CZ296732B6

CZ296732B6 - Zpusob výroby alkoholických nápoju

Info

Publication number: CZ296732B6
Application number: CZ0037899A
Authority: CZ
Inventors: Souppe@Jerôme; Franciscus Beudeker@Robert
Original assignee: Syngenta Mogen B.V.; Gist-Brocades N. V.
Priority date: 1996-08-05
Filing date: 1997-07-23
Publication date: 2006-05-17
Also published as: PL191456B1; MXPA99001239A; US6361808B1; CN1230225A; BG64681B1; US20050095315A1; CA2262436A1; JP2000515381A; BR9711620A; AU720139B2; US20020164399A1; PL331493A1; BG103199A; WO1998005788A1; EP0915985A1; CZ37899A3; US6699515B2; AU4116197A

Abstract

Zpusob výroby alkoholických nápoju, napríklad piva nebo whisky, za pouzití smesi enzymu obsahující endo-.beta.-(1,4)xylanázu, arabinofuranosidázu, alfa-amylázu, endo-proteázu a .beta.-(1,3; 1,4)glukanázu a prípadne sacharizující amylázu a/nebo exo-peptidázu. Výhodne jsou smesi, které obsahují enzymy nezbytné pro varení piva, poskytovány transgenními semeny. Pro chut a barvu alkoholického nápoje je nezbytné pouze minimální mnozství sladu.

Description

Způsob výroby alkoholických nápojů

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby alkoholických nápojů, zejména piva a whisky.

Dosavadní stav techniky

Alkoholické nápoje, například pivo, lze vyrábět ze semen sladového a/nebo nesladového ječmene. Charakteristickou chuť a barvu dodává pivu kromě kvasnic slad. Slad navíc působí jako zdroj fermentovatelného cukru a enzymů. To, zdali se při varném procesu použije slad, závisí na typu piva a na zemi, ve které se toto pivu vyrábí. V afrických zemích se například slad do piva tradičně nepřidává.

Obecný postup sladování a vaření alkoholických nápojů nedávno popsal R. C. Hoseney (Cereal Foods World, 39 (9), 675-679, 1994). Sladování je proces řízeného klíčení, po kterém následuje řízené sušení zrna ječmene. Zrno se převede na slad postupným máčením, klíčením, růstem a sušením (pražením). Důležitým krokem pro získání exprese řady enzymů, které umožňují modifikaci endospermu, je v tomto ohledu klíčení. Toto modifikace produkuje fermentovatelné cukry.

Následné sušení/ohřívání, které jsou součástí sladovacího procesu, poskytuje chuť a barvu díly neenzymatickým hnědnoucím reakcím (Maillard).

Proces sladování je velmi komplikovanou a finančně náročnou součástí výroby piva. Mezi několik nevýhod sladovacího procesu, které lze změnit, patří:

- slad obsahuje různé koncentrace enzymů, takže nelze spolehlivě předvídat dosažené výsledky,

- ne každá enzymatická aktivita, která je žádaná, je během klíčení vytvořena nebo je vytvořena v dostatečném množství, takže je nezbytné tyto enzymy dodávat,

- podmínky, které podporují získání výrazné chuti a barvy, mohou mít škodlivý vliv na enzymatickou aktivitu sladu,

- tento způsob je drahý,

- během klíčení dochází v důsledku respirace a růstu kořínků (které se odstraní během čištění sladu) k 10 až 20% hmotnostním ztrátám,

- vzhledem k nepříznivým klimatickým podmínkám není možné produkovat slad na jakémkoliv požadovaném místě,

- použití sladu může vést ke koloidní nestabilitě v důsledku solubilizace proteinů proteázou přítomnou ve sladu,

- může docházet ke tvorbě biogenních aminů (J. Food Science 59 (5), 1104-1107, 1994), což může vést například khistaminové intoxikaci.

Slad a/nebo ječmen byl tradičně jediným zdrojem fermentovatelných cukrů a enzymů a v mnoha zemích je jediným zdrojem doposud. Nicméně v dnešní době se stále více a více piva vyrábí za použití jiných zdrojů cukrů. Jako zdroj těchto cukrů lze v podstatě použít jakýkoliv zdroj škrobu nebo zkapalněný/degradováný škrob. Tyto alternativní zdroje se označují jako tzv. doplňky. Protože slad nemá pouze funkci jako zdroj fermentovatelných cukrů, ale rovněž jako zdroj enzymů, je třeba v případě nahrazení více než přibližně 50 % sladu nesladovaným ječmenem a/nebo doplňky poskytnout alternativní zdroje enzymů. Kromě toho poskytuje slad pivu jeho charakteristickou chuť a barvu.

-1 CZ 296732 B6

Při výrobě skladu se vždy zohledňuje buď chuť, barva nebo enzymatická aktivita. Slad, který poskytuje výraznou chuť a tmavou barvu, lze získat extenzivnějším sušením při relativně vysokých teplotách. To jsou podmínky, které mají nežádoucí dopad na aktivitu enzymů. Doplnění enzymů z exogenního zdroje je tedy nezbytné z několika důvodů. Po určitou dobu bylo běžnou praxí používání mikrobiálních enzymů. Při vaření piva se například zrna a/nebo sladovaná zrna zkapalňovala a sacharizovala, s cílem získat fermentovatelné cukry. Zkapalnění lze zlepšit použitím termostabilní alfa-amylázy, které je například popsáno v patentech US 4 285 975 nebo US 5 180 669. Pro zvýšení množství volně dostupného dusíku ve kvasné kapalině zlepšení fermentace lze rovněž použít proteázu.

Vedle škrobu jsou v obilných zrnech přítomny i další polysacharidy, například β-glukany (Henry R.J.a kol., J. Sci. Food Agric. 36, 1243-1253, 1985). β-Glukanáza, která je přítomna ve sladu není dostatečně tepelně stabilní, aby mohla být aktivní během varného procesu. Tyto β-glukany jsou vysoce viskózní a způsobují problémy při filtraci kvasné kapaliny a piva. To je důvodem, proč se mikrobiální β-glukanázy používají v širokém měřítku při varném procesu.

Mezi neškrobové polysacharidy rovněž patří pentosany, jejichž struktura byla v nedávné době důkladně prostudována (Gruppen H. a kol., Carbohydr. Res. 233, 45-64, 1992), zejména ty pentosany, které jsou obsaženy v ječmeni a skladu (Vietor R. J. a kol., Carbohydr. Res. 254, 245-255, 1994). Zjistilo se, že pentosanáza z Penicillum emersonii zvyšuje produkci a extrakci fermentovatelných cukrů během varného procesu (GB 2,150,933).

Použití xylanázy B, které zlepšuje kvalitu kvasné kapaliny, je rovněž zmíněno v patentu WO 94/14965.

Navzdory pokroku, kterého bylo v této oblasti dosaženo, ještě stále existuje potřeba nalézt způsoby vaření piva za použití zde popsaných enzymatických přípravků.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje způsob výroby alkoholických nápojů, například piva, do kterých se přidává směs enzymů, která obsahuje alespoň endo-^-(l,4)xylanázu, arabinofuranosidázu, alfa-amylázu, endo-proteázu a β-(1,3;1,4^Κύί3ηάζυ a případně rovněž sacharizující amylázu a/nebo oxopeptidázu. Enzymy, které jsou nezbytné pro výrobu piva jsou výhodně poskytovány transgenními semeny.

Nyní se překvapivě zjistilo, že varný proces podle vynálezu lze provádět v přítomnosti směsi enzymů s minimálním množství sladu. Tento způsob se použil při výrobě klasického sladového piva, ale stejně dobře lze použít při jakémkoliv způsobu, u kterého se slad používá jako zdroj enzymatické aktivity.

Enzymy použitelné v rámci vynálezu se zvolí ze skupiny enzymů nezbytných pro vaření alkoholických nápojů. Mezi tyto enzymy patří enzymy zvolené ze skupiny amylolytických enzymů, ze skupiny celulolytických enzymů, ze skupiny hemicelulolytických enzymů a ze skupiny proteolytických enzymů.

Amylolytické enzymy zahrnují například alfa-amylázu, sacharizující amylázu, amyloglukosidázu, exo-amylázu a pululanázu.

Celulolytické enzymy zahrnují například β-l,4-endoglukanázu, celubiohydrolázu a β-glukosidázu.

-2CZ 296732 B6

Hemiculolytické enzymy zahrnují například P-l,3-l,4-glukanázu, xylanázu, endo-arabinanázu, arabinofuranosidázu, arabinoxylanázu, arabinogalaktanázu a esterázu kyseliny ferulové.

