CN101027387A - 代谢活性微生物及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及有代谢活性细菌的制备物、包含这种制备物的组合物例如益生素补充物或动物饲料及其用途，例如治疗影响肠道微生物平衡的疾病。同时也描述了微生物的生长基质，所述基质包含复合和简单糖的混合物，和利用这种生长基质制造有代谢活性微生物制备物的方法。

Description

代谢活性微生物及其生产方法
技术领域
本发明涉及代谢活性细菌的制备物、包含此制备物的组合物例如益生素补充物或动物饲料及其用途，例如在治疗疾病中的用途。本发明还涉及微生物的生长基质，该生长基质包含复合和简单糖的混合物，和利用此生长基质制造有代谢活性微生物制备物的方法。
背景技术
通常使用微生物有机体作为食品补充物。一个实例是已知对肠道微生物群落具有有益影响的益生菌，其可增加对传染性疾病比如腹泻的抵抗力。益生素还显示出涉及血液化学修饰和免疫调节(见参考文献部分中列在潜在健康益处之下的参考文献)。
益生菌可在乳制品比如酸奶中发现并且已知有益健康的菌种包括那些来自肠球菌属和乳杆菌属的菌种。然而，益生素乳制品的保存期很短。消费者也能买到粉末或片剂形式的益生素。益生素另外的应用涉及在动物饲料中的使用。
目前保存细菌培养物的方法通常使用冻干法，也被称作冷冻干燥法。在此方法中，通过升华作用从生物体除去水并且在加入水后生物体可以复活。然而，冻干的细菌没有代谢活性并且众所周知的是冻干的产物在室温下保存几周后通常丧失了它们大部分的复原能力(Fonseca et al andMurga et al)。
此外，许多商业益生素似乎并不包含标签上所提及的所有菌种，并且存在的细菌中活细菌量经常是非常低的(J.Hamilton-Miller)。
现在本发明人已经确认，活的、有代谢活性细菌的稳定制备物可使用特定的生长基质来制备，该生长基质包含平衡量的复合和简单碳水化合物。与现有技术中的益生素相比，根据本发明提供的制备物包含大量可在长期储存期间保持稳定和活性的细菌。
发明内容
本发明的第一方面提供了包含活的、有代谢活性的细菌的制备物以及包含复合和简单碳水化合物的混合物的生长基质，其中细菌表现出平衡的生长状态，该状态的特征在于当在约4℃和控制pH条件下保存至少5个月时，细菌群保持稳定的水平。
本发明的一个基本特征是，在此制备物中细菌培养物可以在4℃、控制pH条件下至少5个月期间维持平衡状态。在此状态中，维持细菌的增殖率接近其死亡率。在优选实施方案中，接近平衡状态的有代谢活性细菌群维持在108-109个活细胞/ml制备物。
所述生长基质包含复合和简单碳水化合物(糖)的混合物。在本文中使用的术语“复合碳水化合物”或“复合糖”包括寡糖和多糖，而术语“简单碳水化合物”或“简单糖”包括单糖和二糖。
优选的是，生长基质中糖的总量为20mg/ml-40mg/ml，还原糖的总量为5mg/ml-20mg/ml。在优选实施方案中，总的糖浓度为约30mg/ml，还原糖的浓度为约10mg/ml。
所述生长基质优选还包含蛋白质和肽成分。典型的是，基质中存在的蛋白质和肽的总量为1mg/ml-2mg/ml，高分子量肽(分子量大于5000道尔顿)的总量为100μg/ml-300μg/ml。在特定的实施方案中，蛋白质和肽的浓度可以是约2mg/ml，高分子量肽的浓度可以是约250μg/ml。
所述生长基质可以包含另外的成分，例如纤维素、淀粉、β-葡聚糖、戊聚糖、多酚、核糖核酸、脂质、磷酸盐、类黄酮(flavenoids)、氨基酸、维生素(B1、B2、C和E)、硅酸盐和微量元素。
在优选实施方案中，生长基质来源于发芽的谷物。最优选的是，用下文描述的方法制备生长基质。
本发明比目前的益生素制备物具有优势，因为有代谢活性细菌可以保存许多个月而没有退化或丧失活性。目前使用的冻干细菌制备物通常即便有也只含很少的有代谢活性细菌。此外，冻干的细菌制备物一旦再水化，将丧失它们的一些特性和活性。同样，再活化细菌的贮藏寿命很短并且只能保存很短的时间。在用于宿主动物之前，冻干的细菌通常不被再水化。如果它们被再水化，那么它们必须在当天使用，否则活力将迅速丧失并且会因为污染生物而腐败。
现有技术的冻干制备物的另一个问题是吸湿(从空气中吸收水分)并且因此包装物必须在开封后的几天内使用，否则部分的水化作用将引起活力的快速丧失。
根据本发明的制备物避免了上面列举的有关使用冻干的细菌培养物的问题。此外，发明人也显示了根据本发明制备的细菌培养物比通过现有技术中的已知方法制备的细菌明显更加强壮，其能够使细菌在宿主动物体内更快地定居并且能容忍哺乳动物消化道的苛刻环境(在实施例5中举例说明)。
发明人已经克服了常规上使用的制备物的问题，通过使用具有平衡营养供给的，复合和简单糖、蛋白质和肽形式的生长基质，并结合控制pH和冷藏条件。在这些条件下，制备物中的细菌持续缓慢地生长。温度、pH、阶段生长和基质的组合强制形成了接近平衡的生长状态，从而活的、有代谢活性细菌的高浓度可以维持至少5个月。
在一个实施方案中，保存时维持制备物的pH为3.8-4.5。在一个特定实施方案中，保存期间制备物的pH维持在约4.0。可通过加入合适的缓冲剂或缓冲试剂的组合来方便地控制制备物的pH。优选的缓冲剂包括，例如，柠檬酸三钠或磷酸缓冲剂。本领域的标准方法描述了缓冲剂，比如柠檬酸三钠或磷酸缓冲剂的使用。
在优选实施方案中，制备物中的细菌是乳酸菌。在本文中使用的术语“乳酸菌(LAB)”描述的是一组革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、非运动性厌氧细菌，它们将碳水化合物发酵成乳酸。这个组包括乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、片球菌属(Pediococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和肠球菌属(Enterococcus)。
