CN112522238A - 一种利用转基因玉米生产淀粉酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用转基因玉米生产淀粉酶的方法，所述方法是将淀粉酶的编码基因在GT1启动子作用下转入玉米基因组中，构建产淀粉酶的转基因玉米；本发明的转基因玉米在胚乳中实现淀粉酶的高表达，所生产的淀粉酶的活性极高，达到每克种子8000单位以上；本发明的转基因玉米生产的淀粉酶无需经过分离浓缩，可以直接应用于饲料生产、食品加工、纺织工业等生产过程；本发明利用玉米生物反应器生产淀粉酶，生产成本低廉，是一种环境友好型的生产方式。

Description

一种利用转基因玉米生产淀粉酶的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种利用转基因玉米生产淀粉酶的方法。

(二)背景技术

淀粉酶(Amylase)广泛应用于粮食加工、食品工业、酿造、纺织和医药领域，是目前发酵工业上应用最广泛的一类酶。淀粉酶是一种水解酶，可以将淀粉水解为麦芽糊精、葡萄糖浆等物质，是生产葡萄糖、果糖等糖工业产品中必不可少的酶。淀粉酶也是饲料酶中的重要成分，可以降解大分子多糖，使动物能够更好地消化吸收营养，对于提高动物生产性能、节约饲料资源意义重大。此外，淀粉酶还是生产生物乙醇中必需的酶制剂，淀粉被淀粉酶降解为六碳糖后，才能进一步被酵母利用、合成乙醇。

淀粉酶可以通过在植物中表达生产，例如，美国专利US7102057B2披露了一种利用转基因玉米表达α-淀粉酶来生产生物酒精的方法，该专利披露了利用一种玉米内源的胚乳蛋白质启动子控制外源淀粉酶基因在玉米胚乳中表达的方法。从效率上来说，这种表达淀粉酶的玉米表达水平相对比较低，无法用于淀粉酶的工业化生产；从用途上来说，其主要用途是玉米淀粉自动降解，解决利用玉米大规模生产酒精过程中的液化问题。此外，在烟草(Pen et al,1992)、苜蓿(Austin et al,1995)等多种植物上也已经报道了利用基因工程技术表达外源淀粉酶的研究。但是，利用植物生物反应器表达的淀粉酶，其单位重量中的酶活性仍然普遍比较低，需要大幅度提高植物中淀粉酶的表达量才能提高这种技术的商业价值。目前，工业上使用的淀粉酶仍然主要通过微生物发酵来生产，成本较高。

本发明披露了一种利用转基因玉米高效生产淀粉酶的方法。玉米是常见的农作物，生产成本低，产量较高。利用转基因玉米生产淀粉酶，可以获得高质量的淀粉酶，降低淀粉酶的生产成本，具有广泛的应用场景和较高的经济价值。本发明方法利用转基因玉米在玉米胚乳中表达高剂量的淀粉酶，这种转基因玉米种子中的淀粉酶活性较高，在转基因玉米种子中生产的淀粉酶无需经过分离浓缩就可以直接运用在粮食加工、饲料生产、食品工业、纺织等工业过程中。本发明的特点是使用了水稻谷蛋白GT1的启动子控制淀粉酶基因在转基因玉米中的胚乳中高效表达，利用这种方法获得的转基因玉米，能够稳定、高效、低成本地生产各种用途的淀粉酶。

(三)发明内容

本发明的目的提供一种利用转基因玉米生产淀粉酶的方法，能够稳定、高效、低成本地生产各种用途的淀粉酶，直接运用在粮食加工、饲料生产、食品工业、纺织等工业过程中。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种利用转基因玉米生产淀粉酶的方法，所述方法是将淀粉酶的编码基因在GT1启动子作用下转入玉米基因组中，构建产淀粉酶的转基因玉米；所述淀粉酶是指α-淀粉酶，能够催化水解直链淀粉中的α-1,4-葡萄糖苷键，生成α-麦芽糖、葡萄糖等物质，优选以下四种中的任意一种：嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)淀粉酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliqefacients)淀粉酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2；地衣芽孢杆菌(Bacillus lichiformmis)淀粉酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3；米曲霉菌(Aspergillus oryzae)淀粉酶，其氨基酸序列为SEQ IDNO:4。

