CN105695477B - 雄性不育突变体oss125及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种雄性不育突变体oss125及其应用方法，具体通过EMS诱变籼稻品种黄华占获得一份雄性不育突变体oss125，控制oss125突变体雄性不育性状的基因是一个隐性核基因。采用改进的Mutmap方法，结合二代测序，发现该基因与已报道的复制蛋白基因OsRPA1a等位。具体地，oss125突变体在OsRPA1a外显子上发生一个点突变，导致水稻完全雄性不育表型，与前人报道的T‑DNA插入突变体表型有差异。T‑DNA插入突变体表现为部分雄性不育和完全雌性不育，而我们的突变体雄性完全不育，而雌性发育基本正常，提示该基因在雄性器官和雌性器官中的作用方式或位点可能存在差异。本发明对加快利用雄性不育株系进行育种的进程具有重要意义。

Description

雄性不育突变体oss125及其应用

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及植物杂交育种方法，包括不育系繁殖和杂交种子制备，更具体地涉及一个雄性不育突变体及其在杂交育种中的应用。

技术背景

水稻是我国重要的粮食作物。从上世纪80年代起，以雄性不育为基础的杂交水稻育种技术极大的提高了水稻的单产，在保障我国粮食安全中发挥关键性作用。杂交水稻制种是用恢复系作父本和不育系杂交生产杂交种子的过程。利用作物杂种优势是提高作物产量的重要途径，而作物雄性不育是有效利用杂种优势的前提和基础。水稻育性是影响水稻产量的关键因素，为了提高产量和获取杂种优势，在杂交育种过程中，对雄性不育和雄性可育的遗传操作是一个关键步骤。利用雄性不育系生产杂交种，不仅能节省大量去雄的人工，降低种子成本，而且可以减少因去雄不净所造成的混杂，从而提高种子纯度，充分发挥杂种优势的作用。水稻雄性不育的发现与利用为增加水稻产量，改进品质，增加抗性和适应性提供优异种源，因而在植物育种上具有重要的应用价值。

植物雄性不育是指在有性繁殖过程中不能产生正常可育雄配子体的遗传现象，在广泛的开花植物中普遍存在。水稻作为模式植物，雄性生殖发育的显著特征是形成6枚雄蕊，任何参与雄蕊发育、孢原细胞分化、减数分裂、小孢子的有丝分裂、花粉分化或开花等过程基因的突变，均有可能引起花药发育异常，最终导致雄性不育(Ma H.Molecular geneticanalysis of microsporogenesis and microgametogenesis in floweringplants.Annual Review of Plant Biology.2005,56:393-434.)。

雄性不育可以分为细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)和细胞核雄性不育(genic male sterility，GMS)。细胞质雄性不育的实质是细胞质基因组与细胞核基因组竞争传递自身遗传物质的结果。细胞核雄性不育由核基因突变产生，突变性状可通过雌配子或者雄配子遗传。遗传分析表明，大多数雄性育性是由核基因控制的(Sunok M,Ki-Hong J,Do-Eun L,Dong-Yeon L,Jinwon L,Kyungsook An,Hong-Gyu K,GynheungAn.The rice FON1gene controls vegetative and reproductive development byregulating shoot apical meristem size.Molecules and Cells.2006,21(1):147-152)。

近年来，随着水稻基因组测序的完成，水稻突变体库的构建以及基因表达谱分析等工作的开展，水稻花粉发育的分子机理研究起取得了一定的进展，发现了一些控制水稻花器官数目基因，如FON1～4^[、OsLRK1，控制花粉囊细胞的分开和分化基因MSP1、OsTDL1A，控制雄性减数分裂基因PAIR1、PAIR2、PAIR3、MEL1、MIL1、DTM1、OsSGO1等，促进花粉粒发育的关键基因CYP703A3、CYP704B2、WDA1、OsNOP、DPW、Ugp2、MTR1等。这些基因涉及多个方面，包括小孢子母细胞的减数分裂、绒毡层发育及降解，以及花粉细胞壁形成等方面。根据不育基因的功能和调控时期的差异，可将水稻隐性核雄性不育基因主要分为3类：1)小孢子母细胞发育时期不育基因；2)绒毡层发育时期不育基因；3)花粉囊和花粉外壁发育时期不育基因。

目前水稻突变体基因克隆最常用的技术有图位克隆、同源克隆、转座子或T-DNA标记法、表达序列标签法、差异表达基因克隆等技术。随着高通量测序技术的发展，2012年，日本科学家提出了基于重测序方法的Mutmap基因克隆技术(Abe A,Kosugi S,Yoshida K,Natsume S,Takagi H,Kan-zaki H,Matsumura H,Yoshida K,Mistsuoka C,Muluneh T,Innan H,Cano L,Kamoun S,Teraushi R.Genome sequencing reveals agronomicallyimportant loci in rice using MutMap.Nature Biotechnology.2012,30(2):174-178)，该技术将突变体与野生型亲本进行杂交，产生F₂代分离群体，随机取20-30个突变个体，分别提取基因组DNA，等量混合后，利用二代测序技术，结合分子生物学与生物信息学分析测序数据，找出候选突变基因，大大缩短了基因克隆时间，降低了基因克隆成本。

到目前为止，涉及水稻花药发育和花粉形成的一些关键基因已被鉴定和研究，这些基因的突变导致雄性不育的表型。但对水稻雄配子体发育过程和调控机制并未完全探明，水稻雄性不育基因的定位与克隆有助于更全面地了解雄配子体发育的分子机制，加快利用雄性不育株系进行育种的进程。

本研究通过EMS诱变水稻品种黄华占，筛选得到一个由单个隐性核基因控制的雄性不育突变体，命名为oss125，对其进行初步的表型鉴定、遗传分析及遗传背景鉴定，并利用改进的MutMap方法(陈竹锋,严维,王娜,张文辉,谢刚,卢嘉威,简智华,刘东风,唐晓艳.利用改进的MutMap方法克隆水稻雄性不育基因.遗传.2014,36(1):85-93)，结合HRM及基因序列分析，成功定位并克隆了该雄性不育基因。本发明还阐述了所述雄性不育基因的应用范围和应用方法。

发明内容

本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。

除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。

本发明包括一种育性相关基因及其核苷酸和蛋白序列，还包括通过操作该基因在调控植株雄性生育力中的应用。非限制性地举例而言，下文描述的任何方法都可与本发明所提供的相应核苷酸序列一起使用，例如，将所述育性基因的突变体序列引入植株以导致植株雄性不育、使植株内源序列突变、向植株中引入该序列的反义序列、使用发卡形式、或将其与其它核苷酸序列连接起来调控植株的表型，或者是本领域技术人员已知的可用于影响植株的雄性生育力的多种方法中的任一方法。

