BG64681B1

BG64681B1 - Подобрен метод за получаване на алкохолни питиета от малцови семена

Info

Publication number: BG64681B1
Application number: BG103199A
Authority: BG
Inventors: Jerome Souppe; Robert Beudeker
Original assignee: Mogen International N.V.; Gist-Brocades N.V.
Priority date: 1996-08-05
Filing date: 1999-02-23
Publication date: 2005-11-30
Also published as: EP0915985A1; PL331493A1; CZ296732B6; WO1998005788A1; CZ37899A3; CN1230225A; BG103199A; AU4116197A; US20050095315A1; AU720139B2; JP2000515381A; BR9711620A; PL191456B1; CA2262436A1; US6361808B1; MXPA99001239A; US6699515B2; US20020164399A1

Abstract

Изобретението се отнася до метод за получаване на бира или уиски със смес от ензими, включваща ендо- (1,4)-ксиланаза, арабинофуранозидаза, -малтаза, ендопротеаза и -(1,3; 1,4)-глюканаза и, по желание, озахаряваща амилаза и/или екзопептидаза. Предпочитат се смеси, в които нужните за процеса на варене на бирата ензими се осигуряват от трансгенни семена. Необходимо е минимално количество малц запридаване на вкус и цвят.

Description

Област на техниката

Настоящото изобретение се отнася до метод за получаване на алкохолни питиета, по-специално на бира и уиски.

Предшестващо състояние на техниката

Алкохолни питиета като бира могат да се получават от малцови и/или не малцови семена ечемик. Малцът, като добавка към дрождите, допринася за цвета и вкуса на бирата. Освен това малцът действа като източник на ферментируеми захари и ензими. Дали малцът ще се използва в процеса на варене на бирата зависи от вида на бирата и от страната, където се произвежда бирата. В африканските страни, например, традиционно не се използва малц.

Общият метод за малцуване и варене на бирата е наскоро описан от R.C. Hoseney (Cereal Foods World, 39(9), 675-679,1994). Малцуването е процес на контролирано покълване, следван от контролирано сушене на ечемичените зърна. Зърната се обвиват с малц чрез последователни етапи на накисване, покълване, прорастване и сушене (убиване). В този смисъл етапът на покълване е важен за получаване на експресия на серия ензими, които позволяват модификация на ендосперма. Тази модификация води до получаване на ферментативни въглехидрати.

Следващият етап на сушене/нагряване от процеса на малцуване продуцира вкус и цвят, дължащи се на неензимни реакции на потъмняване (Millard).

Процесът на малцуване е много сложна и скъпа част от процеса на производство на бира. Могат да се споменат някои недостатъци на процеса на малцуване:

- ензимното ниво на малца е променливо, което води до непредвидими резултати,

- не се достига всяка желана ензимна активност или се образува в недостатъчно количество по време на покълването, което прави необходимо добавянето на ензими,

- условия, които благоприятстват добрия вкус и цвят, могат да се окажат пагубни за ензимната активност на малца,

- процесът е скъп,

- получават се 10 - 20% загуби в теглото по време на покълването, дължащо се на дишането и растежа на коренчетата (които се отстраняват по време на почистването на малца),

- не е възможно да се продуцира малц на всяко желано място, поради неблагоприятни климатични условия

- използването на малц може да доведе до колоидална нестабилност поради разтварянето на протеина от присъстващата в малца протеиназа,

- може да се получи образуване на биогенни амини (J, Food Science 59 (5), 1104-1107,1994), коиго могат да доведат до, например, хистаминова интоксикация.

Традицонно малцът е единственият източник на ферментируеми въглехидрати, и в много страни все още е. Въпреки това, до сега все повече и повече бира се произвежда при използване на други източници на въглехидрати, вместо малц и/или ечемик, например, фактически всяка скорбяла или вгечнена/разградена скорбяла, тъй наречените добавки. Освен това малцът придава на бирата вкус и цвят.

При продуцирането на малц има зависимост между вкус и цвят и ензимна активност. Малцът, осигуряващ висококачествен вкус и тъмен цвят, може да бъде продуциран единствено след продължително сушене при сравнително високи температури. Тези условия са вредни за активността на ензимите. Добавянето на ензими от външен източник е необходимо от няколко гледни точки. С оглед на това използването на микробиални ензими е било всеобща практика за известно време. При вареното на бира, например, зърната и/или малцуваните зърна се втечняват и озахаряват, с цел да дадат ферментеруеми захари. Етапът на втечняване може да се реализира чрез използване на термостабилна амилаза, както е описано, например, в US 4 285 975 или US 5 180 669. Използват се също и протеази за увеличаване на количеството на свободно достъпен азот в неферментиралата бира за осъществяване на ферментацията.

Освен нишестето, в зърновите култури присъстват и други полизахариди, например β-глюкани (Henry, R.J. et al., J. Sci. Food Agric. 36,1243-1253). Присъстващите в малца β-шюкани не са достатъчно термостабилни, за да са ефективни по време на процеса на варене на бирата. Тези β-глюкани са високо вискозни и дават проблеми с неферментиралата бира и филтруването на бирата. Това е причината, поради която β-глюканазите широко се използват в процеса на варене на бира.

Нескорбялните полизахариди включват, също така, пентозани, чиято структура наскоро е широко изследвана (Gruppen, Н. et al., Carbohydr. 233,

45-64,1992), а по-специално тези на ечемика и мал2 ца (Vietor, R.J. et al., 254-255,1994). За пентозана от Penicillium emersonii се твърди, че подобрява продукцията и екстракцията на ферментеруеми захари при варенето на бира (GB 2 150 933).

Използването на ксиланаза В за подобряване качеството на неферментиралата бира също се споменава във WO1994/014965.

Въпреки направения напредък в тази област, все още съществува необходимост от методи за варене на бира с ензимно получаване, използвани тук.

Техническа същност на изобретението

Настоящото изобретение се отнася до метод за получаване на алкохолни питиета, като например бира, към които се добавя смес от ензими, като ензимната смес съдържа най-малко ендо-β (1,4)-ксиланаза, арабинофуранозидаза, α-амилаза, ендо-протеаза и β-( 1,3; 1,4)-глюканаза, по желание може също да съдържаозахаряваща амилаза и/или екзопептидаза. За предпочитане ензимите, необходими за процеса на производство на бира, се доставят от трансгенетични семена.

Настоящото изобретение описва освен това, трансгенетични растения, експресиращи ензимите, необходими за процеса на производство на бира.

Установено е, че процесът на варене на бира може да се осъществи в присъствието на ензимната смес, както се посочва в патентните претенции, с минимално количество малц. Този процес се осъществява при производството на класическа малцова бира, но може също така, добре да се изпълни в който и да процес, в който малцът се използва за осигуряване на ензимна активност.

Ензимите, които предстои да бъдат използвани, се избират от групата ензими, които задължително са в процеса на варене на бира. Те включват ензими, които са избрани от групата на амилолитичните ензими, от групата на целулотичните ензими, от групата на хемицелулотичните ензими и от групата на протеолитичните ензими.

Амилолитичните ензими включват ензими като α-амилаза, озахаряваща амилаза, амилоглюкозидаза, екзо-амилаза, пулуланаза.

Целулолитичните ензими включват ензими като β-1,4-ендоглюканаза, целобиохидролаза, β-глюкозидаза.

Хемицелулолитичните ензими включват ензими като β-1,3-1,4-ппокоаназа, ксиланаза, ендо-арабинаназа, арабинофура-нозидаза, арабиноксиланаза, арабиногалактаназа, естераза на феруловата киселина.

Протеолитичните ензими включват ензими като екзопептидази и ендопептидази (също наречени проте(ин)ази.

Във връзка с това, изборът на специфичен амилолитичен, целулолитичен, хемицелулолитичен или протеолитичен ензим не е критичен за настоящето изобретение, освен това, че изборът на ензима трябва да е такъв, че свойствата на ензима (като pH и температурен обхват) да са съвместими със специфичните условия на процеса на варене на бира.

Многобройни гени, кодиращи амилолитичен, целулолитичен, хемицелулолитичен или протеолитичен ензим, са на разположението на специалистите в областта. Гените, кодиращи ензимите, представляващи интерес, могат да се получат от какъвто и да е източник, растителен, животински или микробиапен. За предпочитане гените се получават от микробиален източник.

