PL191456B1 - Sposób wytwarzania piwa z wykorzystaniem Maltseed - Google Patents

Sposób wytwarzania piwa z wykorzystaniem Maltseed

Info

Publication number
PL191456B1
PL191456B1 PL331493A PL33149397A PL191456B1 PL 191456 B1 PL191456 B1 PL 191456B1 PL 331493 A PL331493 A PL 331493A PL 33149397 A PL33149397 A PL 33149397A PL 191456 B1 PL191456 B1 PL 191456B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
enzyme
malt
enzymes
grain
plant
Prior art date
Application number
PL331493A
Other languages
English (en)
Other versions
PL331493A1 (en
Inventor
Jérome Souppe
Robert Franciscus Beudeker
Original Assignee
Dsm Gist Holding Bv
Syngenta Mogen Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dsm Gist Holding Bv, Syngenta Mogen Bv filed Critical Dsm Gist Holding Bv
Publication of PL331493A1 publication Critical patent/PL331493A1/xx
Publication of PL191456B1 publication Critical patent/PL191456B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01073—Licheninase (3.2.1.73)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C5/00—Other raw materials for the preparation of beer
    • C12C5/004—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C5/00—Other raw materials for the preparation of beer
    • C12C5/004—Enzymes
    • C12C5/006—Beta-glucanase or functionally equivalent enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C7/00—Preparation of wort
    • C12C7/04—Preparation or treatment of the mash
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C7/00—Preparation of wort
    • C12C7/04—Preparation or treatment of the mash
    • C12C7/047—Preparation or treatment of the mash part of the mash being unmalted cereal mash
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01001—Alpha-amylase (3.2.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Alcoholic Beverages (AREA)
  • Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

1. Sposób wytwarzania piwa z wykorzystaniem Maltseed, znamienny tym, ze do s lodu do- daje si e mieszanin e enzymów obejmuj ac a przynajmniej endo- ß-(1,4)-ksylanaz e, arabinofuranozy- daz e, a-amylaz e, endoproteaz e oraz ß-(1,3;1,4)-glukanaz e, przy czym mieszanina enzymów zmniejsza ilo sc wymaganego s lodu. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania piwa z wykorzystaniem Maltseed.
Napoje alkoholowe takie jak piwo mogą być produkowane ze słodowanego i/lub niesłodowanego ziarna jęczmienia. Słód, wraz z drożdżami, stanowi o zapachu i kolorze piwa. Ponadto, słód spełnia rolę źródła fermentowanego cukru i enzymów. Używanie słodu w procesach browarniczych zależy od rodzaju piwa i kraju, w którym jest ono produkowane. Przykładowo, w krajach afrykańskich, nie ma tradycji używania słodu.
Ogólny sposób otrzymywania słodu i warzenia piwa został ostatnio opisany przez R.C. Hoseney (Cereal Foods World, 39(9), 675-679, 1994). Słodowanie jest procesem kontrolowanego kiełkowania przebiegającego poprzez kontrolowane suszenie ziarna jęczmienia. Ziarno jest przerabiane na słód poprzez kolejne etapy moczenia, kiełkowania, wzrostu i suszenia (piecowania). Etap kiełkowania jest istotny dla otrzymania ekspresji grupy enzymów, które umożliwiają modyfikowanie endospermy. Modyfikacja ta daje ulegające fermentacji węglowodany.
Kolejne etapy suszenia/ogrzewania w procesie słodowania dają zapach i kolor dzięki nieenzymatycznej reakcji czernienia (Maillard).
Proces słodowania jest bardzo skomplikowaną oraz kosztowną częścią procesu produkcji piwa. Można wymienić kilka wad słodowania:
• poziom enzymów słodu jest zmienny, co prowadzi do nieprzewidzianych rezultatów, • nie każda z pożądanych aktywności enzymatycznych jest otrzymywana lub jest otrzymywana w odpowiedniej ilości podczas kiełkowania, co zmusza do uzupełnienia enzymów, • warunki sprzyjające powstawaniu zapachu i koloru słodu mogą być niszczące dla jego aktywności enzymatycznej, • proces jest kosztowny, • 10 - 20% utrata wagi podczas kiełkowania, będąca efektem oddychania i wzrostu korzeni (są one usuwane podczas oczyszczania słodu), • nie jest możliwe produkowanie słodu w dowolnym miejscu, ze względu na niesprzyjające warunki klimatyczne, • stosowanie słodu może prowadzić do koloidalnej niestabllności ze względu na rozpuszczanie białek przez proteazy zawarte w słodzie, • może dochodzić do tworzenia się amin biogennych (J.Food Science 59(5), 1104-1107, 1994), które mogą prowadzić do np. zatrucia histaminowego.
Tradycyjnie, słód był jedynym źródłem fermentowanych węglowodanów i enzymów, i w wielu krajach jest tak nadal. Jednak, coraz więcej piwa jest produkowane z wykorzystaniem innych źródeł węglowodanów niż słód i/lub jęczmień, tj. praktycznie dowolnego źródła skrobi lub upłynnionej/zdegradowanej skrobi, czyli tzw. dodatków. Ponieważ słód nie jest jedynie źródłem węglowodanów poddawanych fermentacji, lecz także źródłem enzymów, dostarcza się alternatywnych enzymów, aby zastąpić więcej niż ok. 50% słodu przez niesłodowany jęczmień i/lub dodatki. Ponadto, słód daje piwu zapach i kolor.
W produkcji słodu istnieje związek między kolorem i zapachem oraz aktywnością enzymatyczną. Słód dostarczający silnego zapachu i ciemnego koloru może zostać uzyskany tylko w wyniku intensywnego suszenia w relatywnie wysokiej temperaturze. Są to warunki szkodliwe dla aktywności enzymów. Stąd też uzupełnienie enzymów z egzogennego źródła jest pożądane z kilku powodów. W związku z tym, użycie enzymów z mikroorganizmów jest w pewnych przypadkach pospolitą praktyką. Przykładowo, dla warzenia piwa ziarno i/lub słodowane ziarno jest upłynniane i scukrzane w celu uzyskania cukrów poddawanych fermentacji. Etap upłynniania może zostać ulepszony dzięki użyciu termostabilnych α-amylaz, co zostało przykładowo opisane w US 4,285,975 lub 5,180,669. Używa się także proteaz do zwiększania ilości łatwo dostępnego azotu w brzeczce dla ulepszenia fermentacji.
Obok skrobi, w ziarnach zbóż obecne są także inne polisacharydy, takie jak przykładowo β-glukany (Henry, R. J. i wsp. J.Sci.Food Agric. 36, 1243-1253, 1985). β-glukanazy obecne w słodzie nie są wystarczająco termostabilne, aby być aktywne podczas procesu warzenia piwa. Takie β-glukany są bardzo lepkie i powodują problemy przy filtracji brzeczki i piwa. Jest to powodem, dla którego mikrobiologiczne β-glukanazy są szeroko stosowane do warzenia piwa.
Nieskrobiowe polisacharydy obejmują także pentozany, których struktura była ostatnio szeroko badana (Gruppen, H. i wsp. Carbohydr. Res. 233, 45-64, 1992), w szczególności tych z jęczmienia
PL 191 456 B1 i słodu (Vietor, R. J. i wsp., Carbohydr. Res. 254, 245-255, 1994). Pentozanaza z Penicillium emersonii została użyta do ulepszenia produkcji i ekstrakcji cukrów poddawanych fermentacji podczas warzenia piwa (GB 2,150,933).
Zastosowanie ksylanazy B do ulepszenia jakości brzeczki przedstawione jest w WO94/14965.
Pomimo postępu poczynionego w tej dziedzinie, ciągle potrzebne są preparaty enzymatyczne służące do ulepszania procesu warzenia piwa.
Podsumowanie wynalazku
Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania piwa z wykorzystaniem Maltseed, w którym to do słodu dodaje się mieszaninę enzymów obejmującą przynajmniej endo-e-(1,4)-ksylanazę, arabinofuranozydazę, α-amylazę, endoproteazę oraz p-(1,3;1,4)-glukanazę, przy czym mieszanina enzymów zmniejsza ilość wymaganego słodu.
W korzystnym wykonaniu wynalazku mieszanina zawiera także scukrzającą amylazę, korzystniej mieszanina zawiera także egzopeptydazę.
W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku każdy z enzymów dostarczany jest przez ziarna pojedynczej roślinnej linii transgenicznej.
W innym korzystnym wykonaniu wynalazku więcej niż jeden enzym dostarczany jest przez ziarna pojedynczej roślinnej linii transgenicznej.
W kolejnym korzystnym wykonaniu wynalazku co najmniej jeden enzym dostarczany jest przez ziarna pojedynczej roślinnej linii transgenicznej.
Korzystne jest, gdy pojedynczą roślinną linią transgeniczną jest roślinna linia jęczmienia.
Opis wynalazku
Nieoczekiwanie stwierdziliśmy, że procesy warzenia mogą być prowadzone w obecności zastrzeganej mieszaniny enzymów, z minimalną ilością słodu. Proces ten został wykorzystany do produkcji klasycznego piwa słodowego, ale może być równie dobrze wykorzystany w innych procesach, w których używa się słodu w celu uzyskania aktywności enzymatycznych.
Użyte enzymy zostały wybrane z grupy enzymów, które są niezbędne do procesu warzenia. Zawierają one enzymy wybrane z grupy enzymów amylolitycznych, grupy enzymów celulolitycznych, z grupy enzymów hemicelulolitycznych oraz z grupy enzymów proteolitycznych.
Enzymy amylolityczne obejmują enzymy takie jak α-amylaza, amylaza scukrzająca, amyloglukozydaza, egzoamylaza, pullulanaza.
Enzymy celulolityczne obejmują enzymy takie jak β-14-endoglukanaza, cellobiohydrolaza, β-glukozydaza.
Enzymy hemicelulolityczne obejmują enzymy takie jak e-1,3-1,4-glukanaza, ksylanaza, endoarabinaza, arabinofuranozydaza, arabinoksylanaza, arabinogalaktanaza, esteraza kwasu ferulenowego.
Enzymy proteolityczne obejmują enzymy takie jak egzopeptydazy i endopeptydazy (zwane także proteazami lub proteinazami).