本发明利用改进的Mutmap方法克隆得到了一个雄性不育突变基因(OsS125)，该基因与OsRPA1a(LOC_Os02g53680)是等位基因。OsRPA1a是一个复制蛋白A(Replicationprotein A,RPA)，是真核生物中高度保守的单链DNA结合蛋白，由三个亚基RPA1,RPA2和RPA3组成的一个稳定的复合体(Wold M S.Replication protein A:a heterotrimeric,single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNAmetabolism.Annual Review of Biochemistry.1997,66:61-92)。在酵母和人中，RPA为DNA代谢的多个过程所必需，如DNA复制，DNA修复以及同源重组等。大部分真核生物包括真菌、昆虫和脊椎动物等编码RPA各亚基的RPA基因都只有一个，而在拟南芥和水稻中含有多个RPA基因。水稻中含有3个RPA的旁系同源基因，包括RPA1，RPA2和RPA3。前人研究已经在体内和体外证明它们在生化水平上可以互作，但它们确切的功能并不清楚。通过T-DNA插入突变体研究发现，osrpa1a突变体在营养生长期中表型正常但在生殖生长期中不育。细胞学分析表明该突变体雌性母细胞中没有形成胚囊，同时雄性母细胞在减数分裂后期I出现异常的染色体片段，植株表现为雄性半不育和雌性完全不育。该结果说明OsRPA1a在水稻雄配子和雌配子发育过程中都起着重要作用，由于T-DNA插入对OsRPA1a蛋白功能有不同层度的影响，说明OsRPA1a蛋白可能有两个功能区，分别控制雄性和雌性发育。本发明中获得的oss125突变体的不育性状是由于OsRPA1a基因外显子上有一个氨基酸的置换，该突变可能仅影响了OsRPA1a蛋白对雄性器官发育调控，而对雌性器官发育没有明显影响，提示该基因在雄性器官和雌性器官中发挥作用的方式或位点可能存在差异。

利用植物杂种优势可以显著地提高作物产量和品质。目前，杂种优势育种已经成为许多农作物的主要育种方法，并被广泛地应用于作物商业化育种。其中，作物雄性不育系的选育是杂种优势利用的关键步骤，利用雄性不育系是提高农作物杂种优势利用的最为有效的途径之一，水稻隐性雄性核不育材料主要应用于作物育种的群体改良上，实现优质基因叠加，优化育种材料的遗传背景，从而培育出优良新品种或育种亲本。本研究中的水稻突变体材料oss125所携带的隐性核不育基因不受光温条件的影响，花粉以碘败为主，雌蕊正常，开花习性正常，可培育为新的不育系或与各恢复系配制培育优良新品种。

本发明还提供了一种OsS125基因的不育突变体序列SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6及其雄性不育突变体材料。更具体地，所述雄性不育突变体材料是通过突变水稻内源的OsS125基因，使其基因编码区的第663位碱基发生变化，更具体地是从A突变为C，相应编码的蛋白第221位谷氨酰胺(Gln)突变为脯氨酸(Pro)，使该植物体丧失雄性育性的过程。所述“突变”包括但不限于以下方法，如用物理或化学的方法导致的基因突变，化学方法包括用EMS等诱变剂处理所导致的诱变，所述突变还可以是点突变，也可以是DNA缺失或插入突变，还可以是通过RNAi、定点突变等基因沉默手段产生。

具体地，本发明还提供了一种水稻雄性不育突变体，其含有突变后的雄性不育基因，所述突变后的雄性不育基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4或6所示，氨基酸序列如SEQID NO:5所示。与野生型相比，在不育突变体中，该基因编码区的第663位碱基发生变化，从A突变为C，导致相应编码的蛋白第221位谷氨酰胺(Gln)突变为脯氨酸(Pro)。本领域技术人员应该知晓，可以将所述核苷酸序列SEQ ID NO:4或6构建到植物表达载体，进行植物转化，从而获得新的转基因的雄性不育突变体材料。

本发明还包括含有OsS125基因和/或其启动子的构建体，所述构建体包括通常所说的载体或表达盒。所述构建体中的启动子可以是天然启动子或被取代的启动子，其将驱动所连核苷酸序列在植株中的表达。构建体中的启动子可以是诱导型启动子。当将OsS125基因的核苷酸序列与另一个启动子相连，优选的是，该启动子在花粉发育早期充分驱动该序列的表达,例如可以在花粉发育的P9期特异性表达。具体地，可使用的启动子的种类包括组成型病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子，或玄参花叶病毒35S启动子,或泛素启动子。

组织特异表达启动子可用于靶向特定的植物组织中增强转录和/或表达。启动子可在目标组织中表达也在其它植物组织中表达，可在目标组织中强烈表达以及比其它组织程度低得多的表达，或者可高度优选在目标组织中表达。在一种实施方式中，启动子是偏好在植物的雄性或雌性组织中特异表达的类型。本发明不必须在方法中使用任何特定的雄性组织优先型启动子，本领域技术人员已知的很多此类启动子中的任何都可以使用。例如5126启动子、MS45启动子、MS26启动子、BS92-7启动子、SGB6调控元件和TA29启动子等，其偏好于指导其连接的基因在植物雄性组织中的表达。某些构建体中还可以包括配子组织优先表达启动子。雄性配子优先表达启动子包括PG47启动子以及ZM13启动子。

上述构建体中还可包括其它组分，这主要取决于载体构建的目的和用途，例如可进一步包括选择标记基因、靶向或调控序列、稳定序列或引导序列、内含子等。表达盒还将在目标异源核苷酸序列的3’端包括在植物中具有功能的转录和翻译终止子。终止子可以是本发明所提供基因的终止子，也可以是来自外源的终止子。更具体地，上述终止子可以是胭脂氨酸合酶或章鱼碱合酶终止区域。

在希望将异源核苷酸序列的表达产物引向特定细胞器，例如质体、造粉体，或者引向内质网，或在细胞表面或细胞外分泌的情况下，表达盒还可包含用于编码转运肽的核苷酸序列。此类转运肽是本领域所公知的，其包括但不限于Rubisco的小亚基、植物EPSP合酶、玉米Brittle-1叶绿体转运肽等。

在制备表达盒的过程中，可对多种DNA片段加以操作，以提供处于合适方向，或是处于正确读码框中的DNA序列。为达到此目的，可使用衔接子或接头，将DNA片段连起来，或者进一步包括其它操作，以提供方便的限制性酶切位点等。

进一步地，本发明所提供的构建体中还可包括选择标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。所述选择标记基因包括赋予抗生素抗性或对除草剂抗性的基因。合适的选择标记基因包括但不限于:氯霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，链霉素抗性基因，奇霉素抗性基因，磺胺类抗性基因，草甘磷抗性基因，草丁嶙抗性基因。所述选择标记基因还可以是红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙p1等基因。

本发明所提供的表达盒或载体可被插入质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌。当宿主细胞是植物细胞时，表达盒或载体可被插入被转化的植物细胞的基因组中。插入可以是定位的或随机的插入。优选地，插入通过诸如同源重组来实现。另外，表达盒或载体可保持在染色体外。本发明的表达盒或载体可存在于植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中。优选地，本发明的表达盒或载体被插入植物细胞核的染色体DNA中。

在某些应用实施方式中，可以应用本发明所提供的OsS125基因来实现oss125雄性不育突变体的繁殖和保持。

具体地，上述雄性不育系的繁殖和保持，是指以纯合隐性核雄性不育突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至该不育突变体受体植株中。所述3个目标基因分别是育性恢复基因、花粉失活基因和颜色标记筛选基因。其中，育性恢复基因可使不育的转化受体育性恢复，花粉失活基因可使含有转化的外源基因的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地、稳定地生产不育系。

根据本发明的一个实施例，可以以水稻核隐性不育oss125/oss125突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至该不育系：其中，育性恢复基因OsS125可使转化受体育性恢复；花粉失活基因Zm-PA可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力；荧光色选基因RFP(r)用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地稳定地生产不育系。由于该技术利用生物技术生产非转基因产品，解决了水稻杂交制种过程中面临的瓶颈问题，即三系法资源利用率低而两系法中不育系育性不稳定的问题(详细方法可参阅PCT专利PCT/CN2013/086657)。