β-( 1,4-)-ксиланаза може да се получи от култура на Aspergillus niger (ЕР 0 463 706). Арабинофуранозидаза се получава във вид на изоензим А или изоензим В (ЕР 0 506190)илинаарабиноксиланхидролаза (ЕР 0 730 653) от култура на Aspergillus niger. Термостабилна амилаза може да се получи като производно на Bacillus licheniformis (WO1991/014772, WO 1992/005259) и се намира в търговската мрежа, например, под търговско наименование Brewers Amyliq Thermostable (B.A.T.S.). Активността на термостабилната амилаза се изразява в TAU единици. Ендопротеазата може да произлиза от Bacillus amyloliquefaciens, и също е достъпна на пазара под търговското наименование Brewers protease (+) и активността й се изразява в PC единици. От същата бактерия може да се получи и β-( 1,3; 1,4-)-ппоканаза (Hofemeisteretal.,Gene49,177,1986), която също е достъпна на пазара под търговското наименование Filtrase 300(+). Активността на пиоканазата се изразява в BGLU единици. Допълнителната озахаряваща амилаза също може да се получи от достъпни на пазара източници (амилаза от Aspergillus orizae под търговското наименование Brewers Fermex, за която активността се изразява в FAU единици), но също така, да се получи от чиста култура на Penicillium emersonii (на разположение от ATCC (American Type Culture Collection) под номер ATCC 16479). Допълнителната екзопептидаза може да се получи от чиста култура Aspergillus sojae, който е депозиран в Centrel Bureau for Schimmelcultures (CBS) Oosterstraat 1, Baam, The Netherlands,под номер CBS 209.96 (A.sojae (DS 8351) на 12 февруари 1996).

Ензимните активности, които са всеизвестни като необходими за производството на бира са а- и β-амилаза за конвертиране на скорбялата на ендосперма във ферментируеми захари, протеаза за разграждане на протеина в разтворими азотни съединения, които действат като храна на дрождите, и βглюканаза и ксиланаза за хидролиза на β-1,3-1,4-ппоканите и ксиланите на ечемика, съответно в олигозахариди, което води до намаляване на вискозитета и подобряване на филтрираемоста. И така, за осигуряване на всички необходими ензими от външен източник, т.е. микробиален източник, ще е необходимо добавянето на поне 5 различни ензима. Въпреки че може да се използва един микроорганизъм за получаването на всичките ензими, ще са необходими различни ферментациони условия за оптималната продукция на всичките ензими.

Чрез използването на ензими с микробиален произход, могат да се преодолеят недостатъците на процеса на малцуване, които бяха споменати погоре. Въпреки това, използването на микроорганизми като източник на ензими има също своите недостатъци :

- необходими са серии от различни ферментации на поне, един микроорганизъм за получаването на всеки ензим в достатъчно количество,

- ензимните препарати могат да включват нежелани странични активности,

- консуматорите не одобряват добавки, различни от, растителен материал, вода и дрожди,

- ограничена стабилност на ензимния препарат по време на съхранението при стайна температура.

Общата употреба на трансгенетичните семена съдържащи увеличено количество ензим при промишлени ензим-катализирани процеси, се описва в заявка за международен патент WO 1991/014772. Директното използване на ензимсъдържащи семена при промишлените процеси дава възможност да се избегне необходимостта от първо екстрахиране и/или изолиране на ензима. Зърното може да действа като стабилна и лесна за обработване форма на депо за съхранение на ензима.

За един единствен ензим 3-1,3-1,4-шюканаза, експресията в ечемичните зърна бе спомената като алтернатива за екзогенно прибавяне.

В заявка за патент DD 275704 се описва конструкцията на експресионен вектор, който да позволи специфичната за зърното експресия на Bacillus β-1,3-1,4-πποκ3Η833 в ечемик. Въпреки това, в настояще време, ефективната трансформация на ечемика още не е проучена. При използване на семена, експресиращи (β-шюканаза от Bacillus, едно достатъчно голямо количество семена може да замести малца без това да причинява сериозни проблеми при филтруването. Все пак, остава да се постигнат от малца или при външна добавка, други ензимни активности, които са необходими за процеса на варене на бира.

Mannonen et al., (1993) предлагат инкорпорирането на плесенна 3-1,3-1,4-глюканаза в зърна от ечемик. По този начин процесът на варене на бирата ще се подобри чрез експресията на β-1,3-1,4-глюканаза в зърната, която притежава по-висока термостабилност, отколкото ендогенния ензим на ечемика. При този случай, все пак, желанието е да се преведе зърното през нормалния процес на малцуване. Освен това, също при този случай, от малца или доставени отвън, трябва да се постигнат други ензимни активности, необходими за процеса на варене на бира.

При един предпочитан метод на настоящето изобретение, ензимите, необходими при процеса на варене на бирата, се експресират в трансгенетични зърна. Така получените трансгенетични зърна, експресиращи посочените необходими ензими, на свой ред се използват в процеса на варене на бира. По този начин се намалява използването на малц, докато прибавянето на екзогенни микробиални ензими може да се избегне.

Трансгенетичните зърна, експресиращи ензими, необходимите при процеса на варене на бира се обхващат от общото наименование малцови семена (MaltSeed).

Растителните видове, способни да продуцират интересуващия ни ензим в техните семена, включват видовете, в семената на които или чиито продукти на семената исторически се използват в процеса на варене на бира. Въпреки това могат да се използват и растителни видове, които не са традиционни при варенето на бира, като източник на трансгенетични семена, експресиращи ензим, представляващ интерес, по-специално в тези случаи, когато единствено минимално количество от тези трансгенетични зърна се добавя при процеса на варене на бирата. Растителните видове, които отговарят на тези критерии, са например ечемик, царевица, ориз, пшеница, сорго, просо, овес, тропически растения от рода на маниоката и други подобни.

Генът, кодиращ ензим, представляващ интерес, се експресира в семената на растението чрез използване на регулаторни последователности, функционални в растението или в семената на растението. Тези регулаторни последователности включват промоторни последователности, терминаторни последователности и, по желание, транскрипционен енхансер на последователности.

Могат да се използват транскрипционни последователности, които водят до конструктивна ексресия на гена в цялото растение. Могат да се използват промоторни последователности, които са активни при директна ексресия на гена в семената на растението.

Освен това, експресията на един ензим, представляващ интерес, може да се насочи или към точно определен клетъчен участък, като цитозола, ендоплазматичния ретикулум, вакуолата, протеинови телца, или към извънклетъчното пространство, чрез използване на специфични насочващи се последователности.

Изборът за специфичен клетъчен участък или за извънклетъчното пространство зависи от способностите на ензима, представляващ интерес, и трябва да се направи така, че да се създаде една оптимална обкръжаваща среда за ензима. Представляващият интерес ензим трябва, например, да бъде в обкръжаваща среда, позволяваща оптимална стабилност на протеина по време на зреенето на зърното. Освен това, ензимът, представляващ интерес, трябва да е в обкръжаваща среда, където експресията на ензима не инхибара основните метаболитни процеси на растението или не води до вредни ефекти върху растението или върху жизнеспособноста на семената.

С цел да е способна да бъде експресирана в растителната клетка, ДНК кодиращата последователност на ензима, представляващ интерес, трябва да се достави с регулаторни елементи, позволяващи да бъде разпозната от биохимичнния механизъм на гостоприемника и трябва да позволява отворената рамка на разчитане да бъде транскрибирана и транслирана в гостоприемника. Обикновено тя включва област за иницииране на транскрипцията, която може подходящо да произлиза от който и да е ген, способен да бъде експресиран в растителните клетки, така както и област за иницииране на транслацията за разпознаване и прикрепяне на рибозомата. При еукариотните растителни клетки една такава експресионна касета включва обикновено в добавка и област за край на транскрипцията, локализирана в посока downstream от посочената отворена рамка на разчитане, позволяваща завършването на транскрипцията и полиаденилацията на първичния транскрипт. Освен това използването на кодон може да се адаптира към използване на приетия кодон на избраното растение гостоприемник. Принципите, командващи експресията на ДНК структурата в растителната клетка, са добре известни на специалистите в областта, а конструирането на експресиращи химерични ДНК структури, също са рутинни.

