preferida, la concentracion de azucares totales es de aproximadamente de 30 mg/ml y la concentracion de azucares reductores es de aproximadamente de 10 mg/ml.
El sustrato de crecimiento comprende tambien componentes de protemas y peptidos. Normalmente, la cantidad total de protemas y peptidos presentes en el sustrato esta en el intervalo de 1 mg/ml a 2 mg/ml y la cantidad total de peptidos de alto peso molecular (peso molecular mayor de 5000 daltons) esta en el intervalo de 100 jg/ml a 300 |jg/ml. En una realizacion espedfica, la concentracion de protemas y peptidos puede ser de aproximadamente 2 mg/ml y la concentracion de peptidos de alto peso molecular puede ser de aproximadamente 250 jg/ml.
El sustrato de crecimiento puede incluir componentes adicionales tales como, por ejemplo, celulosa, almidon, p- glucanos, pentosanos, polifenoles, acidos ribonucleicos, lfpidos, fosfatos, flavonoides, aminoacidos, vitaminas (B1, B2, C y E), silicatos y elementos traza.
En una realizacion preferida, el sustrato de crecimiento se deriva de granos de cereales malteados. Lo mas preferiblemente, el sustrato de crecimiento se prepara utilizando el proceso descrito mas adelante en el presente documento.
La invencion presenta una ventaja sobre las preparaciones probioticas actuales ya que las bacterias metabolicamente activas se pueden almacenar durante muchos meses sin deterioro o perdida de actividad. Las preparaciones de bacterias criodesecadas que se usan actualmente de manera normal contienen pocas, si acaso, bacterias metabolicamente activas. Ademas, las preparaciones de bacterias criodesecadas pierden algunas de sus caractensticas y la actividad tras la rehidratacion. Tambien, las bacterias reactivadas tienen una vida media corta y solamente se pueden mantener en almacenamiento durante un tiempo corto. Las bacterias criodesecadas frecuentemente no se rehidratan antes de su uso en un hospedador animal. Si se rehidratan, generalmente deben utilizarse en el mismo dfa; de los contrario, pueden perder rapidamente su viabilidad y se deterioran por organismos contaminantes.
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Un problema adicional con las preparaciones criodesecadas de la tecnica anterior es que son higroscopicas (atraen la humedad del aire) y, por tanto, un envase ha de utilizarse en un plazo de pocos dfas tras la apertura, de otra forma, la hidratacion parcial producina una rapida perdida de la viabilidad.
La preparacion de acuerdo con la invencion evita los anteriores problemas relacionados asociados con el uso de cultivos bacterianos criodesecados. Ademas, los inventores tambien han demostrado que los cultivos bacterianos preparados de acuerdo con la invencion son significativamente mas robustos que las bacterias preparadas mediante los metodos conocidos en la tecnica anterior, lo que permite a las bacterias establecerse mas rapidamente en animales hospedadores y tolerar el ambiente diffcil del tracto digestivo de los mairnferos (ilustrado en el ejemplo 5).
Los inventores han superado los problemas de las preparaciones convencionalmente usadas utilizando un sustrato de crecimiento con el suministro de nutrientes equilibrado en la forma de azucares, protemas y peptidos complejos y simples, junto con un pH controlado y almacenamiento en fno. En estas condiciones, se produce un crecimiento lento continuo de bacterias en la preparacion. La combinacion de temperatura, pH, crecimiento en fases y sustrato impone un estado de crecimiento proximo al equilibrio, por el cual se pueden mantener altas concentraciones de bacterias viables metabolicamente activas durante periodos de al menos 5 meses.
En una realizacion, el pH de la preparacion cuando se almacena se mantiene en el intervalo de 3,8 a 4,5. En una realizacion espedfica, el pH de la preparacion se mantiene a aproximadamente 4,0 durante el almacenamiento. El pH de la preparacion puede controlarse convenientemente mediante la adicion de un tampon adecuado o una combinacion de agentes tamponantes. Los tampones preferidos incluyen, por ejemplo, tampones de citrato trisodico o fosfato. El uso de tampones, tales como citrato trisodico o fosfato, se describe en los metodos normalizados en la tecnica.
Las bacterias de la preparacion son bacterias acidolacticas. La expresion "bacteria acidolactica (LAB)" como se usa en el presente documento, describe un grupo de bacterias anaerobias no motiles, catalasa negativas, Gram positivas. Este grupo incluye los generos Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus, Bifidobacterium, y Enterococcus.
De acuerdo con la invencion, se usa una combinacion de Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei.
La preparacion puede comprender adicionalmente un agente antifungico, tal como por ejemplo, sorbato de potasio esterilizado y/o un antioxidante, tal como vitamina C.
En un segundo aspecto, la invencion tambien proporciona un sustrato de crecimiento para microorganismos (especialmente bacterias) que comprende una mezcla compleja de hidratos de carbono. El sustrato de crecimiento comprende una mezcla de azucares simples y complejos, incluyendo monomeros, dfmeros, oligomeros y polfmeros de azucares.
Las caractensticas del sustrato de crecimiento son sustancialmente como se ha descrito anteriormente en relacion con el primer aspecto de la invencion. De esta manera, la cantidad total de hidratos de carbono (azucares simples sumados a los complejos) presentes en el sustrato de crecimiento esta en el intervalo de 20 mg/ml a 40 mg/ml, mas preferentemente en el intervalo de 25 mg/ml a 35 mg/ml y lo mas preferible aproximadamente 30 mg/ml. De este contenido de hidratos de carbono totales (azucares), la cantidad total de azucares reductores (monosacaridos) esta en el intervalo de 5 mg/ml a 20 mg/ml, mas preferentemente de 5 mg/ml a 15 mg/ml, y lo mas preferiblemente de aproximadamente 10 mg/ml.
Aunque los hidratos de carbono simples y complejos son el componente clave del sustrato de crecimiento, se apreciara que el sustrato de crecimiento puede contener tambien componentes adicionales, tales como protemas que proporcionan nitrogeno para el crecimiento bacteriano. De acuerdo con ello, el sustrato de crecimiento comprende preferiblemente una cantidad total de protemas y peptidos en el intervalo de 1 mg/ml a 2 mg/ml, preferentemente de aproximadamente 2 mg/ml. De este contenido total de protemas/peptidos, la cantidad total de peptidos de alto peso molecular (peso molecular mayor que 5000 daltons) puede estar en el intervalo de 100 pg/ml a 300 pg/ml, y normalmente de aproximadamente 250 pg/ml. La identidad precisa (por ejemplo, secuencia de aminoacidos) de los componentes de protemas y peptidos en el sustrato de crecimiento no es generalmente un tema de la invencion.
El sustrato de crecimiento puede incluir componentes adicionales tales como, por ejemplo, celulosa, almidon, p- glucanos, pentosanos, polifenoles, acidos ribonucleicos, lfpidos, fosfatos, flavonoides, aminoacidos, vitaminas (B1, B2, C y E), silicatos y elementos traza. La identidad precisa y las cantidades relativas de estos componentes adicionales en el sustrato no son particularmente limitantes. Si como se prefiere, el sustrato de crecimiento se deriva de una fuente vegetal natural, por ejemplo, granos de cereales malteados, estos componentes adicionales seran normalmente biomoleculas naturales.
El sustrato de crecimiento puede contener diversos aditivos tales como agentes tamponantes y otras sustancias disenadas para mejorar el comportamiento del sustrato y/o la vida media extendida. Dichos aditivos pueden incluir,
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por ejemplo, agentes antifungicos, antioxidantes, etc.
En una realizacion preferida, el sustrato de crecimiento puede contener materia particulada, por ejemplo, partmulas que no exceden de 1 mm de diametro.