W związku z tym, wybór odpowiedniego enzymu amylolitycznego, celulolitycznego, hemicelulolitycznego lub proteolitycznego nie jest istotą niniejszego wynalazku, gdyż wybór enzymu powinien polegać na takim doborze właściwości enzymu (takich jak zakres tolerancji pH i temperatury) i powinien być związany z odpowiednimi właściwościami w procesie warzenia.
Liczne geny kodujące enzymy amylolityczne, celulolityczne, hemicelulolityczne lub proteolityczne są znane specjalistom. Geny kodujące odpowiednie enzymy mogą pochodzić z wielu źródeł, roślinnych, zwierzęcych lub mikrobiologicznych. Korzystnie, geny te są pozyskiwane ze źródeł mikrobiologicznych.
Endo-e-(1,4)-ksylanaza może być otrzymywana z hodowli Aspergillus niger (EP 0 463 706). Arabinofuranozydaza jest dostępna jako izoenzym A lub izoenzym B (EP O 506 190) lub hydrolaza arabinoksylanowa (EP 0 730 653) pochodzące z hodowli Aspergillus niger. Termostabilne amylazy pochodzą z Bacillus licheniformis (WO91/14772, WO92/05259), i jest, przykładowo dostępna komercyjnie pod nazwą handlową Brewers Amyliq Termostable (B.A.T.S.). Aktywność termostabilnej amylazy wyraża się w jednostkach TAU. Endoproteaza może pochodzić z Bacillus amyloliquefaciens, i jest także komercyjnie dostępna pod nazwą handlową Brewers protease (+), a jej aktywność wyraża się w j ednostkach PC. Z tej samej bakterii może pochodzić także β-(1,3;1,4)-glukanaza (Hofemeister i wsp., Gene 49, 177, 1986), która to jest także komercyjnie dostępna pod nazwą handlową Filtrase L 3000 (+). Aktywność glukanazy jest wyrażana w jednostkach BGLU. Ewentualna amylaza scukrzająca może być także pozyskana z komercyjnych źródeł (amylaza z Aspergillus oryzae pod handlową na4
PL 191 456 B1 zwą Brewers Fermex, której aktywność wyrażana jest w jednostkach FAU), ale może być także otrzymywana z czystych kultur Penicillium emersonii (dostępna w ATTC (American Type Culture Collection) pod numerem ATCC16479). Ewentualna egzopeptydaza może pochodzić z czystych kultur
Aspergillus sojae, która została zdeponowana w Centraal Bureau for Schimmelcultures (CBS),
Oosterstraat 1, Baarn, Holandia, pod numerem CBS 209.96 (A. sojae (DS 8351) 12 lutego 1996).
Aktualnie znanymi aktywnościami potrzebnymi do produkcji piwa są α- i β-amylaza zamieniająca skrobię z endospermy na cukry ulegające fermentacji, proteaza degradująca białka do rozpuszczalnych związków azotowych, które są pożywką dla drożdży, i β-glukanaza oraz ksylanaza hydrolizujące, odpowiednio, jęczmienne e-1,3-1,4-glukany i ksylany do oligosacharydów, co prowadzi do obniżenia lepkości i polepszenia zdolności filtracyjnej. Stąd, aby dostarczyć wszystkich potrzebnych enzymów ze źródła egzogennego, np. mikrobiologicznego, wymagane jest dodanie, co najmniej 5 różnych enzymów. Jakkolwiek do produkcji wszystkich enzymów może zostać użyty jeden mikroorganizm, różne warunki fermentacji mogą być wymagane do optymalizacji produkcji poszczególnych enzymów.
Dzięki użyciu enzymów ze źródeł mikrobiologicznych mogą zostać ominięte pewne wady procesu słodowania wspomniane powyżej. Jednakże, użycie mikroorganizmu jako źródła enzymów ma także swoje wady:
• seria różnych fermantacji co najmniej jednego mikroorganizmu jest wymagana do otrzymania odpowiedniej ilości każdego z enzymów, • preparaty enzymatyczne mogą posiadać dodatkowe, niepożądane aktywności, • konsumenci mogą nie akceptować dodawania surowców innych niż materiał roślinny, woda i drożdże, • ograniczona stabilność preparatów enzymatycznych podczas ich przechowywania w temperaturze pokojowej.
Ogólnie, użycie transgenicznych ziaren zawierających zwiększoną ilość enzymów w procesach przemysłowych katalizowanych enzymatycznie zostało opisane w międzynarodowym zgłoszeniu WO91/14772. Bezpośrednie użycie w procesach przemysłowych ziarna zawierającego enzymy omija przede wszystkim potrzebę oczyszczania i/lub izolowania enzymu. Ziarno może służyć jako stabilna i nadająca się do przechowywania postać enzymu.
W przypadku jednego enzymu, β-1,3-1,4-glukanazy, ekspresja w ziarnie jęczmienia została wymieniona jako alternatywa dla dodawania z zewnątrz.
Wschodnio Niemieckie zgłoszenie patentowe DD 275704 ujawnia skonstruowanie wektora ekspresyjnego umożliwiającego ekspresję w ziarnie jęczmienia e-1,3-1,4-glukanazy z Bacillus. Jednakże, dotychczas nie jest znana efektywna transformacja jęczmienia. Używając ziaren wyrażających β-1,3-1,4-glukanazę z Bacillus, większa ilość ziarna może być zastąpiona w słodzie, bez uzyskania poważnych problemów filtracyjnych. Jednakże, inne aktywności enzymatyczne potrzebne do warzenia piwa są nadal uzyskiwane ze słodu lub dodawane z zewnątrz.
Mannonen i wsp. (1993) sugeruje włączenie pochodzącej z grzybów β-1,3-1,4-glukanazy do ziaren jęczmienia. Tym sposobem, proces warzenia może być ulepszony poprzez ekspresję w ziarnie β-1,3-1,4-glukanazy, która ma wyższą termostabilność niż endogenny enzym jęczmienny. Jednak w tym przypadku, intencją jest przeprowadzenie ziaren przez normalny proces słodowania. Ponadto, także w tym przypadku, inne aktywności enzymatyczne potrzebne do warzenia piwa są nadal otrzymywane ze słodu lub uzupełniane egzogennie.
W korzystnym sposobie według niniejszego wynalazku, enzymy potrzebne do warzenia są wyraźne w ziarnie transgenicznym. Tak otrzymane transgeniczne ziarno wyrażające wspomniane potrzebne enzymy jest w przewadze użyte w procesie warzenia piwa. W ten sposób, zmniejszono stosowanie słodu, i ominięto stosowanie mikrobiologicznych enzymów z zewnątrz.
Transgeniczne ziarna wyrażające enzymy potrzebne do warzenia piwa są nazwane ogólnie MaltSeed.
Rodzaje roślin, które są zdolne do produkcji pożądanych enzymów w ich ziarnie obejmują gatunki, których ziarno lub produkty z ziarna były tradycyjnie używane do warzenia piwa. Jednakże, również gatunki roślin, które nie są zwykle używane w piwowarstwie mogą zostać użyte jako źródło ziarna wyrażającego pożądane enzymy, szczególnie w takich przypadkach, gdy jedynie mała ilość takiego transgenicznego ziarna jest dodawana podczas warzenia piwa. Rodzajami roślin, które spełniają te kryteria są, przykładowo, jęczmień, kukurydza, ryż, pszenica, sorgo, proso, owies, maniok i tym podobne.
PL 191 456 B1
Gen kodujący pożądany enzym jest wyrażany w roślinnym ziarnie z wykorzystaniem sekwencji regulatorowych funkcjonujących w roślinie lub ziarnie roślinnym. Te sekwencje regulatorowe obejmują sekwencje promotorowe, sekwencje terminacyjne i, ewentualnie sekwencje wzmacniające transkrypcję.
Mogą zostać użyte sekwencje promotorowe powodujące konstytutywną ekspresję genu w całej roślinie. Można też użyć sekwencji promotorowej kierującej ekspresją genu, tak że jest on aktywny w ziarnie rośliny.
Ponadto, ekspresja pożądanego enzymu może być ukierunkowana na specyficzny obszar komórkowy, taki jak cytozol, retikulum endoplazmatyczne, wakuole, ciała białkowe, lub do przestrzeni poza komórkowej, dzięki zastosowaniu odpowiednich sekwencji ukierunkowujących.
Wybór określonego obszaru komórki lub przestrzeni poza komórkowej zależy od właściwości pożądanego enzymu i powinien zostać dokonany tak, aby dobrać odpowiednie środowisko dla enzymu. Przykładowo, pożądany enzym powinien znajdować się w otoczeniu zapewniającym optymalną stabilność białka podczas dojrzewania ziarna. Dodatkowo, pożądany enzym powinien znajdować się w otoczeniu, w którym jego ekspresja nie będzie zaburzała zasadniczych procesów metabolicznych rośliny bądź prowadziła do niszczenia żywotności rośliny lub ziarna.
W celu umożliwienia ekspresji w komórkach roślinnych sekwencji DNA kodującego wybrany enzym, dostarcza się go zwykle wraz z elementami regulatorowymi umożliwiającymi rozpoznawanie przez maszynerię biochemiczną gospodarza, co umożliwia transkrypcję i translację otwartej ramki odczytu w gospodarzu. Obejmuje to zwykle region inicjujący transkrypcję, który może być odpowiednim pochodzącym z genu wyrażanego w komórce roślinnej, jak i region inicjacji translacji odpowiedzialny za rozpoznawanie i przyłączanie rybosomu. W eukariotycznych komórkach roślinnych, taka kaseta ekspresyjna zawiera zwykle ponadto region terminacji transkrypcji ulokowany za wspomnianą otwartą ramką odczytu, umożliwiający terminację transkrypcji i poliadenylację pierwotnego transkryptu. Ponadto, użyte kodony mogą zostać dostosowane do używanych w wybranym gospodarzu roślinnym. Zasady sterowania ekspresją konstruktów DNA w komórkach roślin są znane w dziedzinie a konstruowanie chimerycznych ekspresyjnych konstruktów DNA należy do czynności rutynowych.
