CN107988245B

CN107988245B - 一种密码子优化的普鲁兰酶及其表达载体与构建方法

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Publication number: CN107988245B
Application number: CN201711013192.XA
Authority: CN
Inventors: 李金良; 孟凡强; 陆兆新; 吕凤霞; 杨娟
Original assignee: Nanjing Foodsafety Biotech Co ltd; Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Foodsafety Biotech Co ltd; Nanjing Agricultural University
Priority date: 2017-10-25
Filing date: 2017-10-25
Publication date: 2021-11-19
Anticipated expiration: 2037-10-25
Also published as: CN107988245A

Abstract

本发明公开了一种密码子优化的普鲁兰酶及其表达载体与构建方法。它是以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis168）密码子偏好性为基础，参考耐酸普鲁兰杆菌（Bacillus acidpullulyticus）普鲁兰酶基因，设计碱基序列，通过自主复制性质粒和整合型质粒的方法在枯草芽孢杆菌中表达。本发明还对表达框的启动子、mRNA稳定序列、信号肽以及它们的组合进行选择，得到一种能够在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达的组合。并实现了工业化生产同时提高了酶活稳定性。

Description

一种密码子优化的普鲁兰酶及其表达载体与构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为通过密码子优化和改变启动子、信号肽的方法提高普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中表达的方法，尤其涉及一种密码子优化的普鲁兰酶及其表达载体与构建方法。

背景技术

普鲁兰酶(pullulanase)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点的α-1,6糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成支链淀粉的脱支酶。工业上所使用的谷类淀粉中，支链淀粉的含量约占75％-85％，而支链淀粉中约含有4％-5％的α-1,6糖苷键。目前工业发酵生产酒精、氨基酸、核苷酸、抗生素等，均需要使用大量的淀粉，经过淀粉酶和糖化酶水解后生成单糖或二糖作为发酵培养基的能源。利用淀粉酶水解淀粉时，存在支链不能被切割的问题。添加脱支酶后，可以明显的提高水解效率。支链淀粉不能彻底分解则直接影响到淀粉的利用率，影响到产品的质量。目前，已经发现的能产普鲁兰酶产生菌有很多种，包括产气气杆菌、嗜热厌氧菌、厌氧古细菌、嗜热芽孢杆菌等。普鲁兰酶与其他淀粉酶协同作用或单独作用，使食品质量提高，降低粮耗，节约成本,减少污染。

目前国际上普鲁兰酶的工业化生产被丹麦垄断,我国仅局限于实验室研究,且酶活较低，所以提高普鲁兰酶的产量对食品加工领域具有重要的工业价值。市场上的普鲁兰酶主要由杰能科和诺维信生产。杰能科的普鲁兰酶(US7968691B2)基因来自于B.deramificans，采用地衣芽孢杆菌表达系统，将普鲁兰酶基因pul整合到基因组上，采用amyL的启动子和信号肽。诺维信的普鲁兰酶有两个专利。一个是US8703465B2其普鲁兰酶基因来自于两种古细菌(Themococcus.Hydrothermalis和T.litoralis)。将T.Litoralis的GH57结构域和T.Hydrothermalis的X47结构域整合到枯草芽孢杆菌中，采用aprH的启动子和信号肽。另外一个是EP2042593A2，其普鲁兰酶基因来自于B.deramificans，采用枯草芽孢杆菌表达系统。

来源于耐酸普鲁兰杆菌(B.acidpullulyticus)的普鲁兰酶具有良好的低pH适应性，和较好的温度稳定性，能够适应淀粉加工、发酵行业、高麦芽糖浆生产过程中的高温和酸性环境，具有广泛的用于前景，但是原始的耐酸普鲁兰杆菌发酵酶活太低，菌株的工业形状较差，不适宜大规模的工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种密码子优化的普鲁兰酶及其表达载体与构建方法，通过密码子优化与表达载体构建，得到能够在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达的组合，并易于工业化生产同时提高酶活稳定性。

本发明通过以下技术方案实现：

一种普鲁兰酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种普鲁兰酶表达载体，包括整合了所述的SEQ ID NO.2序列的自主复制型表达质粒。

进一步地，所述的普鲁兰酶表达载体，所述自主复制型表达质粒包括pWB980、pHP13、pHP13-43、pHT01、pHT43、pHT304、pMK3、pMK4、pHCMC04、pHCMC05、pMA5或pBE中的任意一种。

进一步地，所述的普鲁兰酶表达载体的构建方法，包括通过引物扩增SEQ ID NO.2序列，回收扩增产物，连接到T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选后利用限制性内切酶酶切T载体和自主复制型表达质粒，通过DNA连接酶连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到。

进一步地，所述的普鲁兰酶表达载体，所述自主复制型表达质粒的启动子可由以下启动子中的任意一种所替代：amyE、amyL、aprE、veg、lepA、liaG、liaL、sodA、xylA或glnA；所述自主复制型表达质粒的信号肽由以下信号肽中的任意一种所替代：amyQ、amyE、aprE、chiA、wapA、pbpA或nprE。

进一步地，所述的普鲁兰酶表达载体的构建方法，通过引物pul-F：ggatccAGGGATGCCTAAAAACGAAGA和引物pul-R：tctagaCTATTGTTTAAGGATAAGTGTA扩增SEQ IDNO.2序列，回收扩增产物，连接到T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选后利用限制性内切酶酶切T载体和自主复制型表达质粒pHT43，通过DNA连接酶连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到。

一种整合型普鲁兰酶表达载体，包括整合了权利要求1所述的SEQ ID NO.2序列的整合型质粒。

进一步地，所述的整合型普鲁兰酶表达载体，所述整合型质粒包括任何能够在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中复制的并且能够通过同源重组的方法整合到染色体上的质粒。

