CN110642929B

CN110642929B - 一种水稻造粉体蛋白转运信号肽及其在花粉育性调控中的应用

Info

Publication number: CN110642929B
Application number: CN201910932412.1A
Authority: CN
Inventors: 唐晓艳; 王梦龙; 彭小群; 严维
Original assignee: Shenzhen Guangsanxi Agriculture Technology Co ltd; Shenzhen Institute of Molecular Crop Design
Current assignee: Shenzhen Guangsanxi Agriculture Technology Co ltd; Shenzhen Institute of Molecular Crop Design
Priority date: 2019-09-29
Filing date: 2019-09-29
Publication date: 2022-11-01
Anticipated expiration: 2039-09-29
Also published as: CN110642929A

Abstract

本发明提供一种水稻造粉体蛋白转运信号肽ASP2及其在花粉育性调控中的应用，属于植物分子生物学和基因工程技术领域。本发明通过克隆水稻武运粳中ASP2基因的信号肽序列，构建重组表达载体和进行遗传转化。在花粉发育后期特异性表达基因启动子PG47的驱动和ASP2的引导下，α‑淀粉酶基因ZM‑AA1可在花粉发育后期特异性表达，从而降解花粉粒中的淀粉，造成水稻转基因花粉不育，有效避免了转基因作物通过花粉将转基因元件传播给其它作物品种。本发明的转运信号肽基因ASP2可用于构建保持雄性不育植株的纯合隐性状态，从而在杂交制种中省去人工去雄步骤，并大量扩繁不育系，减少劳力投入和对产量的影响，具有广阔的应用前景。

Description

一种水稻造粉体蛋白转运信号肽及其在花粉育性调控中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水稻造粉体蛋白转运信号肽及其在花粉育性调控中的应用。该造粉体蛋白转运信号肽基因有助于技术人员通过生物技术获得不育系转基因水稻植株，还可控制植物育性和防止转基因漂移。

背景技术

杂交水稻育种是有效提高水稻产量和品质的主要途径。由于杂交技术的应用，使得增产、抗病、抗虫、抗旱、抗除草剂、耐涝、抗寒、耐盐和抗倒伏等各种性状的聚合都成为了可能。杂交技术的应用依赖于向母本提供花粉的父本，然后通过父本和母本的杂交方法获得杂交种。尽管水稻杂交优势利用是最为经济有效的提高水稻产量和品质的途径之一，但其仍然存在较多的限制因素，例如各种优势性状的聚合难度较大、杂交作物所占的比重较小等。虽然大部分的农作物都尽可能的利用杂种优势，但仍然存在巨大的潜力。

目前应用于水稻生产上的主要杂交育种技术有“三系法”和“两系法”。“三系法”由于受恢保关系的制约，限制了水稻种质资源的利用及强优势组合的选育；而“两系法”由于其不育系育性受环境条件因素的影响调控，在实际制种生产中隐藏着较大的风险。由此可见，传统的“三系法”和“两系法”均存在一定的技术缺陷，一定程度上限制了杂交水稻的进一步发展和推广应用。在这里，雄性不育系资源是严重制约水稻杂交技术发展的关键因素。此外，“三系法”和“两系法”育种方法周期长、见效慢，难以满足生产发展的迫切需求。

为了解决“三系法”和“两系法”等繁殖雄性不育材料的问题，先后有众多科学家想通过利用分子设计方法来解决这一问题。1993年，PLANTGENETIC SYSTEM公司提出专利申请(Williams M,Leemans J..Maintenance ofmale-sterileplants.1993.PatentNo.WO93/25695.)：即在雄性不育植株中转入连锁的育性恢复基因、花粉失活(败育)基因和用于筛选的标记基因，即可获得该不育系植株的保持系，然后通过自交实现不育系和保持系的繁殖。此外，2002年Perez-Prat等人提出通过在雄性不育的植株中转入连锁的育性恢复基因和筛选标记基因两套元件就可获得雄性不育植株的保持系，并进一步可繁育成不育系(Perez-Prat,E.,and van Lookeren Campagne,M.M.(2002).Hybrid seed production and thechallenge of propagating male-sterileplants.TrendsPlant Sci.7,199-203.)。这些构想的提出为精确利用分子生物学技术开展作物分子杂交育种提供了新的思路。当前，有很多研究表明其它功能基因也可能通过生物技术方法构建转基因雄性不育植株。然而，近年来随着转基因作物的种类和种植面积的不断增加，转基因安全问题也受到越来越多人的关注和重视。转基因植物中携带的外源基因可通过天然杂交的方式整合到非转基因品种或其它野生近缘种中，从而造成转基因安全问题。在杂交亲和的植物种类之间，花粉介导的基因漂移是不可避免的。

植物的雄性不育主要表现在花粉败育，它涉及雄性器官缺失、造孢细胞异常、减数分裂异常、胼胝质代谢异常、绒毡层发育异常、花粉壁发育异常、花药开裂异常和花粉萌发失败等各个过程。因此，了解花粉发育的全过程和分子机理是研究植物雄性不育的基础和关键所在。花粉的发育过程较为复杂，它涉及到许多基因的表达调控，其中在花粉发育后期，淀粉能为花粉的萌发和花粉管的延伸储备能量。因此，当花粉粒中的淀粉提前被淀粉酶降解，使得花粉粒能量来源被瓦解，最终遏制花粉的生长，出现畸形花粉粒，导致植物雄性不育。