进一步，所述的淀粉酶在转基因玉米中的表达由一个来自水稻谷蛋白GT1(Genbank:AP014966)的启动子控制，所述的GT1启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示。

本发明涉及由所述淀粉酶的编码基因构建的玉米遗传转化T-DNA载体。所述的T-DNA载体是包含了由GT1启动子启动淀粉酶基因的表达框，所述表达框包括GT1启动子、淀粉酶基因、终止子和载体；所述载体为pCambia1300。淀粉酶基因的核苷酸序列与上述GT1启动子拼接至同一表达框中，用于构建T-DNA载体。所述的T-DNA载体可以用于玉米的遗传转化。由于一种氨基酸可以由不同的核苷酸密码子编码，因此，只要一段核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:1-4中的任意一种相同，且使用了本发明所涉及的遗传转化载体构建方法，均应视为本发明的内容。对于终止子序列无特殊要求，研究人员可以选用常用的终止子，如农杆菌Nos终止子、玉米pepc终止子、CaMV 35s终止子等来终止淀粉酶基因的转录。

本发明选用来自细菌或真菌的淀粉酶基因，使用一种水稻谷蛋白GT1启动子序列，构建玉米转化载体进行遗传转化，使淀粉酶基因能够特异性地在转基因玉米种子的胚乳中高效表达。利用本发明所述的方法，将包含有GT1启动子启动淀粉酶基因表达框的外源T-DNA整合到玉米基因组中，通过筛选，得到能够稳定遗传、在胚乳中高表达淀粉酶的转基因玉米株系，是实现大规模生产应用的基础。

本发明优选T-DNA载体构建方法为：将淀粉酶基因5’端被设计上BamHI位点，3’端被设计上SacI位点，酶切获得BamHI-SacI酶切片段，与5’端设计SacI位点，3’端设计KpnI位点的玉米pepc终止子的SacI-KpnI片段连接，获得包括淀粉酶基因和终止子的BamHI-KpnI片段；GT1启动子序列5’端设计HindIII位点，3’端设计BamHI位点，经酶切后获得HindIII-BamHI片段；将BamHI-KpnI片段和HindIII-BamHI片段插入至玉米转化载体pCambia1300的多克隆位点的HindIII和KpnI位点之间，即可获得用于玉米转化的T-DNA载体。

本发明还包括一种玉米细胞，所述玉米细胞的基因组上整合了所述的T-DNA载体。

本发明创造性地提出并实现了一种利用转基因玉米高效生产淀粉酶的方法。与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：(1)从功能效率的角度，本发明的转基因玉米在胚乳中实现淀粉酶的高表达，所生产的淀粉酶的活性极高，达到每克种子8000单位以上；(2)从生产应用的角度，本发明的转基因玉米生产的淀粉酶无需经过分离浓缩，可以直接应用于饲料生产、食品加工、纺织工业等生产过程；(3)本发明利用玉米生物反应器生产淀粉酶，生产成本低廉，是一种环境友好型的生产方式。

(四)附图说明

图1、用于玉米遗传转化的载体p1300-GT1-AS示意图。

图2、麦芽糖标准曲线。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明以下实施例中所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in MolecularBiology，和J.Sambrook等编写的Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3^rd ED.等文献均有详细的说明。

实施例1、构建玉米遗传转化载体

本发明涉及的编码基因均由上海生工公司进行人工合成。玉米遗传转化载体是基于pCambia1300(NCBI序列编号AF234296)载体而构建的，唯一的不同是将原始pCambia1300上的潮霉素筛选基因hptII(位于两个XhoI位点之间)替换为本课题组自主研发的抗草甘膦筛选基因g10-evo(仅用于阳性玉米转化株系的筛选)(Zhao,Qc.,Liu,Mh.,Zhang,Xw.etal.Generation of insect-resistant and glyphosate-tolerant rice byintroduction of a T-DNA containing two Bt insecticidal genes and an EPSPSgene.J.Zhejiang Univ.Sci.B 16,824–831(2015))，该载体命名为1300-g10evo，在-80℃冰箱中保存。上述载体仅仅是举例，而非本发明的内容，研究者可以直接使用原始的pCambia1300载体(使用潮霉素筛选)，也可以将潮霉素编码基因hptII替换为其他合适的筛选基因，均能实现同样的效果。

