NL8403600A - Werkwijze voor de bioafbraak van pentosanen. - Google Patents

Description

* u - 1 - *L·.

Werkwijze voor de bioafbraak van pentosanen.

De uitvinding heeft betrekking op een nieuwe werkwijze voor de bioafbraak van pentosanen, op een daarvoor te 5 gebruiken enzyme en op een werkwijze voor het verkrijgen van een preparaat, die het bevat.

Pentosanen zijn een klasse van polymeren van een of meer in de natuur voorkomende pentosen. Zij komen voor in een aantal natuurlijke bronnen, zoals granen, bijvoorbeeld tarwe 10 en haver, planten, bijvoorbeeld thee en koffie, zeewier, vruchten, groeten en gierst en hun aanwezigheid is ongewenst in een aantal toepassingen, waarbij men de natuurlijke bron gebruikt. Zo treden pentosanen bijvoorbeeld op in tarwebloem, waarin zij water binden en zij dragen bij tot het stijf en oud worden van brood na het 15 bakken. Ken vermindering in het pentosangehalte van de bloem vermindert de kans op stijf worden in deze situatie. Een ander voorbeeld is het optreden van pentosanen in koffie en in oplosbare gommen, die met de koffie meegeextraheerd worden bij de bereiding van instantkoffiekorrels of poeder. Vermindering van het pentosan-20 gehalte van dergelijke stoffen maakt het mogelijk hogere vaste stofgehalten in het extrakt te verkrijgen met daaruit voortvloeiende besparingen bij het bereidingsproces.

Het Britse octrooischrift 1.421.127 beschrijft een werkwijze voor de bereiding van enzymen, die van gerst afkom-25 stige /3-glucanen en verwante /3-1,4//3-1,3 glucanen afbreken.

Het voornaamste verkregen enzyme is een /3-1,4//5-1,3 glucanase, dat van bijzondere betekenis is bij de behandeling van gerst, hoewel andere /3-glucanase, laminarinase, hydroxyethylcellulase, cellulase en oi-amylase aktiviteiten, naar men zegt ook aanwezig 30 kunnen zijn. Men gebruikt mikroorganismen van de species Penicil-lium emersonii als enzymebron, in het bijzonder de stam, die bij het Commonwealth Mycological Institute, Kew, Engeland werd gedeponeerd onder nummer IMI 116815.

Er werd nu gevonden, dat men' Talarómyces emerso-35 nii (vroeger bekend als Penicillium emèrsónii) kan fermenteren 3403600 j i

J

7 .....Λ - 2 - onder produktie van een ander enzyme, een pentosanase, dat de afbraak katalyseert van pentosanen, vooral van uit tarwe afkomstige pentosanen. De klasse van dergelijke enzymen is algemeen bekend en men heeft verschillende individuele enzymen onder andere 5 gebruikt bij het bakken, de zetmeelbereiding, de landbouw, de brouwerij, de extraktie van plantaardig weefsel en de bereiding van plantaardige kleurstoffen. Bij vele' van deze toepassingen gebruikt men echter gewoonlijk hoge temperaturen en er bestaat behoefte aan een thermostabiele pentosanase, die over een breed 10 trajekt van hoge temperaturen goede aktiviteit behoudt.

De uitvinding heeft nu betrekking op een enzyme, dat men door fermentatie kan verkrijgen uit een stam van de species Talaromyees emersonii, in het bij zonder uit TalarömyCes emer-sonii Stolk, syn. PéniciIlium‘ emèrsónii Stolk IMI 116815, of een 15 mutant daarvan, die de afbraak van pentosanen kan katalyseren.

Er werd gevonden, dat het enzyme in goede opbrengst en in een voor commercieel gebruik zeer bevredigende concentratie wordt geproduceerd.

Dé uitvinding heeft in het bijzonder betrekking 20 op een enzyme, dat men door fermentatie kan verkrijgen uit een stam van de species T. emèrsónii, in het bijzonder T. emèrsónii IMI 116815, of een mutant daarvan, dat de afbraak van xylan kan katalyseren. Xylan is een polymeer van de pentose xylose.