Pewne rodzaje replikonów są zdolne do samodzielnego wnikania w całości lub części do innych komórek gospodarza, takich jak komórki roślinne, kotransferując jednocześnie otwartą ramkę odczytu kodującą enzym(y) do wspomnianej komórki roślinnej. Replikony o takich właściwościach są tu nazywane wektorami. Przykładem takiego wektora jest plazmid Ti, który gdy jest obecny w odpowiednim gospodarzu, takim jak Agrobacterium tumefaciens, jest zdolny do przenoszenia swojego fragmentu, tzw. regionu T, do komórki roślinnej. Inny typ wektorów Ti (patrz EP 0 116 718 B1) jest teraz rutynowo używany do przenoszenia chimerycznych sekwencji DNA do komórek roślinnych, lub protoplastów, z których może być odtworzona nowa roślina posiadająca wbudowany na stałe do swego genomu chimeryczny DNA. Szczególnie korzystne wektory plazmidowe Ti są tzw. wektorami binarnymi jak zastrzeżone w (EP 0 120 516 B1 i US 4,940,838). Inne odpowiednie wektory, które mogą być użyte do wprowadzania DNA do gospodarza roślinnego, mogą być wybrane z wektorów wirusowych, np. nieintegrujących się roślinnych wektorów wirusowych, takich jak pochodzące od dwuniciowych wirusów roślinnych (np. CaMV) i jednoniciowych wirusów, wirusów gemini i tym podobnych. Użycie takich wektorów może być korzystne, szczególnie, gdy trudno jest stabilnie transformować roślinę gospodarza, jak to ma miejsce przykładowo u gatunków drzewiastych, szczególnie drzew i krzewów.
Wyrażenie „komórki gospodarza posiadające wbudowaną do swego genomu chimeryczną sekwencję” obejmuje swym znaczeniem komórki, jak i organizmy wielokomórkowe posiadające takie komórki, lub zasadniczo składające się z takich komórek, które posiadają stabilnie wbudowany do swego genomu chimeryczny DNA zachowujące chimeryczne DNA, i korzystnie przekazujące kopie takiego chimerycznego DNA komórkom potomnym, w trakcie mitozy lub mejozy. Zgodnie z korzystną realizacją wynalazku, dostarczane są rośliny, które zasadniczo składają się z komórek, które mają wbudowane jeden lub więcej kopii chimerycznego DNA do swego genomu, i które są zdolne przekazywać tę kopię/te kopie swemu potomstwu, korzystnie zgodnie z regułami genetyki mendlowskiej. Dzięki transkrypcji i translacji chimerycznego DNA komórki te produkują enzymy. Mimo, że zasady rządzące transkrypcją DNA w komórkach roślinnych nie są zawsze znane, stworzenie chimerycznego DNA poddawanego ekspresji jest czynnością rutynową. Regiony inicjacji transkrypcji rutynowo używane do ekspresji transformowanych polinukleotydów na drodze konstytutywnej są promotorami otrzymywanymi z wirusa mozaiki kalafiora, zwłaszcza 35S RNA i 19S RNA promotory transkrypcji i tzw. promotory T-DNA z Agrobacterium tumefaciens. W szczególności należy wspomnieć promotor syntazy nopaliny, promotor syntazy oktopiny (ujawnione w EP 0 122 791 B1) i promotor syntazy manno6
PL 191 456 B1 piny. Ponadto mogą zostać użyte promotory roślinne, które mogą być właściwie konstytutywne, takie jak promotor genu aktyny z ryżu. Dla ekspresji specyficznej w nasionach, cDNA pożądanego genu może zostać wbudowane za promotorem pochodzącym z genu, który jest specyficznie wyrażany w ziarnie roślin. Takie promotory obejmują promotory genów kodujących białka zapasowe nasion, takie jak promotor krucyferyny z Brassica napus, promotor fazeoliny z Phaseolus vulgaris, promotor gluteliny z Oryza sativa, promotor zeiny z Zea mays i promotor hordeiny z Hordeum vulgare.
Wiadomo ponadto, że powielenie pewnych elementów, tzw. enhancerów, może znacząco wzmacniać poziom ekspresji DNA spod jego kontroli (patrz przykładowo: Kay R. i wsp. (1987), Science 236, 1299-1302: duplikacja sekwencji między -343 i -90 z promotora CaMV 35S zwiększa aktywność tego promotora). Ponadto konstytutywny promotor 35S, pojedynczo lub podwójnie wzmocniony, przykładowo silnymi promotorami są promotor indukowanej przez światło małej podjednostki karboksylazy dwufosforanorybulozowej (rbcSSU) i promotor białka przyłączającego chlorofil a/b (Cab). Także polecanymi przez niniejszy wynalazek są promotory hybrydowe, które zawierają elementy różnych regionów fizycznie sprzężonych z promotorami. Dobrze znanym przykładem takiego jest tak zwany wzmocniony promotor syntazy mannopiny CaMV (US patent 5,106,739), który zawiera elementy promotora syntazy mannopiny sprzężone z enhancerem CaMV.
Specyficznym dla transformacji roślin jednoliściennych jest użycie intronów umieszczonych między promotorem i genem markera selekcyjnego wzmacniającego ekspresję.
Pojecie „promotor” odnosi się do regionu DNA poprzedzającego gen strukturalny i zawierającego region rozpoznawany i wiążący polimerazę RNA i inne białka inicjacji transkrypcji. „Promotor roślinny” jest promotorem zdolnym do inicjowania transkrypcji w komórkach roślinnych. „Promotor konstytutywny” jest promotorem, który jest aktywowany w większości warunków środowiskowych i stanowi o rozwoju bądź różnicowaniu komórki.
W odniesieniu do konieczności stosowania regionu terminacji transkrypcji, jest powszechnie przyjęte, że takie regiony wzmacniają wydajność i zachodzenie transkrypcji w komórkach roślinnych. Dlatego ich użycie jest bardzo korzystne w kontekście niniejszego wynalazku.
Jako, że pewne realizacje wynalazku mogą być aktualnie nieużyteczne, przykładowo, dlatego, że pewne gatunki roślin są niepodatne na transformacje genetyczne, wdrożenie wynalazku w takich gatunkach roślin jest zaledwie kwestią czasu i nie dotyczy istoty, gdyż niepodatność na transformację nie wyklucza takiej realizacji z zakresu niniejszego wynalazku.
Transformowanie gatunków roślinnych jest aktualnie rutynowo przeprowadzane dla znacznej liczby gatunków roślinnych, włączając zarówno Dicotyledoneae jak i Monocotyledoneae. W zasadzie może zostać użyta dowolna metoda transformacji w celu wprowadzenia chimerycznego DNA do odpowiedniej wyjściowej komórki przodka. Metodami, które mogą być użyteczne jest metoda otrzymywania protoplastów z wykorzystaniem wapnia/glikolu polietylenowego (Krens, F.A. i wsp., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I, i wsp, czerwiec 1987, Plant. Mol.Biol. 8, 363-373), elektroporacja protoplastów (Shillito R. D. i wsp., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), mikroiniekcja do materiału roślinnego (Crossway A. i wsp., 1986, Mol.Gen.Genet. 202, 179-185), mikrobombardowanie cząstkami (otoczonymi DNA lub RNA) różnorodnego materiału roślinnego (Klein T.M. i wsp., 1987, Nature 327, 70), infekowanie wirusami (nie integrującymi się), przenoszenie genów przez Agrobacterium tumefaciens poprzez infiltrowanie dojrzałych roślin lub transformowanie dojrzałego pyłku lub mikrospor (EP 0 301 316) i tym podobne. Korzystny sposób według wynalazku obejmuje przenoszenie DNA przez Agrobacterium. Szczególnie korzystne jest zastosowanie tzw. układu binarnego jak ujawniono w EP A 120 516 i U.S. Patent 4,940,838.
Mimo iż uznawane za bardziej oporne na transformację genetyczną, rośliny jednoliścienne są podatne na transformację i płodne rośliny transgeniczne mogą być odtwarzane z transformowanych komórek lub embrionów, lub innego materiału roślinnego. Korzystnym sposobem transformowania jednoliściennych jest mikrobombardowanie embrionów, linii komórek roślinnych i zawiesin komórek, bezpośrednie przenoszenie DNA lub (tkankowa) elektroporacja (Shimamoto, i wsp., 1989, Nature 338, 274-276). Rośliny kukurydzy transgenicznej uzyskano poprzez wprowadzanie genu bar z Streptomyces hygroscopicus, który koduje acetylotransferazę fosfinotrycyny (enzym inaktywujący herbicyd fosfinotrycynę), do zawiesiny komórek embriogennych kukurydzy poprzez mikrobombardowanie (GordonKamm, 1990, Plant Cell, 2, 603-618). Zastało opisane wprowadzanie materiału genetycznego do aleuronów protoplastów innych jednoliściennych roślin uprawnych, takich jak jęczmień czy pszenica (Lee, 1989, Plant Mol.Biol. 13, 21-30). Rośliny pszenicy były regenerowane z hodowli zawiesin komórek embriogennych poprzez selekcję kalusa embriogennego w celu uzyskania hodowli zawiesinowych
PL 191 456 B1 komórek embriogennych (Vasil, 1990 Bio/Technol. 8, 429-434). Połączenie z systemami transformacyjnymi dla tych roślin uprawnych umożliwia zastosowanie niniejszego wynalazku dla jednoliściennych.
Rośliny jednoliścienne, włącznie z komercyjnie ważnymi zbożami takimi jak ryż i kukurydza są także podatne na transfer DNA przez szczepy Agrobacterium (patrz WO 94/00977; Ep 0 159 418 b1;
Gould J, Michael D, Hasegawa O, Ulian EC, Peterson G, Smith RH, (1991) Plant.Physiol. 95, 426-434).
W przypadku jęczmienia korzystna jest metoda transformacji opisana przez Tingay, S. i wsp. (The Plant j. 11(6), 1369-1376, 1997).
Aby otrzymać rośliny transgeniczne zdolne do konstytutywnego wyrażania więcej niż jednego genu chimerowego, istnieje wiele możliwości włącznie z następującymi:
A. Użycie DNA np. T-DNA na plazmidzie binarnym, z Ilcznymi modyfikowanymi genami nie sprzężonymi z drugim genem markerowym. Zaletą takiej metody jest to, że geny chimerowe są fizycznie sprzężone i dlatego migrują jako pojedynczy locus mendlowski.