El sustrato de crecimiento puede prepararse a partir de granos de cereales malteados usando el proceso de fabricacion descrito a partir de ahora en el siguiente documento. Sin embargo, no se pretende que la invencion este limitada a sustratos preparados de acuerdo con este proceso. Los sustratos de crecimiento que presenten propiedades sustancialmente similares pueden prepararse sinteticamente, por ejemplo, mezclando entre sf la mezcla requerida de hidratos de carbono simples y complejos junto con cualquiera de los componentes adicionales relacionados anteriormente.
Se proporciona un metodo para preparar un sustrato de crecimiento para microorganismos que comprende:
someter los cereales malteados a una etapa de maceracion donde los cereales malteados se mezclan con lfquido acuoso y se someten a condiciones de tiempo y temperatura que limitan la extension de la conversion de hidratos de carbono complejos a simples de tal manera que se obtenga una mezcla de hidratos de carbono simples y complejos, protemas y peptidos, y
separar la mezcla de hidratos de carbono simples y complejos, protemas y peptidos de los cereales malteados agotados para obtener un sustrato de crecimiento.
Los terminos "cereal malteado" o "malta" como se usa en el presente documento se refieren al producto de un proceso de malteado aplicado a los granos de cereales. El malteado es un proceso bien conocido en la tecnica de la fabricacion de cerveza.
En un proceso de malteado tfpico, los granos de cereales se hacen germinar para inducir la movilizacion de los nutrientes almacenados. Las semillas en germinacion producen numerosas enzimas para movilizar las protemas y los hidratos de carbono almacenados, incluyendo las a-amilasas, que hidrolizan el almidon a maltosa. Un metodo preferido se refiere al uso de cebada, pero se pueden usar otros cereales, tales como arroz, trigo, almidon y avena. El proceso de germinacion es generalmente bien conocido. Se apreciara que el metodo puede llevarse a cabo proporcionando granos malteados o un sustrato sintetico que comprende una mezcla de hidratos de carbono, protemas y enzimas.
Preferentemente, los granos malteados se laminan antes del procesamiento adicional. El agrietamiento de los granos debido al laminado facilita el acceso del agua y la extraccion de nutrientes durante la etapa de maceracion, a la vez que se evita que el aplastamiento de los granos ayude en la posterior separacion del sustrato de crecimiento de los granos malteados gastados.
La malta preparada se somete a una etapa de maceracion que se asemeja a la etapa de maceracion utilizada en los metodos para la fabricacion de cerveza (vease, por ejemplo, Kunze, W. Technology Brewing and Malting (1996)). El termino "maceracion" se conoce bien en el campo de la fabricacion de cerveza y se refiere a un proceso donde los granos malteados se agitan en presencia de agua calentada a temperaturas definidas a fin de preparar la malta. Durante la etapa de maceracion los hidratos de carbono complejos de los granos malteados se descomponen en maltosa.
El metodo implica tambien una etapa de maceracion donde los granos de cereales malteados se mezclan con un lfquido acuoso (normalmente agua) y la mezcla se calienta a diversas temperaturas definidas. Esta etapa de maceracion, sin embargo, no conforma un proceso de maceracion tfpico de la fabricacion de cerveza. El objetivo de los cerveceros es convertir tanto hidrato de carbono como sea posible en azucares simples para la posterior fermentacion alcoholica. En contraste, las condiciones de la etapa de maceracion en el proceso descrito en el presente documento se seleccionan espedficamente para limitar la extension de la conversion en azucares simples (reductores), dejando cantidades significativas de hidratos de carbono en formas oligomericas y polimericas mas complejas.
La extension de la conversion de hidratos de carbonos puede limitarse de tal manera que la cantidad de azucares simples (reductores) presente en el sustrato de crecimiento resultante, expresada como porcentaje (p/p) del contenido total de hidratos de carbono, esta en el intervalo de 10 % (p/p) a 50 % (p/p).
La conversion limitada deseada de azucares complejos en simples puede conseguirse aumentando la temperatura de la etapa de maceracion durante un corto periodo de tiempo, normalmente de 30 minutos, sin dejar que la mezcla de granos malteados/agua repose a temperaturas intermedias. Los procesos de fabricacion de cerveza tradicionales incluyen periodos de reposo a 60-65 °C y 70-74 °C ya que esto permite a las enzimas producir altas concentraciones de azucares simples (principalmente maltosa). De acuerdo con ello, la etapa de maceracion puede no comprender periodos de reposo a temperaturas en el intervalo de entre 60 °C a 65 °C y/o a temperaturas en el intervalo de entre 70 °C a 74 °C.
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La etapa de maceracion puede comprender mezclar el cereal malteado con agua a una temperatura en el intervalo de 30 °C a 45 °C, reposo de la mezcla de 1 a 2 horas, aumento de la temperatura a una temperatura en el intervalo de 75 °C a 85 °C durante un periodo de tiempo en el intervalo de 20 a 40 minutos, preferentemente de 30 minutos, y a continuacion reposo de la mezcla a una temperatura en el intervalo de 75 °C a 85 °C durante un periodo de tiempo en el intervalo de 60 a 90 minutos. A mayores temperaturas, las enzimas presentes en la mezcla se inactivan y se pueden extraer los nutrientes. Se prefieren generalmente temperaturas superiores, en el intervalo de 76 °C a 80 °C y espedficamente 78 °C. La temperatura en esta etapa debe ser lo suficientemente alta para inactivar durante un plazo de tiempo largo todas las enzimas presentes en la preparacion. Se apreciara que la temperatura y los tiempos precisos utilizados pueden variar algo de acuerdo con el tipo de cereal utilizado.
El proceso descrito en el presente documento limita espedficamente la cantidad de conversion de los azucares complejos en azucares simples. Ademas, el reposo inicial a una temperatura en el intervalo de entre 30 °C a 45 °C proporciona una ventaja adicional ya que maximiza la liberacion de aminoacidos y peptidos. Se prefieren generalmente las temperaturas hacia el extremo superior de este intervalo, es decir, entre 40 °C y 45 °C o de forma espedfica 45 °C. El objetivo de esta etapa es hidrolizar las protemas almacenadas presentes en los granos de cereales a aminoacidos y peptidos disponibles. La combinacion optima del tiempo y la temperatura para conseguir la hidrolisis deseada puede variar algo dependiendo del tipo de granos utilizados.
La presencia de altas concentraciones de protemas, peptidos y aminoacidos es deseable en un sustrato de crecimiento que se vaya a usar para soportar el crecimiento de microorganismos, ya que estos proporcionan una fuente util de nitrogeno. Los procesos de maceracion tfpicos utilizados en la fabricacion de cerveza tradicional no incluinan generalmente un reposo a una temperatura en este intervalo, ya que los cerveceros no buscan conseguir un contenido elevado de protemas o aminoacidos en un mosto previsto para su fermentacion para producir alcohol.
Cuando se completa la etapa de maceracion, por ejemplo, se han extrafdo todos los nutrientes deseados de los granos malteados ahora "agotados", la mezcla resultante que comprende hidratos de carbono simples y complejos, protemas y peptidos puede separarse de los granos agotados para obtener un sustrato de crecimiento usando cualquier medio adecuado. Normalmente, esto implicara una filtracion gruesa, utilizando, por ejemplo, un filtro de 1 mm tal como una cesta de alambre de cuna, dando como resultado una solucion que contiene partmulas gruesas. Es una caractenstica del proceso que el sustrato de crecimiento no esta clarificado, como sena generalmente el caso de un mosto preparado en un proceso normal de fabricacion de cerveza. En la fabricacion de cerveza tradicional, el mosto se suele clarificar para eliminar todas las partmulas gruesas, produciendo de esta forma un lfquido transparente.