Het nieuwe enzyme is thermostabiel bevonden, 25 dat wil zeggen het behoudt goede aktiviteit bij verhoogde temperaturen en is zodoende van bijzondere betekenis bij de afbraak van pentosanen bij hoge temperatuur. Zo behield het enzyme bijvoorbeeld bij stabiliteitsmetingen onder gebruikmaking van het volgens de werkwijze van onderstaand voorbeeld I beschreven en-30 zyme nog altijd 50% van zijn beginaktiviteit na. 6 minuten op 95°C verhitten bij pH 5,0 in afwezigheid van'substraat. Het enzyme vertoont ook een voordelige temperatuur-aktiviteitverwantschap met een optimum aktiviteit onder gebruikmaking van haverzemelen-xylan als substraat bij 87 ± 2°C en retentie van 45% optimum 35 aktiviteit bij 95eC. Dit is ongebruikelijk bij een enzyme, dat 8403500 - 3 - van fungus afkomt en staat bijvoorbeeld in tegenstelling tot de boven beschreven yd-glucanase, die een slecht gedefinieerd optimum bij 60-70°C heeft en slechts 40% van deze piekaktiviteit bij 80°C behoudt.

5 Het enzyme van de uitvinding heeft de volgende eigenschappen, gemeten onder gebruikmaking van een ruw enzyme-preparaat, dat is verkregen volgens de werkwijze van onder beschreven voorbeeld I: (a) de pH voor de optimum aktiviteit van het 10 nieuwe enzyme is 5,0, gemeten bij 50°C en onder gebruikmaking van haverzemelenxylan als pentosahsubstraat, (b) de temperatuur voor de optimumaktiviteit van het nieuwe enzyme is 87 ± 2°C, gemeten bij pH 5,0 onder gebruikmaking van haverzemelenxylan als pentosansubstraat, 15 (c) de aanwezigheid van vooraf toegevoegde xylo se, glucose of maltose heeft geen effekt op de enzymeaktiviteit wanneer deze vervolgens beproefd wordt bij pH 5,0 en 50°C onder gebruikmaking van haverzemelenxylansubs traat.

Men kan het enzyme van de uitvinding in het 20 algemeen bereiden door een ent van T. emèrsónii, bijvoorbeeld T. emersonii ME 116815, of een mutant daarvan in een daartoe geschikt voedingsmedium te fermenteren. Er werd echter voorts gevonden, dat men de langs natuurlijke weg geproduceerde hoeveelheid pentosanase ten opzichte van de geproduceerde hoeveelheid 25 y#-glucanase kan opvoeren door geschikte modificatie van het fer-mentatiemedium. Een enzymepreparaat, dat rechtstreeks is verkregen door fermentatie van Talarómyces émèrsónii, liefst T. emersonii ML 116815, waarin het pentosanaseaktiviteitspeil ten opzichte van eventuele yS-1,4/β-\ ,3-glucanaseaktiviteit ten. gevolge van een 30 dergelijke modificatie hoger is dan op gewone wijze kan worden bereikt, vormt een voorkeursaspekt van dé uitvinding, evenals een werkwijze voor de bereiding daarvan.

Men kan de fermentatie volgens in de fermentatie-industrie welbekende werkwijzen uitroeren. Aldus kan men de stam 35 van T. émersonii onder aerobe omstandigheden, bij voorkeur in sub- j 8403600 Γ" - 4 - ί * d merse cultuur, onder beweging of beroering met lucht of zuurstof kweken. Het gebruikte fermentatiemedium moet een assimileerbare koolstofbron, een verteerbare stikstofbron, en, desgewenst, groei-bevorderende stoffen, alsmede anorganische zouten bevatten.

5 Geschikte koolstofbronnen zijn stoffen, die rijk zijn aan pentosanen, bijvoorbeeld granen, zoals gerst en tarwe, oplosbare stoffen uit de destilleerderij, of andere bij-produkten van mout of graandestillatie, cellulose, bijvoorbeeld Solka Floc, of xylan.

10 Geschikte stikstofbronnen zijn bijvoorbeeld gerst, oplosbare stoffen uit de destilleerderij of andere bij-produkten van de mout of graandestillatie, sojameel, nitraten, of ammoniumzouten, zoals ammoniumdiwaterstoffosfaat.

Als het gewenst is het peil van pentosanase-15 aktiviteit ten opzichte van enige β-glucanaseaktiviteit op te voeren, kan men als koolstof- of stikstofbron goed gebruik maken van Scotagran (een mengsel van opgeloste stoffen en gedroogde gerstekorrels), ammoniumnitraat, potbiersiroop, maispersstukjes (gedroogde maïskorrels, vermengd met oplosbare stoffen), Curne-20 siroop of maisweekvloeistof.

Anorganische zouten, die men in het fermentatiemedium kan gebruiken, zijn bijvoorbeeld kalium-, magnesium- en natriumsulfaat en -chloride.

Groeibevorderende stoffen, die men kan gebruiken, 25 zijn bijvoorbeeld sporeelementen, zoals mangaan, ijzer, zink, koper of fosfor.