B. zapylanie roślln transgenicznych, z których każda jest zdolna do wyrażania jednego lub więcej chimerycznych genów, korzystnie sprzężonych z genem markerowym, z pyłkiem z rośliny transgenicznej, która zawiera jeden lub więcej genów chimerycznych sprzężonych z innym genem markerowym. Otrzymane nasiona, które powstają w wyniku tego krzyżowania, mogą być selekcjonowane na podstawie obecności dwóch genów markerowych, lub na podstawie obecności samych genów chimerowych. Rośliny uzyskane z wybranych nasion mogą być następnie użyte do kolejnych krzyżowań. W zasadzie geny chimerowe nie są pojedynczym locus i dlatego mogą zajmować niezależne loci.
C. Zastosowanie licznych chimerycznych cząsteczek DNA, przykładowo plazmidów, z których każdy posiada jeden lub więcej genów chimerowych i marker selekcyjny. Gdy częstość kotransformacji jest wysoka, wtedy możliwa jest selekcja na podstawie tylko jednego markera. W innych przypadkach, korzystna jest selekcja z użyciem kilku markerów.
D. Kofojne transformacje roślln transgenicznych posiadających już pierwszy, drugi etc.. chimerowy gen z nowym chimerowym DNA, ewentualnie obejmującym gen markera selekcyjnego. Tak jak w sposobie B, geny chimerowe w zasadzie nie są pojedynczym locus i geny chimerowe mogą segregować jako niezależne loci.
E. Połączenie powyższych strategii.
Aktualne podejście może być związane z kilkoma rzeczami, takimi jak właściwości linii rodzicielskich (ukierunkowanie do upraw, użycie w programach hodowlanych, zastosowanie do otrzymywania hybryd), ale nie jest krytyczne w stosunku do niniejszego wynalazku.
Wiadomo, że właściwie każda roślina może być regenerowana z komórek lub tkanek. Znaczenie regeneracji różni się w zależności od gatunku rośliny, której to dotyczy, ale ogólnie najpierw dostarczane są zawiesina transformowanych protoplastów lub szalki petriego zawierające transformowane komórki roślinne. Kiełki mogą być indukowane bezpośrednio, lub pośrednio poprzez kalus na drodze organogenezy lub embriogenezy a następnie ukorzeniane. Obok markerów selekcyjnych, kultury tkankowe mogą ogólnie zawierać różne aminokwasy i hormony, takie jak auksyny i cytokininy. Korzystne jest także dodawanie kwasu glutaminowego i proliny do pożywki. Wydajność regeneracji będzie zależeć od pożywki, genotypu i przebiegu hodowli. Jeśli te trzy zmienne są kontrolowane, kontrolowana regeneracja zachodzi zwykle bez kłopotów i jest powtarzalna.
Po stabilnym wbudowaniu transformowanej sekwencji genowej do roślin transgenicznych, nowe cechy mogą być przenoszone z kolei na inne rośliny w drodze krzyżowania płciowego. Mogą zostać użyte liczne standardowe techniki hodowli, zależnie od gatunku poddawanego krzyżowaniu.
W jednym z wykonań niniejszego wynalazku, są używane transgeniczne nasiona, które zostały tak spreparowane, aby mogły wytwarzać pewien enzym, umożliwiając dowolne kształtowanie składu mieszaniny enzymatycznej, w zależności od potrzebnej ilości enzymu. W innej realizacji, więcej niż jedna aktywność enzymatyczna jest zawarta w nasionach określonej linii rośliny transgenicznej.
Nasiona transgeniczne zawierające pożądane enzymy może być dodawane razem w odpowiednim stadium procesu warzenia. Ewentualnie, ziarno transgeniczne zawierające określony pożądany enzym może być podawane indywidualnie, każde na odpowiednim etapie procesu.
Sposób według wynalazku umożliwia uzyskanie słodu o intensywnej barwie i zapachu, bez korzystania z aktywności enzymatycznej słodu. W sposobie według wynalazku omija się w dużym stopniu stosowanie słodowych aktywności enzymatycznych. Tylko niewielka ilość słodu jest potrzebna, aby dostarczyć piwu koloru i zapachu.
PL 191 456 B1
Ziarno transgeniczne zawierające pożądane enzymy może być stosowane w odpowiednim stosunku ze zbożem oraz, ewentualnie, wraz z odpowiednia ilością słodu dającego zapach i kolor. Ziarno transgeniczne boże być zmieszane wstępnie ze zbożem i słodem.
Ewentualnie, każdy ze składników, zboże, ziarno transgeniczne, zboże i słód, lub mieszanina transgenicznego ziarna, zboże i słód są mielone przed poddaniem procesom warzenia.
Ziarno transgeniczne zawiera pożądane enzymy w ilości 0,001-2,5%, korzystnie 0,01-1,0%, bardziej korzystnie 0,05%-0,25% wagi ziarna. Zależnie od poziomu ekspresji w ziarnie część lub całe ziarno normalnie używane w procesie warzenia może być zastąpione ziarnem transgenicznym. Gdy osiągany jest wysoki poziom ekspresji, jest również możliwe dodawanie ziarna transgenicznego z innych roślin nieużywanych tradycyjnie do produkcji piwa, bez zbytniego zmieniania składu mieszaniny piwowarskiej.
W przypadku słodu, korzystnie część słodu poddaje się specjalnej obróbce, w porównaniu z tradycyjnym słodem, w której słód jest ogrzewany podczas opiekania w celu maksymalizowania produkcji komponentów zapachowych i barwnych. Zachowywana aktywność enzymatyczna jest nieistotna po takiej obróbce.
Ekspresja enzymów w ziarnie, zgodnie z ujawnieniem w niniejszym wynalazku, dostarcza możliwość uniknięcia dodawania enzymów mikrobiologicznych w procesie warzenia. Koszty produkcji ziarna transgenicznego, zawierającego enzymy są dużo niższe niż koszty produkcji enzymów w procesach fermentacyjnych. Ponadto, transgeniczne ziarno jest bardziej wygodne w użyciu, ponieważ dostarcza ono stabilnej i poddającej się przechowywaniu postaci enzymów i jest łatwe w obróbce. Redukcja kosztów i zalety użytkowe, które łączą się ze stosowaniem transgenicznego ziarna są szczególnie istotne w sposobie według wynalazku, ponieważ unika się konieczności dodawania kilku różnych enzymów z kilku różnych mikrobiologicznych fermentacji do procesu warzenia piwa.
Sposób postępowania według niniejszego wynalazku jest dużo bardziej zalecany niż sposób stosujący słód jako źródło enzymów, ponieważ transgeniczne ziarno nie zawiera wysokiego poziomu innych aktywności enzymatycznych poza reprezentującymi wprowadzone geny. Ponadto, sposób według niniejszego wynalazku jest dużo bardziej zalecany niż sposób stosujący mikrobiologiczne enzymy, ponieważ preparaty enzymów mikrobiologicznych wykazują niezdefiniowaną i zmienną aktywność uboczną.
Jednym z obszarów, na którym szczególnie może być stosowany sposób według wynalazku są kraje afrykańskie, w których utrudnione jest stosowanie słodu. W tym przypadku enzymy mogą być wyrażane w sorgo, które może być później dodawane w procesie warzenia.
Można rozpatrywać także dalsze zastosowania, obok warzenia napojów alkoholowych, w których MaltSeed może zastąpić słodowane ziarno. Słodowany jęczmień i/lub słodowana pszenica są używane przez młynarzy do standaryzacji siły distatycznej mąki. Także hemicelulazy (takie jak ksylanaza) są dodawane do mąki w celu polepszenia utrzymywania gazów w cieście produkowanym z mąki. Dodatek, bądź zastosowanie enzymów w mące może być zastąpione przez stosowanie MaltSeed, jest to bardzo odpowiedni sposób, ponieważ enzymy mogą być podawane w formie ziarna, które i tak jest używane. Podobnie w procesach piekarniczych mogą być dodawane enzymy, zastępując słód stosowany w produkcji wielu ciast. Enzymy ulepszające proces pieczenia to ksylanaza, amylaza, arabinofuranozydaza, egzopeptydaza. Także oksydaza glukozowa z Aspergillus niger może być wyrażana w ziarnie stosowanym w piekarnictwie.
P r z y k ł a d 1. Pomiar aktywności endo-p-1,4-ksylanazy
Endoksylanaza została otrzymana z czystych kultur Aspergillus niger w sterylnych zbiornikach i pożywce. Pożywka hodowlana zawierała odpowiednie źródło węgla i azotu oraz soli mineralnych. Fermentację przeprowadzano w stałej temperaturze pomiędzy 30-40°C, a pH utrzymywano w przedziale 3-5.
Aktywność enzymu była mierzona poprzez reakcję hydrolizy ksylanu z zawiesiny otrębów owsianych (35g/l) w 1M buforze glicynowym o pH 2,75. Lepkość roztworu określano wiskozymetrem kapilarnym (typu Ubbelhode) w temperaturze 47°C. Czas dt potrzebny do tego, aby dolny menisk płynu spadł pomiędzy dwa punkty odnośnikowe mierzono dla czasu T. Nachylenie w punkcie T wektora 1/dt daje pewną stałą kinetyczną. Jednostka 1 Lyx jest ilością enzymu potrzebną do osiągnięcia wartości 1 min1 przez wspomnianą stałą kinetyczną.
P r z y k ł a d 2. Pomiar aktywności egzopeptydazy.
Hodowano szczep produkcyjny Aspergillus sojae (DS. 8351). Aktywność egzopeptydazy wyrażana była jako jednostka leucynowa aminopeptydazy (Leu-1): 1 Leu-A jest ilością enzymu potrzebną
PL 191 456 B1 do produkcji 1 pmol p-nitroaniliny na minutę w pH 7,2 i 20°C z L-leucyno-p-nitroalaniny. Test prowadzono następująco: Paranitroanilid leucyny (SIGMA) rozpuszczano w wodzie do stężenia 9 mM. 1 ml roztworu mieszano z 1,5 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7,2. W t=0, wprowadzano 0,5 ml enzymu i prowadzono reakcje w 20°C. Piętnaście minut później, 1 ml 1N HCl dodawano w celu zatrzymania reakcji. Start dla próby ślepej następował w czasie t=0 poprzez wprowadzenie 1N HCl. Mierzono gęstość optyczną przy 400 nm dla próby kontrolnej (ODk) i próby testowej (ODt). Aktywność obliczano ze wzoru:
λ (ODk — ODt ) 4 . . . .