La presencia de cierta materia particulada en un sustrato de crecimiento preparado de acuerdo con el proceso descrito en el presente documento es ventajosa con respecto al uso posterior como soporte del crecimiento de las bacterias, ya que proporciona una liberacion lenta de los nutrientes y superficies particuladas para la adhesion de cultivos bacterianos.
Si se necesita, el sustrato de crecimiento preparado de acuerdo con la invencion se puede esterilizar antes del uso posterior. Como se apreciara, esto se puede llevar a cabo mediante ebullicion durante aproximadamente una hora o mediante autoclavado a 120 °C durante aproximadamente 20 minutos.
Si se necesita, se puede anadir un tampon, o varios componentes tamponantes al sustrato de crecimiento, por ejemplo, si el sustrato de crecimiento se va a usar posteriormente en la fabricacion de una preparacion bacteriana de acuerdo con el primer aspecto de la invencion. Los tampones preferidos son como se relaciona con respecto al primer aspecto de la invencion. Si el sustrato de crecimiento se va a esterilizar, el(los) tampon(ones) se puede(n) anadir antes de, durante o despues de la esterilizacion, segun sea conveniente.
La invencion se refiere tambien a un metodo para producir microorganismos viables, metabolicamente activos y estables, que comprende: hacer crecer microorganismos en un sustrato de crecimiento que comprende una mezcla de azucares simples y complejos, protemas y peptidos para obtener una preparacion de microorganismos, y enfriar la preparacion resultante a aproximadamente 4 °C, donde los microorganismos adoptan un estado de crecimiento proximo al equilibrio caracterizado por que la poblacion de bacterias en la preparacion se puede mantener a un nivel constante cuando se almacena a aproximadamente 4°C y a pH controlado durante un periodo de al menos 5 meses, y opcionalmente, almacenar la preparacion a aproximadamente 4 °C.
En este metodo, los microorganismos son bacterias.
En una realizacion espedfica, las bacterias se hacen crecer en el sustrato de crecimiento hasta que alcanzan una concentracion de 2 x 108 y 1 x 109 unidades formadores de colonias por mililitro. En este punto, el cultivo (o la fermentacion) se enfna a aproximadamente 4 °C y la combinacion de temperatura, pH, fase de crecimiento y composicion de sustrato residual proporciona las condiciones de equilibrio que permiten el mantenimiento de un estado de crecimiento proximo al equilibrio durante el almacenamiento a largo plazo. En este estado proximo al equilibrio, que se puede mantener durante un periodo de al menos 5 meses, la poblacion de bacterias metabolicamente activas se mantiene a un nivel sustancialmente constante en el intervalo de 108 a 109 celulas
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viables por mililitro. Se apreciara, sin embargo, que el numero preciso de celulas viables en el estado proximo al equilibrio puede variar algo dependiendo de las especies de bacterias utilizadas.
El metodo de acuerdo con este aspecto de la invencion implica una "Etapa de crecimiento" donde los microorganismos (por ejemplo, bacterias) se hacen crecer en un sustrato de crecimiento hasta que alcanzan una concentracion que permite que se consiga el estado proximo al equilibrio durante un posterior almacenamiento. Es una caractenstica importante del metodo que el sustrato de crecimiento utilizado proporcione un suministro de nutrientes equilibrado que contiene una mezcla de azucares simples y complejos donde una elevada proporcion del contenido de hidratos de carbono esta en la forma de azucares complejos que los microorganismos pueden usar como fuente de energfa. Esta mezcla ayuda a limitar inmediatamente la energfa disponible durante la etapa de crecimiento. La composicion y las caractensticas preferidas del sustrato de crecimiento es/son preferentemente como se ha descrito anteriormente en relacion con el primer y el segundo aspectos de la invencion. El sustrato de crecimiento se prepara preferentemente a partir de granos de cereales malteados usando el metodo de fabricacion descrito en el siguiente documento. Se apreciara, sin embargo, que no es estrictamente necesario usar el sustrato de crecimiento preparado de acuerdo con este metodo. Se pueden conseguir resultados similares utilizando sustrato de crecimiento preparado sinteticamente mezclando las proporciones requeridas de hidratos de carbono simples y complejos, protemas y peptidos.
La etapa de crecimiento debe llevarse a cabo de tal manera que se tenga cuidado en no hacer crecer los microorganismos durante demasiado tiempo, para evitar producir condiciones acidas que inhibinan de otra manera el crecimiento adicional asf como limitando el periodo de almacenamiento de la preparacion resultante. Por otra parte, si la etapa de crecimiento se termina prematuramente, limitara la produccion de la biomasa. El pH de la preparacion durante el crecimiento de los microorganismos se puede usar como un indicador del estado proximo al equilibrio. En una realizacion tfpica, los cultivos de bacterias acidolacticas pueden hacerse crecer hasta que se alcanza un pH de 4,5 +/-0,3 unidades.
Se apreciara que el pH del sustrato de crecimiento puede variar algo dependiendo del intervalo de pH optimo para el microorganismo (por ejemplo, bacterias) utilizado. En una realizacion tfpica (adecuada para las bacterias acido lacticas) el pH debe mantenerse en el intervalo de 3,8 a 4,5 durante el almacenamiento. Preferentemente, los tampones, tales como citrato trisodico o fosfatos, se anaden al sustrato de crecimiento para controlar el pH durante el crecimiento de los microorganismos y el almacenamiento posterior.
Se apreciara que la temporizacion exacta de la etapa de crecimiento de los microorganismos (por ejemplo, bacterias) en un estado proximo al equilibrio depende de las especies utilizadas. El crecimiento de los microorganismos se puede llevar a cabo en cualquier equipo de cultivo adecuado. En realizaciones espedficas, la etapa de crecimiento puede llevarse a cabo por medio de fermentacion en un fermentador. De acuerdo con la invencion, los microorganismos utilizados son especies de bacterias acidolacticas de los generos Enterococcus y Lactobacillus. Si se hicieran crecer dichas especies utilizando medios de crecimiento "convencionales" consistentes en ultima instancia en azucares simples, el suministro de energfa en exceso conducina a la produccion de acido en exceso por las bacterias acidolacticas, lo que limitana la produccion de biomasa y la vida media del cultivo resultante. Por el contrario, la mezcla compleja de azucares presentes en el sustrato de crecimiento utilizado en el metodo de la invencion suministra energfa para el crecimiento durante la etapa inicial del crecimiento y tambien para el mantenimiento durante el almacenamiento del producto.
La etapa de crecimiento puede llevarse a cabo utilizando especies individuales de bacterias (u otros microorganismos). Pueden hacerse crecer de manera independiente dos o mas especies bacterianas (microorganismos) diferentes en medios de crecimiento separados y a continuacion mezclarse entre sf antes o despues de la etapa de enfriado. Los sustratos de crecimiento utilizados para el cultivo independiente de dos o mas especies bacterianas diferentes pueden tener la misma composicion, o ser de composicion diferente. De esta manera, es posible optimizar las condiciones de crecimiento para cultivos de especies bacterianas individuales y, a continuacion, combinar los cultivos entre sf para su almacenamiento en condiciones que permitan el mantenimiento del crecimiento en equilibrio de cada una de las especies individuales en el cultivo.