更具体地，本发明所提供的用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态的方法，所述方法包括：a)提供第一植株，其包含OsS125基因的纯合隐性等位基因，并且其是雄性不育的；b)向第一植株中引入下述构建体，形成第二植株，所述第二植株包含OsS125基因的纯合隐性等位基因和所述构建体，且构建体在第二植株中为半合状态，所述构建体包含：

i)第一核苷酸序列，其包含OsS125核苷酸序列，当在第一植株中表达时其将恢复雄性生育力；

ii)第二核苷酸序列，当其表达时，会抑制所述第二植株中可育雄性配子的形成或功能，具体为花粉失活基因ZM-PA；以及

c)用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，以产生保持了所述第一植株纯合隐性状态的后代。

本发明的转基因植物使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法制备。任何方法可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射，等。在本发明的具体实施方式中，本发明使用了基于土壤杆菌的转化技术(可参见Horsch RB等(1985)Science 225：1229；WhiteFF，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Academic Press，1993，pp.15-38；Jenes B等.Techniquesfor Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Academic Press，1993，pp.128-143，等)。土壤杆菌菌株(例如根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌)包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，所述质粒和元件在用土壤杆菌转染后被转移至植物，而T-DNA被整合进植物细胞的基因组中。T-DNA可位于Ri-质粒或Ti-质粒上，或独立地包含在所谓的双元载体中。土壤杆菌介导的转化方法描述于例如中。土壤杆菌介导的转化最适合双子叶植物，但是也适合单子叶植物。土壤杆菌对植物的转化描述于例如中。转化可导致瞬时或稳定的转化和表达。尽管本发明的核苷酸序列可被插入落入这些广泛种类中的任何植物和植物细胞中，但是其尤其适用于作物植物细胞。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明提供了一种水稻花粉发育基因以及基于该基因突变所产生的雄性不育系，该不育系的育性稳定、不受环境条件影响、能够被野生型转基因恢复。该基因以及该基因突变产生的不育系为构建第三代杂交育种体系提供了必要的元件，该基因突变产生的雄性不育系，用来生产杂交种子，对于突破并改良现有的“三系”和“两系”杂交技术有重要意义。

附图说明

图1是突变体的表型特征，A:野生型HHZ(左)与突变体oss125(右)株叶形态；B:HHZ(左)与oss125(右)小穗结实情况；C:HHZ花药形态；D:oss125花药形态；E:HHZ花粉染色；F:oss125花粉染色。

图2是SNP位点在水稻染色体上的分布情况。

图3是OsS125基因结构及突变位点信息。

图4是OsS125基因在水稻各组织器官中的表达。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1.突变体材料的获得

2011年在深圳采用EMS处理籼稻品种黄华占(处理浓度为0.7％，处理时间12h)，建立突变体库，从突变体库中筛选到1份雄性不育突变体oss125。该突变体的性状经过多代自交已稳定遗传，在大田条件下观察和比较突变体与野生型整个生长周期植株形态，发现无明显差异，仅出现花粉不育，最终导致雄性不育性状。本研究所采用的野生型及突变体的遗传背景均为籼稻品种黄华占。所有水稻材料种植于深圳市作物分子设计育种研究院光明试验基地，常规管理。

实施例2.植株表型鉴定及花粉育性观察

oss125突变体在营养生长期与野生型黄华占相比，植株形态上没有明显的差异。在灌浆后期，野生型黄华占能正常结实，而oss125突变体最明显的特征就是自然结实率低(图1A,B)，仅有5％左右，套袋自交结实率为0，说明自然状态下的结实是异花授粉的结果。解剖观察野生型黄华占与oss125突变体的成熟颖花，发现突变体的花药略微泛白，雌蕊形态发育正常(图1C,D)。

采用I₂-KI染色方法鉴定水稻花粉育性。在抽穗期，选取已抽出1/3主穗或较大分蘖穗，随机选取穗子中上部未开放的颖花，用镊子将6枚花药取出置于载玻片上，并小心将花药夹碎使花粉粒释放浸于适量的1％I₂-KI染液中1～2min，去除花药壁等残留物后置于光学显微镜下观察并拍照，根据花粉粒形态和染色状况，随机选取5个视野，利用Image J软件统计不同视野下碘败型和正常染色的花粉数目及所占的比率。染色结果表明，突变体以碘败型花粉为主，有少量花粉能正常染色(图1E,F)，随机挑选5个视野，分别统计了不同视野下的花粉染色情况，正常染色的花粉平均约占15％，～85％的花粉为碘败型。

实施例3.水稻雄性不育基因克隆

以oss125突变体为母本，野生型黄华占为父本，杂交F1代表现为可育，F2群体中正常可育植株与不育植株的比率为267:73，卡方(χ2)检验其分离比符合3∶1(χ2＝1.95<χ2(0.05,df＝1)＝3.84)，表明oss125的突变性状由单隐性核基因控制，该基因命名为OsS125。

将雄性不育突变体材料oss125与野生型黄华占杂交获得F₁个体，F₁自交获得F₂分离群体，F₂群体出现表型分离，并从F₂群体中随机取30株具有雄性不育表型的植株，分别取其叶片提取DNA，等量混合后形成DNA池。基因组DNA采用Qiagen DNA提取试剂盒(DNeasyPlant Mini Kit，货号：69106)提取，具体操作步骤参见说明书。

等量混合突变体DNA，采用超声波方法将其随机片段化，挑选长度为200-300bp的片段，在两端加上特异的测序接头进行建库，建库方法参考Illumina Paired-End DNASample Prep kit。之后采用Hiseq 2000平台进行高通量测序。测序原始数据经过质量监控，去除低质量(平均质量值<20，或含N>10％)及接头污染的数据后，利用SOAP2软件(Li RQ,Yu C,Li Y R,Lam T W,Yiu S M,Kristiansen K,Wang J.SOAP2:an improvedultrafast tool for shortread alignment.Bioinformatics.2009,25(15):1966-1967)，将数据比对到日本晴参考基因组(MSU v7)上，筛选比对到染色体唯一位置的短序列，采用SOAPsnp软件(Li R Q,Li Y R,Fang X D,Yan H M,Wang J,Wang J.SNP detection formassively parallel whole-genome resequencing.Genome Research.2009,19(6):1124-1132)寻找突变体与日本晴参考基因组间的单核苷酸多态性(SNP)。采用改良的MutMap方法进一步分析(Abe A,Kosugi S et al.，Genome sequencing reveals agronomicallyimportant loci in rice using MutMap.Nature Biotechnology.2012,30(2):174-178；陈竹锋,严维,王娜,张文辉,谢刚,卢嘉威,简智华,刘东风,唐晓艳.利用改进的MutMap方法克隆水稻雄性不育基因.遗传.2014,36(1):85-93)，筛选在突变体oss125中特异存在而其他雄性不育突变体中为野生型基因型的SNP位点，通过计算SNP index，挑选基因组上短序列支持数>＝10且连续分布的高SNP index位点(>＝0.8)，得到候选区域。针对候选区域内的高SNP index的位点，综合考虑SNP所在区域及所在基因的功能，确定该SNP是否造成氨基酸或RNA剪切的变化，最终得到候选位点。