Proteolytické enzymy zahrnují takové enzymy, jakými jsou například exo-peptidázy a endopeptidázy (rovněž označované jako prote(in)ázy).

Volba konkrétního amylolytického, celulolytického, hemicelulolytického nebo proteolytického enzymu není pro vynález kritická kromě toho, že vlastnosti zvoleného enzymu (například pH a teplotní rozmezí) by měly být slučitelné se specifickými podmínkami varného procesu.

Odborníkům v daném oboru je dostupná celá řada genů, kódujících amylolytické, celulolytické, hemicelulolytické a proteolytické enzymy. Geny, kódující tyto důležité enzymy, lze získat z různých rostlinných, živočišných nebo mikrobiálních zdrojů. Volně se tyto geny získávají z mikrobiálního zdroje.

Endo-P-(l,4)xylanázu lze získat z kultury Aspergillus niger (EP 0 463 706). Arabinofuranosidáza je dostupná ve formě izoenzymu A nebo izoenzymu B (EP 0 506 190) nebo ve formě rabinoxylanhydrolázy (EP 0 730 653), které lze získat z kultury Aspergillus niger. Termostabilní amylázu lze odvodit zBacillus licheniformis (WO 91/14772, WO 92/05259) a je například komerčně dostupná pod obchodním označením Brewars Amyliq Thermostable (B.A.T.S.). Aktivita termostabilní amylázy se vyjadřuje vTAU jednotkách. Endoproteázu lze odvodit zBacillus amyloliquefaciens a je rovněž komerčně dostupná pod obchodním označením Brewers protease (+) a její aktivita se vyjadřuje v PC jednotkách. Ze stejné bakterie lze rovněž odvodit |3-(l,3;l,4)glukanázu (Hofemeister a kol., Gene 49, 177, 1986), která je rovněž komerčně dostupná pod obchodním označením Filtrase L 3000 (+). Aktivita glukanázy se vyjadřuje vBGLU jednotkách. Případně použitelnou sacharizující amylázu lze rovněž získat z komerčně dostupných zdrojů (amyláza z Aspergillus oryzae pod obchodním označením Brewers Fermex, jejíž aktivita se vyjadřuje ve FAU jednotkách), ale lze ji rovněž získat z čisté kultury Penicillium emersonii (lze získat z ATCC (Akerican Type Culture Collection), kde je uložena pod číslem ATCC16479). Případně použitelnou expeptidázu lze odvodit z čisté kultury Aspergillus sojae, která je uložena v Cetraal Bureau for Schimmelcultures (CBS), Oosterstraat 1, Baam, The netherlands, pod číslem CBS 209,96 (A. sojae (DS, 8351), 12. února 1996).

Enzymatickými aktivitami, které jsou v současnosti známé jako aktivity nezbytné pro výrobu piva, jsou alfa- a β-amyláza, které jsou nezbytné pro převedení škrobu endospermu na fermentovatelné cukry, proteáza, která je nezbytná pro rozpad proteinu na rozpustné dusíkové sloučeniny, které mají funkci kvasnicových živin, a β-glukanáza a xylanáza, které jsou potřebné pro hydrolýzu β-1,3-1,4^Κ&3ηύ resp. xylanů ječmene a oligo-sacharidy, čímž se snižuje viskozita a zlepšuje filtrovatelnost kvasní kapaliny. Pro získání všech nezbytných enzymů zexogenního zdroje, tj. mikrobiálního zdroje, by tedy bylo žádoucí přidání alespoň pěti různých enzymů. Pro výrobu všech enzymů lze sice použít jeden mikroorganismus, ale pro optimální produkci všech enzymů je třeba vytvořit různé fermentačhí podmínky.

Použitím enzymů z mikrobiálních zdrojů lze překonat některé nevýhody výše zmíněného sladovacího způsobu. Nicméně použití mikroorganismů jako zdroje enzymů, má rovněž své nevýhody:

pro získání jednotlivých enzymů v dostatečném množství je potřebná řada různých fermentací alespoň jednoho mikroorganismu,

- enzymatické přípravky mohou obsahovat nežádoucí vedlejší aktivity,

- konzumenti nejsou příznivě nakloněni přidávání jiných materiálů než jsou rostlinné materiály, voda a kvasnice,

- omezenou stabilitu enzymatického přípravku během skladování při pokojové teplotě.

-3CZ 296732 B6

Obecné použití transgenních semen obsahujících zvýšené množství enzymu v průmyslových, enzymy katalyzovaných procesech je popsáno v mezinárodní patentové přihlášce WO 91/14772. Přímé použití semene obsahujícího enzym v průmyslových procesech obchází potřebu extrakce a/nebo izolace enzymu. Semeno může působit jako stabilní a skladovatelná forma enzymů.

Pro jeden jediný enzym, 3~l,3-l,4--glukanázu byla popsána exprese v zrnech ječmene jako alternativa pro exogenní přidání.

Východoněmecká patentová přihláška DD 275704 popisuje konstrukci expresního vektoru, který umožňuje pro semeno specifickou expresi Bacillus p-l,3~l,4-glukanázy v ječmeni. Nicméně v této době nebyla ještě známá účinná transformace ječmene. Použitím semen exprimujících Bacillus β-glukanázu lze slad nahradit větším množstvím zrna bez toho, že by došlo k závažnějším problémům s filtraci. Nicméně další enzymatické aktivity, které jsou nezbytné při vaření piva, se musí stále ještě získávat ze sladu nebo exogenně doplňovat.

Mannonen a kol. (1993) navrhuje zabudovat do semene ječmene fungální β-1,3-1,4—glukanázu. V tomto případě by se varný proces zlepšil expresí β-l,3-l,4-glukanázy, která má vyšší tepelnou stabilitu než endogenní enzym ječmene, přímo v semenu. Nicméně i v tomto případě je záměrem získat semeno normálním sladovacím procesem. Další enzymatické aktivity, které jsou nezbytné při vaření piva, se musí i v tomto případě získávat ze sladu nebo doplňovat exogenně.

U výhodného způsobu podle vynálezu se enzymy, které jsou nezbytné pro varný proces, exprimují v transgenních semenech. Takto vyprodukovaná transgenní semena exprimující tyto nezbytné enzymy se potom použijí ve varném procesu piva. V tomto případě se zredukuje použití sladu, zatímco přidání exogenních mikrobiálních enzymů se zcela eliminuje.

Transgenní semena exprimující enzymy, které jsou nezbytné při vaření piva, jsou společně označeny jako „sladové semeno“.

Rostlinný druh, který je schopen produkovat ve svých semenech požadovaný enzym, zahrnuje druhy jejichž zrna nebo produkty zrn se tradičně používají při vaření piva. Nicméně jako zdroj transgenního semene exprimujícího požadovaný enzym lze rovněž použít rostlinné druhy, které se při vaření piva běžně nepoužívají, zejména v těch případech, kdy se do varného procesu přidává pouze minimální množství uvedeného transgenního semene. Rostlinnými druhy, které splňují tato kritéria, jsou například ječmen, kukuřice, rýže, pšenice, čirok, proso, oves, kassava apod.

Gen, kódující požadovaný enzym, se exprimuje v rostlinném semenu pomocí regulačních sekvencí, funkčních v rostlině nebo v rostlinném semenu. Tyto regulační sekvence zahrnují sekvence promotoru, sekvence terminátoru a případně sekvence zesilovače transkripce.

Pokud jde o sekvence promotoru, lze použít ty sekvence, které vedou ke konstitutivní expresi genu v celé rostlině. Jinak lze použít ty promotorové sekvence, které jsou účinné při řízení exprese genu do semene rostliny.

Kromě toho lze expresi požadovaného enzymu směrovat buď do specifické buněčné jednotky, například do cytosolu, nedoplasmatického retikula, vakuoly a proteinového těla, nebo do extracelulárního prostoru pomocí specifických směrovacích (targetingových) sekvencí.

Volba konkrétní buněčné jednotky nebo extracelulámího prostoru závisí na vlastnostech požadovaného enzymu a měla by být provedena tak, aby se enzymu vytvořilo optimálníokolní prostředí. Požadovaný enzym by se například měl nacházet v prostředí, které umožní proteinu během klíčení semen optimální stabilitu. Kromě toho by se měl požadovaný enzym nacházet v prostředí, ve kterém exprese enzymu neinhibuje základní metabolické procesy rostliny nebo nevyvolává nežádoucí účinky na životnost rostliny nebo semene.