对于本发明所提及的四种淀粉酶的编码基因，它们的遗传转化载体的构建方式完全一致，各个遗传转化载体之间的区别仅在于淀粉酶编码基因的不同。以嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)淀粉酶(氨基酸序列为SEQ ID NO:1)为例：将人工合成的嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶基因(命名为AS，5’端被设计上BamHI位点，3’端被设计上SacI位点，BamHI-SacI酶切片段)与玉米的pepc终止子(Genebank NO:X15239，5’端被设计上SacI位点，3’端被设计上KpnI位点，SacI-KpnI片段)连接，获得包括基因和终止子的BamHI-KpnI片段；GT1启动子序列(SEQ ID NO:5)5’端被设计上HindIII位点，3’端被设计上BamHI位点，经酶切后获得HindIII-BamHI片段；将上述基因片段(BamHI-KpnI片段)和启动子片段(HindIII-BamHI片段)插入连接至玉米转化载体1300-g10evo的多克隆位点的HindIII和KpnI位点之间，即可获得用于玉米转化的T-DNA载体p1300-GT1-AS(如图1所示)。

将嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)淀粉酶(氨基酸序列为SEQ ID NO:1)分别替换为编码解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliqefacients)淀粉酶(氨基酸序列为SEQ ID NO:2)、地衣芽孢杆菌(Bacillus lichiformmis)淀粉酶(氨基酸序列为SEQ ID NO:3)、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)淀粉酶(氨基酸序列为SEQ ID NO:4)的核苷酸序列，即可构建得到T-DNA载体，上述载体分别记作p1300-GT1-BA、p1300-GT1-BL、p1300-GT1-AO。

将上述T-DNA载体通过电击转化法转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404菌株的感受态细胞中，筛选单克隆菌株并进行酶切鉴定(例如，用HindIII和KpnI双酶切后能够获得与预期大小一致的目标片段)，即可制备得到用于玉米遗传转化的根癌农杆菌菌株。

实施例2、转基因玉米的获得

玉米的转化方法已经比较成熟，例如Frame等描述了利用农杆菌转化玉米的方法(Frame et al.,(2002)Plant Physiol,129:13-22)。取实施例1方法构建的含载体p1300-GT1-AS的根癌农杆菌LBA4404菌株划板，挑单菌落接种，准备转化用的农杆菌。取授粉后8-10天的农大178玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小为1.0-1.5mm)。将上述根癌农杆菌与未成熟胚共培养2-3天(遮光，22℃)。随后转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(含200mg/LTimentin，用于杀灭农杆菌，参照(Frame et al.,(2002)Plant Physiol,129:13-22))，28℃暗培养10-14天。随后将所有的愈伤转到带有终浓度2mM草甘膦的筛选培养基上(Frameet al.,(2002)Plant Physiol,129:13-22)，28℃暗培养2-3周。

转移所有的组织到新鲜的含终浓度2mM草甘膦的筛选培养基上进行继代培养，28℃暗培养2-3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基上(Frame et al.,(2002)Plant Physiol,129:13-22)，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基上(Frame et al.,(2002)Plant Physiol,129:13-22)，26℃光照培养直到根发育完全，然后移植到温室中单株培养。单株植株成活2～3周后，用稀释200倍的农达(41％的草甘膦)水剂喷洒，7天后叶片发黄，枯死的为阴性；和喷清水对照长势一样的为阳性植株。将阳性植株保留并编号，以便后续的鉴定和检测。

上述方法获得的玉米转化株系命名为AS。对于由其他淀粉酶基因构建的T-DNA载体，其遗传转化方法与AS完全一致，区别仅在于农杆菌与未成熟胚共培养的过程中使用的是包含有不同T-DNA载体的根癌农杆菌，获得的玉米转化株系命名为BA、BL、AO。

实施例3、转基因玉米种子中表达的淀粉酶活性测定

采用DNS法(Miller,1959)，测定淀粉酶的活性。具体的实验方法如下：

麦芽糖标准液：用去离子水配制10mM的麦芽糖标准液；

麦芽糖标准曲线的制作，按如下表1加入不同的试剂。

表1麦芽糖标准曲线的制作

摇匀后沸水煮5min，取出后冷却，测定540nm波长下的吸光度，以麦芽糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，如图2所示。