进一步地，所述的整合型普鲁兰酶表达载体，所述整合型质粒为pDG364，pMLK83，pDG1661，pDG1662，pDG1728，pDG1730，pDG1664，pAX01，pSG1170，pSG1729，pMAD，pCBS，pCBS595，pCBS221，pCBS345或pCBS412中的任意一种。

进一步地，所述的整合型普鲁兰酶表达载体，所述整合型质粒的启动子由包括以下任意一种的启动子替代：PamyQ、PamyE、PamyL、PaprE、Pveg、PlepA、PliaG、PliaL、PsodA、PxylA或PglnA；所述整合型质粒的信号肽由包括以下任意一种的信号肽替代：SPamyQ、SPamyE、SPaprE、SPchiA、SPwapA、SPpbpA或SPnprE。

进一步地，所述的整合型普鲁兰酶表达载体，所述整合型质粒的启动子由包括以下任意一种的复合启动子或串联启动子替代，复合启动子可选择PamyL+PamyQ、PamyL+PamyE、PamyE+PamyQ、PamyL+PaprE、PamyL+PlepA、PamyL+PsodA、PamyQ+PaprE、PamyQ+PlepA、PamyQ+PsodA、PamyE+PaprE、PamyE+PlepA、PamyE+PsodA、PaprE+PlepA、PaprE+PsodA、PlepA+PsodA、PamyL+PamyQ+PamyE、PamyL+PamyQ+PaprE或PamyL+PamyQ+PlepA中的任意一种；串联启动子可选择Dimer PamyL、Dimer PamyQ、Dimer PamyE、Dimer PaprE、Dimer PlepA、Dimer PsodA、Trimer PamyL、Trimer PamyQ、Trimer PamyE、Trimer PaprE、Trimer PlepA或Trimer PsodA中的任意一种。

本发明通过密码子优化的方法，提高普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的表达量。本发明还通过改变启动子和信号肽的方法，进一步的提高普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的表达量。

本发明采用自主复制型质粒和整合型质粒，通过改变普鲁兰酶基因N端的启动子(amyQ、amyE、amyL、aprE、veg、lepA、liaG、liaL、sodA、xylA、glnA)和信号肽(amyQ、，amyE、amyL、aprE、chiA、wapA、pbpA、nprE)以及它们的组合、复合、串联等，提高普鲁兰酶的表达量。

本发明通过对发酵参数的控制，培养基成分的改变的技术手段实现在100L、0立方米、60立方米发酵罐中的生产。

本发明涉及到的普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的表达，通过密码子优化、改变启动子、信号肽种类、串联启动子等方式极大地提高了普鲁兰酶的产量，并且实现了100L的中试规模生产和10立方米、60立方米的大规模发酵生产，打通了普鲁兰酶从菌种改造到大规模发酵生产的全部流程，实现了普鲁兰酶的国内生产。

附图说明

图1是本发明涉及到含有普鲁兰酶的自主复制性载体pHT43-pul；

图2是本发明涉及到的含有淀粉酶启动子和几丁质酶信号肽的自主复制质粒pHT3-amyL-chiA-pul；

图3是本发明涉及到的能够在amyE基因座处发生整合的整合型质粒pCBS-pul；

图4是本发明涉及到的含有淀粉酶启动子和几丁质酶信号肽的整合型质粒；

图5是本发明涉及到的含有两个复合启动子的整合型质粒；

图6是本发明涉及到的含有二联淀粉酶L启动子的整合型质粒；

图7是重组菌株(pCBS-amyL-amyQ-amyE-chiA-pul)普鲁兰酶SDS-PAGE蛋白电泳验证。

具体实施方式

实施例1：普鲁兰酶基因获得

为获得在酸性条件下具有良好活性的普鲁兰酶，该发明参考耐酸普鲁兰杆菌(Bacillusacidpullulyticus)的普鲁兰酶氨基酸序列(Accession:2WAN_A，GI:229597615)，并根据氨基酸序列(SEQ ID NO.1)，以Bacillus subtilis 168的密码子为基础，优化其碱基组成，使其能在枯草芽孢杆菌中更好的表达。得到优化后的碱基序列(SEQID NO.2)共2763bp，其中不含常见的限制性内切酶的酶切位点，便于后续操作。不含其它的启动子序列和核糖体识别位点防止产生其它的产物。普鲁兰酶基因前添加mRNA稳定序列(来自于苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白cry3A的mRNA稳定序列(SEQ ID NO.3)。完成设计的普鲁兰酶基因由金斯瑞生物科技有限公司合成。

实施例2：自主复制型表达质粒构建

自主复制型质粒可以是任何能够在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中复制的穿梭质粒，可以是pWB980，pHP13，pHP13-43，pHT01，pHT43，pHT304，pMK3，pMK4，pHCMC04，pHCMC05，pMA5，pBE等中的任意一种。该实施例中以pHT43质粒为例描述自主复制型质粒的构建过程，其他的质粒构建原理和过程与此相同。通过引物pul-F：ggatccAGGGATGCCTAAAAACGAAGA(SEQ ID NO.4)和引物pul-R：tctagaCTATTGTTTAAGGATAAGTGTA(SEQ ID NO.5)(小写字母为酶切位点BamHⅠ和XbaⅠ)扩增普鲁兰酶基因(SEQ ID NO.2)，PCR条件如下：预变性95℃5min。变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃2min；30个循环。最终延伸72℃10min。产物通过PCR产物回收试剂盒(OMEGA)回收后，连接到T载体pEASY-blunt(全式金生物)。按照《分子克隆实验指南》的方法，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落测序验证碱基序列。利用限制性内切酶BamHⅠ和XbaⅠ(Thermo Fisher Scientific)酶切T载体和表达载体pHT43，通过T4DNA ligase(Takara)连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到重组质粒pHT43-pul(图1)。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落PCR验证连接情况。从阳性克隆子中提取质粒，电转化枯草芽孢杆菌B.subtilis 168和BS001。从氯霉毒的抗性平板上挑取单菌落PCR验证转化情况。按照同样的方法可以构建密码子未优化的普鲁兰酶基因表达载体，阳性克隆子发酵测普鲁兰酶活性，见表1。