Het fermentatiemedium kan goed gist in een concentratie van 0,2 tot 3,5% w/v, oplosbare stoffen van destilleer-derijen of andere bijprodukten van mout- of graandestillatie in 30 een concentratie van 0,4 tot 5,5% w/v en 0,2 tot 3,0% w/v cellulose bevatten.

Kweekomstandigheden, zoals temperatuur, pH en fermenteertijd kiest men zodanig uit, dat de gebruikte stam een maximumhoeveelheid gewenst enzyme kan opzamelen. Zo kan men de 35 fermentatie bijvoorbeeld goed bij een temperatuur van 35-60°C, 8403600 * . .5 - 5 - bij voorkeur van 50-54°C, bij een pH van 3,5-4,5 en gedurende 1-20 dagen, bij voorkeur 7-10 dagen uitvoeren.

Men kan de ruwe kweekvloeistof rechtstreeks voor enzymatische werking gebruiken, maar desgewenst kan men de 5 gehele kweekvloeistof drogen en het resulterende poeder gebruiken. Desgewenst kan men enige zuivering van de pentosanase uitvoeren, bijvoorbeeld door chromatografische methoden, teneinde een enzyme-preparaat te verkrijgen met verhoogde pentosanaseaktiviteit ten opzichte van enige β-\,4/1,3-glucanaseaktiviteit en een werk-10 wijze voor het uitvoeren van een dergelijke zuivering en het daarmee verkregen produkt vormen verdere aspekten van de uitvinding.

Eventueel kan men het enzyme, dat exocellulair is, uit het fermentatieprodukt extraheren volgens bijvoorbeeld gebruikelijke werkwijzen. Aldus is bijvoorbeeld een eerste trap 15 normaliter af filtreren van het gevormde mycelium, bij voorkeur met een filter, dat met een filterhulp is bekleed. Men kan het resulterende filtraat rechtstreeks gebruiken, maar men kan het ook goed concentreren, bij voorkeur in vakuum, teneinde het enzyme in de vorm van een vloeibaar concentraat te verkrijgen. Men kan 20 het vloeibare concentraat zelf als enzymebron gebruiken. Men kan aan dergelijke vloeibare concentraten desgewenst stoffen toevoegen als natriumchloride, natriumbenzoaat of natriummetabisulfiet, die stabiliteit van het enzyme bij opslag, thermostabiliteit van het enzyme en/of bacteriologische stabiliteit verlenen. Eventueel 25 kan men het vloeibare concentraat ook absorberen in een geschikte vaste stof, bijvoorbeeld gemalen tarwe of gerst, eventueel in aanwezigheid van een drager, zoals natriumcarboxymethylcellulose en de resulterende vochtige massa tot een aktief enzymeprodukt dragen. Desgewenst kan men het vloeibare concentraat zalf drogen, bijvoor-30 beeld door sproeidrogen, vriesdrogen of walsdrogen, onder verkrijging van een droog enzymepreparaat.

Tenzij de extraktie rigoreus is, wat voor commerciële doeleinden gewoonlijk om ekonomische redenen vermeden wordt en niet nodig is gegeven de scala van toepassingen, waarvoor men 35 een ruwer preparaat kan gebruiken, bevat het preparaat gewoonlijk 8403000 ♦ * - 6 - < andere enzymeaktiviteiten.

I Als men een vast enzymeprodukt wenst, kan men dit uit het filtraat of een vloeibaar concentraat daarvan verkrijgen op gebruikelijke wijzen, zoals precipitatie door toevoe-5 ging van bijvoorbeeld een overmaat met water vermengbaar organisch oplosmiddel, zoals een alkohol, bijvoorbeeld ethanol, of een keton, bijvoorbeeld aceton. Men kan hetzij rechtstreekse precipitatie, hetzij precipitatie op een drager gebruiken en goede dragers zijn met name bijvoorbeeld zetmeel, methylcellulose of natriumcarboxy-10 methylcellulose.

De bij de fermentatie gebruikte ent van T. emersonii kan bijvoorbeeld worden verkregen door schaalvergroting vanuit een oppervlaktecultuur van het organisme. Schaalvergroting tot pröduktieve fermentatie kan goed geschieden door een 15 vegetatieve groei op laboratoriumschaal te laten plaatshebben, gevolgd door een of meer zaaistadia in geroerde fermentatievaten.