Специален тип репликон е този, способен сам да се трансферира, или да трансферира негова част, в друга клетка гостоприемник, като растителна клетка, като по този начин се котрансферира отворената рамка на разчитане кодираща за ензима(ите), съгласно изобретението, в посочената растителна клетка. Репликони с такива способности тук се посочват като вектори. Пример за такъв вектор е Ti- плазмиден вектор, който, ако присъства в подходящ гостоприемник, като Agrobacterium tumefaciens, е способен да трансферира част от себе си, тъй-наречената Т-област, в растителната клетка. Различни видове Tiплазмидни вектори (ЕР 0116718В1) сега вече рутинно се използват за трансфер на химерични ДНК последователности в растителни клетки, или протопласти, от които могат да се генерират нови растения, със стабилно инкорпорирана посочената химерна ДНК в техния геном. Особено предпочитана форма на Ti-плазмидни вектори са тьй-наречените бинарни вектори, посочени в претенциите на ЕР 0 120 516 В1 и US 4 940 838. Други подходящи вектори, които могат да се използват за въвеждане на ДНК, съгласно изобретението, в гостоприемник растение, могат да се селекционират от вирусните вектори, например, неинтегративни растителни вирусни вектори, като тези, произлизащи от двойно верижни растителен вируси (например СаМ V) и едноверижни вируси, двойните вируси и други подобни. Използването на такива вируси може да се окаже предимство, особено когато е трудно стабилно да се трансформира растението гостоприемник, както например е случая с дървесните видове, а по-специално дърветата и лозите.

Изразът “клетки гостоприемници, инкорпориращи химерна ДНК последователност съгласно изобретението, в техния геном” означава, че се включват клетки, както и многоклетъчни организми, съдържащи такива клетки, или основно съставени от такива клетки, в които стабилно се инкорпорира посочената химерна ДНК в техния геном, като по този начин се поддържа химерната ДНК, и за предпочитане предаващи копие от такава химерна ДНК на поколението от клетки чрез митоза или мейоза. Съгласно един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението се осигуряват растения, които по същество са съставени от клетки, инкорпориращи едно или повече копия от посочената химерна ДНК в техния геном, и които са способни да предадат копие или копия на тяхното поколение, за предпочитане по начина на Mandelian. Посредством транскрипцията и транслацията на химерната ДНК съгласно изобретението, тези клетки ще продуцират ен зимите. Въпреки че принципите, управляващи транскрипцията на ДНК в растителните клетки, не винаги са добре разбрани, създаването на ДНК, която може да се експресира вече, са рутинни. Областите за инициация на транскрипцията, които обикновено се използват при експресията на трансформирания полинуклеогид по конститутивния начин, са промотори, които могат да се получат от вируса на мозайката по карфиола, а именно 35s РНК и 19s РНК промотори на транскрипти и тъй-наречените Т-ДНК промотори от Agrobacterium tumefaciens. Трябва, в частност, да се споменат нопалин синтазният промотор, октопин синтазният промотор (както е описанвЕРО 122791В1) и манопин синтазният промотор. Могат да се използват, освен това, растителни промотори, които са конститутивни по същество, като актинония генен промотор на ориза. За специфична за семената експресия, ген от представляваща интерес ДНК може да се инсерира след промоторите, произлизащи от гени, които специфично се експресират в растителните семена. Тези промотори включват промотори от гени, кодиращи протеини, съхранявани в семената, като круцифериновия промотор на Brassica napus, фазеолиновия промотор на Phaseolus vulgaris, глутелиновия промотор на Oryza sativa, зеиновия промотор на Zea mays и хордеинобия промотор на Hordeum vulgare.

Известно е, освен това, че удвояването на някои елементи, тъй-наречените енхансери, може значително да усили степента на експресия на ДНК под негов контрол (виж например: Kay R. et al., (1987), Science 236q 1299-1302: the duplication ofthe sequence between -343 and -90 of the CaMV 35s promotor increases the activity of that promotor). Освен конститутивния 35s промотор, единично или двойно усилен, примери за промотори с висока степен на усилване са малката подеденица на промотора на слабо индуцируемата риболозо бифосфат карбоксилаза (rbcSSU) и промотора на хлорофил а/b свързващия протеин (Cab). В настоящото изобретение се имат предвид, също така, и хибридни промотори, които включват елементи от различни промоторни области свързван физически. Добре известен пример за такъв промотор е тъй-наречения CaMV подсилен манопин синтазен промотор US 5 106 739), който включва елементи от манопин синтезния промотор, свързва към CaMV енхансер.

Специфично, при трансформацията на едносемеделни растения, използването на интрони между промотора и гена за маркера за селекция засилва експресията

Терминът “промотор” се отнася до област от ДНК в посока upstream от структурния ген и се включва при разпознаването и свързването на РНК полимеразата и други протеини, за иницииране на транскрипцията. “Растителен промотор” представлява промотор, способен да инициира транскрипцията в растителни клетки. “Конститутивен промотор” представлява промотор, който е активен при повечето условия на средата и състояния на развитие или на клетъчна диференциация.

С оглед необходимостта от транскрипционната терминаторна област се счита, по принцип, че такава област засилва надеждността, както и ефикастностга на транскрипцията в растителните клетки. Използването на такава област е, следователно, строго предпочитано в контекста на настоящето изобретение.

Въпреки че някои варианти за изпълнение на настоящото изобретение може да не са възможни за изпълнение в настоящето, например, някои растителни видове са все още трудно податливи на генетична трансформация, изпълнението на изобретението в такива растения е единствено въпрос на време, а не въпрос на принцип, тъй като подчинеността на генетичната трансформация като такава не е очевидна за точно посочения вариант за изпълнение на изобретението.

Трансформацията в растителни видове е вече рутинна операция за внушително количество растителни видове, включващи и двете, както Dicotyledoneae, така и Monocotyledonede. По принцип може да се използва който и да е метод на трансформация, за въвеждане на химерна ДНК, съгласно изобретението, в подходяща родителска клетка. Могат да се подберат подходящи методи измежду калций/полиетилен гликол метода за прогопласти (rens, F.A. et al., 1982, Nature 296,72-74; Negrutiu I. Et al., June 1987, Plant Mol. Biol 8,363-373), елекгропорация на прогопласти (ShillitoR-D.etal., 1985 Bio/Technol. 3,1099-1102),микроинжектиране в растителния материал (Crossway А. etal., 1986,Mol Gen. Genet 102,179-185), бомбардиране c частици (обвити с ДНК или РНК) на различни растителни материали (Ulein Т.М. et al., 1987, Nature 327,70), инфектиране c (неинтегративни) вируси, в растения, при които генният трансфер е медииран от (Agrobactericum tumefaciens инфилтриране на възрастни растения или трансформиране на зрял полен или микроспори(ЕР0301316) и други подобни. Предпочитаният метод съгласно изобретението включвамедииран посредством Agrobactericum трансфер на ДНК. Особено предпочитано е използването на тъй наречената технология на бинарния в вектор както се описва в ЕР А120 516 и US 4 940 838).

Въпреки че се считат за малко по-упорити по отношение на генната трансформация, едносемеделните растения се подчиняват на трансформация и от трансформираните клетки и зародиши, или от друг растителен материал могат да се регенерират кълняеми растения. В настоящото изобретение, предпочитани методи за трансформиране на едносемеделни растения са бомбадирането с микроснаряди, на зародиши, експланти или клетки в суспензия, и директно взимане на ДНК или (тъкан), електропорация (Shimmamoto, et al., 1989, Nature 338,274276). Получени са трансгенетични царевични растения чрез въвеждане на bar-ген от Streptomyces hygroscopicus, който кодира фосфинотрицин ацетилтрансфераза (ензим, който инактивира фосфинтрицина от хербициди), в ембриогенни клетки в суспенсионна култура от царевица, чрез бомбардиране с микроснаряди (Gordon-Kamm, 1990, Plant Cell, 2,603-618). Въвеждането на генетичен материал в алейронови протопласти на други едносемеделни зърнени растения, като пшеница и ечемик, се докладва от (Lee, 1989, Plant: Mol. Biol. 13,21-30). Пшенични растения са регенерирани от ембриогенна суспенсионна култура чрез селекция на ембриогенен калус за установяване на ембриогенните суспензионни култури (Vasil, 1990 Bio/Technol., 8,429434). Комбинирането със система за трансформиране при тези зърнени растения дава възможност за прилагане на настоящото изобретение за едносемеделни растения.

Едносемеделните растения, включително промишлено важните растения, като ориз и царевица, също се подчиняват на трансфера на ДНК чрез щамове на Agrobacterium (виж ЕРО 159418В; Gould

J.Michael D. Hasegawa 0., Lilian EC., Peterson G, Smith RH, (1991) Plant. Physiol. 95,426-434).