-4CZ 296732 B6

Aby se umožnila exprese DNA sekvence, kódující zvolený enzym v rostlinné buňce, opatřuje se zpravidla regulačními prvky, které jsou rozpoznatelné biochemickým aparátem hostitele a které umožňují transkripci a translaci otevřeného čtecího rámce do hostitele. DNA sekvence zpravidla obsahuje oblast transkripční iniciace, kterou lze vhodně odvodit z libovolného genu, který je schopen exprimovat rostlinné buňky, a rovněž oblast translační iniciace pro rozpoznání a zachycení ribosomu. V eukaryotických rostlinných buňkách taková expresní kazeta zpravidla navíc obsahuje transkripční terminační oblast, která je umístěna za uvedeným otevřeným čtecím rámcem a která umožňuje ukončení transkripce a provedení polyadenylace primárního transkriptu. Kromě toho lze použití kodonu přizpůsobit použití přijatého kodonu zvolené hostitelské rostliny. Principy řízení exprese DNA konstruktu v rostlinné buňce jsou odborníkům v daném oboru obecně známy a konstrukce exprimovatelných chimérických DNA konstruktů je v současnosti běžnou rutinou.

Speciálním typem replikonu je replikon, který je schopen transferovat sám sebe nebo svou část do další hostitelské buňky, jakou je například rostlinná buňka, a tak ko-transferovat otevřený čtecí rámec, kódující enzym(y) použitelné v rámci vynálezu do uvedené rostlinné buňky. Replikony s touto schopností jsou zde označeny jako vektory. Příkladem takového vektoru je Ti-plasmidový vektor, který, pokud je přítomen ve vhodném hostiteli, například Agrobacterium tumefaciens, je schopen transferovat svou část, tzv. T-oblast, do rostlinné buňky. Pro přenos chimérických DNA sekvencí do rostlinných buněk nebo protoplastů, z nichž lze generovat nové rostliny, které mají stabilně ve svých genomech zabudovanou chimérickou DNA, se nyní běžně používají různé typy Ti-plasmidových vektorů (například viz EP 0 116 718 Bl). Zvláště výhodnou formou Ti-plasmidových vektorů jsou tzv. binární vektory, nárokované například v patentových dokumentech EP 0 120 516 Bl a US 4 940 838. Dalšími vhodnými vektory, které lze použít pro zavedení DNA do vhodného rostlinného hostitele, jsou například virové vektory, zejména neintegrační virové rostlinné vektory, například ty vektory, které jsou odvozeny ze dvoušroubovicovitých rostlinných virů (například CaMV) a jednošroubovicových virů, zdvojených virů apod. Použití těchto vektorů může být výhodné zejména tehdy, pokud je složité stabilně transformovat rostlinného hostitele, jako je tomu například v případě dřevinných druhů, zejména stromů a vinné révy.

Výrazem „hostitelské buňky zabudovávající chimérickou DNA sekvenci do svého genomu“ se rozumí buňky a stejně tak více buněčné organismy obsahující ty buňky nebo v podstatě tvořené těmito buňkami, které stabilně zabudovávají chimérickou DNA do svého genomu a tak zachovávají chimérickou DNA a výhodně transmitují kopii této chimérické DNA do dceřinných buněk prostřednictvím mitosy nebo meiosy. Podle výhodného provedení vynálezu se použijí rostliny, které jsou v podstatě tvořeny buňkami, které zabudovávají jednu nebo více kopií uvedené chimérické DNA do svého genomu a které jsou schopny transmitovat kopii nebo kopie do své dceřinné rostliny, výhodně způsobem podle Mendela. Díky transkripci a translaci chimérické DNA podle vynálezu budou tyto buňky produkovat enzymy. Ačkoliv principy, které řídí transkripci DNA v rostlinných buňkách, nejsou vždy zřejmé, je vytvoření chimérické DNA, která se bude schopna exprimovat, rutinní záležitostí. Iniciační oblast transkripce, které se běžně používají při expresi transformovaného polynukleotidu konstitutivním způsobem jsou promotory, které lze získat z viru květákové mozaiky, tzv. 35S RNA a 19S RNA transkripční promotory a tzv. T-DNA promotory Agrobacterium tumefaciens. Za zmínku stojí zejména nopalinsyntézový promotor, oktopinsyntázový promotor (popsaný vEP 0 122 791 Bl) a mannopinsyntázový promotor. Kromě toho lze použít rostlinné promotory, které mohou být v podstatě konstitutivní, například genový promotor rýžového aktinu. Při pro semeno specifické expresi může být příslušný gen cDNA vložen za promotory pocházející z genů, které se specificky exprimují v semenu rostliny. Tyto promotory zahrnují promotory genů, kódujících zásobní proteiny semene, například Brassica napus cruciferinový promotor, Phaseolus vulgaris phaseolinový promotor, glutelinový promotor z Oryza sativa, zeinový promotor ze Zea mays a hordeinový promotor z Hordeum vulgare.

Rovněž je známo, že duplikace určitých prvků, tzv. zesilovačů, může podstatně zesílit expresní úroveň DNA za jejího režimu (viz například Kay R. a kol. (1987), Science 236, 1299-1302:

-5CZ 296732 B6 duplikace sekvence mezi -343 a -90 CaMV 35S promotoru zvyšuje aktivitu tohoto promotoru). Kromě jednoduše nebo dvojitě zesíleného konstitutivního 35S promotoru lze mezi vysoce úrovňové promotory zahrnout například promotor světlem indukovatelné ribulózobisfosfátkarboxylázové malé podjednotky (rócSSU) a promotor a/b vazebného proteinu chlorofylu (Cab). Dalšími promotory, které lze použít podle vynálezu jsou hybridní promotory, které obsahují prvky různých fyzikálně spojených oblastí promotoru. Dobře známým příkladem hybridního promotoru je tzv. CaMV zesílený mannopinsyntázový promotor (patent US 5 106 739), který obsahuje prvky mannopis-syntázového promotoru navázané na CaMV zesilovač.

Použití intronů mezi promotorem a genem volitelného markéru zesiluje expresi, konkrétně v případě transformace jednoděložných rostlin. Výraz „promotor“ tedy označuje oblast DNA, která se nachází před strukturním genem a je zahrnuta v rozlišovací a vazebné RNA polymeráze a dalších proteinech, které iniciují transkripci. Výraz „rostlinný promotor“ tedy označuje promotor, který je schopen iniciovat transkripci v rostlinných buňkách. Výraz „konstitutivní promotor“ označuje promotor, který je aktivní za většiny okolních podmínek a určuje vývoj nebo buněčnou diferenciaci.

Pokud jde o nezbytnost transkripční terminační oblasti, obecně se předpokládá, že tato oblast zvyšuje spolehlivost a rovněž účinnost transkripce v rostlinných buňkách. Její použití je tedy pro obsah vynálezu velmi výhodný.

Přestože některá provedená vynálezu nemusí být v současnosti prakticky proveditelná, například proto, že některé rostlinné druhy jsou doposud nepřístupné genetické transformaci, je provedení vynálezu u těchto rostlinných druhů pouze otázkou času a nikoli otázkou principu, protože přístupnost ke genetické transformaci není závislá na předložených provedeních vynálezu.

V současné době je transformace rostlinných druhů pro velký počet rostlinných druhů včetně Dicotyledoneae a Monocotyledoneae rutinní záležitostí. Pro zavedení chimérická DNA do vhodné hostitelské buňky lze použít v postatě libovolný transformační způsob. Mezi vhodné způsoby, ze kterých lze vybírat, patří například kalcium/polyethylenglykolová metoda určená pro proteplasty (Krens, F.A. a kol., 1982, Nátuře 296, 72-74; Negrutiu I. a kol., červen 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), elektroporace protoplastů (Shillito R. D. a kol., 1985, Bio/Technol. 3, 1099-1102), mikrovstřikování do rostlinného materiálu (Crossway A. a kol., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), bombardování různých rostlinných materiálů (DNA nebo RNA-potaženými) částicemi (Klein T.M. a kol., 1987, Nátuře 327, 70), infíkace (neintegračními) viry v rostlinném Agrobacterium tumefaciens mediovaném genovém transferu infiltrací dospělých rostlin nebo transformací zralého pylu nebo mikrospór (EP 0 301 316) apod. Výhodný způsob zahrnuje transfer Agrobacíerium-mediované DNA. Zvláště výhodné je použití tzv. technologie binárních vektorů, která je popsána v EP A 120 516 a patentu US 4 940 838.