Aldus wordt bij echte toebereiding van een ent het organisme uitgestreken op een vast voedingsmedium, bijvoorbeeld een agarmedium, dat pepton (bijvoorbeeld 0,5% w/v), natrium-20 chloride (bijvoorbeeld 0,4% w/v), glycerol (bijvoorbeeld 0,75% w/v), molasse (bijvoorbeeld 0,8% w/v), kaliumdiwaterstoffosfaat (bijvoorbeeld 0,006% w/v) en magnesiums.ulfaat (bijvoorbeeld 0,005% MgSO^. 7^0 w/v) bevat en vooraf gesteriliseerd is, bijvoorbeeld door het 15 minuten op 120°C te verhitten in een autoclaaf en het 25 daarna te laten afkoelen. Het broeden geschiedt bij voorkeur 10 dagen bij 37QG, waarna men de geproduceerde sporen gebruikt voor het enten van een vloeibaar medium voor vegetatieve groei, dat gesteriliseerd is door het bijvoorbeeld 15 minuten op 120°C in een autoclaaf te verhitten en moutextrakt (bijvoorbeeld 3,3% w/v), 30 gistextrakt (bijvoorbeeld 2,0% w/v) en ammoniumdiwaterstoffosfaat (bijvoorbeeld 0,6% w/v) bevat. Men voert de kweek bij voorkeur uit tot er een goede myceliumgroei aanwezig is, bijvoorbeeld, wanneer men 500 ml medium gebruikt, 72 uur bij 45°C.

Daarna gebruikt men de resulterende vegetatieve 35 cultuur voor het enten van een eerste geroerd zaaistadium. Het 8403600 - 7 - medium voor dit stadium bevat bij voorkeur soortgelijke componenten als boven beschreven voor het hulpfermentatiemedium en wordt bij voorkeur bereid door alle bestanddelen samen in het zaai-stadiumvat te steriliseren door bijvoorbeeld stoominjektie. Een 5 goed medium voor het zaaistadium is 'Medium. A', hieronder getoond in tabel A. Onder gebruikmaking van 40 1 medium voert men de kweek bij voorkeur bij 50°C gedurende 76 uur uit onder roeren, bijvoorbeeld met 420 omwentelingen per minuut en beluchting, bijvoorbeeld 50 1 lucht per minuut.

10 Men kan de aldus verkregen zaaicultuur dan ge bruiken voor het enten van een produktiestadium als boven beschreven, of indien er meer zaaimateriaal nodig is, gebruiken voor verdere zaaistadia, die van identieke aard zijn als het eerste.

Mutanten van T. êmèrsónii ten gebruike bij boven-15 genoemde fermentatieprocessen kunnen worden verkregen volgens de gebruikelijke methoden voor stamverbetering, bijvoorbeeld door gebruikmaking van ioniserende straling (bijvoorbeeld röntgenstraling en Y-straling, W-licht, of W-licht in aanwezigheid van een licht-gevoeligmakend middel, zoals 8-methoxypsoraleen), chemicaliën 20 (bijvoorbeeld stikstofoxyde, hydroxylamine, pyrimidinebaseanalogen, zoals 5-broomuracil, acridinen, alkyleermiddelen, zoals ethyl-methaansulfonaat of mosterdgas, waterstofperoxyde, fenolen of formaldehyde), verhitting of genetische methoden (bijvoorbeeld recombinatie, transductie, transformatie, lyogenisering, lyogene 25 omzetting en selectieve methoden voor spontane mutatie).

Men kan de gewenste enzymeaktiviteit in de kweek-vloeistof of op enig punt in een isolatieprocedure bepalen met een eenvoudige proef, die ontworpen is voor het bepalen van de reducerende suikers, die door de inwerking van.het enzyme op een 30 pentosansubstraat worden af gegeven. Aldus wordt bij een proef een van het te meten enzymepreparaat geschikt verdund en daarna 10 minuten bij 50°C in een pH 5,0 acetaatbuffer gebroed met een overmaat van de pentose xylan. De afgegeven striker wordt als maltose-equivalent bepaald door alkalisch 3,5-dinitrosalicylzuurreagens 35 toe te voegen, 5 minuten op een kokend waterbad te verhitten, in 8403600 .

a- s, - 8 -

ijswater af te schrikken, de absorptie van de oplossing bij 540 nm te meten en dit in een maltoseequivalent om te zetten aan de hand van een standaard ijkgrafiek, die men heeft verkregen door standaard maltoseoplossingen van bekend vochtgehalte te bereiden 5 en deze onder de zojuist beschreven omstandigheden met het dinitro-salicylzuurreagens te laten reageren. Zoals hier gebruikt geeft één eenheid enzyme onder de proefomstandigheden bij 50°C en pH

5,0 t mg maltoseequivalent per minuut af.