За ечемика предпочитаният метод за трансформация е описан от Tingay, S. et al., (The Plant J. 11(6),1369-1376,1997).

За получаване на трансгенетични растения, способни конститутивно да експресират повече от един химерен ген, разполагаме с голям брой алтернативи, включително и следното:

A. Използване на ДНК, например Т-ДНК от бинарен плазмид с множество модифицирани гени, физически куплирани с втори маркерен ген за селекция. Предимството на този метод е, че химерните гени са физически свързвани и следователно мигрират като единичен локус на Mendelian.

B. Кръстосано опрашване на трансгенетичните растения, като всяко е вече способно да експресира един или повече химерни гени, за предпо читане куплирани със селекционен маркерен ген, с прашец от трансгенетично растение, който съдържа един или повече химерни гени, куплирани към друг маркер за селекция. Впоследствие семената, които се получават от кръстосването, могат да се селекционират на основата на присъствието на двата маркера за селекция, или на основата на присъствието на самите химерни гени, Растенията, получени от селекционираните семена, могат след това да се използват за кръстосване. По принцип химерните гени не са разположени на един локус и гените могат, следователно, да се разделят като независими локуси.

C. Използването на известен брой множествени химерни ДНК молекули, например плазмиди, всеки от които притежава един или повече химерни гени и маркери за селекция. Ако степента на котрансформация е висока, тогава е достатъчно селекционирането на основата на само един маркер. В противен случай се предпочита селекция на основата на повече от един маркер.

D. Последователно трансформиране на растения, които вече включват първи, втори (и т.н.) химерни гени с нова химерна ДНК, включваща по желание маркерен ген за селекция. Както при метод В, химерните гени не са, по принцип, върху един локус и, следователно, химерните гени могат да се разделят като независими локуси.

E. Комбиниране на гореспоменатите стратегии.

Настоящата стратегия може да зависи от няколко обстоятелства, като например целесъобразността на родителската линия (директен растеж, използване в програмата на варене на бира, използване за получаване на хибриди), но не критично по отношение на описаното изобретение.

Известно е, че практически всички растения могат да бъдат регенерирани от култивирани клетки или тъкани. Методите за регенерация варират според растенията, но обикновено първо се осигурява суспензия от трансформирани протопласти или петриево блюдо, съдържащо трансформирани експланти. Младите растения могат да се индуцират директно или индиректно от калус, чрез органогенезис или ембриогенезис и впоследствие да се вкоренят. След маркера за селекция, културалната среда обикновено включва различни аминокиселини и хормони, като например ауксини и цитокини. Благоприятно е към средата да се добавят, също така, глутаминова киселина и пролин. Ефикастностга на регенерирането зависи от средата, от генотипа и от историята на културата. Ако тези три променливи се контро64681 лират, е възможно, обикновено, регенерацията да е репродуцируема и повтаряема.

След стабилно инкорпориране на трансформационните генни последователности в трансгенетичните растения, признаците, придадени от тях, могат да се прехвърлят на други растения чрез полово кръстосване. Може да се използва която и да е стандартна техника за кръстосване, в зависимост от видовете, които ще бъдат кръстосани.

В един конкретен вариант за изпълнение на изобретението се използват трансгенетични семена, които са конструирани по такъв начин, че да продуцират един индивидуален ензим, позволяващи една пластична продукция на ензимни смеси с желаното съотношение на ензимна активност. При един друг вариант за изпълнение на изобретението, повече от една ензимна активност могат да се включват В семената на индивидуалната трансгенетична растителна линия.

Трансгенетичните семена, съдържащи ензимите, представляващи интерес, могат заедно да се добавят при желания етап на процеса на варене на бира. Алтернативно, трансгенетичните семена, съдържащи представляващ интерес ензим, могат индивидулно да се добавят, всеки в желания момент на процеса.

Процесът от настоящето изобретение дава възможност за развитието на малц с високо качество на вкуса и цвета, без да се притесняваме за активността на малца. В настоящето изобретение се избягва използването на малц. Може да е все още необходимо само едно малко количество малц за осигуряване на вкус и цвят на бирата.

Трансгенетичните семена, съдържащи желаните ензими, могат да се прилагат в най-оптимално съотношение със семената и, по желание, с достатъчно количество малц за вкус и цвят. Трансгенетичните семена могат преди това да се смесят със зърното и малца. Алтернативно, всяко съединение, зърно, трансгенетични семена и малц, могат да се добавят при отделните етапи от процеса на варене на бира.

За предпочитане отделните съединения, трансгенетични семена, зърното и малца, или смес от трансгенетични семена, зърното и малца се смилат, преди да са добавят в процеса на варене на бирата.

Трансгенните семена съдържат желаните ензими при средно ниво, вариращо между 0,001 - 2,5%, за предпочитане от 0,01 -1,0%, по за предпочитане от 0,05 - 0,25% от теглото на семето. В зависимост от степента на експресия в семената, единствено част от целия брой семена използвани в процеса на ва рене на бира се заменят от трансгенетични семена. Когато се стремим към високи нива на експресия, тогава е възможно да са добавят трансгенетични семена от други родове растения, които обикновено не се използват в процеса на варене на бира, без да се променя значително сместа за варене на бирата.

При този случай за предпочитане част от малца получава специална обработва, при сравнение с традиционния малц, където малцът се загрява по време на убиването, за да се намалят до минимум продуцирането на оцветителни и овкусителни съединения. След тази обработка оставащата ензимна активност е нищожна.

Експресията на ензими в семената се описва в настоящето изобретение, като се има предвид възможността да се избегне прибавянето на екзогенни микробиални ензими към в процеса на варене на бирата. Разходите за продукцията на трансгенетични семена, съдържащи ензимите, са значително пониски от разходите за продуциране на ензими чрез ферментативни процеси. Освен това, трансгенетичните семена са по-лесни за употреба, тъй като те предоставят стабилна и лесно достъпна форма за съхранение на ензимите и се борави лесно с тях. Намаляването на разходите, както и улеснението при употреба, които се свързват с използването на трансгенетични семена, са специално релевантни при процеса на настоящето изобретение, тъй като се избягва необходимостта от прилагане на няколко различни ензима от няколко микфобиални ферментации 6 процеса на варене на бирата.

Курсът на процеса на настоящето изобретение е много по-предсказуем, отколкото на процеса, използващ малц като източник на ензими, тъй като трансгенетичните семена не включват други ензимни активности при високи нива, освен тези експресирани в следствие на интродуцираните гени. В допълнение, курсът на процеса на настоящето изобретение е много по-предсказуем, отколкото курса на процеса, използващ микробиални ензими, тъй като приготвянето на микробиалните ензими дава неопределени и вариращи нива на странични активности.

Един от районите, в които може специално да се използва, са Африканските страни, където е забранено внасянето на малц. Ензимите в този случай могат да се експресират в сорго, което след това може да се добави в процеса на варене на бира.

Заедно с приложението при варене на алкохолни питиета, могат да бъдат разгледани и други приложения, в които MaltSeed (малцовите семена) могат да заменят малцуваното зърно.

Малцуваният ечемик и/или малцуваната пшеница се изполват от мелничарите за стандартизиране на диастатичната сила на брашното. Освен това се добавят хемицелулази (като например ксиланаза) към брашното за подобряване способността за ретенация на газ на тестата, приготвени от брашното. Прибавянето или използването на ензими в брашното може да се замени с използването на MaltSeed, което и много подходящо, тъй като ензимите могат да се добавят под формата на зърна, които могат да се използуват по всякакъв начин.

Идентично, също в пекарния процес, могат да се прибавят ензими, като заместители на малца, който присъства в много теста. Ензими подобряващи пекарния процес са ксиланазата, амилазата, арабинофуранозидазата, екзопептидазата. Освен това, глюкозооксидазата от Aspergillus niger може да бъде експресирана в семена за използване в лекарската индустрия.

Примери за конкретно изпълнение

Пример 1.

Измерване на активността на ендо-β-1,4-ксиланаза

Ендосиланаза се получава от чиста култура Aspergillus niger в стерилен реактор и среда. Културалната среда съдържа подходящи източници на въглерод и азот, като минерални соли. Ферментацията се провежда при постоянна температура между ЗО-4О°С, a pH се провежда в границите между 3-5.