表1.重组枯草芽孢杆菌发酵酶活

实施例3：自主复制型质粒启动子和信号肽的选择

外源基因的表达与其启动子序列是密切相关的，蛋白质的分泌与其信号肽相关。不同的外源蛋白需要不同的启动子和信号肽，在该案例中，我们实验了不同的启动子和信号肽对普鲁兰酶发酵酶活的影响。以实施例2构建的质粒pHT43-pul为基础，利用限制性内切酶KpnⅠ和BamHⅠ双酶切处理切除启动子和信号肽，形成可以验证不同启动子和信号肽的效果的载体。该实施例中以其中一种启动子和信号肽(amyQ启动子和amyL信号肽)为例描述载体的构建(见图2，pHT43-amyL-chiA-pul)，其余启动子和信号肽的载体构建原理和方法与此相同。

通过引物amyQ-F：ggtaccTCGATTGTTTGAGAAAAGA(SEQ ID NO.6)，amyQ-R：CGCTTTCGTTTTTGAATCATTTATATTTTCAAA(SEQ ID NO.7)扩增amyQ启动子；通过引物amyL-F:gaaaatataaATGATTCAAAAACGAAAGCGTGC,(SEQ ID NO.8)amyL-R:ggatccTGCAGCCCAAGTTTTAGATACCG(SEQ ID NO.9)扩增amyL信号肽。二者通过DNA回收试剂盒(OMEGA)回收片段。再通过引物amyQ-F、amyL-R，以回收的amyQ和amyL为模板，利用SOE-PCR的方法将二者连接到一起。SOE-PCR产物回收后连接到T载体pEASY-blunt。按照《分子克隆实验指南》的方法，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落测序验证碱基序列。利用限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ酶切T载体和表达载体pHT43，通过T4DNA ligase连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落PCR验证连接情况。从阳性克隆子中提取质粒，电转化枯草芽孢杆菌B.subtilis 168和BS001。从氯霉毒的抗性平板上挑取单菌落PCR验证转化情况。阳性克隆子发酵测普鲁兰酶活性，发酵酶活见表2。

其他的组合包括：PamyQ+SPamyQ、PamyQ+SPamyE、PamyQ+SPaprE、PamyQ+SPchiA、PamyQ+SPwapA、PamyQ+SPpbpA、PamyQ+SPnprE。以及其他的启动子amyE、amyL、aprE、veg、lepA、liaG、liaL、sodA、xylA、glnA)和信号肽amyQ、amyE、aprE、chiA、wapA、pbpA、nprE之间的任意组合，均可以按照上述描述的方法构建。

表2.自主复制型质粒中不同信号肽和启动子对发酵酶活的影响

启动子与信号肽组合	酶活(U/ml)	启动子与信号肽组合	酶活(U/ml)
				PamyQ+SPamyL	100.4	PamyE+SPchiA	105.4
PamyQ+SPamyQ	95.5	PamyL+SPchiA	123.6
				PamyQ+SPamyE	93.4	PaprE+SPchiA	95.4
PamyQ+SPaprE	89.7	Pveg+SPchiA	89.7
				PamyQ+SPchiA	108.5	PlepA+SPchiA	105.7
PamyQ+SPwapA	75.1	PliaG+SPchiA	75.3
				PamyQ+SPpbpA	50.4	PliaL+SPchiA	50.8
PamyQ+SPnprE	65.2	PsodA+SPchiA	110.4
						PxylA+SPchiA	93.6
		PglnA+SPchiA	89.1

实施例4：整合型表达质粒构建

整合型质粒可以是任何能够在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中复制的并且能够通过同源重组的方法整合到染色体上的任何质粒，可以是pDG364，pMLK83，pDG1661，pDG1662，pDG1728，pDG1730，pDG1664，pAX01，pSG1170，pSG1729，pMAD，pCBS，pCBS595，pCBS221，pCBS345，pCBS412等中的任意一种。整合位点可以是枯草芽孢杆菌中的amyE基因座、xylA基因座、gntP基因座以及其他任何的枯草芽孢杆菌生长非必须基因的位置。该实施例中以pCBS质粒，整合位点为amyE基因座为例描述整合型质粒的构建过程，其他的质粒构建原理和过程与此相同。通过引物hamyE-up-F:agatctATGTTTGCAAAACGATTCAAAACC(SEQ IDNO.10)和引物hamyE-up-R:ggtaccCGCCCGATCAGACCAGTTTTTAAT(小写字母为酶切位点BglⅡ和KpnⅠ)(SEQ ID NO.11)扩增淀粉酶基因(amyE)上游同源臂，PCR条件如下：预变性95℃5min。变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min；30个循环。最终延伸72℃10min。产物通过PCR产物回收试剂盒(OMEGA)回收后，连接到T载体pEASY-blunt。按照《分子克隆实验指南》的方法，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落测序验证碱基序列。利用限制性内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切T载体和表达载体pCBS，通过T4DNA ligase连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落PCR验证连接情况，得到具有上游同源臂的载体。