Pokud jde o zvážení přístupnosti ke genetické transformaci jednoděložné rostliny, jsou k této transformaci přístupné, přičemž plodné transgenní rostliny lze regenerovat z transformovaných buněk nebo zárodků nebo z dalšího rostlinného materiálu. V současnosti je za výhodný způsob transformace jednoděložných rostlin považováno mikroprojektilové bombardování zárodků, explantátů nebo suspenzních buněk a přímá digerace DNA nebo (tkáňová) elektroporace (Shimamoto a kol., 1989, Nátuře 338, 274-276). Transgenní kukuřičné rostliny se získaly zavedením genu Streptomyces hygroscopicus bar, který kóduje fosfínothricinacetyltransferázu (enzym, který inaktivuje herbicidní fosfinothricin), do embryogenních buněk suspenze kukuřičné kultury mikroprojektilovým bombardováním (Gordon-Kamm, 1990, Plant Cell, 2, 603-618). Zavedení genetického materiálu do aleuronových protoplastů dalších jednoděložných plodin, například pšenice a ječmene, již bylo zaznamenáno (Lee, 1989, Plant Mol. Biol. 13, 21-30). Rostliny pšenice se regenerovaly ze suspenze embryogenní kultury selekcí embryogenního hojivého pletiva pro založení suspenze embryogenních kultur (Vasil, 1990, Bio/Technol. 8, 429-434). Kombinace s transformačními systémy pro tyto plodiny umožní aplikovat způsob na jednoděložné rostliny.

-6CZ 296732 B6

Jednoděložné rostliny zahrnující komerčně důležité plodiny, například rýži a kukuřici, jsou přístupné DAN transferu řetězci Agrobacterium (viz WO 94/00977; EP 0 159 418 Bl; Gould J., Michael D., Hasegawa O., Ulian E.C., Peterson G., Smith R.H. (1991), Plant. Physiol. 95, 426-434). Výhodný transformační způsob pro ječmen popsán Tingay S. a kol. (The Plant J., 11(6), 1369-1376, 1997).

Pro získání transgenních rostlin, které jsou schopny konstitutivně exprimovat více než jeden chimérický gen, je dostupná celá řada alternativ včetně následujících:

A. Použití DNA, například T-DNA, na binární plasmid s celou řadou modifikovaných genů fyzikálně navázaných na sekundární volitelný markerový gen. Výhodou tohoto způsobu je, že chimérické geny jsou fyzikálně spojené a migrují tedy jako jediné Mendelovské centrum.

B. Křížové opylování transgenních rostlin, které jsou již schopny exprimovat jeden nebo více chimérických genů, výhodně navázaných na volitelný markerový gen, pylem z transgenní rostliny, která obsahuje jeden nebo více chimérických genů navázaných na další volitelný markér. Potom se semeno, které se tímto křížením získá, může vybrat na základě přítomnosti dvou volitelných markérů nebo na základě přítomnosti samotných chimérických genů. Rostliny získané z vybraných semen lze potom využít k dalšímu křížení. Chimérické geny se v zásadě nenechají na jednom místě a lze je tedy segregovat jako nezávislá centra.

C. Použití celé řady množin chimérických DNA molekul, například plasmidů, které mají jeden nebo více chimérických genů, a volitelný markér. Pokud je frekvence kotransformace vysoká, potom je selekce na základě pouze jediného markéru dostatečná. V dalších případech je výhodná selekce na bázi více než jednoho markéru.

D. Konsekutivní (postupná) transformace transgenních rostlin, které již obsahují první, druhý, (atd.) chimérický gen s novou chimérickou DNA, která případně obsahuje volitelný markerový gen. Stejně jako u způsobu B se chimérické geny v podstatě nenechají na jednom místě a mohou se tedy segregovat jako nezávislá centra.

E. Kombinace výše zmíněných strategií.

Aktuální strategie může záviset na celé řadě faktorů, například na účelu použití rodičovských linií (přímý růst, použití v pěstitelském programu, použití pro produkci hybridů), ale není kritická pro popsaný vynález.

Je známo, že prakticky všechny rostliny lze regenerovat z kultivovaných buněk nebo tkání. Prostředky pro regeneraci se u rostlin liší druh od druhu, ale zpravidla představují suspenzi transformovaných protoplastů nebo transformované explantáty umístěné v Petriho misce. Výhonky lze indukovat přímo embryogenezi a následně je nechat zakořenit. Vedle volitelného markéru bude kultivační médium zpravidla obsahovat různé aminokyseliny a hormony, například auxiny a cytokininy. Do média se rovněž výhodně přidává kyselina glutamová a prolin. Účinná regenerace bude závislá na médiu, na genotypu a na historii kultury. Pokud se tyto tři proměnné řídí, potom je regenerace zpravidla reprodukovatelná a může se opakovat.

Po stabilním zabudování transformovaných genových sekvencí do transgenních rostlin se mohou znaky, poskytnuté těmito sekvencemi, transferovat do dalších rostlin pohlavním křížením. V závislosti na druhu, který má být křížen, lze použít libovolnou standardní techniku množení.

U jednoho provedení podle vynálezu se používají transgenní semena, která jsou zpracována takovým způsobem, že produkují jeden jediný enzym, což umožňuje pružnou produkci enzymových směsí s požadovaným poměrem aktivit jednotlivých enzymů. U dalšího provedení může být více než jedna enzymatická aktivita obsažena v semenech jednotlivých transgenních rostlinných linií.

-7CZ 296732 B6

Transgenní semena, která obsahují sledované enzymy, lze přidat najednou v požadovaném stupni varného procesu. Alternativně lze transgenní semena obsahující sledovaný enzym přidat jednotlivě, každé vždy v nejvhodnějším okamžiku.

Způsob podle vynálezu umožňuje získat slad s výraznou chutí a barvou bez toho, že by se muselo počítat s enzymatickou aktivitou sladu. U způsobu podle vynálezu se použití sladu velkou měrou obchází. Pro dosažení charakteristické chuti a barvy pívaje potřebné pouze minimální množství sladu.

Transgenní semena obsahující požadované enzymy lze aplikovat v nejoptimálnějším poměru se zrnem a případně s množstvím sladu, které je dostatečné pro získání charakteristické chuti a barvy. Transgenní semena lze předtím smísit se zrnem a sladem. Alternativně lze jednotlivé sloučeniny, zrno, transgenní semeno a slad přidat do varného procesu při výrobě piva v samostatných stupních.

Výhodně se jednotlivé sloučeniny, transgenní semena, zrno a slad nebo směs transgenních semen, zrna a sladu před přidáním do varného procesu umelou.

Transgenní semeno obsahuje požadované enzymy v průměrné koncentraci, která se pohybuje od 0,001 do 2,5 %, výhodně od 0,01 do 1,0 %, výhodněji od 0,05 do 0,25 % hmotnosti semene.

V závislosti na stupni exprese v semenu lze pouze část semen nebo celý objem semen, který se zpravidla použije ve varném procesu, nahradit transgenními semeny. Pokud se dosáhne vysokých stupňů exprese, je rovněž možné přidat transgenní semena jiného rostlinného druhu než který se zpravidla používá při varném procesu bez toho, že by došlo k přílišné změně varné směsi.

V případě sladu je část sladu výhodně zpracována speciálním způsobem, při kterém se slad zahřeje během pražení a poskytne tak maximální množství sloučenin, které dodávají sladu barvu a chuť. Zbývající enzymatická aktivita je po tomto ošetření neznatelná.

Exprese enzymů v semenu podle vynálezu poskytuje možnost eliminace přidání exogenních mikrobiálních enzymů do varného procesu. Náklady na výrobu transgenních semen obsahujících enzymy jsou mnohem nižší než náklady na výrobu enzymů fermentačními způsoby. Kromě toho jsou transgenní semena snáze použitelná, protože poskytují stabilní a kontrolovatelně skladovatelnou formu enzymů a umožňují snadnou manipulaci. Redukce nákladů a pohodlnost použití, které souvisí s použitím transgenních semen, se zvláště projevují u způsobu podle vynálezu, při kterém se eliminuje aplikace několika různých enzymů získaných v několika mikrobiálních fermentačních krocích při výrobě piva.

Průběh varného procesu prováděného způsobem podle vynálezu, je mnohem lépe předvídatelný než průběh procesu, při kterém se slad používá jako zdroj enzymů, protože transgenní semena neobsahují žádné další enzymatické aktivity ve vyšších koncentracích než ty enzymatické aktivity, které se exprimovaly zavedením genů. Kromě toho je průběh způsobu podle vynálezu mnohem lépe předvídatelný než průběh způsobu využívajícího mikrobiální enzymy, protože mikrobiální enzymatické přípravky vykazují nedefinované a proměnné úrovně vedlejších aktivit.

Jednou z oblastí, ve kterém je možné v zásadě použít způsob podle vynálezu, jsou africké země, do kterých je dovoz sladu zakázán. Enzymy by se v tomto případě mohly exprimovat v čiroku, který by se potom mohl přidávat do varného procesu.