在优选实施方案中，所述细菌属于乳杆菌属或肠球菌属。在最优选实施方案中，乳酸菌属于以下菌种中的至少一种：屎肠球菌(Enterococcus faecium)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。在一个优选实施方案中，使用屎肠球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌的组合。
所述制备物还可以包含抗真菌剂，例如灭菌的山梨酸钾和/或抗氧化剂，比如维生素C。
在本发明第二方面中还提供了包含碳水化合物复合混合物的微生物(特别是细菌)的生长基质。所述生长基质包括包含糖的单体、二聚体、低聚体和多聚体的复合和简单糖的混合物。
在上面有关本发明第一方面的描述中基本上给出了生长基质的优选特征。因此，生长基质中存在的碳水化合物(简单糖加上复合糖)总量优选为20mg/ml-40mg/ml，更优选25mg/ml-35mg/ml和最优选约30mg/ml。在这个总碳水化合物(糖)含量中，还原糖(单糖)的总量优选为5mg/ml-20mg/ml，更优选5mg/ml-15mg/ml和最优选约10mg/ml。
尽管简单和复合碳水化合物是生长基质的关键成分，应该理解的是生长基质还可以包含另外的成分，比如提供细菌生长氮源的蛋白质。由此生长基质优选包含的蛋白质和肽的总量为1mg/ml-2mg/ml，优选约2mg/ml。在这个总的蛋白质/肽含量中，高分子量肽(分子量大于5000道尔顿)的总量可以是100μg/ml-300μg/ml，典型的为约250μg/ml。生长基质中蛋白质和肽成分的准确特征(例如氨基酸序列)通常不是本发明的内容。
所述生长基质可包含另外的成分，例如纤维素、淀粉、β-葡聚糖、戊聚糖、多酚、核糖核酸、脂质、磷酸盐、类黄酮(flavenoids)、氨基酸、维生素(B1、B2、C和E)、硅酸盐和微量元素。基质中这些额外成分的准确特征和相对量没有特定的限制。如果优选的话，生长基质是源自天然植物来源，例如发芽的谷物，这些另外的成分通常是天然存在的生物分子。
所述生长基质可包含各种添加物比如缓冲剂和其它用来改善基质性能和/或延长保存期的物质。这样的添加物可以包括，例如，抗真菌剂、抗氧化剂等。
在优选实施方案中，所述生长基质可以包含颗粒物质，例如直径不超过1mm的颗粒。
可从发芽的谷物开始使用下文描述的制造方法制备生长基质。然而，本发明不限于根据此方法制备的基质。可以用合成的方式制备显示基本相似特性的生长基质，例如将必需的复合和简单碳水化合物与上面列举的任何另外成分一起进行混合。
本发明的另一方面提供了制备微生物的生长基质的方法，所述方法包括：
将发芽的谷物糖化，其中混合发芽的谷物与水成液并置于限制复合碳水化合物向简单碳水化合物转化程度的时间和温度条件下，从而获得复合和简单碳水化合物、蛋白质和肽的混合物，和
从经过处理的发芽谷物中分离复合和简单碳水化合物、蛋白质和肽的混合物，从而获得生长基质。
本文中使用的术语“发芽的谷物”或“麦芽”表示用麦芽制造方法处理谷物的产物。在酿造领域中麦芽制造是众所周知的方法。
在典型的麦芽制造方法中，使谷物发芽以诱导贮存营养物的活动化(mobilisation)。发芽的种子产生大量酶以动员(mobilize)贮存的蛋白质和碳水化合物，包括将淀粉水解成麦芽糖的α-淀粉酶。优选的实施方案涉及大麦的使用，但是在本发明的范围内可以使用其它谷物，比如稻、小麦、玉米和燕麦或甚至它们的混合物。发芽的方法通常是众所周知的。
应该理解的是可以通过提供发芽的谷物或包含碳水化合物、蛋白质和酶混合物的合成基质来实施本方法。
优选的是，在进一步的处理之前碾压发芽谷粒。通过碾压使谷物破裂促进了糖化步骤中水的进入和营养物的提取，同时避免谷物粉碎以参与随后从经过处理的发芽的谷物中分离生长基质。
制备的麦芽经过糖化步骤，该步骤类似于酿造方法中所用的糖化步骤(例如见Kunze，W.Technology Brewing and Malting(1996))。术语“糖化”在酿造领域中是众所周知的，并且涉及将发芽的谷物在加热到确定温度的水中搅动来制备麦芽汁的过程。在糖化步骤中，发芽谷物中的复合碳水化合物被降解成麦芽糖。
本发明的方法也涉及糖化(mash)步骤，其中发芽的谷物与水成液(通常是水)混合并且将混合物加热至各种规定的温度。然而，这个糖化步骤与典型啤酒酿造的糖化方法不一致。啤酒酿造的目的在于尽可能多地将碳水化合物转化成简单糖，随后发酵成酒精。与此相比，本发明的方法中特别地选择糖化步骤的条件从而限制转化成简单(还原)糖的程度，剩余相当数量更复杂的低聚体和多聚体形式的碳水化合物。
在非限制性实施方案中，可以限制碳水化合物的转化程度，使得得到的生长基质中存在的以总碳水化合物含量百分比(w/w)形式表示的简单(还原)糖的量为10％(w/w)-50％(w/w)。
期望的复合糖向简单糖有限转化可通过在短时间内增加糖化步骤中的温度来实现，典型地为30分钟，并且不让发芽谷物/水的混合物在中间温度静置。传统酿造方法包括在60-65℃和70-74℃静置，因为这使得酶产生高浓度的简单糖(主要是麦芽糖)。由此，在本发明的优选实施方案中，糖化步骤不包括在60℃-65℃和/或70℃-74℃的温度下静置。
在特定的实施方案中，糖化步骤包括将发芽的谷物与水在30℃-45℃的温度下混合，静置混合物1-2个小时，在20-40分钟内使温度升至75℃-85℃，优选30分钟，随后使混合物在75℃-85℃静置60-90分钟。在较高的温度下，混合物中存在的任何酶都将失活并且可以提取营养物。通常优选76℃-80℃，尤其是78℃的较高温度。在此步骤中，温度需要在足够长的时间内足够的高，从而使制备物中存在的所有酶失活。应该理解的是，所用的温度和时间可以根据所用谷物的类型稍微改变。
本文描述的方法尤其限制复合糖向简单糖转化的量。此外，在30℃-45℃下最初的静置提供的另外益处在于，它使氨基酸和肽的释放最大化。通常优选所述范围内较高一端的温度，即40℃-45℃或特别是约45℃。此步骤的目的是将谷物中存在的贮存蛋白质水解成可用的氨基酸和肽。实现期望的水解所需的时间和温度的最佳组合可以根据所用谷物的类型稍微改变。