En otras realizaciones del metodo, se pueden hacer crecer dos o mas especies bacterianas (u otros microorganismos) diferentes en un solo cultivo con el mismo sustrato de crecimiento, con la condicion de que sus tasas de crecimiento sean comparables, de forma que una especie no domine la poblacion. Tras la etapa de crecimiento, la preparacion puede analizarse por metodos normalizados para determinar la pureza microbiologica y el recuento de microorganismos. Es tambien posible hacer crecer dos o mas combinaciones diferentes de microorganismos (por ejemplo, bacterias) juntas en sustratos de crecimiento separados y a continuacion combinar los cultivos entre sf en un producto final. Un cultivo combinado podna mezclarse de forma similar con un cultivo de una unica especie bacteriana.
Los cultivos iniciadores de la etapa de crecimiento del metodo incluyen, por ejemplo, bacterias criodesecadas o cultivos lfquidos.
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Se apreciara que la preparacion de microorganismos preparados usando el metodo de la invencion puede utilizarse inmediatamente despues de la etapa de enfriado, pero mas normalmente, la preparacion se almacenara antes del uso. La temperature optima para el almacenamiento a fin de mantener el estado de crecimiento proximo al equilibrio en el cultivo es aproximadamente de 4 °C, pero el lector experto apreciara que la temperatura de almacenamiento puede variar algo. Por conveniencia, se pueden dispensar alfcuotas del cultivo proximo al equilibrio producido mediante el metodo en un envase esteril adecuado antes del almacenamiento a largo plazo.
Es una ventaja clave del metodo de la invencion que los cultivos proximos al equilibrio producidos mantienen la viabilidad y la integridad cuando se almacenan durante periodos extendidos, normalmente durante al menos 5 meses. Sin embargo, se apreciara que no es esencial para el metodo que los cultivos deban almacenarse realmente durante al menos 5 meses antes del uso.
Para evitar el crecimiento de hongos o levaduras, se puede anadir un agente antifungico, tal como sorbato de potasio esteril, antes del almacenamiento. Los agentes antifungicos son principalmente para prevenir el deterioro por levaduras u hongos durante el uso por los usuarios finales, una vez que se ha abierto un recipiente del producto. Ademas, se puede anadir un antioxidante, por ejemplo, vitamina C para ayudar a prevenir el deterioro del producto durante el almacenamiento. Se apreciara que se pueden usar otros agentes bien conocidos en la materia como agentes antifungicos o antioxidantes.
La invencion se refiere tambien a un metodo alternativo para producir una preparacion de microorganismos viables, metabolicamente activos y estables que no requiere una etapa de crecimiento activo. Este metodo comprende las siguientes etapas:
anadir microorganismos a un sustrato de crecimiento que comprende una mezcla de azucares simples y complejos, proternas y peptidos para formar una preparacion de microorganismos, donde los microorganismos se anaden al sustrato de crecimiento a una concentracion que proporciona un estado de crecimiento proximo al equilibrio caracterizado por que la poblacion de microorganismos en la preparacion se puede mantener a un nivel constante cuando se almacena a aproximadamente 4 °C y a pH controlado durante un periodo de al menos 5 meses, y
opcionalmente, almacenar la preparacion a aproximadamente 4 °C.
De acuerdo con la invencion, los microorganismos son bacterias. Las especies bacterianas son como se relacionan con respecto al cuarto aspecto de la invencion.
Este metodo no requiere que los microorganismos crezcan en el sustrato de crecimiento antes de que se impongan las condiciones para el crecimiento proximo al equilibrio. En su lugar, el sustrato de crecimiento se inocula con cultivo(s) iniciador(es) de microorganismos a una concentracion que permita el mantenimiento del estado de equilibrio cuando la preparacion resultante se almacena a 4 °C y a un pH controlado durante un periodo de al menos 5 meses. Los cultivos iniciadores para el metodo incluyen, por ejemplo, bacterias criodesecadas o cultivos lfquidos. El sustrato de crecimiento puede inocularse con mas de una especie bacteriana. Preferentemente, la concentracion de celulas viables en el cultivo iniciador supera 108 celulas viables por mililitro.
El estado proximo al equilibrio se consigue de nuevo mediante la combinacion de nutrientes en el sustrato de crecimiento, la temperatura, el pH y el crecimiento en fases. En el estado proximo al equilibrio, que se puede mantener durante un periodo de al menos 5 meses, la poblacion de bacterias metabolicamente activas se mantiene a un nivel constante en el intervalo de 108 a 109 celulas viables por mililitro. Se apreciara de nuevo que el numero preciso de celulas viables en el estado proximo al equilibrio puede variar algo dependiendo de las especies de bacterias utilizadas. Se apreciara tambien que la concentracion exacta del cultivo iniciador y el pH del sustrato de crecimiento pueden variar dependiendo de las especies de bacterias utilizadas.
Las caractensticas descritas como preferidas con respecto a los cultivos proximos al equilibrio producidos utilizando el metodo que requiere una etapa de crecimiento se aplican mutatis mutandis a los cultivos proximos al equilibrio conseguidos utilizando este metodo. De esta manera, en una realizacion preferida, el pH del cultivo proximo al equilibrio se mantiene en el intervalo de 3,8 a 4,5 durante el almacenamiento. Preferentemente, los tampones, tales como citrato trisodico o fosfatos, se usan para controlar el pH durante el almacenamiento.
De acuerdo con la invencion, los microorganismos usados son especies de bacterias acidolacticas de los generos Enterococcus y Lactobacillus.
Las caractensticas preferidas del sustrato de crecimiento usado en este metodo son como se ha descrito anteriormente en relacion con el primer aspecto de la invencion. De nuevo, se prefiere, pero no es esencial, que el sustrato de crecimiento se prepare a partir de granos de cereales malteados utilizando el proceso descrito en el presente documento.
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Usos de la preparacion de bacterias metabolicamente activas
Son bien conocidos los beneficios para la salud de los probioticos (vease, por ejemplo, Marteau, P. y Rambaud, J-C, (1996) 'Therapeutic applications of probiotics in humans' en Leeds, A. R. y Rowland, I. R. (eds.) Gut flora and health - past, present and future, Royal Society of Medicine Press Limited, Londres; Stark, B. A. y Wilkinson, (eds.) (1989) Probiotics. Theory and Applications,). Los probioticos han mostrado ser utiles en el tratamiento de la diarrea y el estrenimiento, smdrome del intestino irritable, tratamiento y prevencion del cancer y otras enfermedades que afectan la microflora intestinal.
Las preparaciones bacterianas proporcionadas por la invencion encuentran por tanto utilidades concretas en el tratamiento o la prevencion de enfermedades que afectan a la flora intestinal microbiana y, de forma mas general, utilidad para ayudar a mantener la flora microbiana sana. De esta manera, la invencion proporciona un uso de una preparacion de bacterias metabolicamente activas y estables de acuerdo con la invencion en la fabricacion de un medicamento para su uso en el tratamiento de un trastorno que afecta el equilibrio microbiano intestinal en un paciente humano u otro paciente mairnfero.
En particular, la invencion se refiere al tratamiento o la prevencion de la enfermedad cronica inflamatoria del intestino, la colitis ulcerosa o la enfermedad de Crohn. Ademas, los cultivos bacterianos de acuerdo con la invencion pueden administrarse a pacientes humanos o a otros pacientes mamfferos para el mantenimiento general de una flora microbiana sana, en lugar de para el tratamiento de una enfermedad espedfica.
En una realizacion adicional, la invencion se refiere tambien al uso de una preparacion metabolicamente activa y estable de bacterias de acuerdo con la invencion en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de enfermedades que afectan la flora intestinal microbiana.