淀粉酶可以水解淀粉，主要分布在动植物、细菌和真菌中，人们通过利用生物技术，已经克隆出了各种淀粉酶基因(崔锦,马向东(2009)淀粉酶基因的多样性.郑州牧业工程高等专科学校学报,29(2):21-23)，同时对淀粉酶的多样性进行了相关研究。研究表明，淀粉酶基因除了在来源多样性外，其基因结构和功能方面皆呈现多样性。淀粉酶可分为α-淀粉酶、β-淀粉酶和λ-淀粉酶，其中α-淀粉酶属于内切葡萄糖苷酶，可以从淀粉链内部随机切割α-1，4糖苷键，使淀粉水解成麦芽糖和葡萄糖等，并释放能量(Morris G P,Beck P L,Herridge M S,et al.Hapten-induced model of chronic inflammation andulceration in the rat colon[J].Gastroenterology,1989,96(3):795-803)。因此，在成熟花粉中，适量的淀粉酶可水解淀粉，其所产生的能量可提供给花粉的正常发育以及花粉管的萌发和生长。然而，若在花粉形成过程中淀粉酶过表达或沉默表达，都会降低花粉能量代谢水平，导致淀粉积累量不足，从而产生败育花粉。一般来说，花粉粒中的淀粉主要储存在造粉体中。

为了精确水解花粉粒中的淀粉，需要一段造粉体转运蛋白信号肽引导α-淀粉酶进入造粉体内，最终才能使α-淀粉酶在造粉体内发挥功能，从而能够精准有效地降解花粉粒中的淀粉，造成花粉败育。已有研究报道，玉米α-淀粉酶基因ZM-AA1与造粉体蛋白转运信号短肽BT1(TargetPeptide，TP)和花粉发育后期特异性表达启动子PG47重组，可使转基因水稻或玉米植株表达α-淀粉酶，导致转基因花粉败育，从而有效降低花粉介导的基因漂移的风险(Wu,Y.,Fox,T.W.,Trimnell,M.R.,Wang,L.,Xu,R.J.,Cigan,A.M.,Huffman,G.A.,Garnaat,C.W.,Hershey,H.,and Albertsen,M.C.(2016).Development of a novelrecessive genetic male sterility system for hybrid seed production in maizeand other cross-pollinating crops.Plant Biotechnol J.14,1046-1054；Chang,Z.,Chen,Z.,Wang,N.,Xie,G.,Lu,J.,Yan,W.,Zhou,J.,Tang,X.,and Deng,X.W.(2016).Construction ofa male sterility system for hybrid rice breeding and seedproduction using a nuclear male sterility gene.Proc NatlAcad Sci USA.113,14145-14150；Zhang,D.,Wu,S.,An,X.,Xie,K.,Dong,Z.,Zhou,Y.,Xu,L.,Fang,W.,Liu,S.,Zhu,T.,Li,J.,Rao,L.,Zhao,J.,and Wan,X.(2018).Construction of a multi-controlsterility system for a maize male-sterile line and hybrid seed productionbased on the ZmMs7 gene encoding a PHD-finger transcription factor.PlantBiotechnol J.16,459-471)。到目前为止，对造粉体蛋白转运信号短肽的挖掘和利用还较少，尤其在水稻中还知之甚少。这些造粉体蛋白转运信号肽基因可以帮助人们通过生物技术获得不育系转基因水稻植株，特别是在控制育性和转基因漂移等方面提供了新的选择。

发明内容

本发明的目的是提供一种造粉体蛋白转运信号肽基因ASP2在导致花粉败育及制备转基因花粉败育植株中的应用，即一个新的来自水稻的造粉体蛋白转运信号肽基因ASP2，从而可有效避免转基因花粉的污染，以获得新的雄性不育系。

为实现上述目的，本发明提供了一种水稻造粉体蛋白转运信号肽基因ASP2，包括：

a)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

b)在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有造粉体蛋白转运信号肽功能的由a)衍生的核苷酸序列；或

c)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且可表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

d)与a)、b)或c)的核苷酸序列具有90％以上同源性且可表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明还提供与水稻造粉体蛋白转运信号肽基因ASP2核苷酸序列互补的DNA分子。本领域技术人能够容易鉴定并利用与水稻造粉体蛋白转运信号肽基因ASP2核苷酸序列互补的DNA分子，因此，在严格条件下与本发明的造粉体蛋白转运信号肽基因ASP2序列或其片段杂交的序列包括在本发明中。其中，所述核苷酸序列互补，是指在严格条件下能与造粉体蛋白转运信号肽基因的DNA序列杂交。

所述的严格条件是指探针与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交的条件。严格条件具有序列依赖性，且会因环境的不同而有所改变。通过严格控制杂交或洗涤条件，可鉴定出与探针100％互补的靶序列。可通过选择性的调节严格条件以允许存在一些序列错配，从而可探测到较低程度的相似性。