酶液的制备：取表达淀粉酶的玉米种子每10mg加入1ml缓冲液(20mM乙酸钠，pH5.4，250mM NaCl)研磨，研磨后的混合液为酶液。

底物的准备：取1g可溶性淀粉溶于5ml乙酸缓冲液(20mM乙酸钠，pH5.4)中，另取95ml乙酸缓冲液加热煮沸，将溶解可溶性淀粉的乙酸缓冲液加入煮沸的乙酸缓冲液中，边加边搅拌，直至淀粉呈透明的胶体状。

酶活性的测定：将酶液用乙酸缓冲液(20mM乙酸钠，pH5.4)稀释100倍后，取50μl稀释酶液加到450μl的底物中，70℃反应1h后加入1ml DNS溶液终止反应，沸水中煮5min后测定OD₅₄₀，以在70℃每分钟水解产生1μmol还原糖所需的酶为一个酶单位(unit)，根据前面绘制的麦芽糖标准曲线计算酶活性。

采用以上方法对T₁代转基因玉米种子进行淀粉酶活性的测定，筛选出酶活较高的转基因玉米株系。测定结果如表2所示。

表2 T₁代转基因玉米的淀粉酶活性测定

根据测定结果，AS-34的单位酶活最高，达到了每克种子8206单位。

对AS-34转基因玉米的后代进行淀粉酶活性的进一步测试。结果表明，AS-34玉米的T₂、T₃和T₄代玉米中，淀粉酶的活性均在每克种子8000单位以上(表3)，该性状能够稳定遗传，该转化体具有广阔的生产应用前景。

表3转基因玉米AS-34后代的淀粉酶活性测定

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种利用转基因玉米生产淀粉酶的方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 537

<212> PRT

<213> 嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)

<400> 1

Met Ala Ser Ile Asn Arg Pro Ile Val Phe Phe Thr Val Cys Leu Phe

1 5 10 15

Leu Leu Cys Asp Gly Ser Leu Ala Ala Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr

20 25 30

Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp

35 40 45

Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr

50 55 60

Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val

65 70 75 80

Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys

85 90 95

Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala

100 105 110

Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met Gln Val Tyr Ala Asp Val Val

115 120 125

Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly Thr Glu Trp Val Asp Ala Val

130 135 140

Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln

145 150 155 160

Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe Asn Gly Arg Gly Asn Thr Tyr

165 170 175

Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp

180 185 190

Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe

245 250 255

Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp

260 265 270

Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly

275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala Phe Asp Met Ser Thr Leu Met

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu

370 375 380

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Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg

405 410 415

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435 440 445

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450 455 460

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465 470 475 480

Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys

485 490 495

Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp Val Pro Arg Lys Thr Thr Val

500 505 510

Ser Thr Ile Ala Trp Pro Ile Thr Thr Arg Pro Trp Thr Gly Glu Phe

515 520 525

Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val

530 535

<210> 2

<211> 659

<212> PRT

<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliqefacients)

<400> 2

Met Phe Ala Lys Arg Phe Lys Thr Pro Leu Leu Pro Leu Phe Ala Gly

1 5 10 15

Phe Leu Leu Leu Phe His Pro Val Leu Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ser

20 25 30

Ala Glu Thr Ala Asn Lys Ser Asn Glu Leu Thr Ala Pro Ser Ile Lys

35 40 45

Ser Gly Thr Ile Leu His Ala Trp Asn Trp Ser Phe Asn Thr Leu Lys

50 55 60

His Asn Met Lys Asp Ile His Asp Ala Gly Tyr Thr Ala Ile Gln Thr

65 70 75 80

Ser Pro Ile Asn Gln Val Lys Glu Gly Asn Gln Gly Asp Lys Ser Met

85 90 95

Ser Asn Trp Tyr Trp Leu Tyr Gln Pro Thr Ser Tyr Gln Ile Gly Asn

100 105 110

Arg Tyr Leu Gly Thr Glu Gln Glu Phe Lys Glu Met Cys Ala Ala Ala

115 120 125

Glu Glu Tyr Gly Ile Lys Val Ile Val Asp Ala Val Ile Asn His Thr

130 135 140

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145 150 155 160

Trp Thr His Gly Asn Thr Gln Ile Lys Asn Trp Ser Asp Arg Trp Asp

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Thr Ala Ala Glu Phe Gln Tyr Gly Glu Ile Leu Gln Asp Ser Ala Ser