Se pueden usar las preparaciones bacterianas como tales, por ejemplo, como suplementos probioticos, o se pueden premezclar con componentes adicionales antes de su administracion a un sujeto humano o animal, o incluso administrase conjuntamente con otros componentes sin premezcla. Para el uso veterinario, puede ser conveniente anadir la preparacion bacteriana a un pienso animal normal. En el campo veterinario, las preparaciones encuentran utilidad concreta en el tratamiento de especies de aves, especialmente aves de corral comerciales (como se ilustra en los ejemplos acompanantes) asf como en especies de mamfferos, por ejemplo, vacas, ovejas, caballos, gatos, perros, etc.
Para uso humano, se pueden administrar las preparaciones bacterianas como tales o se pueden premezclar de nuevo o formularse con componentes adicionales antes de la administracion a un sujeto humano. La invencion abarca por tanto composiciones que comprenden una preparacion bacteriana de acuerdo con la invencion mas uno o mas componentes adicionales. Como ejemplo, se pueden anadir componentes adicionales para mejorar la palatabilidad de la composicion para el consumo humano. Si resulta conveniente, se pueden incorporar las preparaciones de acuerdo con la invencion a comestibles o bebidas para consumo humano, con la condicion de que no afecten a la viabilidad de las bacterias de la preparacion.
Para uso humano y/o veterinario, puede ser conveniente formular las preparaciones de acuerdo con la invencion en formas farmaceuticas unitarias, tanto solas como en combinacion con uno o mas diluyentes, excipientes o transportadores farmaceuticamente aceptables. De nuevo, dicha formulacion no debe afectar adversamente la viabilidad de las bacterias en la preparacion.
La invencion se entendera adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos experimentales no limitantes, junto con los dibujos acompanantes donde:
Las Figuras 1a-1d muestran la robustez de un cultivo lfquido de Lactobacillus plantarum preparado mediante el metodo descrito en el presente documento ("humedo") en comparacion con una preparacion liofilizada de la bacteria ("seco"). Las dos primeras curvas de crecimiento (Figura 1a y 1b) indican que, en un entorno no hostil, las bacterias preparadas de acuerdo con la invencion crecen mas rapidamente que la preparacion liofilizada. La curva de crecimiento en la Figura 1c muestra el crecimiento de Lactobacillus plantarum preparado mediante el metodo descrito en el presente documento ("humedo") en comparacion con una preparacion liofilizada de la bacteria ("seco") en un medio suplementado con sales biliares. La Figura 1d muestra el crecimiento de Lactobacillus plantarum preparado mediante el metodo descrito en el presente documento ("humedo") en comparacion con una preparacion liofilizada de la bacteria ("seco") a un pH bajo en presencia de sales biliares simulando un entorno que se encuentra en el tracto digestivo de los marnfferos. Los resultados muestran que las bacterias preparadas de acuerdo con el metodo de la invencion son mas resistentes a un entorno hostil.
Las Figuras 2a y 2b muestran que se ha aumentado la vida media de las bacterias preparadas de acuerdo con la invencion.
La Figura 3 muestra la colonizacion de bacterias en el intestino delgado de pollo.
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Ejemplo 1: Produccion de un sustrato de crecimiento, utilizando un medio basado en cebada.
(A) Germinacion (malteado)
D^a 1
La cebada se impregno en agua durante 2 a 24 horas, dependiendo del lote de grano. Se puede incluir un 0,1 % (p/v) de hipoclorito sodico (blanqueador) en el agua para inhibir el crecimiento de contaminantes durante la fase de germinacion. Despues de 4 horas, el agua se retiro de los granos mediante drenaje, y los granos se dejaron reposar a temperatura ambiente de 10 a 30 °C durante aproximadamente 1 dfa.
D^a 2
Los granos se impregnaron en agua limpia durante otro periodo de 4 horas. Se puede anadir peroxido de hidrogeno (0,1 % p/v) al agua durante estos enjuagados y los posteriores. El peroxido de hidrogeno proporciona oxfgeno para la germinacion de los granos, y actua como desinfectante. De forma alternativa, se puede usar hipoclorito de sodio. Despues de 4 horas, el agua se retiro de los granos mediante drenaje, y los granos se dejaron reposar durante aproximadamente 1 dfa. La agitacion ocasional (por ejemplo, cada 4 horas) de los granos puede mejorar la germinacion aumentando el intercambio gaseoso, proporcionando oxfgeno y eliminando el dioxido de carbono.
Dfa 3 en adelante
Se continuo el ciclo de impregnacion, drenaje y reposo hasta que las raicillas que emergfan de los granos en germinacion tuvieron de 2 a 4 mm de longitud. Este estado de crecimiento indico que los granos habfan producido enzimas para la movilizacion de los nutrientes almacenados. Estas enzimas son fundamentales para la posterior produccion del medio de crecimiento, durante la 'maceracion'. Se podna permitir una modificacion mas amplia de los granos, dejando la fase de germinacion hasta que las raicillas tienen algunos milfmetros de longitud. Sin embargo, demasiado crecimiento convertira a los nutrientes en meras rafces y brotes de la planta, que no se pueden usar en la fermentacion.
(B) Laminado
Cuando los granos habfan germinado suficientemente se molieron a continuacion con un molino de cilindros. El molino se ajusto de tal manera que los granos teman grietas abiertas, pero no se aplastaron o aplanaron completamente. El agrietamiento de los granos permite el acceso del agua y la extraccion de los nutrientes durante la maceracion, evitando a la vez que el aplastamiento de los granos ayude en las etapas de filtracion.
(C) preparacion de un sustrato de crecimiento.
Los granos molidos germinados se mezclaron con suficiente agua para cubrirlos, a 45 °C y la mezcla se mantuvo a 45 °C durante 1 hora.
Despues de 1 hora a 45 °C, se aumento la temperatura a 78 °C durante un periodo de 30 minutos.
La mezcla se dejo reposar a 78°C durante 1 hora. Despues de reposar a 78 °C, se separaron los bagazos mediante filtracion. Se uso un filtro relativamente grueso (por ejemplo, una cesta de alambre de cuna con huecos de 1 mm) dando como resultado una solucion que contema cantidades significativas de solidos en suspension. Se descarto el bagazo y el lfquido se trato a continuacion con calor para pasteurizarlo o esterilizarlo. En este experimento concreto el lfquido, se hizo hervir durante 45 minutos. A continuacion se anadio un tampon (citrato trisodico al 0,5 % (p/v)) y se hizo hervir la mezcla durante 15 minutos mas para dar como resultado el sustrato final de crecimiento.
Ejemplo 2: Analisis del sustrato de crecimiento
(a) Analisis de hidratos de carbono:
Se determino el contenido total de hidratos de carbono usando el ensayo del acido sulfurico-fenol, con glucosa como patron de referencia. (Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A. y Smith, F. (1956) Analytical Chemistry, vol. 28., p. 350).
Se determinaron los azucares reductores usando el metodo Nelson-Somogyi, de nuevo con glucosa como patron de referencia. (Somogyi, M. (1952) Journal of Biological Chemistry., vol. 195., p. 19).
Resultados:
Los azucares totales en el sustrato estan en el intervalo de 20 a 40 mg/ml (miligramos por mililitro)
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Los azucares reductores estan en el intervalo de 5 a 20 mg/ml.
(b) Analisis de protemas y peptidos:
Se determino la protema total usando dos ensayos, con albumina de suero bovino como patron de referencia:
(i) El reactivo del Biuret (Itzhaki, R. F & Gill, D. M. (1964) Analytical Biochemistry, Vol. 9., p. 401-410.
(ii) El metodo de Lowry, como se ha modificado por Ohnishi y Barr. (Ohnishi, S. T. & Barr, J. K. (1978) Journal of Biological Chemistry, Vol. 193, p. 265).
Se determinaron los peptidos de peso molecular mayor de 5000 daltons usando el reactivo de Bradford, (Bradford, M. M. (1976) Analytical Biochemistry, Vol. 72, p. 248-254).