通常的，严格条件是在pH值7.0-8.3下盐浓度低于大约1.5M钠离子，典型的大约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐类)，温度对短探针(如10-50个核苷酸)至少大约30℃，对长探针(如超过50个核苷酸)至少大约60℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可获得严格条件。低严格条件，例如，包括在1MNaCl、30-35％甲酰胺、l％SDS(十二烷基磺酸钠)的缓冲溶液中37℃杂交，在1至2×SSC(20×SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中50-55℃洗涤。中度严格条件，例如，包括在1MNaCl、40-45％甲酰胺、l％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.5至1×SSC中55-60℃洗涤。高度严格条件，例如，包括在1MNaCl、50％甲酰胺、l％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.1×SSC中60-65℃洗涤。非必要的，洗涤缓冲液可含有大约0.1％-1％的SDS。杂交时间大约4-12小时。

特别典型的是杂交后的洗涤，其中关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中Tm是50％互补靶序列与完全配对探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)，M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比，L是杂交体在碱基对中的长度。Tm降低大约l℃，错配就增加1％；因此，Tm杂交或洗涤条件可被调节以与所需同一性的序列杂交。例如，如果探寻的序列具有≥85％的同一性，Tm可以降低10℃。一般地，选择的严格条件是低于特定序列的热解链温度(Tm)大约5℃，且其在规定的离子强度和pH下互补。但是，高度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)1、2、3或4℃的杂交或洗涤；中度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)6、7、8、9或10℃的杂交或洗涤；低度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)11、12、13、14、15或20℃的杂交或洗涤。如果所需的错配程度使Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度以能够使用较高的温度。核酸杂交的指南见于Tijssen(1993)生物化学和分子生物学实验室技术一用核酸探针杂交，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等人编辑(1995)分子生物学现代方法第2章(Greene Publishing andWiley-Interscience,NewYork)。见Sambrook等人(1989)分子克隆:实验室手册(第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press,Plainview,NewYork)。

所述严格条件优选为在0.5％SDS(十二烷基磺酸钠)、6×SSC(柠檬酸钠)的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。

此外，本发明所述的造粉体蛋白转运信号肽ASP2的氨基酸序列为：

a)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

b)将SEQ ID NO:4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO:4衍生的且保持SEQ ID NO:4所示的蛋白功能的蛋白。

本发明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本领域的常规技术，优选这种氨基酸变化为：小的特性改变，即不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常约1-30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一个甲硫氨酸残基；小的连接肽，例如约20-25个残基长。

保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变特定活性的那些氨基酸取代在本领域内是众所周知的，并且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hill在1979年纽约学术出版社(AcademicPress)出版的《Protein》中进行了描述。最常见的互换有Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thu/Ser，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly，以及它们相反的互换。

对于本领域的技术人员而言显而易见地，这种取代可以在对分子功能起重要作用的区域之外发生，而且仍产生活性多肽。对于由本发明的多肽，其活性必需的并因此选择不被取代的氨基酸残基，可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变进行鉴定(如参见，Cunningham和Wells，1989，Science244：1081-1085)。后一技术是在分子中每一个带正电荷的残基处引入突变，检测所得突变分子的影响雄性生育力活性，从而确定对该分子活性而言重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可以通过其三维结构的分析来测定，这种三维结构可由核磁共振分析、结晶学或光亲和标记等技术测定(参见，如deVos等，1992，Science255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol224:899-904；Wlodaver等，1992，FEBSLetters309：59-64)。

因此，与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本发明中。这些序列与本发明序列类似性/相同性典型的大于60％，优选的大于75％，更优选的大于80％，甚至更优选的大于90％，并且可以大于95％。也可以根据更特定的相同性和/或类似性范围定义本发明的优选的多核苷酸和蛋白质。例如与本发明示例的序列有49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性和/或类似性。

本发明提供了一种表达盒，其特征在于，包含在有效连接的调控序列调控下的水稻造粉体蛋白转运信号肽基因ASP2，以调控水稻雄性生育力。

本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子、增强子、前导序列、内含子以及其它可操作地连接到所述影响雄性生育力的基因的调节序列。

具体地，所述调控序列含花粉发育后期特异性启动子和α-淀粉酶基因。更具体地，所述的花粉发育后期特异性启动子为PG47启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述的α-淀粉酶基因为ZM-AA1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。即水稻造粉体蛋白转运信号肽ASP2基因的上游连接有PG47启动子；同时在水稻造粉体蛋白转运信号肽ASP2基因的下游连接有α-淀粉酶基因ZM-AA1，能够有效干扰花粉粒中淀粉积累。

本发明提供一种包含上述水稻造粉体蛋白转运信号肽基因ASP2或表达盒的DNA构建体，以及包含该DNA构建体的重组表达载体。

本发明含有上述的水稻造粉体蛋白转运信号肽基因ASP2的重组表达载体可通过农杆菌介导法或基因枪法法等常规生物学方法转化水稻细胞或愈伤组织获得独立的转基因细胞或组织，从而获得水稻雄性不育的转基因株系。