按照同样的方法，通过hamyE-down-F:gaattcCAAGTGAACGATGGTAAACTG(SEQ IDNO.12)和引物hamyE-down-R:ggatccTCAATGGGGAAGAGAACCGCT(小写字母为酶切位点EcoRⅠ和BamHⅠ)(SEQ ID NO.13)扩增淀粉酶基因(amyE)下游同源臂，利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切T载体和表达载体pCBS，得到具有amyE基因上下游同源臂的整合载体。通过引物hpul-F：gaattcAGGGATGCCTAAAAACGAAGA(SEQ ID NO.14)和引物hpul-R：ggtaccCTATTGTTTAAGGATAAGTGTA(小写字母为酶切位点EcoRⅠ和KpnⅠ)(SEQ ID NO.15)扩增普鲁兰酶基因(SEQ.NO.2)，PCR条件如下：预变性95℃5min。变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃2min；30个循环。最终延伸72℃10min。产物通过PCR产物回收试剂盒(OMEGA)回收后，连接到T载体pEASY-blunt。按照《分子克隆实验指南》的方法，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落测序验证碱基序列。利用限制性内切酶EcoRⅠ和KpnⅠ酶切T载体和具有amyE上下游同源臂的表达载体pCBS，通过T4DNA ligase连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞得到重组质粒pCBS-pul(见图3)。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落PCR验证连接情况。从阳性克隆子中提取质粒，电转化枯草芽孢杆菌B.subtilis 168和BS001。从红霉毒的抗性平板上挑取单菌落PCR验证转化情况，得到不具有启动子和信号肽的重组质粒pCBS-pul(图3)。

实施例5：整合型质粒启动子和信号肽的选择

外源基因的表达与其启动子序列是密切相关的，蛋白质的分泌与其信号肽相关。整合到基因组上的外源基因因为只有1个拷贝，对启动子和信号肽具有更高的要求，以保证转录出足够的mRNA合成外源蛋白。在该案例中，我们实验了不同的启动子和信号肽对普鲁兰酶发酵酶活的影响。以实施例4构建的质粒pCBS-pul为基础，利用限制性内切酶EcoRⅠ酶切处加入不同的启动子和信号肽，形成具有不同启动子和信号肽的效果的载体。该实施例中以其中一种启动子和信号肽(amyQ启动子和amyL信号肽)为例描述载体的构建(如图4，pCBS-PamyL-SPchiA-pul)，其余启动子和信号肽的载体构建原理和方法与此相同。通过引物hamyQ-F：gaattcTCGATTGTTTGAGAAAAGA，(SEQ ID NO.16)，hamyQ-R：CGCTTTCGTTTTTGAATCATTTATATTTTCAAA(SEQ ID NO.17)扩增amyQ启动子；通过引物hamyL-F:GAAAATATAAATGATTCAAAAACGAAAGCGTGC(SEQ ID NO.18)，hamyL-R:gaattcTGCAGCCCAAGTTTTAGATACCG(小写字母为酶切位点EcoRⅠ)(SEQ ID NO.19)扩增amyL信号肽。二者通过DNA回收试剂盒(OMEGA)回收片段。再通过引物hamyQ-F、hamyL-R，以回收的amyQ和amyL为模板，利用SOE-PCR的方法将二者连接到一起。SOE-PCR产物回收后连接连接到T载体pEASY-blunt。按照《分子克隆实验指南》的方法，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落测序验证碱基序列。利用限制性内切酶EcoRⅠ酶切T载体和表达载体pCBS-pulA，通过T4DNAligase连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落PCR验证连接情况。从阳性克隆子中提取质粒，电转化枯草芽孢杆菌BS001。从红霉毒的抗性平板上挑取单菌落PCR验证转化情况。阳性克隆子发酵测普鲁兰酶活性，发酵酶活见表3。

表3.整合型质粒中不同信号肽和启动子对发酵酶活的影响

启动子与信号肽组合	酶活(U/ml)	启动子与信号肽组合	酶活(U/ml)
				PamyQ+SPamyL	105.4	PamyE+SPchiA	111.2
PamyQ+SPamyQ	101.5	PamyL+SPchiA	143.5
				PamyQ+SPamyE	98.4	PaprE+SPchiA	123.4
PamyQ+SPaprE	97.2	Pveg+SPchiA	90.4
				PamyQ+SPchiA	118.4	PlepA+SPchiA	116.8
PamyQ+SPwapA	86.7	PliaG+SPchiA	80.5
				PamyQ+SPpbpA	59.3	PliaL+SPchiA	72.4
PamyQ+SPnprE	72.8	PsodA+SPchiA	123.1
						PxylA+SPchiA	105.2
		PglnA+SPchiA	93.8

实施例6：复合启动子及串联启动子

单个启动子的启动转录效率有限，可以通过复合启动子或者串联多个启动子的方法提高转录的效率。该实施例以复合启动子PamyL+PamyQ为例描述复合启动子的构建过程。通过引物pamyL-F:TGCGTCCTTCTTTGTGCTTGGA(SEQ ID NO.20)和pamyL-R：ggatccAATGTGTAACATATGATATTGTA(小写字母为酶切位点BamHⅠ)(SEQ ID NO.21)扩增amyL启动子，产物通过PCR产物回收试剂盒(OMEGA)回收后，连接到T载体pEASY-blunt。按照《分子克隆实验指南》的方法，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落测序验证碱基序列。通过引物pamyQ-F:ggatccTCGATTGTTTGAGAAAAGAAGA(SEQ IDNO.22)和pamyQ-R：TTATATTTTCAAATTTTCAAGGT(小写字母为酶切位点BamHⅠ)(SEQ IDNO.23)扩增amyQ启动子，产物通过PCR产物回收试剂盒(OMEGA)回收后，连接到T载体pEASY-pamyL。按照《分子克隆实验指南》的方法，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落测序验证碱基序列，得到具有两个启动子的复合启动子(如图5，pCBS-PamyL-PamyQ-pul)。