Resultados:
La protema y los peptidos totales estan en el intervalo de 1 a 2 miligramos por mililitro.
Los peptidos de alto peso molecular (mayores de 5000 daltons) estan en el intervalo de 100 a 300 microgramos por mililitro.
Ejemplo 3: Produccion de un cultivo bacteriano metabolicamente activo (A) Fermentacion
El sustrato de crecimiento preparado de acuerdo con el ejemplo 1 se enfrio a 37 °C y se anadieron los cultivos bacterianos. Los ejemplos de un inoculo adecuado son bacterias criodesecadas o cultivos iniciadores lfquidos (normalmente 1 % (v/v) de un cultivo durante la noche en un caldo nutriente).
En este ejemplo, las siguientes bacterias se hicieron crecer en dos recipientes:
(i) Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum;
(ii) Lactobacillus casei
Se llevo a cabo la fermentacion durante 16-20 horas, hasta que se alcanzo el pH de 4,5 +/- 0,3 unidades. A continuacion se enfrio la mezcla de fermentacion a 4 °C y se sometio a tecnicas normalizadas para evaluar la calidad (para determinar la pureza microbiologica y la enumeracion de bacterias).
En este punto, se puede anadir sorbato de potasio esteril (0,005 % p/v de concentracion final) al caldo fermentado. Este actua para inhibir el crecimiento de cualquier hongo o levadura que pueda surgir debido a la contaminacion durante la manipulacion por el usuario final.
Se puede anadir tambien vitamina C (0,01 % p/v de concentracion final) como antioxidante.
Tras los ensayos de aseguramiento de la calidad, si se requiere, se pueden mezclar diferentes lotes para dar productos con mezclas complejas de especies bacterianas.
En el ejemplo presentado en el presente documento, la mezcla de dos lotes de bacterias da como resultado un producto final que contiene las bacterias Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus casei.
Ejemplo 4: Vida media del cultivo bacteriano metabolicamente activo
Para evaluar la vida media del cultivo bacteriano metabolicamente activo, que comprende las especies Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus casei, como se obtuvieron en el ejemplo 2, se almacenaron a 4 °C (+/- 1 °C). Las muestras se tomaron a intervalos semanales, y se pulverizaron almuotas de 100 ul de diluciones en serie en agua de peptona al 0,1 % (p/v) sobre placas de agar. Se incubaron las placas durante aproximadamente 48 horas a aproximadamente 37 °C y se contaron las colonias bacterianas.
Resultados
Los resultados siguientes muestran la vida media de las bacterias preparadas mediante el metodo de la invencion como el numero de unidades formadoras de colonias por mililitro por semana (vease tambien la Figura 2). Se han preparado el lote A y el B de acuerdo con el mismo metodo que se describe en el presente documento pero en diferentes dfas.
E.f = Enterococcus faecium
L.p = Lactobacillus plantarum
L.c = Lactobacillus casei LAB = Bacterias acidolacticas
ufc por ml = unidades formadoras de colonias por mililitro 5 Tabla 1
Lote A Semana
(8059) E.f L.p L.c LAB total
0
2,7E+08 1,2E+08 9,0E+07 4,8E+08
1
2,0E+08 2,4E+08 1,9E+08 6,3E+08
2
2,4E+08 2,2E+08 1,5E+08 6,1E+08
3
3,0E+08 1,9E+08 9,0E+07 5,8E+08
4
3,0E+08 1,8E+08 8,0E+07 5,6E+08
5
3,5E+08 1,7E+08 6,0E+07 5,8E+08
6
3,0E+08 1,9E+08 5,0E+07 5,4E+08
7
3,1E+08 1,5E+08 3,0E+07 4,9E+08
8
2,8E+08 1,7E+08 3,0E+07 4,8E+08
9
2,5E+08 1,7E+08 3,0E+07 4,5E+08
10
2,5E+08 1,6E+08 2,0E+07 4,3E+08
11
2,2E+08 1,5E+08 3,0E+07 4,0E+08
12
2,0E+08 1,4E+08 3,0E+07 3,7E+08
13
1,6E+08 1,5E+08 2,0E+07 3,3E+08
14
1,5E+08 1,5E+08 2,0E+07 3,2E+08
15
1,5E+08 1,3E+08 2,0E+07 3,0E+08
16
1,4E+08 1,3E+08 2,0E+07 2,9E+08
17
1,2E+08 1,4E+08 2,0E+07 2,8E+08
18
6,0E+07 1,4E+08 1,0E+07 2,1E+08
19
4,0E+07 1,3E+08 2,0E+07 1,9E+08
20
3,0E+07 1,1E+08 2,0E+07 1,6E+08
21
4,0E+07 1,1E+08 2,0E+07 1,7E+08
22
1,0E+07 1,0E+08 1,0E+07 1,2E+08
Lote B Semana
(8060) E.f Tabla 2 L.p L.c LAB total
0
3,0E+08 1,3E+08 1,5E+08 5,8E+08
1
3,6E+08 1,6E+08 2,5E+08 7,7E+08
2
3,0E+08 1,5E+08 1,4E+08 5,9E+08
3
1,8E+08 2,2E+08 1,2E+08 5,2E+08
4
2,1E+08 1,0E+08 8,0E+07 3,9E+08
5
1,7E+08 1,0E+08 7,0E+07 3,4E+08
6
1,6E+08 2,0E+08 8,0E+07 4,4E+08
7
1,5E+08 1,4E+08 7,0E+07 3,6E+08
8
1,2E+08 1,5E+08 5,0E+07 3,2E+08
9
1,5E+08 1,1E+08 6,0E+07 3,2E+08
10
2,3E+08 1,0E+08 5,0E+07 3,8E+08
11
1,8E+08 1,0E+08 2,0E+07 3,0E+08
12
1,6E+08 1,0E+08 3,0E+07 2,9E+08
13
1,2E+08 1,1E+08 3,0E+07 2,6E+08
14
1,0E+08 1,1E+08 2,0E+07 2,3E+08
15
1,0E+08 1,0E+08 2,0E+07 2,2E+08
16
1,0E+08 1,0E+08 2,0E+07 2,2E+08
17
8,00E+07 9,00E+07 1,00E+07 1,8E+08
18
9,00E+07 9,00E+07 1,00E+07 1,9E+08
5
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15
20
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35
40
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Lote B
(8060)
Semana
E.f L.p L.c LAB total
19
8,00E+07 8,00E+07 2,00E+07 1,8E+08
20
6,00E+07 8,00E+07 1,00E+07 1,5E+08
21
5,00E+07 7,00E+07 1,00E+07 1,3E+08
22
4,00E+07 8,00E+07 1,00E+07 1,3E+08
Ejemplo 5: Evaluacion de la robustez del cultivo metabolicamente activo y de las bacterias criodesecadas
En esta serie de experimentos se uso una unica cepa de Lactobacillus plantarum para inocular el medio de crecimiento. Se midio el posterior crecimiento a aproximadamente 37 °C vigilando la absorbancia a 600 nm (y tambien se comprobo sembrando en placas diluciones sobre medio de agar).
'Humedo' se refiere a un cultivo lfquido de la bacteria (producido por el metodo descrito en esta solicitud de patente). 'Seco' se refiere a una preparacion liofilizada de la bacteria, suspendida en caldo MRS (Caldo de Man, Rogosa y Sharpe). Se usaron cantidades identicas de bacterias 'humedas' y 'secas' en cada par de incubaciones.