Vedle použití při vaření alkoholických nápojů lze rovněž předvídat další uplatnění sladových semen jako náhražku sladovaného zrna. Mlynáři používají sladovaný ječmen a/nebo sladovanou pšenici ke standardizaci diastázové energie mouky. Do mouky se rovněž přidávají hemicelulázy (například xylanázy), které zvyšují plynovou retenční kapacitu těsta vyrobeného z mouky. Přidání nebo použití enzymů v mouce lze nahradit použitím sladového semene, které je velmi vhodné,

-8CZ 296732 B6 protože poskytuje enzymy ve formě zrn, která mohou být využita libovolným způsobem. Rovněž lze enzymy přidat namísto sladu do pekařských těst. Enzymy, které zkvalitňují pekařský proces, jsou xylanáza, amyláza, arabinofuranosidáza a exopeptidáza. V semenech pro pekárenské účely lze rovněž exprimovat glukózooxidázu zAspargillus niger.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Měření aktivity endo-beta-l,4-xylanázy

Endoxylanáza se získá z čisté kultury Aspergillus niger ve sterilní nádobě a sterilním médiu. Kultivační médium obsahuje vhodný zdroje uhlíku a dusíku pouze ve formě minerálních solí. Fermentace se provádí při konstantní teplotě, která se pohybuje v rozmezí od 30 do 40 °C a pEÍ hodnota se udržuje v rozmezí od 3 do 5.

Aktivita enzymů se měří hydrolýzou xylanu z ovsa, suspendovaného (35 g/1) v 1M glycinovém pufru s pH 2,75.

Viskozita tohoto roztoku se stanoví za použití kapilárního viskozimetru (typ Ubbelhode) při 47 °C. Čas dt, potřebný k tomu, aby horní meniskus kapaliny klesl mezi dva referenční body se měřil během doby T. Směrnice křivky T vs. 1/dt poskytla kinetickou konstantu. 1 Lyx jednotka odpovídá množství enzymu, které je potřebné pro dosažení hodnoty 1 min“¹ pro tuto kinetickou konstantu.

Příklad 2

Měření aktivity exopeptidázy

Kultivuje se produkční kmen Aspergillus sojae (DS 8351). Exopeptidázová aktivita je vyjádřena v Leucinaminopeptidázových jednotkách (Leu-A): 1 Leu-A odpovídá množství enzymu potřebnému pro produkci 1 pmol p-nitroanilinu za 1 minutu při pH 7,2 a teplotě 20 °C z L-leucin-p-nitroanilinu. Test je prováděn následujícím způsobem: Leucinparanitroanilid (SIGMA) se rozpustí ve vodě při koncentraci 9 mmol. 1 ml roztoku se smísí s 1,5 ml 0,1 M fosfátového pufru s pH 7,2. V čase t=0 se zavede 0,5 ml enzymu a nechá zreagovat při 20 °C. O patnáct minut později se reakce zastaví přidáním 1 ml IN roztoku kyseliny chlorovodíkové. Při kontrolním běhu se IN roztok kyseliny chlorovodíkové zavede v čase t=0. Optická hustota se určí pro kontrolní běh (OD_Mank) a pro testovaný běh (OD_aSsa_y) při 400 nm. Aktivita se vypočte pomocí následující rovnice:

(ODbianfc OD_aSsay)

Leu-A/ml

0,5

Příklad 3

Měření aktivity arabinofuranosidázy

Izoenzym A nebo izoenzym B nebo arabinoxylanhydroláza se získá z kultury kmenů Aspargillus niger nebo Aspergillus nidulands. Aktivita izoenzymu A a B se měří hydrolýzou p-nitrofenyl-alfa-L-arabinofuranózy. 1 ARF jednotka odpovídá množství enzymu potřebnému pro uvolnění 1 pmolu p-nitrofenolu za 1 minutu, za podmínek, které popsal Gunata Z. a kol. (J. Agric. Food Chem. 38, 772, 1989).

Příklad 4

Měření aktivity sacharizující amylázy

-9CZ 296732 B6

Sacharizující amyláza se získá z čisté kultury Penicillium emersoniii ve sterilní nádobě a sterilním médiu, které obsahuje vhodný zdroj uhlíku a dusíku pouze ve formě minerálních solí. Nádobě se po 10 až 30 hodinách po zahájení fermentace (výhodně po 24 hodinách) naplní maltodextri5 ny. Teplota se udržuje v rozmezí 40 až 50 °C (výhodně 45 °C) a pH hodnota se udržuje v rozmezí 4,5 až 5,5 (výhodně 5,0). Fermentace se ukončí 40 až 55 hodin (výhodně 48 hodin) po startu.

Aktivita sacharizující amylázy se měří za použití testu BETAMYL, který je komerčně dostupný od společnosti MEGAZYME (Irsko). 1 BTU jednotka odpovídá množství enzymu, které je io potřebné pro produkci 1 pmolu p-nitrofenolu při pH 6,2 a 42 °C z komerčního substrátu společnosti Megazyme.

Příklad 5

Příprava kvasné kapaliny za použití mikrobiálních enzymů

Kvasná kapalina se připravila ze zrn surového ječmene variety PLAISANT. Ječmen se mlel v mlýnu EBC MIAG a dosáhl tak granulometrie typu filtrovaného lisu. 57 g umletého ječmene se suspendovalo ve 300 ml teplé vody (50 °C), která obsahovala:

650 Lyx jednotek endo-p-(l,4)xylanázy

8 50 ARF jednotek arabinofuranosidázy mg B.A.T.S. (tepelně stabilní amylázy) mg Brewers Protease (+) (endo-proteázy) mgFlitrase L3000 (+) (3~l,3;l,4)glukanázy).

Teplota se udržovala po dobu 30 minut na 50 °C a následně se zvýšila na 63 °C (rychlostí 1 °C/min); potom se 30 minut udržovala teplota při 63 °C a po jejich uplynutí se opět zvýšila na 72 °C (rychlostí 1 °C/min) a při této teplotě udržovala dalších 30 minut. V závěru se teplota zvýšila na 76 °C (rychlostí 1 °C/min) a při této teplotě se udržovala 5 minut. Odpařená voda se doplila a kaše se potom nalila do nálevky obsahující papírový filtr Schleicher a Schull. Z hustoty přefiltrované kvasné kapaliny se způsobem, který se používá v pivovarech, určil výtěžek a za po užití standardních EBC postupů se rovněž určila viskozita a obsah volných aminokyselin (FAA).

Výtěžek byl v tomto případě 71,5%, viskozita 2,52mPa.s a obsah volných aminokyselin 66 mg/1.

Příklad 6

Porovnání sacharizující amylázy

Kvasná kapalina se připravila ze zrn surového ječmene PLAISANT. Ječmen se mlel v mlýnu 40 EBC MIAG a dosáhl tak granulometrie typu filtrovaného lisu. 57 g umletého ječmene se suspendovalo ve 300 ml teplé vody (50 °C), která obsahovala:

650 Lys jednotek endo-p-(l,4)xylanázy

850 ARF jednotek arabinofuranosidázy mg B.A.T.S. (tepelně stabilní amylázy)

6 mg Brewert Pretease (+) (endo-proteázy)

100 Leu-A jednotek exopeptidázy mg Flitrase L3000 (+) (P~(l,3;l,4)glukanázy).

Do varné směsi se přidaly sacharizující enzymy v dávkách naznačených v Tabulce 1.

-10CZ 296732 B6

Tabulka 1 Dávky sacharizujících enzymů

Varná směs č.	Sacharizující enzym
1	žádný	0
2	Brewers Fermex	510 FAU
3	Amyláza z P. emersonii	10 BTU
4	Brewers Fermex + amyláza z P. emersonii	510 FAU + 10 BTU

Teplota se udržovala po dobu 30 minut na 50 °C a následně se zvýšila na 63 °C (rychlostí 1 °C/min); potom se 30 minut udržovala teplota při 63 °C a po jejich uplynutí opět zvýšila na 5 72 °C (rychlostí 1 °C/min) a při této teplotě udržovala dalších 30 minut. V závěru se teplota zvýšila na 76 °C (rychlostí 1 °C/min) a při této teplotě se udržovala 5 minut. Odpařená voda se doplnila a kaše se potom nalila do nálevky obsahující papírový filtr Schleicher a Schull. Z hustoty přefiltrované kvasné kapaliny se způsobem, který se používá v pivovarech, určil výtěžek a za po užití standardních EBC postupů se rovněž určila viskozita a obsah volných aminokyselin (FAA).