在本发明中，高通量测序共获得了139,233,622条短序列(长度为100bp)，覆盖整个参考基因组约32.3X，去除低质量和接头污染的数据，采用比对软件SOAP2，以日本晴(MSUv7)为参考基因组，将序列比对到参考基因组上，覆盖度为87.39％，比对上唯一位置的短序列数目为84,456,098。利用SOAPsnp软件寻找突变体与参考基因组之间的单核苷酸多态性(SNP)，共找到1,382,732个高质量SNP。采用改良的Mutmap方法进一步分析，筛选突变体oss125中特异的SNP位点，计算SNP index值，结合各位点在染色体上的分布情况(图2)，筛选SNP index>＝0.8且连续分布的候选区间，最终在二号染色体得到4个突变候选位点(表1)。其中三个候选位点位于基因间，仅有一个位于OsS125基因(LOC_Os02g53680)外显子区。

由于候选位点只有一个位于基因的外显子区(LOC_Os02g53680)，其余三个均位于基因间区，因此将LOC_Os02g53680作为候选基因进行基因分型验证。随机挑取了22个雄性不育单株与44个表型可育单株，利用HRM引物对LOC_Os02g53680突变区进行特异性扩增，采用Light Scanner软件分析数据。SNP分型结果(表2)显示该突变位点与不育表型出现共分离，由此推断LOC_Os02g53680编码的蛋白第221位氨基酸突变(谷氨酰胺突变为脯氨酸)是导致oss125突变体产生雄性不育表型的原因。更具体的是该基因LOC_Os02g53680编码区的第663位碱基A突变为C，导致编码的蛋白第221位谷氨酰胺(Gln)突变为脯氨酸(Pro)。

表1候选基因及注释信息

表2候选基因OsS125(LOC_Os02g53680)HRM基因分型结果

本发明所提供的OsS125基因(LOC_Os02g53680)位于2号染色体，cDNA全长1971bp，包含有2个外显子和一个内含子，编码一个由656个氨基酸组成的蛋白(图3)。其中，OsS125基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其从翻译起始位点ATG到终止位点TAG的基因组DNA序列如SEQ ID NO:3所示。此外，本发明中还提供了一个具有完全雄性不育功能的突变体基因，所述突变体基因的cDNA序列如SEQ ID NO:4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，基因组DNA序列如SEQ ID NO:6所示。

Blast分析发现OsS125基因(LOC_Os02g53680)与前人报道的OsRPA1a是等位基因(Chang Y X et al.，Replication protein A(RPA1a)is required for meiotic andsomatic DNA repair but is dispensable for DNA replication and homologousrecombination in rice.Plant Physiology.2009,151(4):2162-2173)。Chang Y X等人的研究结果显示，T-DNA插入OsRPA1a基因导致突变个体不育，该突变体在营养生长期表型正常，但生殖生长期表现不育，不育类型为部分雄性不育和完全雌性不育，通过对水稻T-DNA插入突变体研究，发现OsRPA1a基因为水稻减数分裂和体细胞DNA修复所必需，但对DNA复制和同源重组非必需。而本发明所获得的oss125基因上的点突变仅导致水稻完全雄性不育，对雌性生殖器官的育性没有明显影响。

本发明所述的HRM是指高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution Melting)，简称HRM，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新方法，可以迅速的检测出核苷酸片段中单碱基的突变。选取F₂群体中具有雄性不育表型及正常可育表型的植株，根据测序分析得到的结果，针对候选基因设计引物(表3)，扩增目标片段，每个反应体系包括1μl 10×PCR buffer，0.1μl dNTP mixture(2.5μM each)，0.15μl forward primer(10μM)，0.15μl reverse primer(10μM)，0.1μl10×LC Green Plus，10ng模版DNA，0.1μlrTaq DNA Polymerase，补水至10μl，每一反应体系均加入25μL矿物油，以防蒸发及污染。PCR反应条件如下：95℃变性3min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸10s，35个循环。PCR产物转移至Light Scanner中进行扫描分型，根据溶解曲线的变化形态将检测样品区分为杂合体、纯合野生型，纯合突变体。

实施例4.OsS125基因表达模式分析

在野生型黄华占抽穗期分别取根、茎、叶片、外稃、内稃、雌蕊、花药(stage12)，样品组织在液氮中进行研磨后，采用TRIzol(Invitrogen)法分别提取总RNA，具体操作步骤参见说明书。采用

ⅢFirst Strand Synthesis Kit试剂盒(Invitrogen)反转录得到cDNA，具体操作步骤参见说明书。

根据水稻OsS125以及Actin基因的cDNA序列设计引物(表3)，以野生型黄华占成熟的根、茎、叶片、外稃、内稃、雌蕊、花药的cDNA为模板，利用Tarkara SYBR Premix Ex Taq^TMII(Tli RNaseH Plus)code no.RR820试剂盒在ABI PRISM 7500实时PCR系统上进行定量PCR分析。将cDNA稀释10倍后进行PCR扩增，每个反应包括5μl的

Premix ExTaq^TMII，4μl的cDNA模板，0.2μl的50×ROX Reference Dye II以及0.4μl基因特异引物(10μmol/L)，总体积10μl。PCR反应采用两步法，反应条件如下：95℃下变性30s，95℃下变性变性5s，60℃下退火延伸34s，40个循环。每个样品进行4次重复，采用2^-ΔCT方法计算目标基因的相对表达量，其中ΔC_T＝C_{T目标基因}-C_TActin。

表3本研究所用的引物

RT-PCR分析表明OsS125在野生型黄华占的表达没有组织特异性，在各个器官中均有表达，其中在外稃的表达量最高(如图4)。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市作物分子设计育种研究院