在用来支持微生物的生长的生长基质中期望存在高浓度的蛋白质、肽和氨基酸，因为它提供了有用的氮源。在传统酿造中所用的典型糖化方法通常不包括在此温度范围内的静置，因为啤酒制造通常不寻求在打算用来发酵产生酒精的麦芽汁中获得高的蛋白质或氨基酸含量。
当糖化步骤完成时，例如已经从现有的“经过处理的”发芽谷物中提取了所有期望的营养物，使用任何合适的手段可以从麦糟中分离产生的包含复合和简单碳水化合物、蛋白质和肽的混合物从而获得生长基质。典型地这包括粗过滤，例如使用1mm过滤材料比如楔形-铁丝篮，产生包含粗颗粒的溶液。本发明方法的特征是所述生长基质未被澄清化，正如通常标准酿造中制备麦芽汁的情形。在传统酿造中，通常将麦芽汁澄清化以去除所有粗的颗粒，由此产生清澈的液体。
在根据本发明方法所制备的生长基质中存在一些颗粒物对随后用于支持细菌生长是有益处的，因为它即可以缓慢释放营养物又提供了附着细菌培养物的颗粒表面。
如果是必需的话，根据本发明制备的生长基质可以在进一步应用前进行灭菌。应该理解的是，这能通过煮沸约一小时来实施或者通过在120℃高压灭菌约20分钟来实施。
如果需要的话可以向生长基质加入缓冲剂或几种缓冲成分，例如，如果生长基质随后将用于制造根据本发明第一方面的细菌制备物。优选的缓冲剂与在有关本发明第一方面中所列举的缓冲剂一样。如果生长基质要进行灭菌，缓冲剂可以根据需要在灭菌之前、期间或之后加入。
在本发明另一方面中还涉及生产活的、有代谢活性和稳定的微生物的方法，包括：
使微生物在包含复合和简单糖、蛋白质和肽的混合物的生长基质中生长，从而获得微生物制备物，和
将得到的制备物冷却至约4℃，其中微生物处于接近平衡的生长状态，所述状态的特征在于当在约4℃和控制pH条件下保存至少5个月时，制备物中的细胞群可以维持稳定的水平，和任选地在约4℃保存制备物。
在此方法的优选实施方案中，所述微生物是细菌。
在特定的实施方案中，细菌在生长基质中生长，直到它们的浓度达到2×108-1×109集落形成单位/ml。在这时，培养物(或发酵物)被冷却至约4℃并且温度、pH、生长阶段和剩余基质组成的组合提供了允许在长期保存期间维持接近平衡生长状态的平衡条件。在这个可以维持至少5个月的接近平衡状态中，有代谢活性的细菌群被维持在108-109个活细胞/ml的基本稳定的水平上。然而，应该理解的是，在接近平衡状态的活细胞的精确量可以根据所用细菌的菌种稍微改变。
根据本发明这个方面的方法包括“生长步骤”，其中微生物(例如细菌)在生长基质中生长，直到它们达到能够在随后保存期间实现接近平衡条件的浓度。该方法的重要特征是所用的生长基质提供均衡的营养供应，该营养供应包含复合和简单糖的混合物，其中碳水化合物含量的很大比例是可用作微生物的能源的复合糖形式。这种混合物帮助在生长步骤期间限制立即可用的能量。生长基质的组成和优选特征优选地如上面有关本发明第一和第二方面中描述的。优选使用本文中描述的制造方法从发芽的谷物制备生长基质。然而，应该理解的是，不必严格地使用根据此方法制备的生长基质。使用通过混合所需比例的复合和简单碳水化合物、蛋白质和肽而合成制备的生长基质可以获得相似的结果。
在进行生长步骤时，必须注意不能使微生物生长时间过长，以避免产生酸性条件，否则酸性条件将抑制进一步的生长以及限制所得制备物的保存期。另一方面，如果过早地终止生长步骤，这将限制生物量生产。在微生物生长期间，制备物的pH可用作接近平衡状态的指示器。在典型的实施方案中，乳酸菌培养物可以生长至pH达到4.5+/-0.3个单位。
应该理解的是生长基质的pH可以根据所用微生物(例如细菌)的最佳pH范围稍微改变。在典型的实施方案中(适用于乳酸菌)，在保存期间pH应该维持在3.8-4.5。优选的是，将缓冲剂，比如柠檬酸三钠或磷酸盐加入生长基质从而控制微生物生长期间和随后保存期间的pH。
应该理解的是，微生物(例如细菌)生长至接近平衡状态的步骤的准确时机取决于所用菌种。微生物生长可以在任何合适的培养装置中进行。在特定实施方案中，生长步骤可以在发酵容器中通过发酵的方式进行。
在优选实施方案中，所用微生物是乳酸菌。优选菌种属于肠球菌属和乳杆菌属。如果使用主要由简单糖组成的“常规”生长培养基培养这样的菌种，过度的能量供应将使乳酸菌产生过量的酸，这将限制生物量的产生和所得培养物的保存期。相比之下，本发明方法所用的生长基质中存在的糖的复合混合物提供用在初始生长步骤中的能源，还用于产物保存期间的维持。
根据本发明，可以使用细菌的单一菌种(或其它微生物)实施生长步骤。在本发明的优选实施方案中，两种或多种不同的细菌(微生物)菌种可以在分开的生长培养基中独立生长并且随后在冷却步骤之前或之后混合在一起。用于独立培养两种或多种不同细菌菌种的生长培养基可以是相同或不同的组成。因此，可以最佳化培养单一细菌菌种的生长条件并且随后将培养物组合在一起，用于在允许维持培养物中各个单一菌种平衡生长的条件下的保存。
在此方法的其它实施方案中，如果它们的生长率是相当的，使得一个菌种不能支配整个菌群，那么两种或多种不同的细菌菌种(或其它微生物)就可以在相同生长基质中的同一培养物中一起培养。生长步骤之后，可以通过标准方法分析制备物以确定微生物纯度并计数微生物。也可以在分开的生长基质中一起培养两种或多种不同的微生物(例如细菌)组合，随后将培养物一起组合在终产物中。组合培养物可以同样地与单一细菌菌种培养物混合。
用于本方法生长步骤的起始培养物包括，例如，冻干的细菌或液体培养物。
应该理解的是，使用本发明方法制备的微生物制备物可以在冷却步骤后立即使用，但是更典型的是在使用之前保存制备物。为了在培养物中维持接近平衡的生长状态，保存的最佳温度为约4℃，但是技术人员应该理解的是保存温度可以稍微改变。方便起见，可以在长期保存之前将由此方法产生的接近平衡的培养物的等分样分装成合适的灭菌包装。