所述转基因水稻为外源基因在花粉后期特异表达的转基因水稻，优选为授粉/受精能力增强/削弱的转基因植物，更优选为雄性不育转基因水稻。

本发明进一步提供含有上述造粉体蛋白转运信号肽基因ASP2表达盒的水稻花粉。

本发明提供一种水稻造粉体蛋白转运信号肽ASP2在导致花粉败育中的应用，包括：

a)一种表达盒，包含植物造粉体蛋白转运信号肽基因序列，所述序列紧密连接于花粉发育后期特异性启动子和α-淀粉酶基因；

b)将a)所述植物表达盒导入水稻愈伤组织中。

所述植物造粉体蛋白转运信号肽基因具有：

a)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

c)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

d)与a)、b)或c)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

a)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

本发明提供了上述水稻造粉体蛋白转运信号肽或其编码基因或含有该编码基因的生物材料在导致水稻花粉败育中的应用。

本发明提供了上述造粉体蛋白转运信号肽或其编码基因或含有该编码基因的生物材料在制备花粉败育转基因植株中的应用。

本发明所述的生物材料是指表达盒或重组表达载体。

本发明含有上述的水稻造粉体蛋白转运信号肽的重组表达载体可通过农杆菌介导法或基因枪法等常规生物学方法转化水稻细胞或愈伤组织获得独立的转基因细胞或组织，从而获得水稻雄性不育的转基因株系。

本发明所述的生物材料还含有花粉发育后期特异性表达启动子和α-淀粉酶基因。

本发明提供了一种驱动外源基因导致花粉败育表达的方法，包括如下步骤：将造粉体蛋白转运信号肽基因和目的外源基因导入到载体中得到含有造粉体蛋白转运信号肽基因和目的外源基因的表达盒重组表达载体，并将其引入水稻基因组，得到外源基因在花粉中特异表达的转基因水稻。

本发明提供了一种调控水稻花粉发育的方法，其特征在于，使水稻表达上述植物造粉体蛋白转运信号肽基因。

所述的调控是降解水稻花粉中淀粉或诱导水稻雄性不育。

本发明提供了一种降解水稻花粉中淀粉的方法，其特征在于，包括通过表达上述造粉体蛋白转运信号肽功能的基因或包含上述造粉体蛋白转运信号肽功能的基因的表达盒以降解水稻花粉粒中的淀粉。

本发明提供了一种降解水稻花粉中外源基因扩散的方法，将含有上述造粉体蛋白转运信号肽基因的表达盒转化水稻愈伤组织，将转化后的愈伤组织进行诱导分化和生根培养获得转基因花粉败育的转基因植株，使转基因植株花粉无法正常授粉，进而降解水稻花粉中外源基因扩散。

本发明的有益效果为：

1)造粉体蛋白转运信号肽基因ASP2能引导花粉败育基因α-淀粉酶ZM-AA1进入造粉体中，有利于其对转基因水稻花粉粒中淀粉的精准降解，从而可有效遏制转基因花粉的污染。

2)水稻花粉碘染实验表明，α-淀粉酶ZM-AA1基因能在花粉发育后期特异性表达启动子PG47的驱动下和在造粉体蛋白转运信号肽基因ASP2的引导下，精确地作用于花粉粒中的淀粉，最终使得可与花粉和败育花粉的比例为1:1。

3)本发明的造粉体蛋白转运肽基因ASP2，通过与水稻α-淀粉酶基因ZM-AA1和花粉发育后期特异性表达基因启动子PG47的共同调控下，可有效控制转基因的扩散；可用于水稻保持系的保持和不育系的扩繁，并可在杂交制种过程中省去人工去雄步骤，减少了劳动力的投入以及对产量的影响，使其在作物种植资源改良和遗传育种等方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为造粉体蛋白转运肽ASP2基因的重组表达载体pSZYJY-12构建流程图，其中不含ASP2基因的pSZYJY-00载体为对照载体。

图2为含重组表达载体pSZYJY-00和pSZYJY-12的转基因水稻的花粉碘染图，其中左图为野生型对照的碘-碘化钾染色照片，全部花粉可育并呈黑蓝色；中间图为不含ASP2信号肽基因的SZYJY-00转基因水稻花粉的碘-碘化钾染色照片，该转基因植株与野生型表型一样，全部花粉可育并呈黑蓝色；右图为含ASP2信号肽基因的SZYJY-12转基因水稻花粉的碘-碘化钾染色照片，白色箭头所指示呈黄褐色的败育花粉，黑色箭头所指示呈黑蓝色的可育花粉，标尺为100μm。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在没有违背本发明精神和实质的情况下，对本发明中采用的方法、步骤或条件所作出的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的各种技术手段为本领域技术人员所通用的常规手段。