(1) Crecimiento en un medio rico y 'adecuado'
Se inocularon bacterias en caldo MRS y se vigilo su crecimiento (x1 = inoculo de 1 x 107 ufc/ml de concentracion final; x2 = 2 x 107 ufc/ml). En la Figura 1a se muestran los resultados. Esta primera curva de crecimiento indica que en un entorno no hostil, el cultivo lfquido crece bastante mas rapido que el de la preparacion liofilizada. Presumiblemente, la bacteria durmiente en la preparacion liofilizada necesita tiempo para rehidratarse y mantener el metabolismo funcionando y activado.
(2) El efecto de un choque acido
1 % (v/v) tanto de un cultivo lfquido, como de una suspension de bacterias liofilizadas, se anadieron a un caldo MRS, que se habfa ajustado a diversos valores de pH con HGI. Las bacterias se incubaron en caldos acidos durante 1 hora y a continuacion las muestras se contaron sobre placas de agar MRS.
pH
6 5 4 3 2 1
Humedo
106 ufc/ml 106 ufc/ml 106 ufc/ml 106 ufc/ml 6 x 105 ufc/ml 0
Seco
106 ufc/ml 106 ufc/ml 106 ufc/ml 2 x 104 ufc/ml 1 x 104 ufc/ml 0
ufc = unidades formadoras de colonias por mililitro
Este resultado indica que las bacterias 'humedas' son mas capaces de sobrevivir al entorno acido que los son las bacterias 'secas'. Como el estomago puede alcanzar niveles de pH tan bajos como 2, esto es significativamente relevante para la supervivencia y el bienestar de las bacterias durante y tras el transito gastrico.
(3) Combinacion de los efectos del pH y las sales biliares
Llevando el nivel de desaffo un paso mas adelante, el crecimiento de preparaciones bacterianas 'humedas' y 'secas' se comparo en las siguientes condiciones:
(a) caldo MRS solo (Figura 1b)
(b) caldo MRS suplementado con sales biliares al 0,5 % (p/v) (Oxoid L55) (Figura lc)
(c) Incubacion en MRS a pH 3,0 durante 1 hora, seguido por el crecimiento en caldo MRS con sales biliares (Figura 1d).
Los resultados combinados de los experimentos indican los siguientes puntos:
• Las bacterias 'humedas' crecen mas rapidamente que las bacterias 'secas'.
• El choque acido tiene un efecto mas perjudicial sobre las bacterias 'secas' que sobre las 'humedas'.
• Las sales biliares inhiben ambos tipos, posiblemente con un efecto mas adverso sobre las bacterias 'secas' que sobre las 'humedas'
• Los efectos secuenciales combinados de un choque acido seguido por la exposicion a las sales biliares ralentiza significativamente el crecimiento de las bacterias 'humedas', pero destruye a las bacterias 'secas' (determinado por la ausencia de colonias en placas de agar).
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Sin embargo, aunque el pH y la tolerancia a las sales biliares son obviamente factores importantes, existen numerosos estimulos diferentes, qmmicos y microbianos, a los cuales deben enfrentarse las bacterias probioticas. De esta manera, la viabilidad y el numero total de bacterias, como se ha determinado de forma sencilla por el numero de unidades formadoras de colonias por gramo o ml, es solo un indicador del bienestar de una preparacion para funcionar como un probiotico. Si las bacterias no estan en un estado activo cuando penetran en el hospedador, existe una posibilidad significativa de que puedan resultar destruidas o que avancen demasiado a lo largo del tracto digestivo, antes de que tengan una posibilidad de colonizar. Por tanto, los probioticos son ventajosos para su uso en un hospedador si estan en un estado metabolicamente activo cuando penetran en el hospedador. De acuerdo con la invencion, las bacterias estan vivas y en forma metabolicamente activa, de tal manera que son capaces de resistir el entorno hostil del tracto GI. La naturaleza metabolicamente activa del producto se disena para aumentar las posibilidades de supervivencia y colonizacion en el hospedador.
Ejemplo 6: Efectos sobre la microflora intestinal de polios de corral
Introduccion y metodos:
Se preparo un probiotico que contiene las bacterias acidolacticas E. faecium, L. plantarum, L. casei y L. acidophilus de acuerdo con el metodo descrito en el presente documento. El probiotico se sometio a ensayo para determinar su capacidad de alterar la microflora intestinal de pollos de corral en una unidad en una unidad de pollo de corral comercial (variedad broiler).
Tratamiento de los pollos:
Se proporciono a los pollos de corral el antibiotico Lincospectina desde el dfa 1 (dfa de edad) al dfa 3.
En el dfa 4, las aves no recibieron tratamiento.
En el dfa 5, la mitad de las jaulas de los pollos variedad broiler recibieron la preparacion a una velocidad de 1 litro por 5000 pollos. Las jaulas restantes se usaron como controles.
En el dfa 6 se seleccionaron aleatoriamente seis aves de cada grupo, se sacrificaron y se examino la microflora intestinal. (Se combinaron muestras de tejidos de parejas de aves de cada grupo, proporcionando tres muestras de cada grupo).
Analisis microbiologico:
Las zonas del sistema digestivo seleccionadas para el analisis son el tracto intestinal superior, tomadas desde el inicio del intestino delgado hacia el punto de union del saco vitelino.
Los tejidos y contenidos intestinales de las parejas de aves se maceraron en agua de peptona esteril, se diluyeron, y las muestras se pulverizaron sobre una variedad de agares semiselectivos. Tras la incubacion de las placas, se senalaron las caractensticas y el numero de colonias juntas con el analisis microscopico de las bacterias. Se llevo a cabo la identificacion de las bacterias acidolacticas mediante el examen de las caractensticas de las colonias, la morfologfa celular y los perfiles de fermentacion de los hidratos de carbono (esto ultimo utilizando el kit de ensayo 'api 50 CH' de BioMerieux).
Resultados:
En la Figura 3 se muestran los resultados.
L1 a L3 = aves tratadas con probioticos (parejas 1 a 3)
C1 a C3 = aves del control (parejas 1 a 3)
SI = intestino delgado
ufc = unidades formadoras de colonias
Como se esperaba, existfan muchos microbios diferentes presentes en los tractos gastrointestinales de las aves tratadas con el control y con los probioticos. Globalmente, existfan cantidades y tipos similares de bacterias en ambos grupos de aves, pero con algunas diferencias significativas en la distribucion y cantidad de especies concretas.
Bacterias acidolacticas
Existfa una diferencia muy perceptible en el contenido de bacterias acidolacticas (LAB) entre la preparacion tratada y las aves del control. Aunque ambos grupos teman cantidades totales comparables de LAB, la flora de las aves del control estaba dominada por una unica especie, mientras que las aves tratadas con probioticos teman una mezcla mas amplia de especies presentes.
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Ejemplo 7 Efecto de la preparacion probiotica sobre polluelos de avestruz
Se llevo a cabo un ensayo para evaluar los efectos de una preparacion de acuerdo con la invencion en polluelos de avestruz. El ensayo se llevo a cabo durante un periodo de 4 semanas con polluelos que padecen diarrea desde el dfa 4. Se trato un grupo de polluelos con la preparacion de acuerdo con la invencion, un segundo con un antibiotico de amplio espectro y un tercero con un suplemento de vitaminas y aminoacidos. Los resultados del ensayo muestran que el grupo tratado con la preparacion de acuerdo con la invencion teman un 67 % de disminucion de la mortalidad en comparacion con el grupo tratado con antibioticos y que la administracion de la preparacion podna aliviar los smtomas del estrenimiento, la diarrea, la estasis del intestino, comportamientos indebidos y prolapsos. Ademas, se observo un aumento de peso del 27 % en comparacion con los grupos del control en el grupo tratado con la preparacion probiotica.