本发明方法的一个关键优势在于，当在延长的时间内保存时，典型地是至少5个月，产生的接近平衡的培养物保持存活性和完整性。然而，应该理解的是，在使用之前培养物必须实际保存至少5个月对于本方法而言并不是必需的。
为避免真菌或酵母的生长，在保存之前，可以加入抗真菌剂，比如灭菌的山梨酸钾。抗真菌剂主要是为了防止最终用户使用期间，一旦产品容器被打开时由酵母或真菌引起的腐败。此外，可以加入有助于防止保存期间产品腐败的抗氧化剂，例如，维生素C。应该理解的是，还可以使用本领域熟知的其它试剂作为抗真菌剂或抗氧化剂。
在本发明的另一方面中还涉及产生活的、有代谢活性的和稳定的微生物制备物的可选择方法，其不需要活跃的生长步骤。这种方法包括以下步骤：
将微生物加入包含复合和简单糖、蛋白质和肽的混合物的生长基质以形成微生物制备物，其中微生物以提供接近平衡生长状态的浓度加到生长基质中，所述接近平衡生长状态的特征在于当在约4℃和控制pH条件下保存至少5个月时，制备物中的微生物群可以维持稳定水平，和任选地在约4℃保存制备物。
在此方法的优选实施方案中，所述微生物是细菌。优选的细菌菌种与上面有关需要活跃生长步骤的方法中列举的一样。
此方法在施加接近平衡生长的条件之前，微生物(例如细菌)不需要在生长基质中生长。更确切的是，将微生物(例如细菌)起始培养物以一定的浓度接种至生长基质，所述浓度允许所得制备物在4℃和受控pH条件下保存至少5个月时维持平衡状态。所述方法的起始培养物包括，例如，冻干的细菌或液体培养物。可以用超过一种的细菌菌种接种生长基质。优选的是，起始培养物中活细胞的浓度超过108个活细胞/ml。
通过生长基质中的营养物、温度、pH和阶段生长的组合再次达到接近平衡的状态。在能够维持至少5个月的接近平衡的状态中，优选将有代谢活性的细菌群维持在108-109个活细胞/ml的稳定水平。还应该理解的是，接近平衡状态的活细胞的准确量可根据所用细菌的菌种稍微改变。还应该理解的是，起始培养物的浓度和生长基质的pH可以根据所用细菌的种类稍微改变。
将在有关应用需要生长步骤的方法中所产生的接近平衡的培养物中描述的优选特征加以必要的变更应用于使用这种方法获得的接近平衡的培养物。因此，在优选实施方案中，保存期间接近平衡的培养物的pH维持在3.8-4.5。优选的是，在保存期间使用缓冲剂，比如柠檬酸三钠或磷酸盐来控制pH。
在优选实施方案中，所用微生物是乳酸菌。优选的菌种属于肠球菌属和乳杆菌属。
在此方法中所用的生长基质的优选特征与上面有关本发明第二方面中所描述的一样。另一方面，使用本文中描述的方法从发芽的谷物制备所述生长基质是优选的但不是必需的。
有代谢活性细菌的制备物的用途
有益健康的益生素是众所周知的(见，例如，Marteau，P.andRambaud，J-C，(1996)‘Therapeutic applications of probiotics inhumans’in Leeds，A.R.and Rowland，I.R.(eds.)Gut flora andhealth-past，present and future，Royal Society of Medicine Press Limited，London；Stark，B.A.and Wilkinson，(eds.)(1989)Probiotics.Theoryand Applications)。益生素已经显示出对治疗腹泻和便秘、肠易激综合征、癌的治疗和预防与其它影响肠内微生物群落的疾病是有用的。
因此，发现了由本发明提供的细菌制备物在治疗或预防影响微生物肠内群落的疾病中的特定效用，和在帮助维持健康微生物群落中更普遍的效用。
由此，本发明的另一方面提供治疗和预防影响人或动物患者肠内微生物平衡的病症的方法，包括向需要的患者施用有效量的根据本发明的有代谢活性和稳定的细菌制备物。
具体而言，本发明涉及治疗或预防慢性炎性肠病、溃疡性结肠炎或克罗恩病。此外，根据本发明的细菌培养物可以给人或动物(例如哺乳动物或鸟)施用以全面维持健康的微生物群落，而不是用于治疗特定的疾病。
在另外的实施方案中，本发明还涉及根据本发明的有代谢活性和稳定的细菌制备物在制备治疗影响微生物肠内群落的疾病的药物中的用途。
细菌制备物可以以本来形式使用，例如作为益生素补充物使用，或者在施用给人或动物对象之前它们可以与另外的成分混合，或者甚至不混合的与另外的成分一起施用。对于兽医使用，可以很方便地将细菌制备物加到正常动物饲料中。在兽医领域中发现所述制备物在治疗鸟类，尤其是市售家禽(如在所附实施例中列举的)，以及治疗哺乳动物种类，例如牛、羊、马、猫、狗等中的特定效用。
对于人的应用，所述细菌制备物可以以本来形式施用，或者在施用于人对象之前与另外的成分再次混合或配置后再施用。因此本发明包括含有根据本发明的细菌制备物加上一种或多种另外成分的组合物。通过实例的方式，可以加入另外的成分以改善人消费的组合物的可口性。如果为了便利，可以将根据本发明的制备物并入人消费用的食品或饮料中，只要这不影响细菌在制备物中的存活性。
对于人和/或兽医的使用，可以将根据本发明的制备物方便地配制成单位剂量形式，单独的或者是与一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体组合在一起。同样，这种制剂不应该对细菌在制备物中的存活性有不利的影响。
附图说明
结合附图参考以下非限制性试验实施例将更进一步理解本发明，其中：
图1a-1d显示根据本发明描述的方法制备的植物乳杆菌液体培养物(“湿性”)与冻干的细菌制备物(“干性”)强壮性的比较。最先的两个生长曲线(图1a和1b)表明在非有害环境(non-hostile)中，根据本发明制备的细菌比冻干的制备物生长更快。图1c中的生长曲线显示通过本文描述的方法制备的植物乳杆菌(“湿性”)与冻干的细菌制备物(“干性”)在补充胆汁盐的培养基中生长的比较。图1d显示通过本文描述的方法制备的植物乳杆菌(“湿性”)与冻干的细菌制备物(“干性”)在模拟哺乳动物消化道环境的低pH和存在胆汁盐的条件下生长的比较。结果显示根据本发明方法制备的细菌对有害环境有更强的抵抗性。