实施例1、水稻造粉体蛋白转运肽基因ASP2获取

1、水稻武运粳RNA的提取

利用Trizol Reagent方法提取水稻武运粳RNA：称取武运粳叶片放入液氮中，取出后用研钵磨成粉末，然后加入1ml Trizol Reagent(TransGen Biotech)，剧烈震荡均匀，接着加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温静置3min；12000rmp，4℃离心15min；从离心机中小心取出离心管，吸取0.6ml上清液转移至另一新的离心管中；向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温下静置10min；12000rmp，4℃离心10min；弃上清，管底出现白色胶状沉淀，加1ml 75％乙醇(用灭菌后DEPC水配置)洗涤，剧烈涡旋，10000rmp，4℃离心5min；弃上清、室温晾干沉淀(沉淀变为无色透明状)；加50ul的RNase-free水溶解沉淀，55℃-60℃孵育10min，置于-70℃保存。

2、水稻武运粳cDNA的获得

以水稻武运粳叶片RNA为模板，利用PrimeScriptRT reagent kit(DRR047A，Takara)试剂盒进行逆转录，具体方法如下：

(1)去gDNA

5×gDNAEraser Buffer 2ul

gDNA Eraser 1ul

RNA 1ug

加RNase free H₂O补齐至10ul

42℃，2分钟

(2)逆转录

加RNase free H₂O补齐至20ul

37℃，2分钟；85℃，5秒

(3)获得武运粳的cDNA分装保存于-20℃。

注：所有实验用品均为RNase-free。

3、水稻造粉体蛋白转运肽基因ASP2的克隆

通过NCBI数据库获得水稻日本晴的造粉体蛋白转运肽基因ASP2(LOC_Os02g07490)的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO：1所示)和氨基酸序列(如序列表中SEQID NO：4所示)。ASP2核苷酸序列是通过设计引物序列(如序列表中SEQ ID NO：5-6所示)，以武运粳叶片的cDNA为模板PCR克隆获得，PCR产物长度为1470bp，产物测序后序列与SEQ IDNO：1一致。引物使用Primer Premier 5软件设计，扩增体系及程序如下：

加ddH₂O补齐至50ul

PCR程序：预变性94℃3min；变性98℃30s，退火55-65℃30s，延伸68℃30s，30个循环；延伸68℃3min。

实施例2、PG47启动子和α-淀粉酶基因ZM-AA1的克隆

PG47启动子(如序列表中SEQ ID NO：2所示)和α-淀粉酶基因ZM-AA1(如序列表中SEQ ID NO：3所示)通过PCR从pZhen18B载体质粒(Chang,Z.,Chen,Z.,Wang,N.,Xie,G.,Lu,J.,Yan,W.,Zhou,J.,Tang,X.,and Deng,X.W.(2016).Construction ofa male sterilitysystem for hybrid rice breeding and seed production using a nuclear malesterility gene.Proc Natl Acad Sci USA.113,14145-14150.)中扩增而来。构建pZhen12载体的目的序列扩增：其中PG47启动子扩增所需引物如序列表中SEQ ID NO：7-8所示，其正向引物带有EcoRI酶切位点，反向引物带有SacI酶切位点；α-淀粉酶基因ZM-AA1扩增所需引物如序列表中SEQ ID NO：9-10所示，其反向引物带有HindIII酶切位点。构建pZhen00载体的目的序列扩增：其中PG47启动子扩增所需引物如序列表中SEQ ID NO：7-8所示，其正向引物带有EcoRI酶切位点，反向引物带有SacI酶切位点；α-淀粉酶基因ZM-AA1扩增所需引物如序列表中SEQ ID NO：11-10所示，其正向引物带有SacI酶切位点，其反向引物带有HindIII酶切位点。引物设计使用Primer Premier 5软件设计，引物上酶切位点左侧的10个碱基为骨架载体重组片段，用于连接载体时进行同源重组连接，扩增体系及程序如下：

加ddH₂O补齐至50ul

PCR程序：预变性94℃3min；变性98℃30s，退火55-65℃30s，延伸68℃2min，30个循环；延伸68℃10min。

实施例3、含水稻造粉体蛋白转运肽基因ASP2的重组表达载体pSZYJY-12的构建

1、构建含水稻PG47启动子的重组表达载体pSZYJY-07

将实施例2中扩增产物PG47启动子插入pCAMBIA1300载体的EcoRI和SacI酶切位点，构建流程如图1所示。即分别用EcoRI和SacI酶切PG47启动子的扩增产物和pCAMBIA1300载体并回收，然后将回收产物连接，连接体系如下：

PG47启动子PCR产物(50ng) 2ul

酶切pCAMBIA1300载体(50ng) 2ul

5×In-Fusion HD Enzyme Premix(TaKaRa) 1ul

50℃连接20min。

取上述全部连接产物热激转化至大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆测序，并将测序正确的阳性克隆所含质粒命名为pSZYJY-07。

2、构建重组表达载体pSZYJY-00

将上述用引物(SEQ ID NO：11-10)扩增的ZM-AA1片段插入pSZYJY-07载体的SacI和HindIII酶切位点，构建流程如图1所示。即分别用SacI和HindIII酶切pSZYJY-07载体，回收ZM-AA1扩增产物和酶切后的pSZYJY-07载体，然后将回收产物连接，连接体系如下：

ZM-AA1 PCR产物(50ng) 2ul

酶切pSZYJY-07载体(50ng) 2ul

5×In-Fusion HD Enzyme Premix(TaKaRa) 1ul

50℃连接20min。

取上述全部连接产物热激转化至大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆测序，并将测序正确的阳性克隆所含质粒命名为pSZYJY-00。