A = 4-k-T. χ — Leu - A / ml
9,8 x 15 03
P r z y k ł a d 3. Pomiar aktywności arabinofuranozydazy
Izoenzym A lub izoenzym B lub hydroksylazę arabinoksylanową otrzymywano z hodowli szczepów Aspergillus niger lub Aspergillus nidulans. Aktywność izoenzymów A i B mierzono poprzez hydrolizę p-nitrofenylo-alfa-L-arabinofuranozydazy. 1 ARF jednostka jest ilością enzymu potrzebną do uwolnienia 1 pmol p-nitrofenolu na minutę w warunkach testowych opisanych przez Gunata Z. i wsp. (J.Agric.Food Chem. 38, 772, 1989).
P r z y k ł a d 4. Pomiar aktywności amylazy scukrzającej.
Amylazę scukrzającą otrzymywano z hodowli Penicillium emersonii w sterylnych zbiornikach i pożywce, która zawierała odpowiednie źródło węgla i azotu oraz soli mineralnych. Zbiornik napełniano maltodekstrynami po 10-30 godzinach (korzystnie 24 godzinach) od startu fermentacji. Temperaturę utrzymywano w przedziale 40-50°C (korzystnie 45°C) a pH w zakresie 4,5-5,5 (korzystnie 5,0). Fermentację zatrzymywano po 40-55 godzinach (korzystnie 48 godzinach) od startu hodowli.
Aktywność amylazy scukrzającej mierzono testem BETAMYL, produkowanym przez MEGAZYME, Irlandia. 1 BTU jest ilością enzymu potrzebną do produkcji 1 pmol p-nitrofenolu w pH 6,2 i 40°C z substratu udostępnianego przez MEGAZYME.
P r z y k ł a d 5. Przygotowywanie brzeczki z zastosowaniem enzymów mikrobiologicznych.
Brzeczka była przygotowywana z surowych ziaren jęczmienia, odmiany PLAISANT. Jęczmień był mielony młynem EBC MIAG w celu osiągnięcia granulacji nadającej się do filtrowania. 57 g otrzymanego zmielonego jęczmienia zawieszano w 300 ml ciepłej wody (50°C) zawierającej:
650 Lyx jednostek endo-p-(1,4)-ksylanazy
850 ARF jednostek arabinofuranozydazy 18 mg B.A.T.S. (termostabilna amylaza) mg Brewers Protease (+) (endopeptydaza) mg Filtrase L3000 (+) (-p-(1,3;1,4)-glukanaza)
Utrzymywano temperaturę 50°C przez 30 minut a następnie podnoszono ją do 63°C (o 1°C/min); utrzymywano temperaturę 63°C przez 30 minut i podnoszono ją do 72°C (o 1°C/min) i utrzymywano ją przez 30 minut. W końcu zwiększano temperaturę do 76°C (o 1°C/min) i utrzymywano ją przez 5 minut. Uzupełniano wodę, która odparowała. Zacier oczyszczano filtrując na bibule Schleicher and Schull. Z gęstości filtrowanej brzeczki, określano wydajność metodami piwowarskimi, także lepkość i poziom wolnych aminokwasów (FAA) określano zgodnie ze standardami EBC.
Wydajność wynosiła 71,5%, lepkość 2,52 mPa, a mierzony poziom wolnych aminokwasów 66 mg/l.
P r z y k ł a d 6. Porównanie amylaz scukrzających.
Brzeczka była przygotowywana z surowych ziaren jęczmienia, odmiany PLAISANT. Jęczmień był mielony młynem EBC MIAG w celu osiągnięcia granulacji nadającej się do filtrowania. 57 g otrzymanego zmielonego jęczmienia zawieszano w 300 ml ciepłej wody (50°C) zawierającej:
650 Lyx jednostek endo-p-(1,4)-ksylanazy
850 ARF jednostek arabinofuranozydazy 18 mg B.A.T.S. (termostabilna amylaza) mg Brewers Protease (+) (endopeptydaza) mg Filtrase L3000 (+) (-p-(1,3;1,4)-glukanaza)
Dodawano scukrzające amylazy do mieszaniny brzeczki zgodnie z tabelą 1.
PL 191 456 B1
T a b e l a 1.
Porcje enzymów scukrzających.
numer brzeczki enzym scukrzający
1 żaden 0
2 Brewers Fermex 510 FAU
3 amylaza z P.emersonii 10 BTU
4 Brewers Fermex +, amylaza z P. emersonii 510 FAU + 10 BTU
Utrzymywano temperaturę 50°C przez 30 minut a następnie podnoszono ją do 63°C (o 1°C/min); utrzymywano temperaturę 63°C przez 30 minut i podnoszono ją do 72°C (o 1°C/min) i utrzymywano ją przez 30 minut. W końcu zwiększano temperaturę do 76°C (o 1°C/min) i utrzymywano ją przez 5 minut. Uzupełniano wodę, która odparowała. Zacier oczyszczano filtrując na bibule Schleicher and Schull. Gęstość filtrowanej brzeczki, wydajność określano metodami piwowarskimi, także lepkość i poziom wolnych aminokwasów (FAA) określano zgodnie ze standardami EBC.
Wyniki mierzonej wydajności, lepkości i FAA podane w tabeli 2 wskazują, że enzym scukrzający z Penicillium emersonii może być substytutem Brewers Fermex, przy czym należy spodziewać się synergizmu podczas używania obydwu enzymów. Szczególnie zaskakujące jest dosyć pozytywny wpływ amylazy z Penicillium emersonii na wzrost FAA i redukcję lepkości.
numer brzeczki wydajność (%) lepkość (%) FAA (12 Plato) (mg/l)
1 71,2 3,12 116
2 74,6 2,73 114
3 78,2 1,99 153
4 79,6 1,99 152
P r z y k ł a d 7. Konstrukcja wektora binarnego zawierającego kasetę ekspresyjną specyficzną dla nasion
Konstrukt ekspresyjny specyficzny dla nasion został otrzymany z zastosowaniem sekwencji gluteliny z Oryza sativa L. będącej białkiem zapasowym (Zheng i wsp., Plant Physiol. (1995) 109; 77-786). Sekwencje te mogą być zastąpione innymi podobnymi, specyficznymi dla nasion genami, w celu uzyskania tego samego efektu, który jest celem tego wynalazku.
Aby otrzymać konstrukt ekspresyjny dla uzyskania specyficznej ekspresji w nasionach, syntetyzowano za pomocą reakcji PCR sekwencje promotora i terminatora z genu gluteliny (Gt1) z Oryza sativa L. używając klonu genomowego Gt1 (Okita i wsp., J.Biol.Che. 264, 12573-12581, 1989) jako matrycy. Gen ten wykazuje ekspresję specyficzną dla nasion i jego sekwencje kodująca i flankujące są znane (EMBL, Genbank Nucleotide Sequence Database numer dostępu D00584)). Syntetyzowano dwa zestawy oligonukleotydów. Jeden umożliwiał amplifikację 2,4 kpz fragmentu Xho-I/Sphl zawierającego fragment 5' flankujący regionu kodującego Gt1:
5'Gt1.1 5' GCACAATTCTCGAGGAGACCG 3'
5'Gt1.2 5' ATGGATGGCATGCTGTTGTAG 3'
Inny zestaw amplifikował fragment (725 kpz) BamHI/EcoRI sekwencji flankującej 3': 3'Gt1.3 5' CCTCTTAAGGATCCAATGCGG 3'
3'Gt1.4 5' CTTATCTGAATTCGGAAGCTC 3'
Oligonukleotydy zaprojektowano tak, aby zawierały odpowiednie miejsca restrykcyjne na swych końcach umożliwiające proste połączenie konstruktu ekspresyjnego po trawieniu fragmentów enzymami restrykcyjnymi. Geny kodujące enzymy do mieszanki określonej w wynalazku można znaleźć w literaturze odpowiednio dla endoksylanazy (Mol.Microbiol. 12, 479-490, 1994), dla izoenzymu A i izoenzymu B arabinofuranozydazy (EP 0 506 190), dla amylazy z Bacillus licheniformis (EP 0 449 376), dla proteazy z Bacillus amyloliquefaciens (J.Bact. 159, 811-819) i dla glukanazy z Bacillus amyloliquefaciens (Gene 49, 177-187, 1986). Geny scukrzającej amylazy z Penicillium i egzopeptydazy
PL 191 456 B1 z Aspergillus sojae specjalista może łatwo otrzymać korzystając z czystych enzymów uzyskiwanych w hodowlach wskazanych w opisie. Używanie kodonów w genach kodujących enzymy, które mają być wyrażane w ziarnie zostało zoptymalizowane dla ekspresji w ziarnie jednoliściennych. W tym celu wytworzono całkowicie syntetyczny gen, wprowadzając miejsce BspHI przy kodonie start ATG i miejsce BamHI za kodonem stop TAA w celu ułatwienia klonowania. 2,4 kpz produkt PCR zawierający 5' flankujący region Gt1 trawiono XhoI/SphI i klonowano w wektorze pSL1180 linearyzowanym XhoI/SphI. Otrzymany wektor linearyzowano Sphl/BamHI i użyto jako wektor w potrójnej ligacji z syntetycznym genem kodującym enzym oraz, ewentualnie dupleksem oligonulkleotydowym kodującym sekwencję sygnalną ukierunkowującą. Można zastosować ukierunkowywanie do wakuoli, apoplastów, amyloplastów lub (wraz z np. sygnałem utrzymującym KDEL) do retikulum endoplazmatycznego.
Z tego wektora izolowano fragment, zawierający fuzję promotora Gt1 gluteliny, ewentualnie sekwencję sygnałową i gen syntetyczny. Fragment ten klonowano w potrójnej ligacji z 725 pz produktem PCR zawierającym 3' sekwencję terminalną z Gt1 trawionego BamHI/EcoRI do wektora binarnego pMOG22 (w szczepie DH5-alfa E.coli K-12, zdeponowanym w Centraal Bureau voor Schimmelcultures 29 stycznia 1990 pod numerem CBS 101.90).
P r z y k ł a d 8. Konstruowanie wektora binarnego zawierającego gen endoksylanazy w kasecie ekspresyjnej specyficznej dla nasion
Gen endoksylanazy z Aspergillus niger zoptymalizowano pod kątem używanych przez jęczmień kodonów. Wynikowa sekwencja DNA jest ujawniona jako SEQ ID NO:1.