湖南旺华生物农业科技有限公司

<120> 雄性不育突变体oss125及其应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1971

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza Sativa）

<400> 1

atggcgatgg cgaggctgac gccgaacggc gtggcggcgg cgctggcggg ggacacgaac 60

ctgaagccgg tgctgcagat cgtcgagctg cggggcgtcc aggtcaacgg cgcgggcgtc 120

acgcgcgggg agaggttccg ggcggtggtc tccgacggca ccgccgcgtc ctccgcgctc 180

ttcgccgcgc agctcagcga ccacgcccga tccggcgccc tccgacgcgg cagcattgtg 240

cagctcagcg agtacgtcat caacgaagtc ggccccagaa ggattattgt cattctgaac 300

ctggaagttc ttgtttcgga gtgtgagata attgggaatc ctacagcgct ttcagaaact 360

ggatctccta tcccaaatcc gacaagagta gagcaattta acggagcacc tcaatatggt 420

ttgatggcag ggaactcatc aaatacaacc acaaagccta gtgacaatgt tccattgttc 480

caaaattcga tggcaggaaa ctcctctaac tttgccacta ggcccagtga caaagttccg 540

gtcttccaac caacagtcca gccatcttat cgccctgcac ctaattacaa aaaccatgga 600

gcaatcatga aaaatgaagc ccctgctaga ataatcccca tatctgcttt aaatccttat 660

caaggccgct gggctatcaa ggctagagtt actgccaagg gagatatccg ccgataccat 720

aatgctaaag gtgatgggaa agtattctct tttgacttgc ttgattctga tgggggagag 780

atacgggtga catgcttcaa tgctcttctt gatcgattct atgaagttgt ggaagttggt 840

aaggtctatg tggtatcaag aggaaacttg agacctgcac agaagaacta taaccatctt 900

aacaatgagt gggagatttt attggagaat ggatcaactg tggatctttg tcctgatgag 960

aacagttcca ttcccaccca gcggtttgac ttcagaccga tcaatgaaat tgaggatgcc 1020

cagaacaatg ctatccttga catcataggt gttgttacat cggtcaatcc ttgcaccaca 1080

atacagagga aaaatggcat ggaaactcag aaaagaacta tgaacctgaa ggatatgtct 1140

ggtcgaagtg ttgaggtaac catgtggggt gacttttgca acagagaagg ctcacagctt 1200

caaggaatgg ttgaacgtgg gatctttcct gtgctggctg tcaaagcagg aaaagtgagt 1260

gatttcagtg gcaagtctgt cggcacaatt tcttcaactc agctcttcat caaccctgat 1320

tctgctgaag ctcatagtct caggcaatgg tttgatagtg gaggaagaga tgcttctact 1380

cagtccatat ccagagatat cacgcctgga gcatcaagga atgagatccg aaagacagta 1440

gcacagatca aggatgaagg tcttggaatg ggggacaaac ctgactggat tacggtgaaa 1500

gccaccgtta tattcttcaa gaatgagtcc ttcttctaca cagcttgccc taacatgatt 1560

ggcgacaggc agtgcaataa gaaggtgaca aagagtacta atggcaattg gacctgtgac 1620

aaatgcgata gggagtttga agagtgcgac tacaggtatc tcctgcagtt tcagattcaa 1680

gatcactcgg gaacagcttg ggtgacagca ttccaggagg ctgggcagga gttgcttggc 1740

tgctcggcaa cagagctcaa cgcacttaag gagcgcgagg accctcggtt tgcagacacc 1800

atgctcaatt gcttgtttca ggaatatctg ctcaggctga aggtcaaaga agaatcatac 1860

ggcgatgagc gcaaagtgaa gaacaccgcg gtcaaagtgg agaaggttga tccttcgggt 1920

gaaagtaaat ttctgctgga tttgatctcc aagtcctcgg cgctacatta g 1971

<210> 2

<211> 656

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza Sativa）

<400> 2

Met Ala Met Ala Arg Leu Thr Pro Asn Gly Val Ala Ala Ala Leu Ala

1 5 10 15

Gly Asp Thr Asn Leu Lys Pro Val Leu Gln Ile Val Glu Leu Arg Gly

20 25 30

Val Gln Val Asn Gly Ala Gly Val Thr Arg Gly Glu Arg Phe Arg Ala

35 40 45

Val Val Ser Asp Gly Thr Ala Ala Ser Ser Ala Leu Phe Ala Ala Gln

50 55 60

Leu Ser Asp His Ala Arg Ser Gly Ala Leu Arg Arg Gly Ser Ile Val

65 70 75 80

Gln Leu Ser Glu Tyr Val Ile Asn Glu Val Gly Pro Arg Arg Ile Ile

85 90 95

Val Ile Leu Asn Leu Glu Val Leu Val Ser Glu Cys Glu Ile Ile Gly

100 105 110

Asn Pro Thr Ala Leu Ser Glu Thr Gly Ser Pro Ile Pro Asn Pro Thr

115 120 125

Arg Val Glu Gln Phe Asn Gly Ala Pro Gln Tyr Gly Leu Met Ala Gly

130 135 140

Asn Ser Ser Asn Thr Thr Thr Lys Pro Ser Asp Asn Val Pro Leu Phe

145 150 155 160

Gln Asn Ser Met Ala Gly Asn Ser Ser Asn Phe Ala Thr Arg Pro Ser

165 170 175

Asp Lys Val Pro Val Phe Gln Pro Thr Val Gln Pro Ser Tyr Arg Pro

180 185 190

Ala Pro Asn Tyr Lys Asn His Gly Ala Ile Met Lys Asn Glu Ala Pro

195 200 205

Ala Arg Ile Ile Pro Ile Ser Ala Leu Asn Pro Tyr Gln Gly Arg Trp

210 215 220

Ala Ile Lys Ala Arg Val Thr Ala Lys Gly Asp Ile Arg Arg Tyr His

225 230 235 240

Asn Ala Lys Gly Asp Gly Lys Val Phe Ser Phe Asp Leu Leu Asp Ser

245 250 255

Asp Gly Gly Glu Ile Arg Val Thr Cys Phe Asn Ala Leu Leu Asp Arg

260 265 270

Phe Tyr Glu Val Val Glu Val Gly Lys Val Tyr Val Val Ser Arg Gly

275 280 285

Asn Leu Arg Pro Ala Gln Lys Asn Tyr Asn His Leu Asn Asn Glu Trp

290 295 300

Glu Ile Leu Leu Glu Asn Gly Ser Thr Val Asp Leu Cys Pro Asp Glu

305 310 315 320

Asn Ser Ser Ile Pro Thr Gln Arg Phe Asp Phe Arg Pro Ile Asn Glu

325 330 335

Ile Glu Asp Ala Gln Asn Asn Ala Ile Leu Asp Ile Ile Gly Val Val

340 345 350

Thr Ser Val Asn Pro Cys Thr Thr Ile Gln Arg Lys Asn Gly Met Glu