Výsledky naměřených výtěžků, viskozity a FAA, které jsou shrnuty v níže uvedené Tabulce 2, prezentují účinky sacharizujícího enzymu Penicillium emersonii jako náhrady Brewers Fermex. Ze získaných výsledků vyplývá, že použití obou enzymů nepřináší žádný skutečně synergický výtěžek. Zvláště překvapivým je poměrně pozitivní vliv amylázy Penicillium emersonii na zvý15 šení koncentrace FAA a snížení viskozity.

Tabulka 2 Výsledky

Varná směs č.	Výtěžek (%)	Viskozita (mPa. s)	FAA (12 Plato) (mg/1)
1	71,2	3, 12	116
2	74,6	2,73	114
3	78,2	1, 99	153
4	79, 6	1, 99	152

Příklad 7

Konstrukce binárního vektoru obsahující pro semeno specifickou expresní kazetu

Expresní konstrukt se zkonstruuje tak, že se za použití Oryza sativa L. glutelinového zásobního proteinu (Zheng a kol., Plant Physiol (1995) 109; 77-786) získá pro semeno specifická exprese. 25 Pro dosažení stejného cíle lze tyto sekvence nahradit sekvencemi z podobných pro semeno specifických genů.

Při konstrukci expresního konstruktu pro semena specifickou expresi, se z glutelinového (Gtl) genu Oryza setiva L. syntetizovaly za použití PCR technologie s genomových klonech Gtl (Okíta 30 a kol., J. Biol. Chem. 264, 12573-12581, 1989) sekvence promotoru a terminátoru jako matrice.

Tento gen vykazoval pro semeno specifickou expresi. Tento gen vykazoval pro semeno specifickou expresi. Stanovila se jeho kódující a lemovací sekvence (EMBL, Genebank Nucleotide Sequence Database, přístupové číslo D00584)). Syntetizovaly se dvě sady oligonukleotidů. Jedna

-11 CZ 296732 B6 se použila pro amplifíkaci 2,4 Kb fragmentu obsahujícího Gtl 5' lemovací oblasti kódující jako Xhol/Sphl fragment:

5'Gtl.l 5' GCACAATTCTCGAGGAGACCG 3'

5'Gtl.2

5' ATGGATGGCATGCTGTTGTAG 3'

Další amplifikace 3' lemovacích sekvencí jako BamHI/EcoRI fragment (725bp):

3'Gtl.3

3'Gtl.4

5' CCTCTTAAGGATCCAATGCGG 3'

5' CTTATCTGAATTCGGAAGCTC 3'

Oligonukleotidy jsou navrženy tak, že obsahují na svých koncích vhodná restrikčními enzymy přísné sestavení expresního konstruktu. Geny pro enzymy směsi podle vynálezu lze nalést v literatuře tj. gen pro endo-xylanázu (Mol. Microbiol. 12, 479-490, 1994), pro arabinofuranosidázový izoenzym A a izoenzym B (EP 0 506 190), pro amylázu z Bacillus licheniformis (EP 0 449 376), pro proteázu z Bacillus amyloliquefaciens (J. Bact. 159, 811-819) a pro glukanázovou formu z Bacillus amyloliquefaciens (Gene 49, 177-187, 1986). Geny pro sacharizující amylázy z Penicillium a pro exopeptidázu zAspergillus sojae lze jak je zřejmé odborníkům v daném oboru, snadno získat z čistého enzymu, který lze izolovat z kultur označených v popisné části vynálezu.

Použití kodonu genů kódujících enzymy, které se mají exprimovat v semenech, se optimalizuje pro expresi jednoděložných semen. Této optimalizace se dosahuje syntetickou přípravou kompletního genu. Za účelem klonování se BspHI místo zavede na ATG startovací kodon a BamHI místo se zavede za TAA koncový kodon.

2,4 kb PCR produkt obsahující 5' lemující oblast Gtl se digeruje Xhol/Sphl a klonuje ve vektoru pSLl 180, linearizovaném Xhol/Sphl. Výsledný vektor se linearizuje SphI/BamHI a použije jako vektor ve třícestné ligaci genem kódujícím syntetický enzym a případně oligonukleotidovým duplexem kódujícím targetingový signál. Targeting lze směrovat ve vakuolu, na apoplast, na amyloplast nebo (například KDEL-retenčním signálem) na endoplasmatické retikulum.

Z tohoto vektoru se izoluje fragment obsahující fúze Gtl glutelinového promotoru, případně signální frekvenci a syntetický gen. Tento fragment se klonuje ve třícestné ligaci 725 bp PCR produktem obsahujícím 3' terminační sekvenci Gtl digerovanou BamHI/EcoRI do binárního vektoru pMOG22 (v E. coli K-12 kmen DH5-alfa, uložený v Centraal Bureau voor Schimmelcultures 29. ledna 1990 pod přístupovým číslem CBS 101.90).

Příklad 8

Konstrukce binárního vektoru obsahujícího endo-xylanázový gen v pro semeno specifické expresní kazetě

Endoxylanázový gen z Aspergillus niger se použije pro optimalizaci využití kodonu v ječmeni. Výslednou DNA sekvenci popisuje SEQ ID NO: 1.

Pro expresi endoxylanázového genu se extracelulámí zesílení provádí za použití oligonukleotidového duplexu

PRS.l y MCTTCCTCA.WAGCnCCCCTTrTATGCCnCCrrTGTnTGGCCAATACTnGTAGCTGnACGCATGC _V PRS.2 5’ GTACTTGAAGGAGTrCTCGAAGGGGAAAATACGGAAGGAAACAAAACCGGTTATGAAACATCGACAATGCGTACGGTACC 5’ kódujícího signální peptid tabákového PR-S proteinu a použije se třícestná ligace syntetického xylanázového genu digenerovaného BspHI/BamHI. Z tohoto vektoru se izoluje 3,1 Kb XhoI/BamHI fragment, který obsahuje fúze Gtl glutelinového promotoru, PR-S signální sekvenci a syntetický xylanázový gen. Tento fragment je uzavřen v třícestné ligaci 725 bp PCR pro

- 12CZ 296732 B6 duktem obsahujícím 3' terminační sekvenci Gtl digerovanou BamHI/EcoRI do binárního vektoru pMOG22. Byl navržen výsledný vektor pMOG1265.

Příklad 9

Transformace ječmene

Způsob použití pro transformaci nezralých zárodků Hordeum vulgare cv. Golden Promise za použití Agrobacterium tumefaciens obecně popsal Tingay, S. a kol., V The Plant J. 11 (6), 1369-1376, 1997. Tento protokol v krátkosti obsahuje následující postup:

Dárcovské rostliny poskytující výchozí materiál se pěstují v phytotronu při teplotě 10 až 20 °C, při šestnáctihodinové světelné periodě 10 000 až 30 000 luxů a při 50 až 95% relativní vlhkosti. Nezralé semeno se sklidí 10 až 15 dní po opylení a 20 až 40 minut se sterilizuje v bělicím roztoku. Nezralé zárodky se zbaví mladých caryopsis a osa zárodku se odstraní ostřím skalpelu. Explantáty se umístí na médium indukující tvorbu hojivého pletiva tak, že scutellum je orientováno směrem nahoru, a inkubují se ve tmě při 24 °C po dobu 16 hodin až 7 dní.

Zárodky se ponoří do suspenze bakterie Agrobacterium (přibližně 0,1 až 10 x 10⁹ bakterií na ml), ve které zmíněná bakterie Agrobacterium obsahuje konstrukty DNA kódující zvolený enzym, na 5 až 20 minut a potom se přemístí do média indukujícího tvorbu hojivého pletiva.

Zárodky se potom inkubují ve tmě, dva nebo tři dny při teplotě 24 °C. Po ko-kultivaci se zárodky přemístí do média indukujícího tvorbu hojivého pletiva, které obsahuje antibiotika ničící bakterie Agrobacterium, a přímo smísí se selekčním činidlem, které zahájí selekci transgenních buněk. Selekční proces trvá až 8 týdnů. Rezistentní linie zárodečného hojivého pletiva se přemístí do regeneračního média a inkubují za zvýšené světelné intenzity (500 až 3 000 luxů) při šestnáctihodinové světelné periodě a 24 °C. Regenerované rostliny se přemístí do média indukujícího tvorbu hojivého pletiva, které neobsahuje žádný hormon nebo obsahuje vysokou koncentraci cytokininu a které obsahuje nebo neobsahuje selekční činidlo. Potom, co se vyvine kořenový systém, se rostliny přemístí do půdy a po samoopylení pěstují až do úplné zralosti.