以amyL为例描述串联启动子的构建过程，通过引物pamyL-F:TGCGTCCTTCTTTGTGCTTGGA(SEQ ID NO.24)和pamyL-R：ggatccAATGTGTAACATATGATATTGTA(小写字母为酶切位点BamHⅠ)(SEQ ID NO.25)扩增amyL启动子，产物通过PCR产物回收试剂盒(OMEGA)回收后，连接到T载体pEASY-blunt。按照《分子克隆实验指南》的方法，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落测序验证碱基序列。通过引物pamyL-F2:ggatccTGCGTCCTTCTTTGTGCTTGGA(SEQ ID NO.26)和pamyL-R2：AATGTGTAACATATGATATTGTA(小写字母为酶切位点BamHⅠ)(SEQ ID NO.27)扩增amyL启动子，产物通过PCR产物回收试剂盒(OMEGA)回收后，连接到T载体pEASY-amyL。按照《分子克隆实验指南》的方法，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落测序验证碱基序列，得到具有二联amyL启动子的串联启动子(如图6，pCBS-DimerPamyL-pul)。

其他的复合启动子包括权利要求4中所有启动子的两两复合，三三复合，构建原理和方法同上。串联启动子可以是权利要求4中所有启动子的二聚启动子和三聚启动子，构建原理和方法同上。该实施例中不做详细描述，发酵酶活见表4。

表4.整合型质粒中复合启动子和串联启动子对发酵酶活的影响

复合启动子	酶活(U/ml)	串联启动子	酶活(U/ml)
				PamyL+PamyQ	205.7	Dimer PamyL	200.8
PamyL+PamyE	198.3	Dimer PamyQ	205.4
				PamyE+PamyQ	203.4	Dimer PamyE	198.7
PamyL+PaprE	186.5	Dimer PaprE	185.6
				PamyL+PlepA	197.8	Dimer PlepA	174.3
PamyL+PsodA	156.4	Dimer PsodA	183.5
				PamyQ+PaprE	188.2	Trimer PamyL	253.7
PamyQ+PlepA	201.3	Trimer PamyQ	267.8
				PamyQ+PsodA	192.4	Trimer PamyE	245.1
PamyE+PaprE	185.4	Trimer PaprE	200.8
				PamyE+PlepA	178.3	Trimer PlepA	214.5
PamyE+PsodA	185.3	Trimer PsodA	208.3
				PaprE+PlepA	165.2
PaprE+PsodA	155.9
				PlepA+PsodA	145.7
PamyL+PamyQ+ PamyE	273.4
				PamyL+PamyQ+ PaprE	210.4
PamyL+PamyQ+ PlepA	222.8

实施例7：发酵及产物纯化

该实施例中描述了普鲁兰酶中试和生产的发酵方法及产物的纯化方法。在100L的中试发酵罐中的发酵参数：

菌种：实施例6中酶活最高的菌株，含有PamyL+PamyQ+ PamyE复合启动子的整合到基因组。

种子培养基：玉米淀粉50g，酵母膏20g，大豆粉10g，尿素2g，硫酸铵3g，磷酸氢二钾8g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.03g，高温淀粉酶3KU，调节Ph至7.0。

发酵基料培养基(g/L)：玉米淀粉100g，小麦粉50g，大豆粉10g，尿素2g，硫酸铵6g，磷酸氢二钾10g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.03g，高温淀粉酶5KU，调节Ph至7.0。

发酵补料培养基(g/L)：，玉米淀粉300g、小麦粉50g、高温淀粉酶10KU.发酵过程中使用磷酸和氨水控制pH在6.8-7.2之间。通气量每升发酵液0.5L/min，转速500rpm，温度37度。通过补料控制生长对数期总还原糖控制在2％左右，稳定期总还原糖控制在1％左右。发酵36-48小时，发酵24小时后，每2小时测一次酶活，酶活出现下降趋势时结束发酵。

在10立方、60立方的生产发酵罐中的发酵参数：

发酵基料培养基(g/L)：玉米淀粉150g，小麦粉75g，大豆粉15g，尿素3g，硫酸铵6g，磷酸氢二钾10g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.03g，高温淀粉酶5KU，调节pH至7.0。

发酵补料培养基(g/L)：，玉米淀粉300g、小麦粉50g、高温淀粉酶10KU。

发酵过程中使用磷酸和氨水控制pH在6.8-7.2之间。控制溶氧大于20％，转速800rpm，温度39度。通过补料控制生长对数期总还原糖控制在1.5％左右，稳定期总还原糖控制在1％左右。发酵36-48小时，发酵24小时后，每2小时测一次酶活，酶活出现下降趋势时结束发酵。

在发酵液适当稀释后，添加6％的硅藻土和1％的絮凝剂，通过板框压滤使上清液的通光率大于99％。通过微滤去除可能存在的固体颗粒，再通过超滤浓缩发酵液，加入稳定剂防腐剂后室温阴凉处保存，室温状态下3个月后酶活保持大于80％，6个月后酶活保持大于70％。

发酵2、3、4、5、6天后，取发酵液12000g离心5分钟，取上清液加入蛋白上样缓冲液后煮沸处理5分钟，SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达情况(如图7)。

序列表

<110> 南京福斯弗瑞生物科技有限公司

南京农业大学

<120> 一种密码子优化的普鲁兰酶及其表达载体与构建方法

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 921

<212> PRT

<213> 普鲁兰杆菌(Bacillus acidopullulyticus)