245 250 255

Arg Asp Ala Ala Tyr Ala Asn Tyr Met Asn Val Thr Ala Ser Asn Tyr

260 265 270

Gly His Ser Ile Arg Ser Ala Leu Lys Asn Arg Asn Leu Gly Val Ser

275 280 285

Asn Ile Ser His Tyr Ala Ser Asp Val Ser Ala Asp Lys Leu Val Thr

290 295 300

Trp Val Glu Ser His Asp Thr Tyr Ala Asn Asp Asp Glu Glu Ser Thr

305 310 315 320

Trp Met Ser Asp Asp Asp Ile Arg Leu Gly Trp Ala Val Ile Ala Ser

325 330 335

Arg Ser Gly Ser Thr Pro Leu Phe Phe Ser Arg Pro Glu Gly Gly Gly

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355 360 365

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405 410 415

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Gly Arg Tyr Asp Asn Lys Ala Gly Ala Gly Ser Phe Gln Val Asn Asp

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465 470 475 480

Thr Gly Val Thr His Ser Phe Asn Asp Gln Leu Thr Ile Thr Leu Arg

485 490 495

Ala Asp Ala Asn Thr Thr Lys Ala Val Tyr Gln Ile Asn Asn Gly Pro

500 505 510

Glu Thr Ala Phe Lys Asp Gly Asp Gln Phe Thr Ile Gly Lys Gly Asp

515 520 525

Pro Phe Gly Lys Thr Tyr Thr Ile Met Leu Lys Gly Thr Asn Ser Asp

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Gly Val Thr Arg Thr Glu Glu Tyr Ser Phe Ile Lys Arg Asp Pro Ala

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565 570 575

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Leu Pro His

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<211> 512

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus lichiformmis)

<400> 3

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser Gln

65 70 75 80

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85 90 95

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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180 185 190

Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln Gly

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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405 410 415

Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr Phe

420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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465 470 475 480

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485 490 495

Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln Arg

500 505 510

<210> 4

<211> 498

<212> PRT

<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400> 4

Met Val Ala Trp Trp Ser Leu Phe Leu Tyr Gly Leu Gln Val Ala Ala

1 5 10 15

Pro Ala Leu Ala Ala Thr Pro Ala Asp Trp Arg Ser Gln Ser Ile Tyr

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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85 90 95

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Asn Tyr Gly Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ala Leu Ser Ser Ala Leu His

115 120 125

Glu Arg Gly Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met Gly

130 135 140

Tyr Asp Gly Ala Gly Ser Ser Val Asp Tyr Ser Val Phe Lys Pro Phe

145 150 155 160

Ser Ser Gln Asp Tyr Phe His Pro Phe Cys Phe Ile Gln Asn Tyr Glu

165 170 175

Asp Gln Thr Gln Val Glu Asp Cys Trp Leu Gly Asp Asn Thr Val Ser

180 185 190

Leu Pro Asp Leu Asp Thr Thr Lys Asp Val Val Lys Asn Glu Trp Tyr

195 200 205

Asp Trp Val Gly Ser Leu Val Ser Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu Arg

210 215 220

Ile Asp Thr Val Lys His Val Gln Lys Asp Phe Trp Pro Gly Tyr Asn

225 230 235 240

Lys Ala Ala Gly Val Tyr Cys Ile Gly Glu Val Leu Asp Gly Asp Pro

245 250 255

Ala Tyr Thr Cys Pro Tyr Gln Asn Val Met Asp Gly Val Leu Asn Tyr

260 265 270

Pro Ile Tyr Tyr Pro Leu Leu Asn Ala Phe Lys Ser Thr Ser Gly Ser

275 280 285

Met Asp Asp Leu Tyr Asn Met Ile Asn Thr Val Lys Ser Asp Cys Pro

290 295 300

Asp Ser Thr Leu Leu Gly Thr Phe Val Glu Asn His Asp Asn Pro Arg

305 310 315 320

Phe Ala Ser Tyr Thr Asn Asp Ile Ala Leu Ala Lys Asn Val Ala Ala

325 330 335

Phe Ile Ile Leu Asn Asp Gly Ile Pro Ile Ile Tyr Ala Gly Gln Glu

340 345 350

Gln His Tyr Ala Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Arg Glu Ala Thr Trp