En un segundo ensayo, donde se administraron 100 ml de la preparacion de acuerdo con la invencion a las aves reproductoras, se observo a la administracion dio como resultado un aumento de la fertilidad en comparacion con el grupo del control.
De acuerdo con ello, estos resultados muestran que la tasa de crecimiento, la morbilidad y la mortalidad estan influenciadas por la administracion de la preparacion probiotica de acuerdo con la invencion.
Ejemplo 8 Efectos beneficiosos de la preparacion probiotica en mamiferos
En un pequeno ensayo independiente, se evaluo el efecto de la preparacion de acuerdo con la invencion sobre gatos y perros que padecen enteritis cronica y se encontro que es util en la restauracion de la flora intestinal normal.
En un ensayo en seres humanos, los voluntarios han observado efectos beneficiosos de la preparacion que ayudan en casos agudos de diarrea y corrigen las irregularidades cronicas del intestino.
Este modelo de beneficios sugiere que un producto basado en el metodo notificado en el presente documento podna tener beneficios significativos para los seres humanos en el control de disfunciones gastrointestinales agudas y cronicas (incluyendo smdrome del intestino irritable y enfermedad inflamatoria del intestino, envenenamiento alimenticio, diarrea infecciosa y estrenimiento). Se esta llevando un ensayo clmico completo para apoyar los resultados obtenidos de esta manera.
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Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
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    REIVINDICACIONES
    1. Una preparacion que comprende bacterias acidolacticas viables metabolicamente activas y un sustrato de crecimiento que comprende una mezcla de oligosacaridos y polisacaridos, y monosacaridos y disacaridos, protemas y peptidos, donde la bacteria en la preparacion presenta un estado de crecimiento casi en equilibrio caracterizado por que la poblacion de bacterias se mantiene en el intervalo de 108 a 109 celulas viables por mililitro cuando se almacena a aproximadamente 4 °C y a pH controlado en el intervalo de 3,8-4,5 durante un periodo de al menos 5 meses, donde la cantidad total de azucares esta en el intervalo de entre 20 mg/ml a 40 mg/ml y donde la cantidad total de azucares reductores esta en el intervalo de entre 5 mg/ml a 20 mg/ml cuando se mide utilizando el metodo de Nelson-Somogyi, y
    donde las bacterias acidolacticas comprenden Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei y Enterococcus faecium.
  2. 2. La preparacion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 donde la cantidad total de protemas y peptidos esta en el intervalo de 1 mg/ml a 2 mg/ml y donde la cantidad total de peptidos de alto peso molecular esta en el intervalo de 100 pg/ml a 300 pg/ml.
  3. 3. La preparacion de las reivindicaciones 1 o 2 que comprende ademas un agente antifungico.
  4. 4. La preparacion de la reivindicacion 1 que comprende ademas un antioxidante.
  5. 5. Un sustrato de crecimiento para las bacterias acidolacticas que comprende una mezcla de oligosacaridos y polisacaridos, y monosacaridos y disacaridos donde la cantidad total de azucares esta en el intervalo de 20 mg/ml a 40 mg/ml y la cantidad total de azucares reductores esta en el intervalo de 5 mg/ml a 20 mg/ml cuando se mide usando el metodo de Nelson-Somogyi.
  6. 6. El sustrato de crecimiento de la reivindicacion 5 donde la cantidad total de azucares reductores esta en el intervalo de 5 mg/ml a 15 mg/ml cuando se mide utilizando el metodo Nelson-Somogyi.
  7. 7. El sustrato de crecimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6 que comprende adicionalmente protemas y peptidos, donde la cantidad total de protemas y peptidos en el intervalo de 1 mg/ml a 2 mg/ml y la cantidad total de peptidos de alto peso molecular esta en el intervalo de entre 100 pg/ml a 300 pg/ml.
  8. 8. Un metodo para preparar una preparacion estable y metabolicamente activa de bacterias acidolacticas que comprende:
    hacer crecer bacterias acidolacticas en un sustrato de crecimiento que comprende una mezcla de oligosacaridos y polisacaridos, y monosacaridos y disacaridos, protemas y peptidos para obtener una preparacion de bacterias acidolacticas, donde la cantidad total de azucares en el sustrato de crecimiento esta en el intervalo de 20 mg/ml a 40 mg/ml y donde la cantidad total de azucares reductores en el sustrato de crecimiento esta en el intervalo de 5 mg/ml a 20 mg/ml cuando se mide usando el metodo de Nelson-Somogyi, y enfriar la preparacion resultante a aproximadamente 4 °C, donde las bacterias acidolacticas adoptan un estado proximo al equilibrio caracterizado por que la poblacion de bacterias acidolacticas en la preparacion se puede mantener en el intervalo de 108 a 109 celulas viables por mililitro cuando se almacena a aproximadamente 4 °C y a pH controlado en el intervalo de 3,8 a 4,5 durante un periodo de al menos 5 meses,
    donde las bacterias acidolacticas comprenden Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei y Enterococcus faecium, opcionalmente, almacenar la preparacion a aproximadamente 4 °C.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 8 donde las especies de bacterias acidolacticas se hacen crecer conjuntamente en un solo sustrato de crecimiento.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 8 o reivindicacion 9 donde dos o mas especies de bacterias acidolacticas se hacen crecer en sustratos de crecimiento separados y se mezclan entre sf antes del almacenamiento a aproximadamente 4 °C.
  11. 11. Un metodo para preparar una preparacion estable y metabolicamente activa de bacterias acidolacticas que comprende:
    anadir bacterias acidolacticas a un sustrato de crecimiento que comprende una mezcla de oligosacaridos y polisacaridos, y monosacaridos y disacaridos, protemas y peptidos, para formar una preparacion de microorganismos, donde la cantidad total de azucares en el sustrato de crecimiento esta en el intervalo de 20 mg/ml a 40 mg/ml y donde la cantidad total de azucares reductores en el sustrato de crecimiento esta en el intervalo de 5 mg/ml a 20 mg/ml, cuando se mide utilizando el metodo de Nelson-Somogyi, y donde las bacterias acidolacticas se anaden al sustrato de crecimiento a una concentracion que proporciona un estado de crecimiento proximo al equilibrio caracterizado por que la poblacion de bacterias acidolacticas en la preparacion se puede mantener en el intervalo de 108 a 109 celulas viables por mililitro cuando se almacenan a aproximadamente 4 °C y a un pH controlado en el intervalo de 3,8 a 4,5 durante un periodo de al menos 5
    meses, donde las bacterias acidolacticas comprenden Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei y Enterococcus faecium y, opcionalmente, almacenar la preparacion a aproximadamente 4 °C.
  12. 12. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 donde el sustrato de crecimiento es como se define 5 en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.
  13. 13. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 donde antes del almacenamiento de la preparacion se anade un agente antifungico.
    10 14. Una preparacion metabolicamente activa y estable de bacterias de acuerdo con una cualquiera de las
    reivindicaciones 1 a 4 para su uso como medicamento.
  14. 15. Uso de una preparacion metabolicamente activa y estable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la fabricacion de un medicamento para su uso en el tratamiento de un trastorno que afecta al equilibrio
    15 microbiano intestinal en un sujeto mairnfero.
  15. 16. Uso de acuerdo con la reivindicacion 15 donde el trastorno que afecta al equilibrio microbiano intestinal es la enfermedad cronica inflamatoria de intestino, la colitis ulcerosa o la enfermedad de Crohn.
    20 17. Uso de una preparacion metabolicamente activa y estable de bacterias de acuerdo con una cualquiera de las
    reivindicaciones 1 a 4 en la fabricacion de un medicamente para su uso en el mantenimiento del equilibrio microbiano intestinal en un sujeto marnffero.
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