355 360 365

Thr Gln Lys Arg Thr Met Asn Leu Lys Asp Met Ser Gly Arg Ser Val

370 375 380

Glu Val Thr Met Trp Gly Asp Phe Cys Asn Arg Glu Gly Ser Gln Leu

385 390 395 400

Gln Gly Met Val Glu Arg Gly Ile Phe Pro Val Leu Ala Val Lys Ala

405 410 415

Gly Lys Val Ser Asp Phe Ser Gly Lys Ser Val Gly Thr Ile Ser Ser

420 425 430

Thr Gln Leu Phe Ile Asn Pro Asp Ser Ala Glu Ala His Ser Leu Arg

435 440 445

Gln Trp Phe Asp Ser Gly Gly Arg Asp Ala Ser Thr Gln Ser Ile Ser

450 455 460

Arg Asp Ile Thr Pro Gly Ala Ser Arg Asn Glu Ile Arg Lys Thr Val

465 470 475 480

Ala Gln Ile Lys Asp Glu Gly Leu Gly Met Gly Asp Lys Pro Asp Trp

485 490 495

Ile Thr Val Lys Ala Thr Val Ile Phe Phe Lys Asn Glu Ser Phe Phe

500 505 510

Tyr Thr Ala Cys Pro Asn Met Ile Gly Asp Arg Gln Cys Asn Lys Lys

515 520 525

Val Thr Lys Ser Thr Asn Gly Asn Trp Thr Cys Asp Lys Cys Asp Arg

530 535 540

Glu Phe Glu Glu Cys Asp Tyr Arg Tyr Leu Leu Gln Phe Gln Ile Gln

545 550 555 560

Asp His Ser Gly Thr Ala Trp Val Thr Ala Phe Gln Glu Ala Gly Gln

565 570 575

Glu Leu Leu Gly Cys Ser Ala Thr Glu Leu Asn Ala Leu Lys Glu Arg

580 585 590

Glu Asp Pro Arg Phe Ala Asp Thr Met Leu Asn Cys Leu Phe Gln Glu

595 600 605

Tyr Leu Leu Arg Leu Lys Val Lys Glu Glu Ser Tyr Gly Asp Glu Arg

610 615 620

Lys Val Lys Asn Thr Ala Val Lys Val Glu Lys Val Asp Pro Ser Gly

625 630 635 640

Glu Ser Lys Phe Leu Leu Asp Leu Ile Ser Lys Ser Ser Ala Leu His

645 650 655

<210> 3

<211> 3030

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza Sativa）

<400> 3

atggcgatgg cgaggctgac gccgaacggc gtggcggcgg cgctggcggg ggacacgaac 60

ctgaagccgg tgctgcagat cgtcgagctg cggggcgtcc aggtcaacgg cgcgggcgtc 120

acgcgcgggg agaggttccg ggcggtggtc tccgacggca ccgccgcgtc ctccgcgctc 180

ttcgccgcgc agctcagcga ccacgcccga tccggcgccc tccgacgcgg cagcattgtg 240

cagctcagcg agtacgtcat caacgaagtc ggccccagaa ggttttgttg cctcctcctc 300

cactttcccc cccattcccc tgcctctgat cgatgtgtga ttgcgtgcga tttttggccc 360

gtttcgtttt agggttcatg cttgcccctg gttttatgtg tgtcagtctg cgtgtggttt 420

agattcccgc tttcagctag tttgcaattt aaattaatac ttagtacttg ccattctgtt 480

ggtaaattgt cgatgagctt catgtttcct actagatact agtagaggtg catcaaaatt 540

tttctgacaa tggttttgtt tatgacatca tttgatcggt gcttgttaac catttgtcca 600

attgatttta attctgattt gaattattat tgtcagaaag aggcctcggt attgcagtac 660

taatcagtgg taactaaggc tgtcctgtga cacaaattgg tgtttgtcga tactcagtag 720

ttaattggct ggcattagta ttaacgatta caaaatagtg tgatatatgt gcttgggtag 780

cctttggtgt tcgccatttc tggcaggtag catgtcaaac gatgaaggta atatggtcag 840

tttgactact acacacttta cagtgttgtc tgatttagtt cactaattta gttgtgtgcc 900

tttttttctc tagccaacaa atcgccatgt ttgggtgcat cgatttggcc aatgtagtta 960

gatattgatc agcattaatg ctgcaactgt ctggtgctgt gaacagtttg ggtctaagta 1020

ctaagtattt tttatctttt agctgtagcc attcagttca acacaacacc gtactaaatg 1080

catttctttt gtatctggtt cataagtaat tggaagcata gttgtgtcca ttcaaatcat 1140

gttggcaagg cgacaaatgc aaaagtgaag ataagtttct gaccaaaagg tgttgtaatt 1200

aaacatagta ttcatgtagc agtgtgaatc atcatattct gagccttttg cattcttatt 1260

ttcaactgat ctactggttg atagagcaga atcaagaatt gttttttgtt ggttgagctg 1320

acttgttgca atacctgtag gattattgtc attctgaacc tggaagttct tgtttcggag 1380

tgtgagataa ttgggaatcc tacagcgctt tcagaaactg gatctcctat cccaaatccg 1440

acaagagtag agcaatttaa cggagcacct caatatggtt tgatggcagg gaactcatca 1500

aatacaacca caaagcctag tgacaatgtt ccattgttcc aaaattcgat ggcaggaaac 1560

tcctctaact ttgccactag gcccagtgac aaagttccgg tcttccaacc aacagtccag 1620

ccatcttatc gccctgcacc taattacaaa aaccatggag caatcatgaa aaatgaagcc 1680

cctgctagaa taatccccat atctgcttta aatccttatc aaggccgctg ggctatcaag 1740

gctagagtta ctgccaaggg agatatccgc cgataccata atgctaaagg tgatgggaaa 1800

gtattctctt ttgacttgct tgattctgat gggggagaga tacgggtgac atgcttcaat 1860

gctcttcttg atcgattcta tgaagttgtg gaagttggta aggtctatgt ggtatcaaga 1920

ggaaacttga gacctgcaca gaagaactat aaccatctta acaatgagtg ggagatttta 1980

ttggagaatg gatcaactgt ggatctttgt cctgatgaga acagttccat tcccacccag 2040

cggtttgact tcagaccgat caatgaaatt gaggatgccc agaacaatgc tatccttgac 2100

atcataggtg ttgttacatc ggtcaatcct tgcaccacaa tacagaggaa aaatggcatg 2160

gaaactcaga aaagaactat gaacctgaag gatatgtctg gtcgaagtgt tgaggtaacc 2220

atgtggggtg acttttgcaa cagagaaggc tcacagcttc aaggaatggt tgaacgtggg 2280

atctttcctg tgctggctgt caaagcagga aaagtgagtg atttcagtgg caagtctgtc 2340

ggcacaattt cttcaactca gctcttcatc aaccctgatt ctgctgaagc tcatagtctc 2400