3、构建含水稻ASP2的重组表达载体pSZYJY-12

首先，将造粉体蛋白转运肽基因ASP2(如序列表中SEQ ID NO：1所示)和用引物(SEQ ID NO：11-10)扩增的α-淀粉酶基因ZM-AA1(如序列表中SEQ ID NO：3所示)通过PCR进行拼接。其中拼接扩增所需引物如序列表中SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：10所示，扩增模板采用实施例1中扩增所得的转运肽基因ASP2和实施例2中扩增所得的淀粉酶基因ZM-AA1。扩增体系及程序如下：

加ddH₂O补齐至50ul

然后，将上述ASP2-ZM-AA1拼接片段插入pSZYJY-07载体的SacI和HindIII酶切位点，构建流程如图1所示。即分别用SacI和HindIII酶切pSZYJY-07载体，回收ASP2-ZM-AA1扩增产物和酶切后的pSZYJY-07载体，然后将回收产物连接，连接体系如下：

ASP2-ZM-AA1 PCR产物(50ng) 2ul

酶切pSZYJY-07载体(50ng) 2ul

5×In-Fusion HD Enzyme Premix(TaKaRa) 1ul

50℃连接20min。

取上述全部连接产物热激转化至大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆测序，并将测序正确的阳性克隆所含质粒命名为pSZYJY-12。

实施例4、转基因水稻植株的获得

将pSZYJY-00和pSZYJY-12质粒分别经2.5KV电击转化到农杆菌感受态Agl0中，并在含有卡那霉素和利福平的YEP培养板上28℃培养，用pCAMBIA1300载体特异性引物SEQ IDNO：12-13经PCR验证并挑选出阳性克隆。

将上述农杆菌阳性克隆进行培养，并通过农杆菌介导的遗传转化法侵染水稻武运粳7号(Hiei,Y.,Ohta,S.,Komari,T.,and Kumashiro,T.(1994).Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis ofthe boundaries ofthe T-DNA.The Plant Journal.6:271-282)。经共培养、筛选、分化、生根等环节获取T₀代转基因幼苗，提取DNA，经PCR验证后获得分别含pSZYJY-00和pSZYJY-12质粒的两种转基因阳性植株，自交结实获得T₁代，取T₁代植株进行后续分析。

实施例5、转基因植株花粉碘化钾染色分析

1、花粉碘化钾染色分析

配制碘化钾染色液溶液：取2g KI溶于5-10ml蒸馏水中，然后用适量的无水乙醇溶解1g I₂，待全部溶解后，再加蒸馏水定容至600ml，贮于棕色瓶中备用。

对水稻转基因植株的成熟花粉进行镜检，并对花粉粒育性进行分析，具体方法如下：

a、花粉采集：取充分成熟将要开花的花药，剥除颖壳，取出花药；

b、镜检：取100ul的碘化钾染色液置于载玻片上，再将花药置于载玻片上，用镊子将花药充分捣碎，使花粉粒释放，盖上盖玻片，置于低倍显微镜下观察。染色后呈黑蓝色的花粉粒为可育花粉粒，呈黄褐色的为败育花粉粒。

含SZYJY-12质粒(即含ASP2信号肽基因)的转基因植株的花粉粒经碘化钾染色分析和花粉粒碘染结果(如图2所示)表明：可育花粉与败育花粉符合1:1的分离比例，即约50％花粉表现为雄性不育，不能染成黑蓝色；约50％花粉可染成黑蓝色；而野生型和含pSZYJY-00质粒(即不含ASP2信号肽基因)的转基因植株则是完全雄性可育的，即100％花粉可被成黑蓝色。花粉粒碘染结果表明水稻造粉体蛋白转运肽ASP2能引导α-淀粉酶ZM-AA1在水稻花粉粒中降解淀粉，因此转基因花粉粒在发育过程中，能量供给不足，导致花粉败育。由此证明造粉体蛋白转运肽ASP2能引导α-淀粉酶ZM-AA1降解花粉粒中的淀粉，造成水稻转基因花粉不育，有效阻止转基因作物通过花粉将转基因元件传播给其它野生作物品种。

综上所述，本发明的水稻造粉体蛋白转运肽ASP2能引导α-淀粉酶ZM-AA1降解花粉粒中的淀粉，造成水稻转基因花粉不育，准确性高，有效阻止转基因作物通过花粉将转基因元件传播给其它野生作物品种；可用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态；同时省去了杂交制种过程中去雄的步骤。

序列表

<110> 深圳市作物分子设计育种研究院

深圳广三系农业科技有限公司

<120> 一种水稻造粉体蛋白转运信号肽及其在花粉育性调控中的应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 171