W celu zoptymalizowania ekspresji wyposażono gen endoksylanazy w zewnątrzkomórkową sekwencję ukierunkowującą z oligonukleotydów:
PRS.1
5' AACTTCCTCAAGAGCTTCCCCTTTTATGCCTTCCTTTGTTTTGGCCAATACTTTGTAGCTGTTACGCATGC 3'
PRS.2
3' GTACTTGAAGGAGTTCTCGAAGGGGAAAATACGGAAGGAAACAAAACCGGTTATGAAACATCGACAATGCGTACGGTAC 5' kodującą sygnałowy peptyd z tytoniowego białka PR-S i w poddawano potrójnej ligacji z syntetycznym genem ksylanazy trawionym BspHI/BamHI.
Z tego wektora izolowano 3,1 kpz fragment XhoI/BamHI, zawierający fuzję promotora gluteiny Gt1, sekwencję sygnałową z PR-S i syntetyczny gen ksylanazy. Fragment ten klonowano w potrójnej ligacji z 725 pz produktem PCR zawierającym 3' terminalną sekwencję z Gt1 trawioną BamHI/EcoRI do wektora binarnego pMOG22. Powstały wektor nazwano pMOG1265.
P r z y k ł a d 9. Transformowanie jęczmienia.
Sposób użyty do transformacji niedojrzałych zalążków Hordeum vulgare cv. Golden Promise z zastosowaniem Agrobacterium tumefaciens został ogólnie opisany przez Tingay, S i wsp., The Plant J. 11(6), 1369-1376, 1997. W skrócie, protokół jest następujący:
Wyjściowy materiał roślinny wzrastał w fitotronie przy 10-20°C przez 16 godzinny jasny okres przy 10,000-30,000 lux i 50-95% RH. Niedojrzałe ziarno zbierano 10-15 dni po zapyleniu i sterylizowano w roztworze utleniającym przez 20-40 minut. Niedojrzałe zarodki były wycinane z młodych osłon i oś zarodka była usuwana ostrzem skalpela. Eksplanty umieszczano stroną tarczki do góry na podłożu indukującym kalus i inkubowano w 24°C w ciemności przez okres od 16 godzin do 7 dni.
Zarodki zanurzano w zawiesinie Agrobacterium, zawierającym w przybliżeniu 0,1 - 10 x 109 bakterii na ml, na 5 do 20 minut, przy czym bakterie zawierały konstrukty z DNA kodującym wybrane enzymy i przenoszono do podłoża indukującego kalus. Następnie, zarodki były inkubowane 2 lub 3 dni w 24°C w ciemności. Po hodowli, zarodki przenoszono do podłoża indukującego kalus zawierającego antybiotyk zabijający Agrobacteria, bezpośrednio połączony z czynnikiem selekcyjnym rozpoczynającym proces selekcji komórek transgenicznych. Proces selekcji trwał do 8 tygodni. Oporne linie kalusa embriogennego przenoszono do podłoża regeneracyjnego i inkubowano przy wzrastającym oświetleniu (500 do 3000 lux) w 16 godzinnym okresie jasnym przy 24°C. Zregenerowane szczepki przenoszono na pozbawione hormonów lub zawierające wysokie stężenie cytokinin podłoże indukujące kalus zawierające, bądź niezawierające czynnika aktywnego. Po utworzeniu systemu korzeniowego, szczepki przenoszono do gleby i uprawiano do dojrzałości z samozypalaniem się.
P r z y k ł a d 10.
Przeprowadzono trzy pełne wstępne próby piwowarskie. Dwie z testowanych brzeczek zawierały znacznie zredukowaną ilość słodu (20% surowców) natomiast kontrolna zawierała normalną ilość słodu (patrz tabela 3). Dwie testowane brzeczki poddawano różnej technologii filtrowania i mielenia (patrz tabela 3). Diagram procesu warzenia wszystkich brzeczek pokazuje figura 1.
PL 191 456 B1
T a b e l a 3:
Skład, filtrowanie i mielenie kompozycji surowców.
kontrolna brzeczka testowa 1 brzeczka testowa 2
słód Pils 75% 20% 20%
kasza kukurydziana 25% 25% 25%
niesłodowany jęczmień - 55% 55%
filtrowanie Lautertun Lautertun Meura 20001
mielenie cylinder cylinder młot
W mieszaninie kontrolnej 8% słodu użyto w podgrzewaczu zbożowym wraz z kaszą kukurydzianą, pozostałe 67% słodu dodano do zbiornika konwersyjnego. W brzeczkach testowych 8% niesłodowanego jęczmienia zastosowano w podgrzewaczu zbożowym wraz z kaszą kukurydzianą, pozostałe 47% niesłodowanego jęczmienia dodawano do zbiornika konwersyjnego wraz ze słodem.
T a b e l a 4.
Nazwy enzymów i ilości dodane na 100 kg surowców
numer enzymu enzym podgrzewacz zbożowy zbiornik konwersyjny
1 endo-β (1,4)-ksylanaza 117,000 Lyx
2 arabinofuranozydaza 112,500 ARF
3 B. A. T. S. 16,5 g
4 Brewers Fermex 75 g
5 Brewers protease (+) 75 g
6 egzopeptydaza -
7 Filtrase L3000 (+) 23 g
Enzymy 1,2, 4, 5 i 7 dodawano do zbiornika konwersyjnego, enzym 3 dodawano do podgrzewacza zbożowego (patrz tabela 4 wyjaśniająca kody enzymów).
Wyniki obróbki brzeczki (zacierania i klarowania) były podobne dla warzeń testowego i kontrolnego. Dwa testowe wary przebiegały podobnie w browarze. Testowe wary dały z grubsza taką samą brzeczkę, wykazując, że różnice w filtrowaniu i mieleniu nie są istotne. Z porównania piw testowych i kontrolnego stwierdzono, że wszystkie trzy piwa miały podobny bukiet smakowy. Mocniejsze w smaku wydawały się wary testowe w porównaniu z warem kontrolnym. Może to być powodowane przez wyższy poziom dekstryn stwierdzony podczas analizy brzeczek. Poziom aminokwasów w brzeczce, mimo iż akceptowalny, był niższy dla warów testowych w porównaniu z kontrolnym. Poziom aminokwasów może być zwiększany przez dodawanie egzopeptydazy (patrz przykład 11). Piwa z testowych brzeczek zaklasyfikowano jako dobre pilsnery, wykazując, że częściowe zastąpienie słodu przez mieszaninę enzymów daje piwo porównywalne z piwem produkowanym z ilością słodu zwykle używaną w piwowarstwie.
P r z y k ł a d 11.
Przeprowadzono dwie pełne próby warzenia. Testowy war przygotowano ze zredukowaną ilością słodu, a kontrolny posiadał normalną ilość słodu (patrz tabela 5). Filtrowanie było dokonywane na filtrze Lautertun. Figura 2 prezentuje diagramy procesu warzenia waru testowego 1 i kontrolnego.
PL 191 456 B1
T a b e l a 5. Kompozycja surowców
kontrola war testowy 1
słód pils 75% 20%
kasza kukurydziana 25% 25%
niesłodowany jęczmień - 55%
W mieszaninie kontrolnej 8% słodu użyto w podgrzewaczu zbożowym wraz z kaszą kukurydzianą, pozostałe 67% słodu dodawano w zbiorniku konwersyjnym. W warach testowych 8% niesłodowanego jęczmienia stosowano w podgrzewaczu zbożowym wraz z kaszą kukurydzianą, pozostałe 47% niesłodowanego jęczmienia dodawano do zbiornika konwersyjnego wraz ze słodem.
W warze testowym, enzymy 1-7 dodawano do zbiornika konwersyjnego, podczas gdy enzym 3 dodawano do zawartości podgrzewacza zbożowego (patrz tabela 6 zawierająca oznaczenia enzymów i użyte ilości).
Wyniki obróbki brzeczki (zacierania i klarowania) były podobne dla waru testowego i kontrolnego. Zawartość azotu z wolnych aminokwasów w brzeczkach było podobne dla waru testowego i kontrolnego. Z porównania piw testowych i kontrolnego stwierdzono, że piwo testowe miało podobny bukiet smakowy do piwa kontrolnego. Piwo z testowej brzeczki zaklasyfikowano jako dobry pilsner, wykazując że częściowe zastąpienie słodu przez mieszaninę enzymów daje piwo porównywalne z piwem produkowanym z ilością słodu zwykle używaną w piwowarstwie.
T a b e l a 6.
Oznaczenia enzymów i ilości dodane na 100 kg surowców w warze testowym
numer enzymu enzym podgrzewacz zbożowy zbiornik konwersyjny
1 endo-β (1,4)-ksylanaza 117,000 Lyx
2 arabinofuranozydaza 112,500 ARF
3 B. A. T. S. 16,5 g 33,5 g
4 Brewers Fermex 75 g
5 Brewers protease (+) 75 g
6 egzopeptydaza 105,000 LeuA
7 Filtrase L3000 (+) 23 g
P r z y k ł a d 12.
Ziarno jęczmienia transgenicznego z siedmiu linii, każda z jednym enzymem pokazanym w tabeli 9, mieszano w takich ilościach żeby dawało MaltSeed, dodawano jako 10% surowego jęczmienia, dostarczając tym aktywności enzymatycznych pokazanych w tabeli 9. Preparaty MaltSeed mieszano i mielono razem z jęczmieniem nietransgenicznym, tworząc razem 55% surowców testowego waru. Kompozycję surowców w podgrzewaczu zbożowym i zbiorniku konwersyjnym dla waru testowego pokazano w tabeli 8. W kontroli 8% słodu stosowano w podgrzewaczu zbożowym wraz z kaszą kukurydzianą. Pozostałe surowce stosowano w zbiorniku konwersyjnym. Podział aktywności enzymatycznych MaltSeed na dodawane do podgrzewacza zbożowego i zbiornika konwersyjnego pokazano w tabeli 10.
Przeprowadzono próbne warzenia. Testowy war przygotowano ze zredukowaną ilością słodu natomiast kontrolny posiadał normalną ilość słodu (patrz tabela 7). Filtrowanie prowadzono na filtrze Lautertun. Figura 2 przedstawia diagram procesu warzenia dla waru testowego i kontrolnego.