Активността на ензима се измерва чрез хидролизиране на ксилана от овес и от лимец (Triticum spelta) суспендиран в (35 g/Ι) в 1М глицинов буфер с pH 2,75. Вискозитетът на тази суспензия се определя чрез използване на капилярен вискозиметър (тип Ubbelhode) при 47°С. Времето dt, необходимо за горната мениска на течността да спадне между две контролни точки, се измерва във времето Т. Наклонът на плот Т спрямо 1 /dt дава явна кинетична константа. 1 Lyx единица е количеството ензим, необходимо за достигане на стойност от 1 мин-1 за тази кинетична константа.

Пример 2.

Измерване на активността на екзопептидазата Култивира се работен щам от Aspergillus sojae (DS 8351). Екзопептидазната активност се изразява като Левцин аминопептидазни единици (LeuА): 1 Leu-A е количеството ензим, необходим за продуциране на 1 pmol р-нитроанилин за min при pH 7,2 и 20°С от L-левцин-р-нитроанилин. Тестът се осъществява както следва:

Левцин паранитроанилид (SIGMA) се разтваря във вода при концентрация от 9 mM. 1 ml от разтвора се смесва с 1,5 ml 0,1М фосфатен буфер с pH 7,2. В момента t=0 се въвежда 0,5 ml ензим и се оставя да реагира при 20°С. 15 min по-късно се прибавя IN НС1, за да се спре реакцията. Пуска се празна проба, като се въвежда 1NHC1 във времето t=0. Определя се оптичната плътност за празната проба (OD ) и за изследването (OD ~) при 400 пт. Активността се пресмята, както следва:

(OD -OD J 4 ' празна изследване⁷

А=--------------- х ----- Leu-A/ml

9,8 х 15 0,5

Пример 3.

Измерване на активността на арабинофуранозидаза

Получени са изоензим А или изоензим В или арабиноксилан-хидролаза от култура на щамове на Aspergillus niger или Aspergillus nidulans. Активността на изоензимите А и В се измерва чрез хидролиза на р-нитрофенил- a-L-арабинофуранозид. 1 ARF единица е количеството ензим, необходимо за освобождаване на 1 μτηοΐ р-нитрофенол за min при тестовите условия, описани от Gunata Z. et al., (J. Agric. Food Chem. 38q772pl989).

Пример 4.

Измерване на активноста на озахаряваща амилаза

Озахаряваща амилаза се получава от чиста култура Penicillium emersonii в стерилен ферментатор и среда, съдържаща подходящи източници на въглерод и азот, във вид на минерални соли. Ферментаторът се пълни с малтодекстрини 10-30 h (за предпочитане 24 h) след началото на ферментационния процес. Температурата се поддържа в границите на 40-50°С за предпочитане 45°С), a pH се поддържа в границите между 4,5 - 5,5 (за предпочитане 5,0). Ферментацията се спира 40-55 h (за предпочитане 48 h) след началото.

Активността на озахаряващата амилаза се измерва съгласно теста BETAMYL, на разпространен в търговската мрежа от MEGAZYME, Ireland. 1BTU е количеството ензим, необходимо за получаване на 1 μτηοΐ р-нитрофенол при pH 6,2 и 40°С от достъпният от търговската мрежа субстрат на MEGAZYME.

Пример 5.

Приготвяне на неферментирала бира чрез използване на микробиални ензими

Неферментиралата бира се приготвя от сурови зърна, вариетет PLAISANT. Ечемикът се смила с ЕВС MIAG мелница, с цел да се достигне фил9 тьрна преса тип гранулометрична. 57 g от полученият смлян ечемик се суспендират 6 300 ml топла вода (50°С) и съдържаща: 650 Lyx единици ендо-^-1,4-ксиланаза 850 ARF единици арабинофуранозидаза mg B.A.T.S. (термостабилна амилаза) 6 mg протеаза за варене на бира (+) (ендо-протеаза) 1 mg филтраза L3OOO (+) (β-( 1,3; 1,4)-п1юканаза) Температурата се поддържа при 50°С в продължение на 30 min, след което се повишава на 63°С (скорост 1 °C/min); понататък температурата се подържа при 63 °C в продължение на 30 min, след което се повишава на 72°С (скорост l°C/min) и се поддържа при тази температура в продължение на 30 min. Последно се повишава до 76°С (скорост 1 °C/min) и се поддържа при тази температура в продължение на 5 min. Добавя се вода, която да компенсира изпаряването на водата. След това сместа се налива във фуния, съдържаща хартиен филтър тип Schleicher and Schul. От гъстотата на неферментиралата бира се определя добива, както се прави при всяко варене на бира; определят, също така, стойностите на вискозитета и свободните аминокиселини (FAA), съгласно стандартни ЕВС процедури.

Измерени са добив от 71,5%, вискозитет 2,52 mPa.s и 66 mg/Ι свободни аминокиселини.

Пример 6.

Сравнение на озахаряващите амилази

Неферментирала бира се приготвя от сурови ечемични зърна, вариетет PLAISANT. Ечемикът се смила с ЕВС M1AG мелница, с цел да се достигне филтърна преса тип гранулометрична. 57 g от полу10 чения смлян ечемик се суспендират в

300 ml топла вода (50°С), съдържаща:

650 Lyx единици ендо-β-1,4-ксиланаза

850 ARF единици арабинофуранозидаза mg В. A.T.S. (термостабилна амилаза)

6 mg протеаза за варене на бира (+) (ендопротеаза)

100 Leu-А единици ендопептидаза mg филтраза L3OOO (+) (β-( 1,3; 1,4)-глк>каназа)

Озахаряващите ензими се прибавят към сместа за варене на бира съгласно таблица 1.

ТАБЛИЦА 1

Дози на озахаряващи ензими

номер на поредното варене на бира 1 2 3	Озахаряващи ензими
няма Fermex за варене на бира амилаза от Р. emersonii	0 510 FAU 10
4	Fermex за варене на бира + амилаза от Р. emersonii	510 FAU + BTU

Температурата се поддържа при 50°С в продължение на 30 min, след което се повишава на 63°С (скорост l°C/min); по-нагатък температурата се поддържа при 63°С в прод ължение на 30 min, след което се повишава на 72°С (скорост 1 °C/min) и се поддържа при тази температура в продължение на 30 min. Накрая се повишава до 76°С (скорост 1 °C/min) и се поддържа при тази температура в продължение на 5 min. Добавя се вода, която да компенсира изпарената вода. След това сместа се налива във фуния, съдържаща хартиен филтър тип Schleicer and Schul. От гъстотата на неферментиралата бира се опреде ля добива, както се прави при всяко варене на бира; определят се, също така стойностите на вискозитета и свободните аминокиселини (FAA) съгласно стандартни ЕВС процедури.

Резултатите от измерените добив, вискозитет и FAA, дадени в таблица 2, показват ефектите на озахаряващия ензим от Penicillium emersonii като заместител на Fermex за варене на бира, като не може да се очаква истински синергизъм от използването на двата ензима. Особено неочаквано е сравнително положителния ефект наамилазатаотРепюПйитemersonii върху повишаването на FAA, и намаляването на вискозитета.

ТАБЛИЦА 2

Резултати

номер на	Добив (%)	Вискозитет	FAA (12 Plato)
поредното варене на бира		(mPa.s)	(mg/1)
1	71,2	3,12	116
2	74,6	2,73	114
3	78,2	1,99	153
4	79,6	1,99	152

Пример 7.

Конструиране на бинарен вектор, съдържащ експресионна касета, специфична към семето

Конструира се експресионна структура, така че се получава специфична към семето експресионна касета, чрез използване на последователности от Oryza sativa L. гпутелин запасен протеин (Zheng et al., Plant Physiol (1995) 109] 77-786). Тези последователности могат да бъдат заменени с такива от подобни специфични за семената гени, за постигане на същата цел, каквато е целта на настоящето изобретение.