Příklad 10

Byly provedeny tři kompletní zkušební várky piva. Při dva testovaných várkách se podstatným způsobem snížilo množství použitého sladu (20 % surového materiálu) a v případě kontrolní várky se použilo normální množství sladu (viz Tabulka 3). Dvě testované várky se od sebe lišily použitou technologií mletí a filtrování (viz Tabulka 3). Diagram várky pro všechny tři případy je znázorněn na Obr. 1.

Tabulka 3 Složení surového materiálu, filtrace a mletí

	Kontrolní	Testovaná várka 1	Testovaná várka 2
Plzeňský slad	75 %	20 %	20 %
Kukuřičná krupice	25 %	25 %	25 %
Nesladovaný ječmen	—	55 %	55 %
Filtr	Lautertun	Lautertun	Meura 20001
Mleti	Válcový mlýn	Válcový mlýn	Kladivový mlýn

-13CZ 296732 B6

Z kontrolní směsi se ve vařiči obilnin použilo 8 % sladu spolu s kukuřičnou krupicí a dalších 67 % sladu se přidalo do konverzní nádoby. V případě testovaných várek se ve vařiči obilnin použilo společně s kukuřičnou krupicí 8 % nesladového ječmene a dalších 47 % nesladového ječmene se přidalo do konverzní nádoby spolu se sladem.

Tabulka 4 Kódy enzymů a množství přidané na 100 kg surového materiálu

Kód enzymu	Enzym	Vařič obilnin	Konverzní nádoba
1	Endo-β-(1,4)-xylanáza		117 000 Lyx
2	Arabinofuranosidáza		112 500 ARF
3	B.A.T.S.	16,5 g
4	Brewers Fermex		75 g
5	Brewers protease (+)		75 g
6	Exo-peptidáza		-
7	Filtrase L3000 (+)		23 g

Enzymy 1, 2, 4, 5 a 7 se přidaly do konverzní nádoby, zatímco enzym 3 se přidal do vařiče obilnin (viz Tabulka 4, kde jsou uvedeny kódy enzymů a přidaná množství).

Výsledky zpracováni sladiny (rmutování a filtrace) jsou v případě testovaných várek a kontrolní várky podobné. Dvě testované várky se provedou podobným způsobem v pivovaru. Testované várky poskytnou zhruba stejnou sladinu, což ukazuje, že rozdíly ve filtraci a mletí nejsou podstatné. Ze srovnání chuti testovaných várek a kontrolní várky vyplývá, že všechny tři piva mají velmi podobný profil. Testované várky mají v porovnání s kontrolní várkou výraznější chuť. To může být způsobeno vyšší hladinou dextrinu, která se zjistila při analýze sladiny. Testované várky mají v porovnání s kontrolní várkou nižší, ale stále ještě přijatelnou, hladinu aminokyselin. Hladiny aminokyselin lze zvýšit přidáním exopeptidázy (viz Příklad 11). Testovaná piva byla klasifikována týmem ochutnávačů jako dobré plzeňské pivo, což ukazuje, že částečná náhrada sladu směsí enzymů poskytuje pivo, které je srovnatelné s pivem vyrobeným za použití množství sladu, které se v pivovarnictví běžně používá.

Příklad 11

Provedly se dvě kompletní zkušební várky. Při testované várce se použilo snížené množství sladu, zatímco při kontrolní várce se použilo normální množství sladu (viz Tabulka 5). Pro filtraci se použil filtr Lautertun. Diagramy testované várky 1 a kontrolní várky znázorňuje Obr. 2.

Tabulka 5 Složení surového materiálu.

	Kontrolní	Testovaná várka 1
Plzeňský slad	75 %	20 %
Kukuřičná krupice	25 %	25 %
Nesladovaný ječmen	-	55 %

-14CZ 296732 B6

Z kontrolní směsi se ve vařiči obilnin použilo 8 % sladu spolu s kukuřičnou krupicí a dalších 67 % sladu se přidalo do konverzní nádoby. V případě testovaných várek se ve vařiči obilnin použilo společně s kukuřičnou krupicí 8 % nesladovaného ječmene a dalších 47 % nesladovaného ječmene se přidalo do konverzní nádoby spolu se sladem.

U testované várky se do konverzní nádoby přidalo enzymy 1 až 7, zatímco enzym 3 se přidal do vařiče obilnin (viz Tabulka 6, kde jsou uvedeny kódy enzymů a použitá množství enzymů).

Výsledky zpracování sladiny (rmutování a filtrování) byly pro testovanou a kontrolní várku io podobné. Testovaná a kontrolní várka měly podobný obsah volného aminokyselinového dusíku ve sladině. Testovaná várka poskytla pivo, které mělo v podstatě stejný chuťový profil jako pivo získané kontrolní várkou. Tým ochutnávačů ohodnotil pivo získané testovanou várkou jako dobré plzeňské pivo, což ukázalo, že částečné nahrazení sladu směsí enzymů poskytuje pivo, které je srovnatelné s pivem vyrobeným za použití množství sladu běžně používaného vpivovamictví.

Tabulka 6 Kódy enzymů a množství přidaná na 100 kg surového materiálu v testované várce

Kód enzymů	Enzym	Vařič obilnin	Konverzní nádoba
1	Endo-β-(1/4)xylanáza		117 000 Lyx
2	Arabinofuranosidáza		112 500 ARF
3	B.A.T.S.	16,5 g	33,5 g
4	Brewers Fermex		75 g
5	Brewers protease (+)		75 g
6	Exo-peptidáza		105 000 LeuA
7	Filtrase L3000 (+)		23 g

Příklad 12

Zrna transgenního ječmene ze sedmi linií, z nichž každá exprimuje jeden z enzymů uvedených v Tabulce 9, se vzájemně smísí v takových množstvích, které poskytnou sladová semena, která pokud se smísí s 10 % surového ječmene, potom poskytnou enzymatickou aktivitu, která je uvedena v Tabulce 9. Sladové semeno se smísí a umele s netransgenním ječmenem, se kterým tvoří 25 společně 55 % surového materiálu testované várky. Složení surového materiálu ve vařiči obilnin a v konverzní nádobě při testované várce uvádí Tabulka 8. Při kontrolní várce se ve vařiči obilnin použilo spolu s kukuřičnou krupicí 8 % sladu. Zbytek surového materiálu se použil v konverzní nádobě. Distribuce sladových semen poskytne enzymatické aktivity, které uvádí Tabulka 10 jak pro konverzní nádobu, tak pro vařič obilnin.

Provedly se dvě zkušební várky. Při testované várce se použilo snížené množství sladu a při kontrolní várce se použilo normální množství sladu (viz Tabulka 7). Při testované várce se použila vyšší sacharizační teplota (viz Tabulka 7). Filtrace se prováděla na filtru Lautertun. Diagram testované a kontrolní várky je znázorněn na Obr. 2.

-15 CZ 296732 B6

Tabulka 7 Složení surového materiálu

	Kontrolní	Testovaná várka 1
Plzeňský slad	75 %	20 %
Kukuřičná krupice	25 %	25 %
Nesladovaný ječmen + sladové semeno	—	55 %

Tabulka 8 Složení surového materiálu na 100 kg celkové hmotnosti v testované várce

Surový materiál	Vařič obilnin (kg)	Konverzní nádoba (kg)
Slad		20
Nesladovaný ječmen	7,2	42, 3
Sladové semeno	0,8	4,7
Kukuřičná krupice	25
Celkem (kg)	33	67

Výsledky zpracování sladiny (rmutování a filtrování) byly podobné pro testovanou várku a pro kontrolní várku. Testovaná várka poskytla piva, která měla podobný chuťový profil jako piva, která poskytla kontrolní várka. Testovaná várka byla klasifikována jako klasické sladové pivo, což ukazuje, že slad může být (částečně) nahrazen enzymy, které poskytují transgenní semena io exprimující tyto enzymy.

Tabulka 9 Množství enzymatické aktivity získané přidáním sladového semena (jednotky na

100 kg surového materiálu) v testované várce 1

Kód enzymu	Enzym	Vařič obilnin	Konverzní nádoba
1	Endo-β-(1,4)xylanáza	19 915 Lyx	117 000 Lyx
2	Arabinofuranosidáza	19 149 ARF	112 500 ARF
3	B.A.T.S.	107 250 TAU	630 094 TAU
4	Brewers Fermex	57 872 FAU	340 000 FAU
5	Brewers protease (+)	115 745 PC	680 000 PC
6	Exo-peptidáza	17 872 Leu-A	105 000 Leu-A
7	Filtrase L3000 (+)	11 701 BGLU	68 745 BGLU

Výše uvedené příklady mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.