<400> 1

Ala Ser Thr Ser Thr Leu Val Ile Val His Thr His Ala Pro Ala Ser

1 5 10 15

Ala Thr Thr Ala Thr Ala Val Thr Met Thr Pro Thr Gly Pro Val Ala

20 25 30

Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly Pro Thr Gly Thr Ala Ala Ala Pro Gly

35 40 45

Ala Val Ala Ala Thr Gly Val Pro Gly Ala Ala Thr Gly Val Gly Leu

50 55 60

Ile Val Ala Leu Ala Ala Thr Ser Gly Leu Ala Thr Pro Ala Ala Leu

65 70 75 80

His Ile Ala Leu Ala Leu Gly His Gly Val Thr Ile Val Gly Gly Ala

85 90 95

Pro Thr Ile Thr Thr Ala Leu Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ile Pro

100 105 110

Ser Val Ser Ala Ala Thr Leu Ala Ala Gly Leu Thr Val Leu Ala Leu

115 120 125

Leu Ser Met Pro Met Thr Leu Ala Ala Ala Ala Ser Gly Pro Thr Val

130 135 140

Ile Ala Leu Thr Thr Gly Gly Leu Ile Pro Val Thr Ser Ala Val Ser

145 150 155 160

Ala Ala Pro Val Thr Ala Val Leu Val Gly Ala Leu Gly Gly Ala Leu

165 170 175

Gly Ala Ala Ala Ala Thr Ser Pro Ala Ala Ala His Thr Leu Leu Leu

180 185 190

Leu Ile Ala Pro Ala Leu Thr Gly Leu Ser Gly Thr Leu Pro Ala Gly

195 200 205

Thr Thr Gly Thr Leu Ile Ala Leu Ala His Ser Thr Ala Thr Ser Thr

210 215 220

Pro Gly Ala Ala Val Ser Leu Thr Val Pro Gly Gly Gly Gly Leu Val

225 230 235 240

Thr Pro Thr Thr Ile Pro Ser Thr Ala Gly Val Pro Ala Ser Val Ala

245 250 255

His Pro Ala Gly Ala Pro Pro Thr Ser Ser Ala Gly Val Gly Thr Ala

260 265 270

Leu Val Gly Leu Thr Leu Ala Ser Ala Pro Ala Val Thr His Ala Leu

275 280 285

Ala Val Ala Ala Ala Gly Thr Leu Ala His Ala Ile Leu Pro Ala Ala

290 295 300

Val Leu Ala Leu Pro Ala Thr Ala Thr Ser Gly Ala Ala Leu Gly Ala

305 310 315 320

Val Thr Ser Leu Ala Ala Thr Ser Pro Ala Val Thr Ala Pro Thr Ala

325 330 335

Ser Ala Val Gly Leu Leu Leu Thr Ala Ser Gly Leu Gly Ser Ile Thr

340 345 350

Leu Gly Leu Gly Met Gly Leu Ser Ala Ala Gly Thr Thr Leu Leu Gly

355 360 365

Val Ser Gly Ala Leu Gly Ala Thr Thr Thr Leu Thr Gly Val Thr Val

370 375 380

Ala Gly Thr Thr Gly Thr Ala Val Ala Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ser

385 390 395 400

Val Ala Ala Thr Ala Gly Met Ile Val Ala Leu Leu Ala Thr Ala Pro

405 410 415

Ala Gly Thr Gly Gly Ala His Gly Gly Thr Pro Ala Ala Pro Val Ala

420 425 430

Gly Val Ile Thr Gly Ala His Val Ala Ala Pro Ser Ile Ala Ala Ala

435 440 445

Ser Gly Met Leu Ala Leu Gly Leu Thr Leu Ala Pro Thr Gly His Gly

450 455 460

Thr Leu Gly Pro Ala His Val Leu Thr Gly Ile Ala Ser Leu Leu Gly

465 470 475 480

Leu Gly Ile Thr Thr Val Gly Leu Gly Pro Val Gly Gly Pro Ala Ser

485 490 495

Ile Ala Gly Thr Gly Pro Ala Thr Thr Ala Thr Gly Thr Ala Pro Ala

500 505 510

Ala Thr Ala Val Pro Gly Gly Ala Thr Ala Thr Thr Pro Gly Gly Thr

515 520 525

Ala Ala Ile Thr Gly Leu Leu Gly Leu Ile Gly Ser Leu His Gly Gly

530 535 540

Ala Ile Gly Val Ala Met Ala Val Val Thr Ala His Thr Pro Ala Val

545 550 555 560

Met Val Ser Ala Pro Ala Leu Ile Val Pro Gly Thr Thr Thr Ala Thr

565 570 575

Ala Ser Ala Gly Ala Thr Thr Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Pro

580 585 590

Ala Thr Gly His Pro Met Ala Gly Leu Pro Val Leu Ala Ser Val Ala

595 600 605

Thr Thr Val Ala Gly Thr His Val Ala Gly Pro Ala Pro Ala Leu Met

610 615 620

Ala Leu Leu Gly Leu Ala Thr Met Ala Leu Ile Ser Ala Gly Leu His

625 630 635 640

Ala Ile Ala Pro Gly Ile Val Leu Thr Gly Gly Pro Thr Thr Gly Gly

645 650 655

Thr Ser Gly Leu Ser Ser Ala Gly Leu Val Thr Leu Gly Gly Gly Leu

660 665 670

Gly Leu Gly Ile Gly Val Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Gly Leu Ala