За конструирането на експресионна структура за специфична към семето експресия се синтезират промоторната и терминаторната последователност от глутелин (Gtl) гена на Oryza sativa L., при използване на PCR техника с геномен клон Gt 1 (Okitaet al., J. Biol. Chem. 264,12573-12581,1989) като матрица. Този ген проявява специфична към семената експресия, а неговите кодираща и гранични последователности са определени (EMBL, Genbank Nucleotide Sequence Database accession number D00584)) B00584)). Сентизирагсе два комплекта олигонуклеотиди. Един, който да позволи амплификациятана2,4 КЬ фрагмент, сдържащGtl 5' граничната област, кодираща като XhoI/SphI фрагмент:

5’Gtl.l 5' GCACAATTCICGAGGAGACCG3’ 5’Gtl .2 5' ATGGATGGCATGCTGTTGTAG3'

Другата амплификация на 3' граничните последователности като BamHI/EcoRl фрагмент(725 Ьр):

3’Gtl35’CCTCTTAAGGATCCAATGCGG3’ 3’Gt 1.4 5’ CITATCTGAATTCGGAAGCAC3’

Олигонуклеоидите са конструирани така, че да включват подходящи рестрикционни сайтове в краищата си, за да позволят директното сглобяване на експресионната структура след смилането на фрагментите с рестрикционни ензими. Гени за ен15 зимите в сместа, съгласно изобретението, могат да се получат от литературата за ендо-ксиланаза (Mol. Microbiol., 12,479-190,1994), за арабинофуранозидазния изоензим А и изоензим В (ЕР 0 506 190), за амилазата от Bacillius licheniformis ЕР 0 449 376), за протеазата от Bacillus amyloliquefaciens (J. Bact. 159, 811-819) и за ппоканаза Bacillus amyloliquefaciens (Gene 49,177-187,1986). Гените за озахаряващата амилаза от Penicillium и за екзопептидазите от Aspergillus sojae могат лесно да се изяснят за специалистите в областта от чистия ензим, получен от културите, посочени в описанието.

Използването на кодони от гените, кодиращи ензимите, които трябва да се експресират в семената, се оптимизира за експресия в едносемеделни семена. С цел да се осъществи това, целият ген се изработва синтетично, въвежда се BspHI сайт в ATG стартовия кодон, a BamHI сайт се въвежда в посока downstream от ТАА стоп кодона, и двата сайта за целите на клонирането.

Продуктът на PCR от 2,4 кЬ, съдържащ 5' граничната област на Gtl, се смила с XhoI/SphI и се клонира във вектор pSL 1180, линеаризиран с Xhol/ Sphl. Полученият вектор се линеаризира с SphI/ BamHI и се използва като вектор за тройно лигиране със синтетичния ген, кодиращ ензима и, по желание, един олигонуклеотиден дуплекс, кодиращ насочващия сигнал. Насочването може да се осъществи във вакуолата, в апопласта, в амилопласта или (с т.н. сигнал за KDEL-ретенация) в ендоплазматичния ретикулум.

От този вектор се изолира фрагмент, съдържащ сливанията на Gtl глутелиновия промотор, по желания сигнална последователност и синтетичния ген. Този ген се клонира при тройно лигиране с 725 bp PCR продукт, съдържащ 3 ’ терминаторната последователност на Gtl, смляна с BamHI/EcoRl в бинарния вектор pMOG22 ( в Е. coli К-12 щам DH5-, депозиран в Central Bureau voor Schimmelcultures на 29.01.1990, под номер CBS 101.90).

Пример 8.

Конструиране на бинарен вектор, съдържащ гена за ендоксиланазата в специфичната за семената експресионна касета

Генът на ендоксиланазата от Aspergillus niger се използва за оптимизиране при използване на кодони в ечемика. Получената ДНК последователност е изобразена на SEQ ID NO: 1.

За експресията на гена на ендоксиланазата се осъществява извънклетъчно насочване чрез олигонуклеотидния дуплекс

PRS.1

S'AACnXZCTCAAGAGClTCCCinTTTATGCCTl’CCITTGTTTTGGCCAATACT ТТСТАССГСГГАСССАЗХХЗ’

PRS.2

3^,GTACri'GAAGGAGTTCTCGAAGGGGAAAATACGGAAGGAAACAAAACCGGTTAT GAAACATCGACAATGCGTACGGTACC5'

Кодиращ сигналния пептид на PR-S протеина на тютюна и тройното лигиране се използва синтетичния ксиланазен ген, смлян с BspHI/BamHI. 20

От този вектор се изолира 3,1 КЬ фрагмент, съдържащ сливанията на Gt 1 гпутелиновия промотор, PR-S сигнална последователност и синтетичната ксиланаза. Този фрагмент се клонира при тройно лигиране с 725 bpPCR продукт, съдържащ З'терми- 25 наторната последователност на Gt 1, смляна с BamHI/ EcoRI в бинарния вектор pMOG22. Полученият вектор се отбелязва като pMOG 1265.

Пример 9. Трансформиране на ечемик

Методът, използван за трансформиране на 30 незрял ембрион от Hordeum vulgare cv. Golden Promise чрез използване на Agrobacterium tumefaciens е както е описано от Tingay, S. et al., Tthe Plant J. 11 (6), 1369-1376,1997. Накратко, протоколът е както следва:

Донорни растения за изходен материал се отг- 35 леждат върху фитотрон при 10-20°С с 16-часов период на осветление при 10 000-30 000 lux и 50-90% RH. Незрелите семена се събират 10-15 дни след опрашването и се стерилизират в разтвор на хлорна вар за 20-40 min. Незрелите ембриони се изрязват от 40 младите кариопси и ембрионалната ос се отстранява със скалпел. Експлантите се поставят със страната на скутелума нагоре върху среда, индуцираща калус, и се инкубират при 24°С на тъмно за период от 16 h до 7 дни. 45

Ембрионите се потопят в суспензия от Agrobacterium, приблизително 0,1-1 ОхН 10⁹ бактерии на милилитър, в която Agrobacterium съдържа структурите, включващи ДНК кодираща избраният ензим, за 5 до 20 min, след което се прехвърля върху среда, индуцираща калус. След това ембрионите се инкубират в продължение на 2 или 3 дни при 24° С на тъмно. След кокултивирането, ембрионите се прехвърлят на средата, индуцираща калус, съдържаща антибиотици, за да се убият Agrobacteria, директно комбинирана с агент за селекция за започване на процеса на селекция на трансгенетичните клетки. Процесът на селекция се осъществява до 8 седмици. Резистентните ембрионални калусни линии се прехвърлят на среда за регенерация и се инкубират при засилващ се интензитет на осветеност (500 до 3000 lux) с 16 часов период на осветеност при 24°С. Регенериралите растениица се прехвърлят на среда без хормони или на среда за индуциране на калус с високо съдържание на цитокинин, с или без агенти за селекция. След развитието на коренната система, младите растения се прехвърлят в почва и се отглеждат до зрялост със самоопрашване.

Пример 10.

Осъществяват се три пилотни опита за варене на бира. Правят се две тестови сварявания със силно намалено количество малц (20% от суровия продукт) и контрола с нормално количество малц (виж таблица 3). Двете тестови варенета се различават по технологията на смилане и филтриране (виж таблица 3). Диаграмата на варене на бира при всички случаи на варене е показана на фигура 1.

ТАБЛИЦА3 Състав, филтриране и смилане на суровия материал

	контрола	тест на варене 1	тест на варене 2
малц	75%	20%	20%
царевичен грис	25%	25%	25%
немалцуван ечемик	-	55%	55%
филтър	лаутертум	лаутертум	Меига 20001
смилане	цилиндър	цилиндър	чук

Използват се 8% малц от контролния разтвор гите 47% немалцуван ечемик се прибавят към съда в зърнените варива заедно с царевичния грис, дру- за конверсия заедно с малца.

Таблица 4

Кодове на ензимите и количества прибавени на 100 kg суров материал

код на ензима	ензим	зърнени варива	съд за конверсия
1	ендо-β- 1,4-ксиланаза		117,000 Lyx
2	арабинофуранозидаза		112,500 ARF
3	B.A.T.S.	16,5
4	Регтех за варене на бира		75 g
5	протеаза за варене на бира(+)		75 g
6	екзо пептидаза
7	филтраза L3000 (+)		23 g

Ензими 1,2,4,5 и 7 се прибавят към съда за конверсия, докато ензим 3 се добавя към стерилизатора за зърнения материал (Виж таблица 4 за ензимните кодове и прибавените количества).