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

atggcgcagc agctctccgc ccccttccgc gccgccgcgg ccgccggatc ccgcgcctcc 60

gccgccgccg ccgatcccgc caaggtgtta cgcttgagaa gcgctggctc agctcagttc 120

acctccatcg cagcttcctc ttcatttgct aggaacattg agccgctgag a 171

<210> 2

<211> 2771

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatctgcacc ggacactgtc tggtggcata 60

ccagacagtc cggtgtgcca gatcagggca cccttcggtt cctttgctcc tttgcttttg 120

aaccctaact ttgatcgttt attggtttgt gttgaacctt tatgcacctg tggaatatat 180

aatctagaac aaactagtta gtccaatcat ttgtgttggg cattcaacca ccaaaattat 240

ttataggaaa aggttaaacc ttatttccct ttcaatctcc ccctttttgg tgattgatgc 300

caacacaaac caaagaaaat atataagtgc agaattgaac tagtttgcat aaggtaagtg 360

cataggttac ttagaattaa atcaatttat acttttactt gatatgcatg gttgctttct 420

tttattttaa cattttggac cacatttgca ccacttgttt tgttttttgc aaatcttttt 480

ggaaattctt tttcaaagtc ttttgcaaat agtcaaaggt atatgaataa gattgtaaga 540

agcattttca agatttgaaa tttctccccc tgtttcaaat gcttttcctt tgactaaaca 600

aaactccccc tgaataaaat tctcctctta gctttcaaga gggttttaaa tagatatcaa 660

ttggaaatat atttagatgc taattttgaa aatataccaa ttgaaaatca acataccaat 720

ttgaaattaa acataccaat ttaaaaaatt tcaaaaagtg gtggtgcggt ccttttgctt 780

tgggcttaat atttctcccc ctttggcatt aatcgccaaa aacggagact ttgtgagcca 840

tttatacttt ctccccattg gtaaatgaaa tatgagtgaa agattatacc aaatttggac 900

agtgatgcgg agtgacggcg aaggataaac gataccgtta gagtggagtg gaagccttgt 960

cttcgccgaa gactccattt ccctttcaat ctacgactta gcatagaaat acacttgaaa 1020

acacattagt cgtagccacg aaagagatat gatcaaaggt atacaaatga gctatgtgtg 1080

taatgtttca atcaaagttt cgagaatcaa gaatatttag ctcattccta agtttgctaa 1140

aggttttatc atctaatggt ttggtaaaga tatcgactaa ttgttctttg gtgctaacat 1200

aagcaatctc gatatcaccc ctttgttggt gatccctcaa aaagtgatac cgaatgtcta 1260

tgtgcttagt gcggctgtgt tcaacgggat tatccgccat gcagatagca ctctcattgt 1320

cacataggag agggactttg ctcaatttgt agccatagtc cctaaggttt tgcctcatcc 1380

aaagtaattg cacacaacaa tgtcctgcgg caatatactt ggcttcggcg gtagaaagag 1440

ctattgagtt ttgtttcttt gaagtccaag acaccaggga tctccctaga aactgacaag 1500

tccctgatgt gctcttccta tcaattttac accctgccca atcggcatct gaatatccta 1560

ttaaatcaaa ggtggatccc ttggggtacc aaagaccaaa tttaggagtg taaactaaat 1620

atctcatgat tcttttcacg gccctaaggt gaacttcctt aggatcggct tggaatcttg 1680

cacacatgca tatagaaagc atactatctg gtcgagatgc acataaatag agtaaagatc 1740

ctatcatcga ccggtatacc ttttggtcta cggatttacc tcccgtgtcg aggtcgagat 1800

gcccattagt tcccatgggt gtcctgatgg gcttggcatc cttcattcca aacttgttga 1860

gtatgtcttg aatgtacttt gtttggctga tgaaggtgcc atcttggagt tgcttgactt 1920

gaaatcctag aaaatatttc aacttcccca tcatagacat ctcgaatttc ggaatcatga 1980

tcctactaaa ctcttcacaa gtagatttgt tagtagaccc aaatataata tcatcaacat 2040

aaatttggca tacaaacaaa acttttgaaa tggttttagt aaagagagta ggatcggctt 2100

tactgactct gaagccatta gtgataagaa aatctcttag gcattcatac catgctgttg 2160

gggcttgctt gagcccataa agcgcctttg agagtttata aacatggtta gggtactcac 2220

tatcttcaaa gccgagaggt tgctcaacat agacctattc accccatttg atcacttttt 2280

tggtccttca ggatctaata gttatgtata atttagagtc tcttgtttaa tggccagata 2340

tttctaatta atctaagaat ttatgatatt ttttaatttt ttatcatgtc tgatgagaat 2400

taacataaag gctcaattgg gtcctgaatt aataatagag tgaaaattaa tccagaggct 2460

ctattagaac cttcaattag taataccaag atatatataa gatagtagag tatagtttaa 2520

atgttggcat tgttcattct ttcttttgtt atttaattta tgctttccac ggtggttagt 2580

ggttacttct gaagggtcca aataatgcat gaagagtttg aggacaagaa gtctgcccta 2640

aaaatagcga tgcaaaggca tggtgtccaa gccatacata tagcgcacta attttatcag 2700

cagaacaatg gtatttatag gtcctagtgc ccaggcaaca agagacacga ataaagcatc 2760

gatcacgaca c 2771

<210> 3

<211> 1336