Men kan het enzyme van de uitvinding gebruiken 10 voor een aantal doeleinden, waarvoor men andere pentosanasen gebruikt. Zo kan men het bijvoorbeeld gebruiken in de bakkerij voor het verminderen van het natuurlijke pentosangehalte van tarwebloem teneinde de houdbaarheidseigenschappen van brood te verbeteren. Men kan het gebruiken bij zetmeelbereiding en hydrolyse 15 ter verlaging van het pentosangehalte van granen en ter vermindering van de viskositeit van zetmeelbrijen, die anders een nadelige invloed zou hebben op de doelmatigheid en kosten van zetmeel-• winning en daaropvolgende hydrolyse. Men kan het in de landbouw gebruiken voor het opvoeren van de kwaliteit van ingekuilde oogst 20 en diervoeder. Men kan het in de brouwerij gebruiken voor een betere produktie en extraktie van fermenteerbare suikers, als het beslag bijvoorbeeld tarwe of gierst bevat en ter voorkoming of behandeling van bepaalde typen vertroebeling. Men kan het gebruiken voor de extraktie van plantaardig weefsel, bijvoorbeeld bij 25 de extraktie van thee, koffie en vruchten en voor het extraheren van alginaten uit zeewier en bij de bereiding van natuurlijke plantaardige kleurstoffen. Bij sommige van deze toepassingen is de thermo stabiliteit van het enzyme bijzonder voordelig, gelet op de temperaturen, waarbij men de processen uitvoert.

30 De uitvinding heeft dan ook betrekking op een werkwijze voor het verminderen .van het pentosangehalte van een pentosan bevattende stof, waarbij men deze stof met een enzyme van de uitvinding in aanraking brengt.

Goede voorbeelden van pentosanen, die met het 35 enzyme van de uitvinding kunnen worden afgebroken, zijn de pento- 8403600 - 9 - sanen, die men aantreft in granen, zoals tarwe en haver, planten, zoals thee en koffie en in extrakten daarvan, vruchten, groenten, zeewier en gierst. Bij een voorbeeld, kan de pentosan xylan zijn, bijvoorbeeld een haverzemelenxylan. Bij een voorkeursuitvoerings-5 vorm is het af te breken pentosan bevattende materiaal van tarwe afkomstig.

De uitvinding heeft voorts betrekking op een werkwijze voor het verlagen van het xylangehalte van een xylan bevattende stof, waarbij men deze stof met een enzyme van de uit-1Q vinding in aanraking brengt. Het enzyme of preparaat van de uitvinding kan worden gebruikt onder toepassing van werkwijzen, die men gewoonlijk in de enzymetechnologie aantreft. Zo kan men bijvoorbeeld het enzyme in aanraking brengen met een waterig medium, dat het substraat hetzij in suspensie, hetzij in vermenging, het-15 zij in oplossing bevat. De reaktietemperatuur wisselt met de juiste aard van de reaktie, maar bedraagt in het algemeen 35-95°C, waarbij het hoogste gebied van het trajekt de voorkeur verdient, bij sommige toepassingen derhalve 90°C en daarboven. De pH van het reaktiemengsel kan bijvoorbeeld 4,0-6,5 bedragen, bij voorkeur 20 4,5-5,5 en liefst 5,0- Desgewenst kan het reaktiemengsel andere toegevoegde enzymen bevatten, bijvoorbeeld of'-amylase.

De stam van Talaromyces emersonii, die werd gébruikt, is een subcultuur van de stam, die werd gedeponeerd bij het Commonwealth Mycological Institute, Kew, Engeland onder 25 nummer DU 116815 in 1972, alvorens het Verdrag van Boedapest over de internationale erkenning van het depot van mikroorganis-men ten behoeve van octrooiprocedures (Boedapest 1977) werd ondertekend. Deze stam werd op 19 november 1984 onder timmer CME CC no. 290604 bij dezelfde verzameling maar onder de omstandigheden van het Verdrag 30 van Boedapest opnieuw gedeponeerd en gemeend wordt dat de twee stammen identiek zijn en dat elk van beide stammen kan worden gebruikt.

De volgende voorbeelden lichten de uitvinding toe. Alle temperaturen zijn in eC. Alle percentages zijn in w/v.

35 8403600 9 <- I -ΙΟ Ι

Voorbeeld I

i Men kweekte Talaromyces emersonii IMI 116815 10 dagen bij 37° op een agarmedium, dat in een autoclaaf gesteri-5 liseerd was en 0,5% pepton, 0,4% NaCl, 0,75% glycerol, 0,8% molas-se, 0,006% K^PO^ en 0,005% MgSO^^I^O bevatte.

Men gebruikte de geproduceerde sporen voor het enten van kolven van een vloeibaar medium, dat gesteriliseerd was in een autoclaaf en 3,3% moutextrakt, 2,0% gistextrakt en 10 0,6% ammoniumdiwaters tof fosfaat bevatte. Men plaatste de kolven 3 dagen bij 45° op een roterende schudinrichting (210 omwentelin-gen/minuut, 4,9 cm slag).