Завършването на процеса на неферментиралата бира (смесване и лаутеринг) са подобни за тестовото варене на бира и за контролата. Двете тестови варенета на бира се провеждат по подобен начин в пивоварната. Тестовите варенета на бира дават почти същата неферментирала бира, което показва, че разликите във филтруването и смилането не са основни. От сравнението между тестовата и контроланата бира се стигна до извода, че всичките три бири имат почти еднакъв профил. По-силна разлика във вкуса се наблюдава между тестовото варене на бира и контролното. Това може да се дължи на по-високото ниво на декстрин, което бе установено при анализа на неферментиралата бира. Нивото на аминокиселини в неферментиралата бира е въпреки това приемливо, по-ниско при тестовото варене на бира, отколкото при контролата. Нивото на аминокиселини се увеличава чрез прибавяне на екзопептидаза (виж пример 11). Бирите от тестовото варене се класифицират по тестовия панел като добри бири от пилзенски тип, като по този начин показват, че частичната замяна на малца от ензимната смес води до получаване на бира, която е сравнима с бира, произведена с такова количество малц, което се използва обикновено в пивоварната индустрия.

Пример 11.

Провеждат се два пилотни опита на варене на бира. Тестовото варене се осъществява с намалено количество малц, а контролното варене с нормално количество малц (виж таблица 5). Филтруването се извършва на Lautertun. Виж фигура 2 за диаграмите на варене на тестовото варене 1 и на конт5 родното.

Таблица 5

Състав на суровия продукт

	контрола	тестово варене 1
малц	75%	20%
царевичен грис	25%	25%
несмлян ечемик	-	55%

От контролната смес се използват 8% малц в зърнените варива заедно с малцовия грис, другите 67% малц се прибавят към съда за конверсия. За тестовото варене се използват 8% несмлян ечемик в зърнените варива, заедно с царевичния грис, другите 47% несмлян ечемик се прибавят към съда за конверсия заедно с малца.

При тестовото варене на бира, ензими 1-7 се прибавят в съда за конверсия, докато ензим 3 се прибавя също и към съдържанието на зърнените варива (виж таблица 6 за кодовете на ензимите и количествата използвани ензими).

Резултатите от завършването на процеса на 3θ неферментиралата бира (смесване и лаутеринг) са

Кодове на ензимите и количества материал в при тестовото варене ι подобни за тестовото варене на бира и за контролата. Съдържанието на свобден аминокиселинен азот в неферментиралата бира е подобно за тестовото варене на бира и за контролното. Тестовото варене на бира дава бира, която чрез проба се счита, че има почти същия профил, както контролата. Бирата от тестовото варене се класифицира по тестовия панел като добра бира от пилзенски тип, като по този начин се показва, че частичната замяна на малца с ензимна смес води до получаване на бира, която е сравнима с бира произведена с такова количество малц, което се използва обикновено в пивоварната индустрия.

Таблица 6 прибавени на 100 kg суров а бира

код на ензима	ензим	зърнени варива	съд за конверсия
1	ендо-β- 1,4-ксиланаза		117,000 Lyx
2	арабинофуранозидаза		112,500 ARF
3	B.A.T.S.	16,5 g	33,5 g
4	Fermex за варене на бира		75 g
5	протеаза за варене на бира (+)		75 g
6	екзо пептидаза		105,000 LeuA
7	филтраза L3000 (+)		23 g

Пример 12.

Трансгенетични семена от ечемик от седем линии, всяка експресираща един от ензимите, показани на таблица 9, се смесват в такова съотношение, че получените малцови семена (MaltSeed), когато се смесят като 1-% от суровия ечемик, да осигурят ензимна активност, каквато е показана на таблица 9. Препаратът от малцови семена се смесва и се смила заедно с нетрансгенетичен ечемик, като заедно съставят 55% от суровия материал при тестовото 1 варене на бира. Съставът на суровия материал в зърненото вариво и съдът за конверсия за тестовото варене на бирата са показани на таблица 8. За контролата се използват 8% малц в зърненото вариво

Състав на суровия материал заедно с царевичен грис. Останалият суров материал се използва в съда за конверсия. Разпределението на малцовите семена дава ензимните активности, както са показани на таблица 10 в съда за конверсия 5 и зърнените варива.

Осъществяват се опити за варене на бира. Тестовото варене се извършва с намалено количество малц, а за контролата с нормално количество малц (виж таблица 7). За тестовото варене на бира се из10 ползва по-висока температура на озахаряване (виж таблица 7). Филтруването се извършва на Lautertun. За диаграмате на варене на бира на контролното и на тестовото варене на бирата виж фигура 2.

Таблица 7

	контрола	тестово варене 1
малц	75%	20%
царевичев грис	25%	25%
несмлян ечемик + малцови семена	-	55%

Таблица 8

Състав на суровия материал за 100 kg общо за тестовото варене на бирата

суров материал	зърнени варива (kg)	съд за конверсия (kg)
малц		20
несмлян ечемик	7,2	42,3
малцови семена	0,8	4,7
царевичен грис	25
тотал (kg)	33	67

Завършването на процеса на неферментиралата бира (смесване и лаутеринг) са подобни за тестовото варене на бира и за контролата. Тестовото варене на бира дава бира, която чрез проба се счита, че има подобен профил, както контролата. Бира та от тестовото варене се класифицира като класическа малцова бира чрез изпробване на вкуса, като по този начин се показва, че малцът може да бъде заменен (частично) с ензими, доставени чрез трансгенетични семена, които ги експресират.

Таблица 9.

Количество ензимна активност, добавено чрез прибавяне на малцови семена (единици за 100 kg суров материал) при тестовото варене на бира

код на ензима	ензим	зърнени варива	съд за конверсия
1	ендо-β- 1,4-ксиланаза	19,915 Lyx	117,000 Lyx
2	арабинофуранозидаза	19,149 ARF	112,500 ARF
3	B.A.T.S.	107,250 TAU	33,5 TAU
4	Fermex за варене на бира	57,872 FAU	75 FAU
5	протеаза за варене на бира (+)	115,745 PC	75 PC
6	екзо-пептидаза	17,872 LeuA	105,000 LeuA
7	филтраза L3000 (+)	11,701 BGLU	23 BGLU

СПИСЪК НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ (1) Обща информация:

(i) Заявител:

(A) име: MOGEN Imtemational nv (B) улица: Einsteinweg 97 (D) град : Leiden (E) страна: The Netherlands (F) пощенски код (ZIP) : 2333 CB (G) телефон: 31-(0)71-5258282 (H) факс: 31-(0)71-52221471 (A) име : GIST-brocades nv (B) улица: Postbus 1 (D) град : Delft (E) страна: The Netherlands (F) пощенски код (ZIP) : 2600 MA (G) телефон : 31-(0)15-2799111 (H) факс: 31-(0)15-2793957 (ii) Заглавие на изобретението : ПОДОБРЕН МЕТОД ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА АЛКОХОЛНИ ПИТИЕТА ОТ МАЛЦОВИ СЕМЕНА (iii) Брой на по последователностите: 8 (iv) компютърен интерфейс:

(A) вид на устройството: флопи диск (B) компютър: IBM PC съвместим (C) операционна система: PC-DOS / MS DOS (D) софтуер: Patentin Release #1.0, версия #1.25 (EPO) (vi) данни за предходни заявки:

(A) номер на заявката: ЕР 96202195.2 (B) дата на подаване: 05.08.1996 (2) Информация за SEQ ID No : 1:

(A) дължина: 558 базови двойки (B) тип : нуклеинова киселина (C) верижност: двойна (D) топология: линейна (ii) тип на молекулата: сДНК (iii) хипотетичност: не (iii) противоположност: не (ix) характеристики (A) име/ключ CDS (B) локализация : 1..558 (D) друга информация : /продукт = зрял протеин (xi) описание на последователноста: SEQ ID NO: 1:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:

ATG Met 1

AGC GCG

GGA Gly

ATC AAC

TAC GTC CAG AAC TAC AAT GGC AAC CTC GGC

48

Ser

Ala

lie 5

Asn

Tyr Val Gin

Asn 10

Tyr

Asn

Gly

Asn Leu Gly 15

GAC

TTT

ACT

TAC

GAC

GAG

TCA

GCG

GGA

ACT

TTC

AGC

ATG

TAT

TGG

GAG

96

Asp

Phe

Thr

Tyr

Asp

Glu

Ser

Ala

Gly

Thr

Phe

Ser

Met

Tyr

Trp

Glu

20

25

30

GAT

GGC

GTG

TCC

TCA

GAC

TTC

GTC

GTG

GGA

CTG

GGC

TGG

ACC

ACT

G0A

144

Asp

Gly

Val

Ser

Asp

Phe

Val

Gly

Leu

Gly

Trp

Thr

Gly

35

40

45

TCA

TCC

AAT

GCG

ATC

ACC

TAC

AGC

GCC

GAG

TAC

TCC

GCG

TCA

GGA

TCA

192

Ser

Asn

Ala

He

Thr

Tyr

Ser

Ala

Glu

Tyr

Ser

Ala

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GCC

TCC

TAT

CTG

GCC

GTG

TAC

GGA

TGG

GTG

AAC

TAC

CCG

CAG

GCC

GAG

240

Ala

Ser

Tyr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gly

Trp

Val

Asn

Tyr

Pro

Gin

Ala

Glu

65

70

75

80

TAC

ATC

GTG

GAG

GAT

TAC

GGA

GAT

TAC

AAC

CCA

TGC

AGC

TCA

GCG

288

Tyr

lie

Val

Glu

Asp

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Asp

Pro

Cys

Ser

Ala

85

$0

95

ACC

TCC

CTC

GGA

ACT

GTG

TAC

AGC

GAC

GGC

TCC

ACC

TAC

CAG

GTC

TGC

336

Thr

Ser

Leu

Gly

Thr

Val

Tyr

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Gin

Val

Cys

100

105

HO

ACC

GAC

ACC

CGC

ACT

AAC

GAG

CCG

TCA

ATC

ACC

GGC

ACT

TCC

ACC

TTC

384

Thr

Asp

Thr

Arg

Thr

Asn

Glu

Pro

Ser

He

Thr

Gly

Thr

Ser

Thr

Phe

115

120

•

125

ACC

CAG

TAC

TTC

AGC'

•GTG

CGC

GAG

TCC

AQT

CGC

ACC

TCA

GGA

ACC

GTG

432

Thr

Gin

Tyr

Phe

Ser

Val

Arg

Glu

Ser

Thr

Arg

Thr

Ser

Gly

Thr

Val

130

135

140

ACC

GTC

GCG

AAC

CAC

TTC

AAC

TTC

TGG

GCG

CAG

CAC

GGA

TTC

GGC

AAC

480

Thr

Val

Ala

Asn

His

Phe

Asn

Phe

Trp

Ala

Gin

His

Gly

Phe

Gly

Asn

145

150

155

160

AGC

GAC

TTT

AAC

TAC

CAG

GTG

GTC

GCA

GTG

GAG

GCA

TGG

TCA

GGA

GCG

528

Ser

Asp

Phe

Asn

Tyr

Gin

Val

Ala

Val

Glu

Ala

Trp

Ser

Gly

Ala

165

170

175

GGC

TCA

GCG

TCC

GTC

ACT

ATC

AGC

TCC

TG

558

Gly

Ser

Ala

Ser

Val

Thr

lie

Ser

180

185

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 185 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:

Met Ser Ala Gly lie Asn Tyr

Val

Gin Asn Tyr Asn Gly Asn Leu Gly

1

5

10

15

Asp

Phe

Thr

Tyr

Asp

Glu

Ser

Ala

Gly

Thr

Phe

Ser

Met

Tyr

Trp

Glu

20

25

30

Asp

Gly

Val

Ser

Asp

Phe

Val

Gly

Leu

Gly

Trp

Thr

Gly

35

40

45

Ser

Asn

Ala

lie

Thr

Tyr

Ser

Ala

Glu

Tyr

Ser

Ala

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Ala

Ser

Tyr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gly

Trp

Val

Asn

Tyr

Pro

Gin

Ala

Glu

65

70

75

80

Tyr

He

Val

Glu

Asp

Tyr

Gly

ASP

Tyr

Asn

Pro

Cys

Ser

Ala

85

do

95

Thr

Ser

Leu

Gly

Thr

Val

Tyr

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Gin

Val

Cys

100

105

110

Thr

Asp

Thr

Arg

Thr

Asn

Glu

Pro

Ser

lie

Thr

Gly

Thr

Ser

Thr

Phe

115

120

125

Thr

Gin

Tyr

Phe

Ser

Val

Arg

Glu

Ser

Thr

Arg

Thr

Ser

Gly

Thr

Val

130

135

140

Thr

Val

Ala

Asn

His

Phe

Asn

Phe

Trp

Ala

Gin

His

Gly

Phe

Gly

Asn

145

150

155

160

Ser

Asp

Phe

Asn

Tyr

Gin

Val

Ala

Val

Glu

Ala

Trp

Ser

Gly

Ala

165

170

175

Gly

Ser

Ala

Ser

Val

Thr

He

Ser

180 185 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 71 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (2) Информация за SEQ ID No: 2 :

(A) дължина: 185 базови двойки (B) тип: аминокиселина (D) топология: линейна (ii) тип на молекулата: протеин (xi) описание на последователноста: SEQ ID NO: 2:

(2) Информация за SEQ ID No : 3:

(A) дължина : 71 базови двойки (B) тип : нуклеинова киселина (C) верижност; единична (D) топология: линейна (ii) тип на молекулата : сДНК (iii) хипотетичност: не (iii) противоположност: не (vi) първоначален източник:

(А) организъм: Nicotiana tabacum (xi) описание на последователноста : SEQ ID NO: 3:

ААСГТССТСА AGAGCTTCCC CTTTTATGCC TTCCTTTGTT 40 TTGGCCAATA CTTTGTAGCT GTTACGCATG С 71 (2) Информация за SEQ ID No : 4:

(A) дължина : 80 базови двойки (B) тип: нуклеинова киселина (C) верижност: единична (D) топология: линейна (ii) тип на молекулата : сДНК (iii) хипотетичност: не (ш)противоположност : ga (xi) описание на последователноста : SEQ ID NO: 4:

CCATGGCATG CGTAACAGCT ACAAAGTATT GGCCAAAACA AAGGAAGGCA TAAAAGGGGA AGCTCTTGAG GAAGTTCATG (2) Информация за SEQ ID No: 5:

(A) дължина : 21 базови двойки (B) тип : нуклеинова киселина (C) верижност: единична (D) топология: линейна (ii) тип на молекулата: сДНК (iii) хипотетичност: не (iii) противоположност: не (xi) описание на последователноста : SEQ ID NO: 5 :

ATGGATGGCATGCTGTTGTAG 21 (2) Информация за SEQ ID No: 6:

(A) дължина: 21 базови двойки (B) тип: нуклеинова киселина (C) верижност: единична (D) топология: линейна (ii) тип на молекулата: сДНК (iii) хипотетичност: не (iii) противоположност: не (xi) описание на последователноста : SEQ ID NO: 6: GCACAATTCT CGAGGAGACC G 21 (2) Информация за SEQ ID No : 7 :

(A) дължина: 21 базови двойки (B) шип: нуклеинова киселина (C) верижност: единична (D) топология: линейна (ii) тип на молекулата : сДНК (iii) хипотетичност: не (iii) противоположност: не (xi) описание на последовашелносша: SEQ ID NO: 7:

CCTCTTAAGG ATCCAATGCG G 21 (2) Информация за SEQ ID No: 8:

(A) дължина: 21 базови двойки (B) тип: нуклеинова киселина (C) верижност: единична (D) топология: линейна (ii) тип на молекулата: сДНК (iii) хипотетичност: не (iii) противоположност: не (xi) описание на последователноста: SEQ ID NO: 8:

СТТATCTGАА TTCGGAAGCT С 21

Claims

Патентни претенции

1. Метод за получаване на алкохолни питиета, към които се добавя ензимна смес, характеризиращ се с това, че сместа съдържа най-малко ендо- 5 Р(1,4)-ксиланаза, арабинофуранозидаза, а-амилаза, ендо-протеаза и β-( 1,3; 1,4)-глюканаза.
2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че сместа съдържа и озахаряваща амилаза
3. Метод съгласно претенция 1 или 2, характеризиращ се с това, че сместа съдържа и екзопептидаза.
4. Метод съгласно коя да е претенция от 1 до

3, характеризиращ се с това, че питието е бира.
5. Метод съгласно която и да е претенция от 1 до 4, характеризиращ се с това, че всеки от тези ензими се доставя от отделна трансгенетична растителна линия.
6. Метод съгласно която и да е претенция от 1 до 4, характеризиращ се с това, че един ензим се доставя от семена от трансгенетична растителна линия.
7. Метод съгласно която и да е претенция от 1 до 6, характеризиращ се с това, че поне един ензим се доставя от семена на отделна растителна линия.
8. Метод съгласно коя да е претенция от 5 до 7, характеризиращ се с това,че трансгенетичната растителна линия е растителна линия от ечемик.