图2a和2b显示根据本发明制备的细菌的保存期增加。
图3显示细菌在小鸡小肠中的建群。
具体实施方式
实施例1：使用基于大麦的培养基生产生长基质
(A)发芽(麦芽制造)
第一天
根据谷物的批次，将大麦在水中浸泡2-24小时。水中可含有0.1％(w/v)的次氯酸钠(漂白剂)以抑制发芽阶段污染物的生长。4小时之后，从谷物中排出水并且将谷物置于10-30℃的室温下约1天时间。
第二天
将谷物在干净水中另外浸泡4小时。这次和随后的浸透的水中可以加入过氧化氢(0.1％w/v)。过氧化氢给发芽的谷物提供氧，并且作为消毒剂。作为选择，可以使用次氯酸钠。4小时后，从谷物中排出水并且将谷物放置约1天。对谷物偶尔的(例如每隔4小时)搅拌可以通过增加气体交换、提供氧和去除二氧化碳来改善发芽。
第三天起
继续浸泡、排水和放置循环，直到发芽谷物上出现的小根达到2-4mm长。此生长状态表明谷物已经产生动员贮存营养物的酶。这些酶对‘糖化’期间随后的产生生长培养基是非常重要的。可以对谷物进行更广泛的改进，让发芽阶段直到小根达到几毫米长为止。然而，太长的生长仅仅将营养物转化成为植物的根和芽，其并不能用在发酵中。
(B)碾压
当谷物已经充分发芽时，接着用滚筒碾磨机对它们进行碾压。调整碾磨机以使谷物破裂开口但并不粉碎或完全变平。破裂谷物允许在糖化期间水的进入和营养的提取，同时避免谷物的粉碎从而有利于过滤步骤。
(C)生长基质的制备
在45℃将发芽的、碾压的谷物与足够覆盖它们的水混合，并且将混合物在45℃保持1小时。
在45℃保持1小时之后，在30分钟的期间将温度升高至78℃。
将混合物放置在78℃条件下1小时。在78℃的放置后，通过过滤将经过处理的谷物分出。使用相对粗的过滤器(例如1mm缝隙楔形-铁丝篮)产生含有相当大量悬浮固体的溶液。抛弃经过处理的谷物并且接下来加热处理液体从而对其进行巴氏灭菌或消毒。在此特定的试验中，液体被煮沸45分钟。随后加入缓冲剂(0.5％(w/v)柠檬酸三钠)并且混合物被进一步煮沸15分钟从而产生最终的生长基质。
实施例2：生长基质的分析
(a)碳水化合物分析
使用苯酚-硫酸分析法测定总碳水化合物含量，用葡萄糖作为参考标准。(Dubois，M.，Gilles，K.A.，Hamilton，J.K.，Rebers，P.A.and Smith，F.(1956)Analytical Chemistry，vol.28.，p.350)。
使用Nelson-Somogyi方法测定还原糖，同样用葡萄糖作为参考标准。(Somogyi，M.(1952)Journal of Biological Chemistry.，vol.195.，p.19)。
结果：
基质中的总糖为20-40mg/ml(毫克每毫升)，还原糖为5-20mg/ml。
(b)蛋白质和肽分析
使用两种分析法测定总蛋白质，用牛血清白蛋白作为参考标准：
(i)双缩脲试剂法(Itzhaki，R.F & Gill，D.M.(1964)AnalyticalBiochemistry，Vol.9.，p.401-410)。
(ii)由Ohnishi和Barr.改进的Lowry方法(Ohnishi，S.T.& Barr，J.K.(1978)Journal of Biological Chemistry，Vol.193，p.265)。
使用Bradford试剂测定分子量超过5000道尔顿的肽(Bradford，M.M.(1976)Analytical Biochemistry，Vol.72，p.248-254)。
结果：
总蛋白质和肽为1-2mg/ml。
高分子量的肽(大于5000道尔顿)为100-300μg/ml。
实施例3：产生有代谢活性的细菌培养物
(A)发酵
将根据实施例1制备的生长基质冷却至37℃并加入细菌培养物。合适接种物的实例是冻干的细菌或液体起始培养物(典型地是营养培养液中1％(v/v)的过夜培养物)。
在此实施例中，以下细菌在两个容器中生长：
(i)屎肠球菌、植物乳杆菌
(ii)干酪乳杆菌
发酵进行16-20小时，直到pH达到4.5+/-0.3单位。随后将发酵混合物冷却至4℃并用标准技术评估质量(确定微生物的纯度和计数细菌)。
在此，可以向发酵的培养液中加入消毒的山梨酸钾(0.005％w/v终浓度)。这起到抑制任何真菌或酵母生长的作用，真菌或酵母可以由于最终用户使用期间的污染而出现。
还可以加入作为抗氧化剂的维生素C(0.01％w/v终浓度)。
质量保证检验之后，如果需要的话，可以将不同的批次物混合从而获得含有细菌菌种的复杂混合物的产物。
在此列举的实施例中，混合两批次的细菌产生含有屎肠球菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌的终产物。
实施例4：有代谢活性细菌培养物的保存期
为评估有代谢活性细菌培养物的保存期，将实施例2中获得的包含屎肠球菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌的细菌培养物批次在4℃(+/-1℃)保存。一周一次进行采样，以0.1％(w/v)蛋白胨水连续稀释的100μl等分试样被涂布在琼脂平板上。在约37℃培养平板约48小时，并计数细菌集落。
结果
下面的结果以每周每毫升集落形成单位的数量来说明由本发明方法制备的细菌的保存期(同样见图2)。已经根据本文中描述的同样方法制备A和B批物，但它们是在不同的天数上制备的。
E.f＝屎肠球菌
L.p＝植物乳杆菌
L.c＝干酪乳杆菌
LAB＝乳酸菌
cfu/ml＝每毫升集落形成单位
表1
A批(8059)
周 E.f L.p L.c   总LAB