Men gebruikte de resulterende vegetatieve cultuur (400 ml) voor het enten van 40 1 medium A (tabel A), dat door 15 stoominjektie gesteriliseerd was, in een roestvrijstalen fermen-teerinrichting van 50 1 capaciteit. Men roerde de cultuur 75 uur bij 50° bij 420 omwentelingen/minuüt en een beluchting van 50 1/ minuut.

Men gebruikte de resulterende cultuur (4,5 1) 20 voor het enten van 40 1 medium A (tabel A), dat door stoominjektie gesteriliseerd was, in een roestvrijstalen fermenteerinrichting van 50 1 capaciteit. Men roerde de cultuur 75 uur bij 50° bij 420 omwentelingen/minuut en een beluchting van 50 1/minuut.

Men gebruikte de resulterende cultuur (4,5 1) 25 voor het enten van 40 1 medium A, dat door stoominjektie gesteriliseerd was in een roestvrijstalen fermenteerinrichting van 50 1 capaciteit. Men roerde de cultuur 36 uur bij 50° bij 420 omwentelingen/minuut en een beluchting van 50 1/minuut.

Men gebruikte de resulterende cultuur (16 1) 30 voor het enten van 32 1 medium B (tabel A), dat door stoominjektie gesteriliseerd was, in een roestvrijstalen fermenteerinrichting van 50 1.

Men beluchtte de cultuur met 50 1/minuut en roerde met onderbrekingen 10 dagen bij 50° bij 420 omwentelingen/ 35 minuut. Men voegde steriel water toe met een gemiddelde hoeveel- 8403500 » φ - 11 - - heid van 1,5 X per dag.

Beproeving van de exocellulaire vloeistof leverde een concentratie van het enzyme van de uitvinding op van 36 eenheden/gram.

5

Tabel A

Bestanddeel Medium A (%) Medium B (%)

Gemalen gerst 1,0 3,38 10 Oplosbare stoffen uit 2,25 5,06 de destilleerderij

Solfca Floc 2,25 2,53 (NH4)2 H2K>4 0,34 0,77 K2SG4 0,12 0,27 15 MgS04.7H20 0,01 0,11

NaCl 0,11 0,11

MnS04.4H20 0,0005 0,001

FeS04.7H20 0,004 0,008

ZnS04.7H20 0,004 0,008 20 CuS04.5H20 0,0005 0,001 H3F04 0,5 1,02

Water tot 100%

Voorbeeld II 25

Demonstratie van de'variatie in pentosanase:glu-canaseverhoudjng bij fermentatie; a) Men produceerde sporen als in voorbeeld I 30 en gebruikte deze voor het enten van een zaaistadium in 250 ml kolven, die 40 ml medium A bevatten, dat in een autoclaaf gesteriliseerd was. Men liet de kolven 72 uur bij 45° broeden onder schudden met 200 omwentelingen/minuut. Men gebruikte de resulterende cultuur (4 ml) voor het enten van 40 ml medium B, dat ge-35 steriliseerd was in een autoclaaf, in kolven van 250 ml. Na 12 8403600 _ __j

^ V

r* * - 12 - dagen broeden bij 45° onder schudden bij 200 omwentelingen/minuut, beproefde men de exocellulaire cultuurvloeistof op pentosaan (P) en gerst /^-glucanase (G) aktiviteit en berekende de P:G verhouding. . , 5 b) Onder gebruikmaking van hetzelfde systeem als in a) boven, gaf weglating van Solka Floc en opneming van haverkorrelxylan (2,2%) een 71% hogere P:G verhouding dan onder a).

Voorbeeld III

10

Teneinde de pentosanaseaktiviteit in het in voorbeeld 1 geproduceerde enzyme aan te tonen, broedde men een 1% pentosanoplossing bij 50° in een buffer bij pH 5,0 in aanwezigheid van toegevoegd enzyme (proefsysteem) of. onder toevoeging van 15 een equivalente hoeveelheid water (controlesysteem). Het gebruikte pentosansubstraat was xylan, dat uit haverzemelen was verkregen.

Men onttrok monsters aan het proefsysteem na 10 minuten, 30 minuten en 22,5 uur, die ter voorkoming van enige verdere reaktie werden afgeschrikt en daarna als vlekken werden 20 aangebracht op 20 cm2 dunnelaagchromatografieplaten, die met 0,25 mm kiezelgel waren bedekt. Men bracht ook vlekken van geselecteerde standaard suikeroplossingen en van het controlesysteem aan.