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 3

gcctgcggcc tggtccaggc acaagtcctc ttccaggggt ttaactggga gtcgtgcaag 60

cagcagggag gctggtacaa caggctcaag gcccaggtcg acgacatcgc caaggccggc 120

gtcacgcacg tctggctgcc tccaccctcg cactccgtct cgccacaagg ctacatgcca 180

ggccgcctat acgacctgga cgcgtccaag tacggcacgg cggcggagct caagtccctg 240

atagcggcgt tccacggcag gggcgtgcag tgcgtggcgg acatcgtcat caaccaccgg 300

tgcgcggaaa agaaggacgc gcgcggcgtg tactgcatct tcgagggcgg gactcccgac 360

gaccgcctgg actggggccc cgggatgatc tgcagcgacg acacgcagta ctcggacggg 420

acggggcacc gcgacacggg cgaggggttc gcggcggcgc ccgacatcga ccacctcaac 480

ccgcgcgtgc agcgggagct ctccgcctgg ctcaactggc tcaggtccga cgccgtgggg 540

ttcgacggct ggcgcctcga cttcgccaag ggctactcgc cggccgtcgc cagaatgtac 600

gtggagagca cggggccgcc gagcttcgtc gtcgcggaga tatggaactc gctgagctac 660

agcggggacg gcaagccggc gcccaaccag gaccagtgcc ggcaggagct gctggactgg 720

acgcgggccg tcggcgggcc cgccatggcg ttcgacttcc ccaccaaggg cctgctgcag 780

gcgggcgtgc agggggagct gtggcggctg cgcgacagct ccggcaacgc ggccggcctg 840

atcgggtggg cgcccgagaa ggccgtcacc ttcgtcgaca accatgacac cgggtcgacg 900

cagaagctct ggccgttccc atcagacaag gtcatgcagg gctacgccta catcctcacc 960

catccaggag tcccctgcat tttctacgac cacatgttcg actggaacct gaagcaggag 1020

atatccacgc tgtctgccat cagggcgcgg aacggcatcc gcgccgggag caagctgcgg 1080

atcctcgtgg cggacgcgga cgcgtacgtg gccgtcgtcg acgagaaggt catggtgaag 1140

atcgggacaa ggtacggcgt gagcagcgtg gtcccgtcgg atttccaccc ggcggcgcac 1200

ggcaaggact actgcgtctg ggagaaagcg agcctccgcg tcccggcggg gcgccaccta 1260

tagcagctca gattgctcag tcttgtgctg cattgcaaac acagcagcac gacactgcat 1320

aacgtctttt ccttga 1336

<210> 4

<211> 57

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 4

Met Ala Gln Gln Leu Ser Ala Pro Phe Arg Ala Ala Ala Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ser Arg Ala Ser Ala Ala Ala Ala Asp Pro Ala Lys Val Leu Arg Leu

20 25 30

Arg Ser Ala Gly Ser Ala Gln Phe Thr Ser Ile Ala Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Phe Ala Arg Asn Ile Glu Pro Leu Arg

50 55

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atcacgacac gagctcatgg cgcagcagct ctccgccccc t 41

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggccgcaggc tctcagcggc tcaatgttcc tagcaa 36

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccatgattac gaattcagct tgcatgcctg caggtcgact c 41

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cccgggtacc gagctcgtgt cgtgatcgat gctttattcg t 41

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agccgctgag agcctgcggc ctggtccagg cacaag 36

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggccagtgcc aagctttcaa ggaaaagacg ttatgcagtg t 41

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atcacgacac gagctcatgg cctgcggcct ggtccaggca caag 44

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cagcgtctcc gacctgat 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cttctgcggg cgatttgt 18

Claims

1.一种含有水稻造粉体蛋白转运信号肽的表达盒在水稻花粉育性调控中的应用，所述的水稻造粉体蛋白转运信号肽为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的多肽，所述表达盒包含花粉发育后期特异性表达启动子和α-淀粉酶基因，以及水稻造粉体蛋白转运信号肽的编码基因。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的水稻造粉体蛋白转运信号肽的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的发育后期特异性表达启动子为PG47启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述的α-淀粉酶基因为ZM-AA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.一种降解水稻花粉中淀粉的方法，其特征在于，包括通过表达权利要求1所述的表达盒以降解水稻花粉粒中的淀粉。

5.一种影响水稻花粉发育的方法，其特征在于，包括利用权利要求4所述降解水稻花粉中淀粉的方法以影响花粉形成。

6.一种诱导水稻雄性不育的方法，其特征在于，包括利用权利要求5所述影响水稻花粉发育的方法以产生部分雄性不育植物。

7.一种影响水稻雄性生育力的方法，其特征在于，包括利用权利要求6所述诱导水稻雄性不育的方法以产生部分雄性不育水稻。

8.一种阻断水稻花粉中外源基因扩散的方法，其特征在于，将权利要求1所述表达盒转化水稻愈伤组织，将转化后的愈伤组织进行诱导分化和生根培养来获得转基因花粉败育的转基因水稻，使转基因水稻花粉无法正常授粉，进而降解水稻中外源基因扩散。