PL 191 456 B1
T a b e l a 7. Kompozycja surowców
kontrola war testowy 1
słód pils 75% 20%
kasza kukurydziana 25% 25%
niesłodowany jęczmień + MaltSeed - 55%
T a b e l a 8.
Kompozycja na 100 kg surowców w warze testowym.
surowiec podgrzewacz zbożowy (kg) zbiornik konwersyjny (kg)
słód 20
jęczmień niesłodowany 7,2 42,3
MaltSeed 0,8 4,7
kasza kukurydziana 25
razem (kg) 33 67
Wyniki obróbki brzeczki (zacierania i klarowania) były podobne dla waru testowego i kontrolnego. Zawartości azotu z wolnych aminokwasów w brzeczkach były podobne dla waru testowego i kontrolnego. Z porównania piwa testowego i kontrolnego stwierdzono, że piwo testowe miało podobny bukiet smakowy do piwa kontrolnego. Piwo z testowej brzeczki zaklasyfikowano jako klasyczne piwo słodowe, wykazując, że słód może być (częściowo) zastąpiony przez enzymy wyrażane w ziarnie transgenicznym.
T a b e l a 9.
Ilości aktywności enzymatycznych dodanych poprzez dodawanie MaltSeed (jednostki na 100 kg surowców) w warze testowym 1
numer enzymu enzym podgrzewacz zbożowy zbiornik konwersyjny
1 endo-β (1,4)-ksylanaza 19,915 Lyx 117,000 Lyx
2 arabinofuranozydaza 19,149 ARF 112,500 ARF
3 B. A. T. S. 107,250 TAU 630,094 TAU
4 Brewers Fermex 57,872 FAU 340,00 FAU
5 Brewers protease (+) 115,745 PC 680,000 PC
6 egzopeptydaza 17,872 Leu-A 105,000 Leu-A
7 Filtrase L3000 (+) 11,701 BGLU 68,745 BGLU
PL 191 456 B1
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE : (i) ZGŁASZAJĄCY:
(A) NAZWA: MOGEN International nv (B) ULICA: Einsteinveg 97 <C) MIASTO: Leider (E) KRAJ: The Netherlands (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 2333 CB (G) TELEFON: 31-(0)71-5258282 (H) TELEFAX: 31-(0) 71-5221471 (A) NAZWA: Gist-brocades N.V.
(B) ULICA: Postbus 1 (C) MIASTO: Del.ft (E) KRAJ: The Netherlands (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 2600 MA (G) TELEFON: 31-(0)15-2799111 (H) TELEFAX: 31-(0)15-2793957 (ii) TITLE OF INVENTION: Ulepszony sposób wytwarzania napojów alkoholowych z zastosowaniem ziarna słodowego (iii) LICZBA SEKWENO d: 8 (iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) RODZAJ NOŚNIKA: Floppy disk (B) KOMPTUTER: IBM PC compaaible (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1,25 (EPO) (vi) DANE DOT. POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: EP 96202195.2 (B) DATA ZGłOSZENIA: 05-AUG-1996 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 558 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HYPOTETYCZNA: de (lii) ANTYSENS: Nie (ί^Χ) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS
PL 191 456 Β1 (B) POŁOŻENIE: 1..558 (D) INNE INFORMACJE: /product= maturę protein' (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR 1:
ATG AQC GCG GGA ATC AAC Asn TAC GTC CAG AAC TAC AAT GGC AAC CTC GGC Gly 48
Met 1 Ser Ala Gly Ile 5 Tyr Val Gln Asn Tyr 10 Asn Gly Asn Leu 15
GAC TTT ACT TAC GAC GAG TCA GCG GGA ACT TTC AGC ATG TAT TGG GAG 96
Asp Phe Thr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Thr Phe Ser Met Tyr Trp Glu
20 25 30
GAT GGC GTG TCC TCA GAC TTC GTC GTG GGA CTG GGC TGG ACC ACT GGA 144
Asp Gly Val Ser Ser Asp Phe Val Val Gly Leu Gly Trp Thr Thr Gly
35 40 45
TCA TCC AAT GCG ATC ACC TAC AGC GCC GAG TAC TCC GCG TCA GGA TCA 192
Ser Ser Asn Ala Ile Thr Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Gly Ser
50 55 60
GCC TCC TAT CTG GCC GTG TAC GGA TGG GTG AAC TAC CCG CAG GCC GAG 240
Ala Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Val Asn Tyr Pro Gln Ala Glu
65 70 75 80
TAC TAC ATC GTG GAG GAT TAC GGA GAT TAC AAC CCA TGC AGC TCA GCG 288
Tyr Tyr Ile Val Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Asn Pro Cys Ser Ser Ala
85 90 95
ACC TCC CTC GGA ACT GTG TAC AGC GAC GGC TCC ACC TAC CAG GTC TGC 336
Thr Ser Leu Gly Thr Val Tyr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Gln Val Cys
100 105 110
ACC GAC ACC CGC ACT AAC GAG CCG TCA ATC ACC GGC ACT TCC ACC TTC 384
Thr Asp Thr Arg Thr Asn Glu Pro Ser Ile Thr Gly Thr Ser Thr Phe
115 120 125
ACC CAG TAC TTC AGC GTG CGC GAG TCC ACT CGC ACC TCA GGA ACC GTG 432
Thr Gln Tyr Phe Ser Val Arg Glu Ser Thr Arg Thr Ser Gly Thr Val
130 135 140
ACC GTC GCG AAC CAC TTC AAC TTC TGG GCG CAG CAC GGA TTC GGC AAC 480
Thr Val Ala Asn His Phe Asn Phe Trp Ala Gln His Gly Phe Gly Asn
145 150 155 160
AGC GAC TTT AAC TAC CAG GTG GTC GCA GTG GAG GCA TGG TCA GGA GCG 528
Ser Asp Phe Asn Tyr Gln Val Val Ala Val Glu Ala Trp Ser Gly Ala
165 170 175
GGC TCA GCG TCC GTC ACT ATC AGC TCC TG 558
Gly Ser Ala Ser Val Thr Ile Ser Ser
180 185
PL 191 456 B1 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 2.
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWWENJJ:
(A) DŁUGOŚĆ: 185 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: linoowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENNCI: ID. SEKW. NR 2:
Met 1 Ser Ala Gly Ile Asn Tyr Val Gin Asn Tyr Asn Gly Asn Leu Gly
5 10 15
Asp Phe Thr Tyr Asp Glu Ser ALa Gly Thr Phe Ser Met Tyr Trp Glu
20 25 30
Asp Gly Val Ser Ser Asp Phe Val Val Gly Leu Gly Trp Thr Thr Gly
35 40 45
Ser Ser Asn ALa Ile Thr Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser ALa Ser Gly Ser
50 55 60 .
Ala Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Val Asn Tyr Pro Gin Ala Glu
65 70 75 80
Tyr Tyr Ile Val Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Asn Pro Cys Ser Ser Ala
85 90 95
Thr Ser Leu Gly Thr Val Tyr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Gin Val Cys
100 105 110
Thr Asp Thr Arg Thr Asn Glu Pro Ser Ile Thr Gly Thr Ser Thr Phe
115 120 125
Thr Gin Tyr Phe Ser Val Arg Glu Ser Thr Arg Thr Ser Gly Thr Val
130 135 140
Thr Val Ala Asn His Phe Asn Phe Trp Ala Gin His Gly Phe Gly Asn
145 150 155 160
Ser Asp Phe Asn Tyr Gin Val Val Ala Val Glu Ala Trp Ser Gly Ala
165 170 175
Gly Ser Ala Ser Val Thr Ile Ser Ser
180 185
(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 71 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NIJIOWOŚĆ: pojedyncza
PL 191 456 Β1 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HYPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENS: Nie (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(A) ORGANIZM: Nicotiana tabacum (Xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR 3:
AACTTCCTCA AGAGCTTCCC CTTTTATGCC TTCCTTTGTT TTGGCCAATA CTTTGTAGCT 60
GTTACGCATG C 71 (2) INFORMACJA,DLA ID. SEKW. NR: 4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 80 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI; cDNA (iii) HYPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENS: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR 4:
CCATGGCATG CGTAACAGCT ACAAAGTATT GGCCAAAACA AAGGAAGGCA TAAAAGGGGA 60 (2 AGCTCTTGAG GAAGTTCATG β 0 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HYPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENS: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR 5:
ATGGATGGCA TGCTGTTGTA G
PL 191 456 B1 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR 6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWWNNJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasac (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncze (D) TOPOLOGIA: linOowe (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HYPOTETYCZNA: Nie (ii_L) ANTYSENS: Nie (xi) OPIS SEKWENCCI: ID. SEKW. NR 6:
GCACAATTCT CGAGGAGACC G 21 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza ' (D) TOPOLOGIA: linOowa (ii) RODZAJ : cDNA (iii) ) HYPOTETYCZNA: N.e (ii±) ANTYSENS: Nie (xi) OPIS SNKWENCJI: ID. SEKW. NR 7:
CCTCTTAAGG ATCCAATGCG G 21 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJ: tA) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: linOowa (ii) RODZAJ : cDNA (iii) HYPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENS: Nie (xi) OPIS SNKWENCJI: ID. SEKW. NR 8:
CTTATCTGAA TTCGGAAGCT C

Claims (7)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania piwa z wykorzystaniem Maltseed, znamienny tym, że do słodu dodaje się mieszaninę enzymów obejmującą przynajmniej endo-p-(1,4)-ksylanazę, arabinofuranozydazę, αamylazę, endoproteazę oraz p-(1,3;1,4)-glukanazę, przy czym mieszanina enzymów zmniejsza ilość wymaganego słodu.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mieszanina zawiera także scukrzającą amylazę.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że mieszanina zawiera także egzopeptydazę.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że każdy z enzymów dostarczany jest przez ziarna pojedynczej roślinnej linii transgenicznej.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że więcej niż jeden enzym dostarczany jest przez ziarna pojedynczej roślinnej linii transgenicznej.
  6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jeden enzym dostarczany jest przez ziarna pojedynczej roślinnej linii transgenicznej.
  7. 7. Sposób według zastrz. 4 albo 5, albo 6, znamienny tym, że pojedynczą roślinną linią transgeniczną jest roślinna linia jęczmienia.