aggcaatggt ttgatagtgg aggaagagat gcttctactc agtccatatc cagagatatc 2460

acgcctggag catcaaggaa tgagatccga aagacagtag cacagatcaa ggatgaaggt 2520

cttggaatgg gggacaaacc tgactggatt acggtgaaag ccaccgttat attcttcaag 2580

aatgagtcct tcttctacac agcttgccct aacatgattg gcgacaggca gtgcaataag 2640

aaggtgacaa agagtactaa tggcaattgg acctgtgaca aatgcgatag ggagtttgaa 2700

gagtgcgact acaggtatct cctgcagttt cagattcaag atcactcggg aacagcttgg 2760

gtgacagcat tccaggaggc tgggcaggag ttgcttggct gctcggcaac agagctcaac 2820

gcacttaagg agcgcgagga ccctcggttt gcagacacca tgctcaattg cttgtttcag 2880

gaatatctgc tcaggctgaa ggtcaaagaa gaatcatacg gcgatgagcg caaagtgaag 2940

aacaccgcgg tcaaagtgga gaaggttgat ccttcgggtg aaagtaaatt tctgctggat 3000

ttgatctcca agtcctcggc gctacattag 3030

<210> 4

<211> 1971

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza Sativa）

<400> 4

atggcgatgg cgaggctgac gccgaacggc gtggcggcgg cgctggcggg ggacacgaac 60

ctgaagccgg tgctgcagat cgtcgagctg cggggcgtcc aggtcaacgg cgcgggcgtc 120

acgcgcgggg agaggttccg ggcggtggtc tccgacggca ccgccgcgtc ctccgcgctc 180

ttcgccgcgc agctcagcga ccacgcccga tccggcgccc tccgacgcgg cagcattgtg 240

cagctcagcg agtacgtcat caacgaagtc ggccccagaa ggattattgt cattctgaac 300

ctggaagttc ttgtttcgga gtgtgagata attgggaatc ctacagcgct ttcagaaact 360

ggatctccta tcccaaatcc gacaagagta gagcaattta acggagcacc tcaatatggt 420

ttgatggcag ggaactcatc aaatacaacc acaaagccta gtgacaatgt tccattgttc 480

caaaattcga tggcaggaaa ctcctctaac tttgccacta ggcccagtga caaagttccg 540

gtcttccaac caacagtcca gccatcttat cgccctgcac ctaattacaa aaaccatgga 600

gcaatcatga aaaatgaagc ccctgctaga ataatcccca tatctgcttt aaatccttat 660

ccaggccgct gggctatcaa ggctagagtt actgccaagg gagatatccg ccgataccat 720

aatgctaaag gtgatgggaa agtattctct tttgacttgc ttgattctga tgggggagag 780

atacgggtga catgcttcaa tgctcttctt gatcgattct atgaagttgt ggaagttggt 840

aaggtctatg tggtatcaag aggaaacttg agacctgcac agaagaacta taaccatctt 900

aacaatgagt gggagatttt attggagaat ggatcaactg tggatctttg tcctgatgag 960

aacagttcca ttcccaccca gcggtttgac ttcagaccga tcaatgaaat tgaggatgcc 1020

cagaacaatg ctatccttga catcataggt gttgttacat cggtcaatcc ttgcaccaca 1080

atacagagga aaaatggcat ggaaactcag aaaagaacta tgaacctgaa ggatatgtct 1140

ggtcgaagtg ttgaggtaac catgtggggt gacttttgca acagagaagg ctcacagctt 1200

caaggaatgg ttgaacgtgg gatctttcct gtgctggctg tcaaagcagg aaaagtgagt 1260

gatttcagtg gcaagtctgt cggcacaatt tcttcaactc agctcttcat caaccctgat 1320

tctgctgaag ctcatagtct caggcaatgg tttgatagtg gaggaagaga tgcttctact 1380

cagtccatat ccagagatat cacgcctgga gcatcaagga atgagatccg aaagacagta 1440

gcacagatca aggatgaagg tcttggaatg ggggacaaac ctgactggat tacggtgaaa 1500

gccaccgtta tattcttcaa gaatgagtcc ttcttctaca cagcttgccc taacatgatt 1560

ggcgacaggc agtgcaataa gaaggtgaca aagagtacta atggcaattg gacctgtgac 1620

aaatgcgata gggagtttga agagtgcgac tacaggtatc tcctgcagtt tcagattcaa 1680

gatcactcgg gaacagcttg ggtgacagca ttccaggagg ctgggcagga gttgcttggc 1740

tgctcggcaa cagagctcaa cgcacttaag gagcgcgagg accctcggtt tgcagacacc 1800

atgctcaatt gcttgtttca ggaatatctg ctcaggctga aggtcaaaga agaatcatac 1860

ggcgatgagc gcaaagtgaa gaacaccgcg gtcaaagtgg agaaggttga tccttcgggt 1920

gaaagtaaat ttctgctgga tttgatctcc aagtcctcgg cgctacatta g 1971

<210> 5

<211> 656

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza Sativa）

<400> 5

Met Ala Met Ala Arg Leu Thr Pro Asn Gly Val Ala Ala Ala Leu Ala

1 5 10 15

Gly Asp Thr Asn Leu Lys Pro Val Leu Gln Ile Val Glu Leu Arg Gly

20 25 30

Val Gln Val Asn Gly Ala Gly Val Thr Arg Gly Glu Arg Phe Arg Ala

35 40 45

Val Val Ser Asp Gly Thr Ala Ala Ser Ser Ala Leu Phe Ala Ala Gln

50 55 60

Leu Ser Asp His Ala Arg Ser Gly Ala Leu Arg Arg Gly Ser Ile Val

65 70 75 80

Gln Leu Ser Glu Tyr Val Ile Asn Glu Val Gly Pro Arg Arg Ile Ile

85 90 95

Val Ile Leu Asn Leu Glu Val Leu Val Ser Glu Cys Glu Ile Ile Gly

100 105 110

Asn Pro Thr Ala Leu Ser Glu Thr Gly Ser Pro Ile Pro Asn Pro Thr

115 120 125

Arg Val Glu Gln Phe Asn Gly Ala Pro Gln Tyr Gly Leu Met Ala Gly

130 135 140

Asn Ser Ser Asn Thr Thr Thr Lys Pro Ser Asp Asn Val Pro Leu Phe

145 150 155 160

Gln Asn Ser Met Ala Gly Asn Ser Ser Asn Phe Ala Thr Arg Pro Ser

165 170 175

Asp Lys Val Pro Val Phe Gln Pro Thr Val Gln Pro Ser Tyr Arg Pro

180 185 190

Ala Pro Asn Tyr Lys Asn His Gly Ala Ile Met Lys Asn Glu Ala Pro

195 200 205

Ala Arg Ile Ile Pro Ile Ser Ala Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Arg Trp