De mobiele fase was n-butanol.:pyridine:ethanol: water (20;15:25;10). De detectie geschiedde door de gedroogde 25 platen te besproeien met 5% ammoniummolybdaat in 5% zwavelzuur, gevolgd door 15 minuten verhitten op 105°.

Alle proefmonsters vertoonden onder andere een vlek van identieke Rf waarde als werd gegeven door de standaard oplossing van de suiker xylose.

30 Aangezien het controlemonster slechts een enkele vlek aan de oorsprong gaf, kon deze proefvlek niet afkomstig zijn van hetzij xyloseverontreiniging van het substraat, hetzij van chemische hydrolyse van xylose en zij moet dus zijn ontstaan door enzymatische afbraak van de pentosan.

35 8403600 *K siff * - 13 -

Voorbeeld IV

Men ontwierp de volgende vergelijkende proef teneinde het potentiële nut van het enzyme van de uitvinding in 5 een enzymatisch tarwezetmeelverteringsproces te laten zien:

Enzyme (2 ml), bereid volgens voorbeeld I, tarwebloem van mindere kwaliteit (155 g), natriumehloride (2 g), cal-ciumchloride (0,17 g), bacteriele alpha-amylase, "Termamyl" (Novo Industri A/S) (1 ml) en water (250 ml), werden grondig in 10 een glazen kolf geschud. Men stelde de pH met natronloog in op 6,5. Men dekte de hals van de houder a£ teneinde verdamping tot een minimum te beperken en hield de kolf 5 uur op 90°. Er trad zetmeelhydrolyse op (negatief resultaat van de jodiumproef) en de viskositeit van het verteringsmengsel was 43 cps.

15 Bij een controleproef onder weglating van het enzyme van de uitvinding was de eindviskositeit van het verteringsmengsel 127 cps.

De volgende voorbeelden lichten proeven toe, 20 die voor het karakteriseren van het enzyme van de uitvinding werden uitgevoerd. In elk voorbeeld was het gebruikte enzyme bereid volgens de werkwijze van voorbeeld I, behalve dat men kleine hoeveelheden natriumhenzoaat en natriummetahisulfiet aan de exocullu-laire vloeistof als bacteriologische stabilisatoren had toegevoegd.

25 Men bepaalde de enzymeaktiviteit in elk voorbeeld onder gebruikmaking van een overmaat 1% tarwezemelenxylan in water als pento-sansubstraat en door meting van de toeneming in reducerende akti-viteit na 10 minuten broeden, tegen een xyloseijkkromme. pH en temperatuur van elke breeding zijn in de voorbeelden opgegeven.

30

Voorbeeld Y

Men verkreeg bij 50° het volgende verband tussen pH en aktiviteit: 35 8403600 - 14 - pH 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 % maximum akti- viteit 62 85 100 84 70 47 5 Er trad over het hele weergegeven trajekt aan zienlijke hydrolyse op.

Voorbeeld VI

10 Men onderzocht de thermische stabiliteit door monsters bij 60, 70, 80, 90 en 95° te bewaren in afwezigheid van substraat en door op bepaalde tussenpozen hoeveelheden te onttrekken, waardoor men een familie van restaktiviteit-tijdkrommen verkreeg. De resterende aktiviteit werd gemeten bij pH 5,0 en 50°: 15 bij 60° was er geen waarneembaar aktiviteits- verlies na 80 minuten, bij 70° was er nog 70% van de beginaktiviteit aanwezig na 1 uur, bij 80° was er nog 70% van de beginaktiviteit 20 aanwezig na 30 minuten, bij 90° was er nog 50% van de beginaktiviteit aanwezig na 8 minuten, bij 95° was er nog 50% van de beginaktiviteit aanwezig na 6 minuten.

25

Voorbeeld Vil

Men verkreeg bij een pH van 5 het verband tussen temperatuur en aktiviteit. Inspektie van de aktiviteit-temperatuur-30 kromme liet zien, dat er een piekaktiviteit optrad bij 87 ± 2°.

De aktiviteiten bij de verschillende onderzochte temperaturen, uitgedrukt als percentages van dit maximum, waren als volgt: % maximum aktiviteit 13 24 41 57 86 / 100_7 90 45 35 Temperatuur °C 40 50 60 70 80 /“87 ± 2J 90 95 8403600 < Φ__£ - 15 -

De resultaten bevestigen de inherente thermische stabiliteit van het nieuwe enzyme als getoond in voorbeeld V. Men kan het enzyme duidelijk bij temperaturen boven 90° gebruiken.