PL331493A 1996-08-05 1997-07-23 Sposób wytwarzania piwa z wykorzystaniem Maltseed PL191456B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP96202195 1996-08-05
PCT/EP1997/004016 WO1998005788A1 (en) 1996-08-05 1997-07-23 Improved process for the production of alcoholic beverages using maltseed

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL331493A1 PL331493A1 (en) 1999-07-19
PL191456B1 true PL191456B1 (pl) 2006-05-31

Family

ID=8224258

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL331493A PL191456B1 (pl) 1996-08-05 1997-07-23 Sposób wytwarzania piwa z wykorzystaniem Maltseed

Country Status (12)

Country Link
US (3) US6361808B1 (pl)
EP (1) EP0915985A1 (pl)
JP (1) JP2000515381A (pl)
CN (1) CN1230225A (pl)
AU (1) AU720139B2 (pl)
BG (1) BG64681B1 (pl)
BR (1) BR9711620A (pl)
CA (1) CA2262436A1 (pl)
CZ (1) CZ296732B6 (pl)
MX (1) MXPA99001239A (pl)
PL (1) PL191456B1 (pl)
WO (1) WO1998005788A1 (pl)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7033627B2 (en) * 1990-03-23 2006-04-25 Syngenta Mogen B.V. Production of enzymes in seeds and their use
CN1174094C (zh) 1997-04-30 2004-11-03 K·U·洛文研究和发展公司 纤维素分解酶、木聚糖分解酶和β-葡聚糖分解酶的抑制剂
EP0979830A1 (en) * 1998-08-12 2000-02-16 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno A novel class of xylanase inhibitors
AU2001236826A1 (en) * 2000-02-10 2001-08-20 Washington State University Research Foundation Methods and compositions that utilize barley as a foodstuff for animals
US7417178B2 (en) 2000-05-02 2008-08-26 Ventria Bioscience Expression of human milk proteins in transgenic plants
AU2001255797A1 (en) 2000-05-02 2001-11-12 Applied Phytologics, Inc. Enhanced gene expression in plants using transcription factors
US6991824B2 (en) 2000-05-02 2006-01-31 Ventria Bioscience Expression of human milk proteins in transgenic plants
AU7242200A (en) * 2000-06-12 2001-12-13 Academia Sinica Protein production in transgenic plant seeds
US20030091691A1 (en) * 2000-06-23 2003-05-15 Olsen Hans Sejr Stepping process
DE60210749T2 (de) * 2001-02-19 2007-03-29 Kirin Beer K.K. Verfahren zur präparation von hefe für fermentationstest
US20040115779A1 (en) * 2002-03-19 2004-06-17 Olsen Hans Sejr Fermentation process
US7008652B2 (en) * 2002-06-14 2006-03-07 Brown-Forman Corporation Method for production of a flavorless malt base
CN102220191B (zh) 2003-12-19 2014-05-21 诺维信公司 糖化工艺
CN1913783A (zh) * 2004-01-30 2007-02-14 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于奶酪熟化的羧肽酶
WO2005118769A1 (en) * 2004-06-03 2005-12-15 Novozymes A/S Mashing process and enzyme composition useful therein
WO2006002481A1 (en) * 2004-07-07 2006-01-12 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Aluminium tolerant barley
GB2418431A (en) * 2004-09-27 2006-03-29 Multigerm Uk Entpr Ltd Metabolically active micro organisms and methods for their production
JP2006288379A (ja) * 2005-03-18 2006-10-26 Suntory Ltd 分画したコーンを用いた発酵飲料
US20090068309A1 (en) * 2006-03-06 2009-03-12 Lakefront Brewery, Inc. Gluten-free beer and method for making the same
JP4627296B2 (ja) * 2006-10-27 2011-02-09 キリンホールディングス株式会社 発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造方法
GB0702844D0 (en) * 2007-02-14 2007-03-28 Leuven K U Res & Dev Improving taste of beer
CN102164573B (zh) 2008-07-23 2015-12-02 菲希欧控制加拿大销售有限公司 用于在心肺复苏期间测量按压参数的cpr辅助装置
JP5658489B2 (ja) * 2010-06-16 2015-01-28 アサヒビール株式会社 発酵麦芽飲料の製造方法
PL2756078T3 (pl) * 2011-09-14 2017-12-29 Dupont Nutrition Biosciences Aps Kompozycje zawierające enzymy o aktywności endo-1,4-beta-ksylanazy i enzymy o aktywności endo-1, 3(4)-beta glukanazy
BR112014027861A2 (pt) * 2012-05-11 2017-12-12 Novozymes As método de preparação de um mosto
DK2958437T3 (da) * 2013-02-21 2020-03-30 Direvo Ind Biotechnology Gmbh Præbiotiske dyrefoderprodukter
RU2695461C2 (ru) * 2013-09-05 2019-07-23 Новозимс А/С Способ снижения вязкости в способе пивоварения
DK3451852T3 (da) * 2016-05-02 2020-09-28 Univ Copenhagen Drikkevarer indeholdende beta-glucan fra byg
CA3062969C (en) * 2017-05-09 2021-12-07 Suntory Holdings Limited Saccharified liquid, method for producing saccharified liquid, food and beverage, distilled liquid for whiskey, and whiskey
MA51410A (fr) 2017-12-28 2021-04-07 Carlsberg As Plantes céréalières présentant des propriétés de paroi cellulaire améliorées
JP2020061988A (ja) * 2018-10-18 2020-04-23 サッポロビール株式会社 ビールテイスト飲料の製造方法及びビールテイスト飲料の香味向上方法

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE275704C (pl)
CA961432A (en) 1969-07-08 1975-01-21 Martin F. Walmsley Process for making a brewers' wort and beer derived therefrom
CH572519A5 (pl) * 1972-10-25 1976-02-13 Ciba Geigy Ag
US4285975A (en) * 1980-01-29 1981-08-25 Miles Laboratories, Inc. Production of brewer's wort
ZA821071B (en) 1981-03-03 1983-01-26 Flogates Ltd Improvements in the pouring of molten metals
JPS57152888A (en) 1981-03-14 1982-09-21 Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd Alcoholic fermentation of raw potato by enzymatic process
IT1178263B (it) * 1983-11-28 1987-09-09 Glaxo Group Ltd Enzima della specie talaromyces emrsonii, composizione che lo contiene e procedimento per degradare con essa pentosani
FI87577C (fi) * 1985-12-03 1993-01-25 Gist Brocades Nv Foerfarande foer framstaellning av voert och oel med foerbaettrad filtrerbarhet och/eller laegre viskositet
US5487989A (en) * 1988-08-31 1996-01-30 Bioenergy International, L.C. Ethanol production by recombinant hosts
DD275704A1 (de) * 1988-09-23 1990-01-31 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur herstellung von gerstenpflanzen
DK0458846T3 (da) 1989-02-16 1996-11-18 Carlsberg As Termostabil(1,3-1,4)-beta-glucanase
IL97645A (en) * 1990-03-23 1997-03-18 Gist Brocades Nv Production of enzymes in seeds and their use
IE913215A1 (en) * 1990-09-13 1992-02-25 Gist Brocades Nv Transgenic plants having a modified carbohydrate content
US5180669A (en) * 1991-03-27 1993-01-19 Genencor International, Inc. Liquefaction of granular-starch slurries using alpha-amylase in the presence of carbonate ion
WO1994014965A1 (en) * 1992-12-24 1994-07-07 Gist-Brocades N.V. Cloning and expression of xylanase b
JPH09503130A (ja) * 1993-10-04 1997-03-31 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 修飾酵素を含んで成る酵素調製品
HUT74960A (en) * 1994-08-26 1997-03-28 Gist Brocades Bv Arabinoxylane degrading enzymes
US6265000B1 (en) * 1994-10-20 2001-07-24 Hokkaido Wine Co, Ltd Process for the production of carbonated alcoholic beverages using koji, malt, and various fermentation media
GB9505479D0 (en) 1995-03-17 1995-05-03 Danisco Enzyme
BR9709175A (pt) 1996-05-03 1999-08-03 Gist Brocades Bv Método para a fabricação de mosto tendo aperfeiçoada filtrabilidade e/ou maior rendimento

Also Published As

Publication number Publication date
CZ37899A3 (cs) 1999-10-13
AU720139B2 (en) 2000-05-25
BR9711620A (pt) 2001-11-20
BG103199A (en) 2000-05-31
EP0915985A1 (en) 1999-05-19
AU4116197A (en) 1998-02-25
CN1230225A (zh) 1999-09-29
CZ296732B6 (cs) 2006-05-17
JP2000515381A (ja) 2000-11-21
PL331493A1 (en) 1999-07-19
US20020164399A1 (en) 2002-11-07
CA2262436A1 (en) 1998-02-12
US20050095315A1 (en) 2005-05-05
BG64681B1 (bg) 2005-11-30
US6699515B2 (en) 2004-03-02
MXPA99001239A (es) 2003-09-12
WO1998005788A1 (en) 1998-02-12
US6361808B1 (en) 2002-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6699515B2 (en) Process for the production of alcoholic beverages using maltseed
James et al. Glucoamylases: microbial sources, industrial applications and molecular biology—a review
RU2312144C2 (ru) Аутопроцессирующиеся растения и части растений
US5888789A (en) Process for protein production in plants
JP3938401B2 (ja) 種子における酵素の生産およびその使用
CA2199158C (en) Seed-specific promoter from barley beta-amylase gene
Nuutila et al. Expression of fungal thermotolerant endo-1, 4-β-glucanase in transgenic barley seeds during germination
US5665585A (en) Recombinant production of glucoamylase P in trichoderma
US9677058B2 (en) Polypeptides having glucoamylase activity and method of producing the same
US9688973B2 (en) Polypeptides having alpha-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
JP2000510336A (ja) 改善された濾過性及び／又は増加した収率を有する麦汁の製造方法
EP1346030B1 (en) Low-lipoxygenase 1 barley
AU710169B2 (en) Endo beta-1,4-glucanase from aspergillus
US10988788B2 (en) Plants expressing cell wall degrading enzymes and expression vectors
US7033627B2 (en) Production of enzymes in seeds and their use
US20050106699A1 (en) Process for xylanase production
WO1998006858A1 (en) BETA-1,4-ENDOGLUCANASE FROM $i(ASPERGILLUS NIGER)
MXPA97007112A (en) Endo-beta-1,4-glucanase from aspergil