675 680 685

Gly Ala Val Pro Ala Leu Thr Ala Gly Gly Pro Ala Thr Gly Ala Pro

690 695 700

Ala Gly Val Ala Val Ile Leu Ala Gly Val Ile Gly Ser Ile Gly Ala

705 710 715 720

Pro Thr Ser Ala Pro Ser Gly Thr Ile Ala Thr Val Thr Ser His Ala

725 730 735

Ala Met Thr Leu Thr Ala Leu Ile Leu Ala Ser Ala Pro Ser Ala Thr

740 745 750

Gly Ala Ala Ala Ile Leu Met Ala Gly Leu Ala His Ala Val Val Pro

755 760 765

Thr Ser Gly Gly Val Pro Pro Met Gly Gly Gly Gly Gly Met Leu Ala

770 775 780

Thr Leu Gly Gly Ala Ala Ala Ser Thr Ala Ala Gly Ala Ser Val Ala

785 790 795 800

Gly Pro Ala Thr Ser Ala Leu Ala Gly Pro Leu Ala Val Pro Ala Thr

805 810 815

Pro Ser Ser Met Ile His Leu Ala Ala Gly His Pro Ala Pro Ala Met

820 825 830

Thr Thr Ala Ala Gly Ile Leu Gly Ala Leu Thr Pro Leu Gly Ser Pro

835 840 845

Thr Ala Thr Val Ala Pro Gly Leu Leu Ala Thr Ala Ala His Ala Thr

850 855 860

Thr Leu Ala Ile Ile Val Met Thr Ala Pro Ala Leu Thr Ser Gly Thr

865 870 875 880

Leu Ala Leu Pro Ser Gly Ala Thr Thr Ile Val Gly Leu Gly Ala Gly

885 890 895

Ile Gly Gly Leu Ser Leu Gly His Val Met Gly Ala Val Gly Val Pro

900 905 910

Ala Ile Ser Thr Leu Ile Leu Leu Gly

915 920

<210> 2

<211> 2763

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gattctacat ctacaaaagt tatcgttcat taccatcgtt tcgattctaa ctacacaaac 60