    012345678910111213141516171819202122   2.7E+082.0E+082.4E+083.0E+083.0E+083.5E+083.0E+083.1E+082.8E+082.5E+082.5E+082.2E+082.0E+081.6E+081.5E+081.5E+081.4E+081.2E+086.0E+074.0E+073.0E+074.0E+071.0E+07   1.2E+082.4E+082.2E+081.9E+081.8E+081.7E+081.9E+081.5E+081.7E+081.7E+081.6E+081.5E+081.4E+081.5E+081.5E+081.3E+081.3E+081.4E+081.4E+081.3E+081.1E+081.1E+081.0E+08   9.0E+071.9E+081.5E+089.0E+078.0E+076.0E+075.0E+073.0E+073.0E+073.0E+072.0E+073.0E+073.0E+072.0E+072.0E+072.0E+072.0E+072.0E+071.0E+072.0E+072.0E+072.0E+071.0E+07   4.8E+086.3E+086.1E+085.8E+085.6E+085.8E+085.4E+084.9E+084.8E+084.5E+084.3E+084.0E+083.7E+083.3E+083.2E+083.0E+082.9E+082.8E+082.1E+081.9E+081.6E+081.7E+081.2E+08
表2
B批(8060)
周 E.f L.p L.c  总LAB
    012345678910111213141516171819202122  3.0E+083.6E+083.0E+081.8E+082.1E+081.7E+081.6E+081.5E+081.2E+081.5E+082.3E+081.8E+081.6E+081.2E+081.0E+081.0E+081.0E+088.00E+079.00E+078.00E+076.00E+075.00E+074.00E+07   1.3E+081.6E+081.5E+062.2E+081.0E+081.0E+082.0E+081.4E+081.5E+081.1E+081.0E+081.0E+081.0E+081.1E+081.1E+081.0E+081.0E+089.00E+079.00E+078.00E+07-8.00E+07.00E+078.00E+07   1.5E+082.5E+081.4E+081.2E+088.0E+077.0E+078.0E+077.0E+075.0E+076.0E+075.0E+072.0E+073.0E+073.0E+072.0E+072.0E+072.0E+071.00E+071.00E+072.00E+071.00E+071.00E+071.00E+07  5.8E+087.7E+085.9E+085.2E+083.9E+083.4E+084.4E+083.6E+083.2E+083.2E+083.8E+083.0E+082.9E+082.6E+082.3E+082.2E+082.2E+081.8E+081.9E+081.8E+081.5E+08.1.3E+081.3E+08
实施例5：评估有代谢活性培养物和冻干细菌的强壮性
在这个系列试验中，使用单菌株植物乳杆菌接种生长培养基。随后通过监测在600nm的吸光度来测量在约37℃的生长(同样可以通过检查稀释物在琼脂平板上的生长来实施)。
‘湿性’表示细菌的液体培养物(由在此专利申请中描述的方法产生)。‘干性’表示细菌的冻干制备物，其仅在特定培养基培育之前被悬浮于MRS培养液(De Man，Rogosa and Sharpe Broth)。在每个配对培育中使用等量活的‘湿性’和‘干性’细菌。
(1)在富集和‘友好’培养基中的生长
将细菌接种到MRS培养液中，并监测它们的生长(×1＝接种物的终浓度为1×107cfu/ml；×2＝2×107cfu/ml)。结果显示在图1a中。此第一生长曲线表明在非有害环境中，液体培养物比冻干制备物的生长快很多。推测起来冻干制备物中的休眠细菌需要时间来再水化并起动和运行它们的新陈代谢。
(2)酸性冲击的影响
将1％(v/v)的液体培养物、或1％(v/v)冻干细菌的悬浮液加入MRS培养液中，该培养液已经用HCl调节到不同的pH值。细菌在酸性培养液中培育1小时，随后在MRS琼脂平板上对样品进行计数。
pH 6  5  4   3  2  1
湿性 106cfu/ml  106cfu/ml  106cfu/ml  106cfu/ml  6×105cfu/ml  0
干性 106cfu/ml  106cfu/ml  106cfu/ml  2×104cfu/ml  1×104cfu/ml  0
cfu＝每毫升集落形成单位
此结果表明‘湿性’细菌比‘干性’细菌能更好的在酸性环境中存活。因为胃的pH水平可以低至2，这明显与细菌在胃转运期间和其后期间的存活和适合度相关。
(3)pH和胆汁盐的联合影响
采用进一步的冲击水平，在以下条件中比较‘湿性’和‘干性’细菌制备物的生长：
(a)只有MRS培养液(图1b)
(b)补充有0.5％(w/v)胆汁盐(Oxoid L55)的MRS培养液(图1c)
(c)在pH3.0的MRS中培养1小时，接着在含有胆汁盐的MRS-培养液中生长(图1d)。
来自试验的联合结果表明以下要点：
●‘湿性’细菌比‘干性’细菌生长的更快。
●酸性冲击对‘干性’细菌比对‘湿性’细菌带来更有害的影响。
●胆汁盐抑制此两种类型细菌，但是与‘湿性’细菌相比，可能给‘干性’细菌带来更不利的影响。
●酸性冲击之后暴露于胆汁盐的联合的连续作用明显地减慢‘湿性’细菌的生长，但是杀死了‘干性’细菌(通过琼脂平板上缺少集落来判断)。
然而，虽然pH和胆汁耐受是非常重要的因素，但是有其它大量的益生细菌必须面对的挑战，即有化学方面的又有微生物方面的。因此简单地通过每克或每ml中集落形成单位的数量来判定细菌的存活力和总量是表明制备物作为功能性益生菌适合度的唯一指示。如果当细菌进入宿主时不是在活动状态，它们非常有可能被杀死，或者在它们有机会建群之前，需要经过很长的消化道。因此，如果当益生素进入宿主时是处于代谢活性状态，那么对它们在宿主内的应用是有益处的。根据本发明，细菌是活的和有代谢活性的形式，因此它们能够抵挡GI道的有害环境。设计所述产物有代谢活性的特性来增加在宿主内存活和建群的机会。