-16CZ 296732 B6

SEKVENČNÍ PROTOKOL (1) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 1:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 558 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÝ: žádný (iii) PROTISMYSLNÝ: žádný (ix) ZNAK (A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POZICE: 1 až 558 (D) JINÉ INFORMACE: /produkt = „zralý protein“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

ATG Met 1

AGC Ser

GCG GGA

ATC AAC TAC GTC CAG AAC TAC AAT GGC

AAC CTC

GGC Gly

48

Ala

Gly

Ile Asn Tyr 5

Val

Gin

Asn 10

Tyr

Asn

Gly

Asn

Leu 15

GAC

TTT

ACT

TAC

GAC

GAG

TCA

GCG

GGA

ACT

TTC

AGC

ATG

TAT

TGG

GAG

96

Asp

Phe

Thr

Tyr

Asp

Glu

Ser

Ala

Gly

Thr

Phe

Ser

Met

Tyr

Trp

Glu

20

25

30

GAT

GGC

GTG

TCC

TCA

GAC

TTC

GTC

GTG

GGA

CTG

GGC

TGG

ACC

ACT

GGA

144

Asp

Gly

Val

Ser

Asp

Phe

Val

Gly

Leu

Gly

Trp

Thr

Gly

35

40

45

TCA

TCC

AAT

GCG

ATC

ACC

TAC

AGC

GCC

GAG

TAC

TCC

GCG

TCA

GGA

TCA

192

Ser

Asn

Ala

ile

Thr

Tyr

Ser

Ala

Glu

Tyr

Ser

Ala

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GCC

TCC

TAT

CTG

GCC

GTG

TAC

GGA

TGG

GTG

AAC

TAC

CCG

CAG

GCC

GAG

240

Ala

Ser

Tyr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gly

Trp

Val

Asn

Tyr

Pro

Gin

Ala

Glu

65

70

75

80

TAC

ATC

GTG

GAG

GAT

TAC

GGA

GAT

TAC

AAC

CCA

TGC

AGC

TCA

GCG

288

Tyr

Ile

Val

Glu

Asp

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Asn

Pro

Cys

Ser

Ala

85

90

95

ACC

TCC

CTC

GGA

ACT

GTG

TAC

AGC

GAC

GGC

TCC

ACC

TAC

CAG

GTC

TGC

336

Thr

Ser

Leu

Gly

Thr

Val

Tyr

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Gin

Val

Cys

100

105

110

ACC

GAC

ACC

CGC

ACT

AAC

GAG

CCG

TCA

ATC

ACC

GGC

ACT

TCC

ACC

TTC

384

Thr

Asp

Thr

Arg

Thr

Asn

Glu

Pro

Ser

Ile

Thr

Gly

Thr

Ser

Thr

Phe

115

120

125

-17CZ 296732 B6

432

ACC CAG TAC Thr Gin. Tyr

TTC AGC GTG

CGC GAG TCC ACT CGC ACC TCA

GGA ACC

GTG Val

Phe

Ser

Val

Arg 135

Glu Ser

Thr Arg

Thr 140

Ser

Gly

Thr

130

ACC

GTC

GCG

AAC

CAC

TTC

AAC

TTC

TGG

GCG

CAG

CAC

GGA

TTC

GGC

AAC

Thr

Val

Ala

Asn

His

Phe

Asn.

Phe

Trp

Ala

Gin

His

Gly

Phe

Gly

Asn

145

150

155

160

AGC

GAC

TTT

AAC

TAC

CAG

GTG

GTC

GCA

GTG

GAG

GCA

TGG

TCA

GGA

GCG

Ser

Asp

Phe

Asn

Tyr

Gin

Val

Ala

Val

Glu

Ala

Trp

Ser

Gly

Ala

165

170

175

GGC

TCA

GCG

TCC

GTC

ACT

ATC

AGC

TCC

TG

Gly

Ser

Ala

Ser

Val

Thr

Ile

Ser

180

185

4B0

528

558 (1) INFORMACE PRO SEQ Π) NO: 2:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 185 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

Met 1

Ser Ala

Gly Ile 5

Asn Tyr

Val Gin Asn 10

Tyr Asn Gly

Asn

Leu 15

Gly

Asp

Phe

Thr

Tyr

Asp

Glu

Ser

Ala

Gly

Thr

Phe

Ser

Met

Tyr

Trp

Glu

20

25

30

Asp

Gly

Val

Ser

ser

Asp

Phe

Val

Gly

Leu

Gly

Trp

Thr

Gly

35

40

45

Ser

Asn

Ala

Ile

Thr

Tyr

Ser

Ala

Glu

Tyr

Ser

Ala

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Ala

Ser

Tyr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gly

Trp

Val

Asn

Tyr

Pro

Gin

Ala

Glu

65

70

75

80

Tyr

Ile

Val

Glu

Asp

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Asn

Pro

Cys

Ser

Ala

85

90

95

-18CZ 296732 B6

Thr

Ser

Leu Gly 100

Thr Val Tyr

Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Gin Val Cys

105

110

Thr

Asp

Thr

Arg

Thr

Asn

Glu

Pro

Ser

Ile

Thr

Gly

Thr

Ser

Thr

Phe

115

120

125

Thr

Gin

Tyr

Phe

Ser

Val

Arg

Glu

Ser

Thr

Arg

Thr

Ser

Gly

Thr

Val

130

135

140

Thr

Val

Ala

Asn

His

Phe

Asn

Phe

Trp

Ala

Gin

His

Gly

Phe

Gly

Asn

145

150

155

160

Ser

Asp

Phe

Asn

Tyr

Gin

Val

Ala

Val

Glu

Ala

Trp

Ser

Gly

Ala

165

170

175

Gly

Ser

Ala

Ser

Val

Thr

Ile

Ser

180 185 (1) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 3:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 71 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÝ: žádný (iii) PROTISMYSLNÝ: žádný (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Nicotiana tabacum (tabák virginský) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:

AACTTCCTCA AGAGCTTCCC CTTTTATGCC TTCCTTTGTT TTGGCCAATA CTTTGTAGCT

GTTACGCATG C (1) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 4:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 80 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÝ: žádný (iii) PROTISMYSLNÝ: ano

-19CZ 296732 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:

CCATGGCATG CGTAACAGCT ACAAAGTATT GGCCAAAACA AAGGAAGGCA TAAAAGGGGA 60

AGCTCTTGAG GAAGTTCATG 80 (1) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 5:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÝ: žádný (iii) PROTISMYSLNÝ: žádný (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:

ATGGATGGCA TGCTGTTGTA G 21 (1) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 6:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÝ: žádný (iii) PROTISMYSLNÝ: žádný (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:

GCACAATTCT CGAGGAGACC G 21 (1) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 7 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÝ: žádný

-20CZ 296732 B6 (iii) PROTISMYSLNÝ: žádný (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:

CCTCTTAAGG ATCCAATGCG G (1) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 8:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÝ: žádný (iii) PROTISMYSLNÝ: žádný (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:

CTTATCTGAA TTCGGAAGCT C 21

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby alkoholických nápojů, při kterém se ohřevem, macerováním nebo smísením množiny surových materiálů vytvoří várka, vyznačující se tím, že se do této várky přidá v libovolném stádiu její přípravy směs enzymů obsahující alespoň endo-p-(l,4)xylanázu, arabinofuranosidázu, oc-amylázu, endo-proteázu a fi-(l,3:l,4)glukanázu.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že směs rovněž obsahuje sacharizující amylázu.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že směs rovněž obsahuje exo-peptidázu.
4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že alkoholickým nápojem je pivo.
5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že každý z uvedených enzymů je poskytnut semeny jednotlivých transgenních rostlinných linií.
6. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že více než jeden enzym je poskytnut semeny jednotlivých transgenních rostlinných linií.
7. Způsob podle některého z nároků laž6, vyznačující se tím, že alespoň jeden enzym je poskytnut semeny jednotlivých rostlinných linií.

-21 CZ 296732 B6
8. Způsob podle některého z nároků 5 až 7, vyznačující se tím, že transgenní rostlinnou linií je rostlinná linie ječmene.

5 9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že enzymy jsou přítomny v jednotlivém semenu nebo v množině semen.

2 výkresy

-22CZ 296732 B6

Obr. 1

Diagram várky • Vařič obilnin/rmutový vařič Konverzní nádoba/rmutový mixér

Teplota

-23 CZ 296732 B6

Obr. 2

Diagram várky pro testovanou várku 1 a kontrolní várku • Vařič obilnin/rmutový vařič Konverzní ňádoba/rmutový mixér

Teplota

Čas (min)