Dit staat in tegenstelling tot een slecht gede- 5 finieerd optimum van 60-70° voor de gerst /$-glucanase van het Britse octrooischrift 1.421.127. Bij 80° wordt slechts 40% van de piekaktiviteit vermeld.

Voorbeeld VIII

10

Bij een voorlopige studie teneinde na te gaan of de aktiviteit van de enzymen werd beïnvloed door reaktiepro-dukten en/of andere suikers, die aanwezig zijn in een echt ver-teringsmengsel van een industrieel proces, voegde men drie een- 15 voudige suikers (xylose, glukose en maltose) afzonderlijk toe aan het enzyme, dat men daarna bij 50° en pH 5,0 beproefde. Men voegde elke suiker toe in een hoeveelheid, die equivalent was met de hoeveelheid xylose, die onder de proefomstandigheden uit het substraat werd vrijgemaakt.

20 Er trad geen remming of bevordering van enzyme- aktiviteit op en dus trad er blijkbaar geen wisselwerking met de enzymeaktiviteit op vanwege de opzameling van de eenvoudige suikers, die bij vele industriële toepassingen optreedt.

25 8403300

Claims (14)

1. Enzyme, dat men door fermentatie uit een stam t van de species Talaromyces emersonii of een mutant daarvan kan verkrijgen, met het kenmerk, dat het de afbraak van pentosanen kan katalyseren.

2. Enzyme volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het een optimum aktiviteit bij pH 5,0 gemeten bij 50°C heeft en een optimum aktiviteit bij 87 ± 2 °C, gemeten bij pH 5,0 heeft en ongeveer 50% van zijn beginaktiviteit behoudt na 6 minuten verhitting op 95°C bij pH 5,0, alles gemeten onder gebruikmaking 10 van tarwezemelenxylan als pentosansubstraat.

3. Enzymepreparaat, met het kenmerk, dat het een enzyme volgens conclusie 1 of 2, vermengd met een β~\ ,4/ β-\ ,3-glucanase bevat en het peil van zijn pentosaneaktiviteit ten opzichte van het peil van zijn /3-1,4//3-1,3-glucanaseaktiviteit is 15 opgevoerd door modificatie van het fermentatiemedium, waarin elk geproduceerd is.

4. Enzyme of preparaat volgens een der conclusies 1 tot 3, met het kenmerk, dat de gebruikte stam Talaromyces emersonii IMI 116815, GMI CC no . 290604, b£ een mutant daarvan is.

5. Werkwijze voor het bereiden van een enzyme preparaat met pentosanaseaktiviteit, met het kenmerk, dat men een mikroorganismestam van de species Talaromyces emersonii fermenteert in een daarvoor geschikt voedingsmedium, waardoor een vloeistof, die dit enzyme bevat, wordt geproduceerd.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat men het peil van de pentosanaseaktiviteit ten opzichte van het peil van de /3-1,4/^-1,3-glucanaseaktiviteit opvoert door modificatie van het voedingsmedium.

7. Werkwijze volgens conclusie 5 tot 6, 30 met het kenmerk, dat men het peil van de pentosanaseaktiviteit ten opzichte van het peil van de /^-1,4//3-1,3-glucanaseaktiviteit opvoert door een zuiveringsbehandeling na de fermentatie.

8. Werkwijze volgens een der conclusies 1 tot 7, 8403600 * - 17 - a: met het kenmerk, dat de stam Talaromyces emersonii IMI 116815, CMI CC no. 290604 of een mutant daarvan is.

9. Werkwijze voor het verlagen van het pentosan-gehalte van een pentosan bevattende stof, met het kenmerk, dat men 5 de stof met een enzyme of preparaat volgens een der conclusies 1 tot 4 in aanraking brengt.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat de pentosan bevattende stof tarwe of haver, een thee-of koffieplant, of een extrakt daarvan, een vrucht of een groente 10 is.

11. Werkwijze volgens conclusie 9 of 10, met het kenmerk, dat de pentosan bevattende stof zetmeel is.

12. Werkwijze volgens conclusie 9 of 10, met het kenmerk, dat de pentosan bevattende stof tarwe of van 15 tarwe afkomstig is.

13. Werkwijze volgens een der conclusies' 9 tot 12, met het kenmerk, dat men het enzyme in een waterig medium bij 35-95°C en een pH van 4,0 tot 6,5 met de pentosan bevattende stof in aanraking brengt. 20

14. Gébruik van een preparaat, dat een pento- sanaseenzyme bevat, dat afkomstig is van een stam van de species Talaromyces emersonii bij het verlagen van het pentosangehalte van tarwe of haver, een thee- of koffieplant, of een extrakt daarvan, een vrucht of een groente. 25 8403600 »