355 360 365

Leu Ser Gly Tyr Pro Thr Asp Ser Glu Leu Tyr Lys Leu Ile Ala Ser

370 375 380

Ala Asn Ala Ile Arg Asn Tyr Ala Ile Ser Lys Asp Thr Gly Phe Val

385 390 395 400

Thr Tyr Lys Asn Trp Pro Ile Tyr Lys Asp Asp Thr Thr Ile Ala Met

405 410 415

Arg Lys Gly Thr Asp Gly Ser Gln Ile Val Thr Ile Leu Ser Asn Lys

420 425 430

Gly Ala Ser Gly Asp Ser Tyr Thr Leu Ser Leu Ser Gly Ala Gly Tyr

435 440 445

Thr Ala Gly Gln Gln Leu Thr Glu Val Ile Gly Cys Thr Thr Val Thr

450 455 460

Val Gly Ser Asp Gly Asn Val Pro Val Pro Met Ala Gly Gly Leu Pro

465 470 475 480

Arg Val Leu Tyr Pro Thr Glu Lys Leu Ala Gly Ser Lys Ile Cys Ser

485 490 495

Ser Ser

<210> 5

<211> 901

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

ttggaaaggt gccgtgcagt tcaaacaatt agttagcagt agggtgttgg tttttgctca 60

cagcaataag aagttaatca tggtgtaggc aacccaaata aaacaccaaa atatgcacaa 120

ggcagtttgt tgtattctgt agtacagaca aaactaaaag taatgaaaga agatgtggtg 180

ttagaaaagg aaacaatatc atgagtaatg tgtgagcatt atgggaccac gaaataaaaa 240

gaacattttg atgagtcgtg tatcctcgat gagcctcaaa agttctctca ccccggataa 300

gaaaccctta agcaatgtgc aaagtttgca ttctccactg acataatgca aaataagata 360

tcatcgatga catagcaact catgcatcat atcatgcctc tctcaaccta ttcattccta 420

ctcatctaca taagtatctt cagctaaatg ttagaacata aacccataag tcacgtttga 480

tgagtattag gcgtgacaca tgacaaatca cagactcaag caagataaag caaaatgatg 540

tgtacataaa actccagagc tatatgtcat attgcaaaaa gaggagagct tataagacaa 600

ggcatgactc acaaaaattc atttgccttt cgtgtcaaaa agaggagggc tttacattat 660

ccatgtcata ttgcaaaaga aagagagaaa gaacaaccaa tgctgcgtca attatacata 720

tctgtatgtc catcattatt catccacctt tcgtgtacca cacttcatat atcatgagtc 780

acttcatgtc tggacattaa caaactctat cttaacattt agatgcaaga gcctttatcc 840

cactataaat gcacgatgat ttctcattgt ttctcacaaa aagcattcag ttcattagtc 900

c 901

Claims (5)

1.一种利用转基因玉米生产淀粉酶的方法，其特征在于所述方法是将淀粉酶的编码基因在GT1启动子作用下转入玉米基因组中，构建生产淀粉酶的转基因玉米；所述淀粉酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之一。

2.如权利要求1所述的利用玉米生产淀粉酶的方法，其特征在于所述启动子GT1核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

3.一种用于权利要求1所述方法的包含淀粉酶基因的玉米遗传转化T-DNA载体。

4.如权利要求3所述的T-DNA载体，其特征在于所述T-DNA载体包含一个由GT1启动子控制淀粉酶基因的表达框，所述表达框包括GT1启动子、淀粉酶基因、终止子和载体；所述载体为pCambia1300。

5.一种玉米细胞，其特征在于所述玉米细胞的基因组上整合了权利要求3所述的T-DNA载体。

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