实施例6：对家禽小鸡胃肠微生物群落的影响
介绍和方法
根据本文中描述的方法制备含有乳酸菌屎肠球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌的益生素。检验益生素改变市售家禽(肉鸡)单位的家禽小鸡胃肠微生物群落的能力。
小鸡的处理
从第一天(日龄(day old))到第三天给家禽小鸡施用抗生素林可霉素(Lincospectin)。在第四天这些禽类不接受处理。在第五天，一半肉鸡舍的鸡以每5000只小鸡1升的比率接受所述制备物。余下的鸡舍的鸡作为对照。在第六天，从每组中随机选择6只小鸡处死，并且检查肠的微生物群落。(集合来自每组中成对小鸡的组织样品，于是从每组得到3个样品)。
微生物学分析：
选择用于分析的消化系统区域是上肠道，采自从小肠的起始部位向下到卵黄囊附着位点的部分。
来自成对小鸡的胃肠组织和内容物在灭菌的蛋白胨水中被浸软、稀释，并且将样品涂布在多种半选择性琼脂上。培养所述平板之后，与细菌的显微镜分析一起记录集落的特征和数量。通过检查集落特征、细胞形态和碳水化合物发酵特征(后者使用BioMerieux的‘api50CH’检测试剂盒进行)实施乳酸菌菌种的鉴定。
结果：
结果显示在图3中。
L1-L3＝经益生素处理的小鸡(1-3对)
C1-C3＝对照小鸡(1-3对)
SI＝小肠
cfu＝集落形成单位
正如所预期的，许多不同的微生物即存在于对照的又存在于益生素处理的小鸡的胃肠道中。总的来说，在两组小鸡中存在相似量和类型的细菌，但是在特定菌种的分布和量上有明显的差异。
乳酸菌
乳酸菌(LAB)的含量在制备物处理的小鸡和对照小鸡之间有非常显著的差异。同时两组有相当总量的LAB，对照小鸡的微生物群落的优势种是单一菌种，然而益生素处理的小鸡存在有更广范围的菌种混合。
实施例7：益生素制备物对鸵鸟幼雏的影响
实施一个试验来评估根据本发明的制备物对鸵鸟幼雏的影响。该试验进行4周时间，其中幼雏从第4天起患有腹泻。一组用根据本发明的制备物处理，第二组使用广谱抗生素和第三组使用维生素氨基酸补充物。试验结果显示用根据本发明制备物处理组的死亡率与抗生素处理组相比降低67％并且施用制备物可以缓解便秘、腹泻、肠淤滞、异常行为和下垂。此外，与对照组相比，在益生素制备物处理组中观察到体重增加27％。
在第二试验中，其中给种鸡施用100ml根据本发明的制备物，与对照组相比，可以观察到施用所述制备物导致繁殖力增加。
因此，这些结果显示施用根据本发明的益生素制备物影响了生长率、发病率和死亡率。
实施例8：益生素制备物对哺乳动物的有益影响
在小规模独立试验中，评估根据本发明的制备物对患有慢性肠炎的猫和狗的影响并且发现了它在恢复正常的肠微生物群落中的用处。
在对人的试验中，从自愿者中已经观察到制备物在治疗急性腹泻中的有益影响并且可以医治慢性肠不规则(chronic bowel irregularity)。
这种益处模式表明基于在此报导方法的产物具有控制人的急性和慢性胃肠功能紊乱(包括肠易激综合征和炎性肠病、食物中毒、传染性腹泻和便秘)的显著好处。现在正在实施一个完整的临床试验以支持迄今已获得的结果。
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Claims (64)

1.一种包含活的、有代谢活性的细菌以及含有复合和简单糖、蛋白质和肽的混合物的生长基质的制备物，其中制备物中的细菌表现出接近平衡的生长状态，所述状态的特征在于当在约4℃和控制pH条件下保存至少5个月时细菌群保持在稳定的水平。
2.根据权利要求1的制备物，其中当在约4℃和控制pH条件下保存至少5个月时细菌群保持108-109个活细胞/ml制备物的水平。
3.根据权利要求1或权利要求2的制备物，其中糖的总量为20mg/ml-40mg/ml，并且其中还原糖的总量为5mg/ml-20mg/ml。
4.根据权利要求3的制备物，其中糖的总量为30mg/ml。
5.根据权利要求3或权利要求4的制备物，其中还原糖的总量为10mg/ml。
6.根据权利要求1-5中任一项的制备物，其中蛋白质和肽的总量为1mg/ml-2mg/ml，并且其中高分子量肽的总量为100μg/ml-300μg/ml。
7.根据权利要求6的制备物，其中蛋白质和肽的总量为2mg/ml。
8.根据权利要求6或权利要求7的制备物，其中高分子量肽的总量为250μg/ml。
9.权利要求1-8中任一项的制备物，其中pH维持在3.8-4.5。
10.根据权利要求9的制备物，其中pH维持在约4.0。
11.权利要求1-10中任一项的制备物，其中通过缓冲剂控制pH。
12.权利要求1-11中任一项的制备物，其中所述细菌是乳酸菌。
13.权利要求12的制备物，其中所述细菌属于乳杆菌属(Lactobacillus)。
14.权利要求12的制备物，其中所述细菌属于肠球菌属(Enterococcus)。
15.权利要求12的制备物，其包含屎肠球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌或嗜酸乳杆菌中的至少一种。
16.权利要求15的制备物，其包含屎肠球菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌。
17.权利要求1-16中任一项的制备物，其另外包含抗真菌剂。
18.权利要求17的制备物，其中所述抗真菌剂是灭菌的山梨酸钾。
19.权利要求1-13中任何一项的制备物，其另外包含抗氧化剂。
20.权利要求14的制备物，其中所述抗氧化剂是维生素C。
21.一种用于微生物的包含复合和简单糖混合物的生长基质，其中糖的总量为20mg/ml-40mg/ml，并且还原糖的总量为5mg/ml-20mg/ml。