tgggatgttt ggatgtggcc ttaccaacct gttaacggca acggcgctgc ttaccaattc 120

acaggcacaa acgatgattt cggcgctgtt gctgatacac aagttcctgg cgataacaca 180

caagttggcc ttatcgttcg taaaaacgat tggtctgaaa aaaacacacc taacgatctt 240

catatcgatc ttgctaaagg ccatgaagtt tggatcgttc aaggcgatcc tacaatctac 300

tacaaccttt ctgatgctca agctgctgct atcccttctg tttctaacgc ttaccttgat 360

gatgaaaaaa cagttcttgc taaactttct atgcctatga cacttgctga tgctgcttct 420

ggcttcacag ttatcgataa aacaacaggc gaaaaaatcc ctgttacatc tgctgtttct 480

gctaaccctg ttacagctgt tcttgttggc gatcttcaac aagctcttgg cgctgctaac 540

aactggtctc ctgatgatga tcatacactt cttaaaaaaa tcaaccctaa cctttaccaa 600

ctttctggca cacttcctgc tggcacatac caatacaaaa tcgctcttga tcattcttgg 660

aacacatctt accctggcaa caacgtttct cttacagttc ctgaaggcgg cgaaaaagtt 720

acattcacat acatcccttc tacaaaccaa gttttcgatt ctgttaacca tcctaaccaa 780

gctttcccta catcttctgc tggcgttcaa acaaaccttg ttcaacttac acttgcttct 840

gctcctgatg ttacacataa ccttgatgtt gctgctgatg gctacaaagc tcataacatc 900

cttcctcgta acgttcttaa ccttcctcgt tacgattact ctggcaacga tcttggcaac 960

gtttactcta aagatgcgac tagcttccgt gtttgggcgc ctacagcttc taacgttcaa 1020

cttcttcttt acaactctga aaaaggctct atcacaaaac aacttgaaat gcaaaaatct 1080

gataacggca catggaaact tcaagtttct ggcaaccttg aaaactggta ctacctttac 1140

caagttacag ttaacggcac aacacaaaca gctgttgatc cttacgctcg tgctatctct 1200

gttaacgcta cacgtggcat gatcgttgat cttaaagcta cagatcctgc tggctggcaa 1260

ggcgatcatg aacaaacacc tgctaaccct gttgatgaag ttatctacga agctcatgtt 1320

cgtgatttct ctatcgatgc taactctggc atgaaaaaca aaggcaaata cctcgcgttc 1380

acagaacatg gcacaaaagg ccctgatcat gttaaaacag gcatcgattc tcttaaagaa 1440

cttggcatca caacagttca acttcaacct gttgaagaat tcaactctat cgatgaaaca 1500

caacctgata catacaactg gggctacgat cctcgtaact acaacgttcc tgaaggcgct 1560

tacgctacaa cacctgaagg cacagctcgt atcacagaac ttaaacaact tatccaatct 1620

cttcatcaac aacgtatcgg cgttaacatg gatgttgttt acaaccatac attcgacgtt 1680

atggtaagcg atttcgataa aatcgttcct caatactact accgtacaga ttctaacggc 1740

aactacacaa acggctctgg cggcaacgaa ttcgctacag aacatcctat ggctcaaaaa 1800

ttcgttcttg attctgttaa ctactgggtt aacgaatacc atgttgatgg cttccgtttc 1860

gatcttatgg ctcttcttgg caaagataca atggctaaaa tctctaacga acttcatgct 1920

atcaaccctg gcatcgttct ttacggcgaa ccttggacag gcggcacttc gggcctgagc 1980

tctgatcaac ttgttacaaa aggccaacaa aaaggccttg gcatcggcgt tttcaacgat 2040

aacatccgta acggcttaga cggcaacgtg ttcgacaaaa cagctcaagg cttcgctaca 2100

ggcgatccta accaagttga tgttatcaaa aacggcgtta tcggctctat ccaagatttc 2160

acatctgctc cttctgaaac aatcaactac gttacatctc atgacaatat gacactctgg 2220

gacaaaatcc ttgcttctaa cccttctgat acagaagctg atcgtatcaa aatggatgaa 2280

cttgctcatg ctgttgtttt cacatctcaa ggcgttcctt tcatgcaagg cggcgaagaa 2340

atgcttcgta caaaaggcgg caacgataac tcttacaacg ctggcgattc tgttaaccaa 2400

ttcgattggt ctcgtaaagc tcaattcaaa gatgttttcg attacttctc ttctatgatc 2460

catcttcgta accaacatcc tgctttccgt atgacaacag ctgatcaaat caaacaaaac 2520

cttacattcc ttgaatctcc tacaaacaca gttgctttcg aacttaaaaa ctacgctaac 2580

catgatacat ggaaaaacat catcgttatg tacaacccta acaaaacatc tcaaacactt 2640

aaccttcctt ctggcgattg gacaatcgtt ggccttggcg atcaaatcgg cgaaaaatct 2700

cttggccatg ttatgggcaa cgttcaagtt cctgctatct ctacacttat ccttaaacaa 2760

tag 2763

<210> 3

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agggatgcct aaaaacgaag aacattaaaa acatatattt gcaccgtcta atggatttat 60

gaaaaatcat tttatcagtt tgaaaattat gtattatgaa aagtg 105

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggatccaggg atgcctaaaa acgaaga 27

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctagactat tgtttaagga taagtgta 28

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtacctcga ttgtttgaga aaaga 25

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgctttcgtt tttgaatcat ttatattttc aaa 33

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaaaatataa atgattcaaa aacgaaagcg tgc 33

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggatcctgca gcccaagttt tagataccg 29

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agatctatgt ttgcaaaacg attcaaaacc 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtacccgcc cgatcagacc agtttttaat 30

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaattccaag tgaacgatgg taaactg 27

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggatcctcaa tggggaagag aaccgct 27

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaattcaggg atgcctaaaa acgaaga 27

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggtaccctat tgtttaagga taagtgta 28

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gaattctcga ttgtttgaga aaaga 25

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgctttcgtt tttgaatcat ttatattttc aaa 33

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaaaatataa atgattcaaa aacgaaagcg tgc 33

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaattctgca gcccaagttt tagataccg 29

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgcgtccttc tttgtgcttg ga 22

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggatccaatg tgtaacatat gatattgta 29

<210> 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggatcctcga ttgtttgaga aaagaaga 28

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ttatattttc aaattttcaa ggt 23

Claims

1.一种普鲁兰酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种普鲁兰酶表达载体，其特征在于，包括整合了权利要求1所述的SEQ ID NO.2序列的自主复制型表达质粒，所述自主复制型表达质粒包括pWB980、pHP13、pHP13-43、pHT01、pHT43、pHT304、pMK3、pMK4、pHCMC04、pHCMC05、pMA5或 pBE中的任意一种。

3.权利要求2所述的普鲁兰酶表达载体的构建方法，其特征在于，包括通过引物扩增SEQ ID NO.2序列，回收扩增产物，连接到T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选后利用限制性内切酶酶切T载体和自主复制型表达质粒，通过DNA连接酶连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到。

4.根据权利要求2所述的普鲁兰酶表达载体，其特征在于，所述自主复制型表达质粒的启动子可由以下启动子中的任意一种所替代：veg、lepA、liaG、liaL、sodA或glnA；所述自主复制型表达质粒的信号肽由以下信号肽中的任意一种所替代： chiA或pbpA。

5.根据权利要求3所述的普鲁兰酶表达载体的构建方法，其特征在于，通过引物pul-F：ggatccAGGGATGCCTAAAAACGAAGA和引物pul-R：tctagaCTATTGTTTAAGGATAAGTGTA扩增SEQ IDNO.2序列，回收扩增产物，连接到T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选后利用限制性内切酶酶切T载体和自主复制型表达质粒pHT43，通过DNA连接酶连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到。

6.一种整合型普鲁兰酶表达载体，其特征在于，包括整合了权利要求1所述的SEQ IDNO.2序列的整合型质粒。

7.根据权利要求6所述的整合型普鲁兰酶表达载体，其特征在于，所述整合型质粒包括任何能够在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中复制的并且能够通过同源重组的方法整合到染色体上的质粒。

8.根据权利要求6所述的整合型普鲁兰酶表达载体，其特征在于，所述整合型质粒的启动子由包括以下任意一种的复合启动子或串联启动子替代，复合启动子可选择PamyL+PamyQ、PamyL+PamyE、PamyE+PamyQ、PamyL+PaprE、PamyL+PlepA、PamyL+PsodA、PamyQ+PaprE、PamyQ+PlepA、PamyQ+PsodA、PamyE+PaprE、PamyE+PlepA、PamyE+PsodA、PaprE+PlepA、PaprE+PsodA、PlepA+PsodA、PamyL+PamyQ+ PamyE、PamyL+PamyQ+ PaprE或PamyL+PamyQ+ PlepA中的任意一种；串联启动子可选择Dimer PamyL、Dimer PamyQ、Dimer PamyE、Dimer PaprE、Dimer PlepA、Dimer PsodA、Trimer PamyL、Trimer PamyQ、Trimer PamyE、Trimer PaprE、Trimer PlepA或Trimer PsodA中的任意一种。