210 215 220

Ala Ile Lys Ala Arg Val Thr Ala Lys Gly Asp Ile Arg Arg Tyr His

225 230 235 240

Asn Ala Lys Gly Asp Gly Lys Val Phe Ser Phe Asp Leu Leu Asp Ser

245 250 255

Asp Gly Gly Glu Ile Arg Val Thr Cys Phe Asn Ala Leu Leu Asp Arg

260 265 270

Phe Tyr Glu Val Val Glu Val Gly Lys Val Tyr Val Val Ser Arg Gly

275 280 285

Asn Leu Arg Pro Ala Gln Lys Asn Tyr Asn His Leu Asn Asn Glu Trp

290 295 300

Glu Ile Leu Leu Glu Asn Gly Ser Thr Val Asp Leu Cys Pro Asp Glu

305 310 315 320

Asn Ser Ser Ile Pro Thr Gln Arg Phe Asp Phe Arg Pro Ile Asn Glu

325 330 335

Ile Glu Asp Ala Gln Asn Asn Ala Ile Leu Asp Ile Ile Gly Val Val

340 345 350

Thr Ser Val Asn Pro Cys Thr Thr Ile Gln Arg Lys Asn Gly Met Glu

355 360 365

Thr Gln Lys Arg Thr Met Asn Leu Lys Asp Met Ser Gly Arg Ser Val

370 375 380

Glu Val Thr Met Trp Gly Asp Phe Cys Asn Arg Glu Gly Ser Gln Leu

385 390 395 400

Gln Gly Met Val Glu Arg Gly Ile Phe Pro Val Leu Ala Val Lys Ala

405 410 415

Gly Lys Val Ser Asp Phe Ser Gly Lys Ser Val Gly Thr Ile Ser Ser

420 425 430

Thr Gln Leu Phe Ile Asn Pro Asp Ser Ala Glu Ala His Ser Leu Arg

435 440 445

Gln Trp Phe Asp Ser Gly Gly Arg Asp Ala Ser Thr Gln Ser Ile Ser

450 455 460

Arg Asp Ile Thr Pro Gly Ala Ser Arg Asn Glu Ile Arg Lys Thr Val

465 470 475 480

Ala Gln Ile Lys Asp Glu Gly Leu Gly Met Gly Asp Lys Pro Asp Trp

485 490 495

Ile Thr Val Lys Ala Thr Val Ile Phe Phe Lys Asn Glu Ser Phe Phe

500 505 510

Tyr Thr Ala Cys Pro Asn Met Ile Gly Asp Arg Gln Cys Asn Lys Lys

515 520 525

Val Thr Lys Ser Thr Asn Gly Asn Trp Thr Cys Asp Lys Cys Asp Arg

530 535 540

Glu Phe Glu Glu Cys Asp Tyr Arg Tyr Leu Leu Gln Phe Gln Ile Gln

545 550 555 560

Asp His Ser Gly Thr Ala Trp Val Thr Ala Phe Gln Glu Ala Gly Gln

565 570 575

Glu Leu Leu Gly Cys Ser Ala Thr Glu Leu Asn Ala Leu Lys Glu Arg

580 585 590

Glu Asp Pro Arg Phe Ala Asp Thr Met Leu Asn Cys Leu Phe Gln Glu

595 600 605

Tyr Leu Leu Arg Leu Lys Val Lys Glu Glu Ser Tyr Gly Asp Glu Arg

610 615 620

Lys Val Lys Asn Thr Ala Val Lys Val Glu Lys Val Asp Pro Ser Gly

625 630 635 640

Glu Ser Lys Phe Leu Leu Asp Leu Ile Ser Lys Ser Ser Ala Leu His

645 650 655

<210> 6

<211> 3030

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza Sativa）

<400> 6

atggcgatgg cgaggctgac gccgaacggc gtggcggcgg cgctggcggg ggacacgaac 60

ctgaagccgg tgctgcagat cgtcgagctg cggggcgtcc aggtcaacgg cgcgggcgtc 120

acgcgcgggg agaggttccg ggcggtggtc tccgacggca ccgccgcgtc ctccgcgctc 180

ttcgccgcgc agctcagcga ccacgcccga tccggcgccc tccgacgcgg cagcattgtg 240

cagctcagcg agtacgtcat caacgaagtc ggccccagaa ggttttgttg cctcctcctc 300

cactttcccc cccattcccc tgcctctgat cgatgtgtga ttgcgtgcga tttttggccc 360

gtttcgtttt agggttcatg cttgcccctg gttttatgtg tgtcagtctg cgtgtggttt 420

agattcccgc tttcagctag tttgcaattt aaattaatac ttagtacttg ccattctgtt 480

ggtaaattgt cgatgagctt catgtttcct actagatact agtagaggtg catcaaaatt 540

tttctgacaa tggttttgtt tatgacatca tttgatcggt gcttgttaac catttgtcca 600

attgatttta attctgattt gaattattat tgtcagaaag aggcctcggt attgcagtac 660

taatcagtgg taactaaggc tgtcctgtga cacaaattgg tgtttgtcga tactcagtag 720

ttaattggct ggcattagta ttaacgatta caaaatagtg tgatatatgt gcttgggtag 780

cctttggtgt tcgccatttc tggcaggtag catgtcaaac gatgaaggta atatggtcag 840

tttgactact acacacttta cagtgttgtc tgatttagtt cactaattta gttgtgtgcc 900

tttttttctc tagccaacaa atcgccatgt ttgggtgcat cgatttggcc aatgtagtta 960

gatattgatc agcattaatg ctgcaactgt ctggtgctgt gaacagtttg ggtctaagta 1020

ctaagtattt tttatctttt agctgtagcc attcagttca acacaacacc gtactaaatg 1080

catttctttt gtatctggtt cataagtaat tggaagcata gttgtgtcca ttcaaatcat 1140

gttggcaagg cgacaaatgc aaaagtgaag ataagtttct gaccaaaagg tgttgtaatt 1200

aaacatagta ttcatgtagc agtgtgaatc atcatattct gagccttttg cattcttatt 1260

ttcaactgat ctactggttg atagagcaga atcaagaatt gttttttgtt ggttgagctg 1320

acttgttgca atacctgtag gattattgtc attctgaacc tggaagttct tgtttcggag 1380

tgtgagataa ttgggaatcc tacagcgctt tcagaaactg gatctcctat cccaaatccg 1440

acaagagtag agcaatttaa cggagcacct caatatggtt tgatggcagg gaactcatca 1500

aatacaacca caaagcctag tgacaatgtt ccattgttcc aaaattcgat ggcaggaaac 1560

tcctctaact ttgccactag gcccagtgac aaagttccgg tcttccaacc aacagtccag 1620

ccatcttatc gccctgcacc taattacaaa aaccatggag caatcatgaa aaatgaagcc 1680

cctgctagaa taatccccat atctgcttta aatccttatc caggccgctg ggctatcaag 1740

gctagagtta ctgccaaggg agatatccgc cgataccata atgctaaagg tgatgggaaa 1800

gtattctctt ttgacttgct tgattctgat gggggagaga tacgggtgac atgcttcaat 1860

gctcttcttg atcgattcta tgaagttgtg gaagttggta aggtctatgt ggtatcaaga 1920

ggaaacttga gacctgcaca gaagaactat aaccatctta acaatgagtg ggagatttta 1980

ttggagaatg gatcaactgt ggatctttgt cctgatgaga acagttccat tcccacccag 2040

cggtttgact tcagaccgat caatgaaatt gaggatgccc agaacaatgc tatccttgac 2100

atcataggtg ttgttacatc ggtcaatcct tgcaccacaa tacagaggaa aaatggcatg 2160

gaaactcaga aaagaactat gaacctgaag gatatgtctg gtcgaagtgt tgaggtaacc 2220

atgtggggtg acttttgcaa cagagaaggc tcacagcttc aaggaatggt tgaacgtggg 2280

atctttcctg tgctggctgt caaagcagga aaagtgagtg atttcagtgg caagtctgtc 2340

ggcacaattt cttcaactca gctcttcatc aaccctgatt ctgctgaagc tcatagtctc 2400

aggcaatggt ttgatagtgg aggaagagat gcttctactc agtccatatc cagagatatc 2460

acgcctggag catcaaggaa tgagatccga aagacagtag cacagatcaa ggatgaaggt 2520

cttggaatgg gggacaaacc tgactggatt acggtgaaag ccaccgttat attcttcaag 2580

aatgagtcct tcttctacac agcttgccct aacatgattg gcgacaggca gtgcaataag 2640

aaggtgacaa agagtactaa tggcaattgg acctgtgaca aatgcgatag ggagtttgaa 2700

gagtgcgact acaggtatct cctgcagttt cagattcaag atcactcggg aacagcttgg 2760

gtgacagcat tccaggaggc tgggcaggag ttgcttggct gctcggcaac agagctcaac 2820

gcacttaagg agcgcgagga ccctcggttt gcagacacca tgctcaattg cttgtttcag 2880

gaatatctgc tcaggctgaa ggtcaaagaa gaatcatacg gcgatgagcg caaagtgaag 2940

aacaccgcgg tcaaagtgga gaaggttgat ccttcgggtg aaagtaaatt tctgctggat 3000

ttgatctcca agtcctcggc gctacattag 3030

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gccccagaag gattattg 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

attgctctac tcttgtcg 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

atgaaaaatg aagcccctg 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

ctcccttggc agtaactct 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gctatgtacg tcgccatcca 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ggacagtgtg gctgacacca t 21

Claims (8)

1.一种核苷酸序列，具有调控植物育性的功能，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6所示。

2.如权利要求1所述的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQID NO:5所示。

3.一种表达盒，其特征在于所述表达盒包含权利要求1所述的DNA序列。

4.一种表达载体，其特征在于所述表达载体包含权利要求3所述的表达盒。

5.一种工程菌，其特征在于所述工程菌含有权利要求4所述的表达载体。

6.一种突变体材料的在育种中的应用，所述突变材料是由核苷酸序列的突变所造成，含有该突变后核苷酸序列的植株表现为完全雄性不育，其特征在于所述突变后产生雄性不育表型的核苷酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示。

7.如权利要求6所述的应用，其中所述的突变是通过基因沉默的手段产生。

8.如权利要求6所述的应用，包括将突变体植株作为不育系母本，与恢复系杂交，生产杂交种子。

Images