22.权利要求21的生长基质，其中糖的总量为25mg/ml-35mg/ml。
23.权利要求22的生长基质，其中糖的总量为约30mg/ml。
24.权利要求21-23中任一项的生长基质，其中还原糖的总量为5mg/ml-15mg/ml。
25.权利要求24的生长基质，其中还原糖的总量为约10mg/ml。
26.权利要求21-25中任一项的生长基质，其另外包含蛋白质和肽，其中蛋白质和肽的总量为1mg/ml-2mg/ml，并且高分子量肽的总量为100μg/ml-300μg/ml。
27.权利要求26的生长基质，其中蛋白质和肽的总量为约2mg/ml。
28.权利要求26或权利要求27的生长基质，其中高分子量肽的总量为约250μg/ml。
29.一种制备用于微生物的生长基质的方法，所述方法包括以下步骤：
将发芽的谷物糖化，其中混合发芽的谷物与水成液并置于限制复合碳水化合物向简单碳水化合物转化程度的时间和温度条件下，从而获得复合和简单碳水化合物、蛋白质和肽的混合物，和
从经过处理的发芽谷物中分离复合和简单碳水化合物、蛋白质和肽的混合物，从而获得生长基质。
30.根据权利要求29的方法，其中所述糖化步骤不包括60℃-65℃和/或70℃-74℃温度下的静置。
31.根据权利要求29或权利要求30的方法，其中所述糖化步骤包括将发芽的谷物与水在30℃-45℃的温度下混合，静置混合物1-2个小时，在20-40分钟内使温度升至75℃-85℃，和随后使混合物在75℃-85℃静置60-90分钟。
32.根据权利要求29-31中任一项的方法，其中通过粗过滤从经过处理的发芽谷物中分离复合和简单碳水化合物、蛋白质和肽的混合物。
33.根据权利要求29-32中任一项的方法，其中所述生长基质未被澄清化。
34.根据权利要求29-33中任一项的方法，其中所述谷物是大麦、小麦、稻、燕麦或玉米。
35.根据权利要求29-34中任一项的方法，其中所述生长基质是经过灭菌的。
36.根据权利要求29-35中任一项的方法，其中向生长基质中加入缓冲剂。
37.一种可通过权利要求29-36中任一项的方法获得的生长基质。
38.一种制备有代谢活性和稳定的微生物制备物的方法，其包括以下步骤：
使微生物在包含复合和简单糖、蛋白质和肽的混合物的生长基质中生长，从而获得微生物制备物，和
将得到的制备物冷却至约4℃，其中微生物处于接近平衡的生长状态，所述状态的特征在于当在约4℃和控制pH条件下保存至少5个月时，制备物中的微生物群可以维持稳定的水平，和
任选地在约4℃保存制备物。
39.权利要求38的方法，其中两种微生物生长在一种生长基质中。
40.权利要求38或权利要求39的方法，其中两种或多种微生物生长在分开的生长基质中并且在于约4℃保存之前将它们混合在一起。
41.一种制备有代谢活性和稳定的微生物制备物的方法，其包括以下步骤：
将微生物加入包含复合和简单糖、蛋白质和肽的混合物的生长基质中以形成微生物制备物，其中所述微生物以提供接近平衡生长状态的浓度加到生长基质中，所述接近平衡生长状态的特征在于当在约4℃和控制pH条件下保存至少5个月时，制备物中的微生物群可以维持稳定水平，和任选地在约4℃保存制备物。
42.权利要求38-41中任一项的方法，其中微生物是细菌。
43.权利要求42的方法，其中所述细菌是乳酸菌。
44.权利要求43的方法，其中所述细菌属于乳杆菌属。
45.权利要求43的方法，其中所述细菌属于肠球菌属。
46.权利要求43-45中任一项的方法，其中制备物中细菌的浓度为108-109个活细胞/ml。
47.权利要求38-46中任一项的方法，其中所述生长基质是权利要求21-28或37中任一项定义的生长基质。
48.根据权利要求38-47中任一项的方法，其中根据权利要求29-36中任一项的方法制备所述生长基质。
49.权利要求38-48中任一项的方法，其中在保存制备物之前加入抗真菌剂。
50.权利要求49的方法，其中所述抗真菌剂是灭菌的山梨酸钾。
51.权利要求38-50中任一项的方法，其中在保存制备物之前加入抗氧化剂。
52.权利要求51的方法，其中所述抗氧化剂是维生素C。
53.权利要求38-52中任一项的方法，其中所述制备物的pH维持在3.8-4.5。
54.权利要求53的方法，其中通过缓冲剂控制pH。
55.一种通过权利要求42-54中任一项的方法可获得的有代谢活性和稳定的细菌制备物。
56.一种包含根据权利要求1-20或55中任一项的有代谢活性和稳定的细菌制备物的动物饲料。
57.一种适合人消费的食品或饮料，其包含根据权利要求1-20或55中任一项的有代谢活性和稳定的细菌制备物。
58.一种药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂混合的根据权利要求1-20或55中任一项的有代谢活性和稳定的细菌制备物。
59.一种用作药物的根据权利要求1-20或55中任一项的有代谢活性和稳定的细菌制备物。
60.根据权利要求1-20或55中任一项的有代谢活性和稳定的细菌制备物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗影响哺乳动物对象的肠微生物平衡的病症。
61.根据权利要求60的用途，其中所述影响肠微生物平衡的病症是慢性炎性肠病、溃疡性结肠炎或克罗恩病。
62.根据权利要求1-20或55中任一项的有代谢活性和稳定的细菌制备物在制备维持哺乳动物对象的肠微生物平衡的药物中的用途。
63.一种治疗或预防影响人或动物患者肠微生物平衡的病症的方法，其包括对有此需要的患者施用有效量的根据权利要求1-20或55中任一项的有代谢活性和稳定的细菌制备物或根据权利要求58的药物组合物。
64.根据权利要求63的方法，其中影响肠微生物平衡的病症是慢性炎性肠病、溃疡性结肠炎或克罗恩病。
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