CN106591351A - 一种能利用淀粉并分泌抗菌肽的重组酿酒酵母 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能利用淀粉并分泌抗菌肽的重组酿酒酵母，该重组酿酒酵母中含有能利用淀粉并分泌抗菌肽的多基因共表达载体，该载体中含有α‑淀粉酶基因、糖化酶基因、抗菌肽基因。本发明基因重组酿酒酵母通过在表达抗菌肽基因的同时，对淀粉降解酶中的淀粉酶和糖化酶间的共表达，发挥其降解淀粉间的协同作用，因而可以实现重组菌降解利用淀粉基料进行菌体生长、生产乙醇或者分泌抗菌肽等。从而，可以利用本发明构建的重组酵母实现在以淀粉基料为主的饲料添加、工业酒精生产、餐厨废弃物降解中同步实现淀粉降解利用、酵母菌体生长、酒精转化以及抑制杂菌生长等多种目的。

Description

一种能利用淀粉并分泌抗菌肽的重组酿酒酵母

技术领域

本发明涉及基因工程和发酵工程以及进化工程领域，更具体地，涉及一种能利用淀粉基料并分泌抗菌肽的基因重组酿酒酵母。

背景技术

饲料原料大部分是含有淀粉的基料，例如谷实类(玉米、稻谷、麦类)、根茎类(如木薯、红苕等)中都含有大量淀粉。淀粉在动体内的淀粉酶、蔗糖酶等作用下，最后分解为葡萄糖，被动物作为能量利用。尽管动物体内能分泌淀粉降解相关酶系，但是在动物养殖中一般需要通过外加例如淀粉酶、糖化酶等酶制剂帮助动物消化利用淀粉。例如，早期断奶仔猪常需要添加例如淀粉酶、蛋白酶等酶类，弥补体内分泌消化酶的不足。工业酒精生产中也会利用一些含有淀粉基料的废弃物进行淀粉-乙醇的转化。

抗生素自发现以来，是治疗动物以及人类疾病的基本手段。然而，证实滥用抗生素会导致细菌性病原体产生普遍的耐药性。在动物养殖中，抗生素的滥用的情况更为严重。因而，需要寻找新型安全的抗菌剂代替抗生素。抗菌肽作为一种新型的抗菌剂，具有广谱的抗细菌活性，还有抗真菌、病毒和寄生虫的活性，甚至具有抗肿瘤等功能。它独特的抗菌机理，不易产生耐药性的特点，使其有望成为替代抗生素的主要候选抗菌剂。抗菌肽作为饲料添加剂一种，还发挥着提高生长性能、增强免疫功能以及抗菌作用等功能。

酿酒酵母作为益生菌，能够在养殖动物肠道中进行“生物夺氧”，抑制需氧的致病菌生长；同时其蛋白含量丰富，能够为动物补充氮源。因而，酿酒酵母成为饲料添加剂益生菌中的重要组成。大多酿酒酵母一般不能够直接利用物料中淀粉，需要通过基因工程改造往酿酒酵母中转入淀粉酶基因、糖化酶基因等与淀粉降解相关酶系的基因。酿酒酵母表达系统可通过基因工程改造，获得能够分泌淀粉降解相关酶、利用淀粉进行生长的益生酿酒酵母。酿酒酵母虽通过“生物夺氧”来抑制需氧的致病菌生长，若是能够通过基因工程改造使得酿酒酵母分泌抗菌肽等，其抑制杂菌和致病菌的生长的能力进一步增强，应用则更为广泛，有效。而大多研究人员只是尝试了将不同的抗菌肽单一在酿酒酵母系统中表达，并简单应用到饲料添加中。本发明则进一步利用“Golden Gate”克隆法的构建多基因共表达技术，实现淀粉降解基因与抗菌肽基因的共表达；并采用高抗筛选、适应性进化等方法获得稳定的高效利用淀粉分泌抗菌肽的重组酵母。这样可实现重组酿酒酵母分泌淀粉降解酶类，降解利用淀粉基料进行菌体生长、生产乙醇或者分泌抗菌肽等。因而，可以利用本发明构建的重组酵母实现在以淀粉基料为主的酵母培养物的饲料添加、工业酒精生产、餐厨废弃物降解中同步实现淀粉降解利用、酵母菌体生长、酒精转化以及抑制杂菌生长等多种目的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述不足，提供一种能够在饲料添加、工业酒精生产、餐厨废弃物降解中可应用的，能降解利用淀粉并分泌抗菌肽重组酿酒酵母。

本发明的目的在于提供一种酿酒酵母多基因共表达载体及其构建方法。

本发明的目的在于提供一种能高效利用淀粉并分泌抗菌肽的重组酿酒酵母。

本发明所采取的技术方案是：

一种酿酒酵母多基因共表达载体，该载体中含有α-淀粉酶基因、糖化酶基因、抗菌肽基因；

所述α-淀粉酶基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；

所述糖化酶基因的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步的，所述抗菌肽基因选自菌丝霉素、鲶鱼抗菌肽突变体、乳铁蛋白肽、脆皮蛙的抗菌肽突变体；

所述菌丝霉素的碱基序列如SEQ ID NO：3所示；

所述鲶鱼抗菌肽突变体的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；

所述乳铁蛋白肽的碱基序列如SEQ ID NO：5所示；

所述脆皮蛙的抗菌肽突变体的碱基序列如SEQ ID NO：6所示。

进一步的，所述α-淀粉酶基因、糖化酶基因、抗菌肽基因上游均引入α-信号肽基因序列，α-信号肽基因的碱基序列如SEQ ID NO：7所示。

进一步的，所述α-淀粉酶基因的启动子为pgk1-1，其碱基序列如SEQ ID NO：8所示，终止子为pgkt1-1，其碱基序列如SEQ ID NO：9所示；

所述糖化酶基因的启动子为pgk1-2，其碱基序列如SEQ ID NO：10所示，终止子为pgkt1-2，其碱基序列如SEQ ID NO：11所示；

所述抗菌肽基因的启动子为pgk1-3，其碱基序列如SEQ ID NO：12所示，终止子为pgkt1-3，其碱基序列如SEQ ID NO：13所示。

进一步的，上述载体的筛选基因中含有G418抗性基因。

进一步的，上述载体的骨架为pGAPZaA质粒。

进一步的，上述载体中含有酿酒酵母菌的25s rDNA基因片段，其碱基序列如SEQID NO：15所示。

一种能高效利用淀粉并分泌抗菌肽的重组酿酒酵母，该重组酿酒酵母基因组中插入有上述任一所述的多基因共表达载体。

上述任一所述酿酒酵母多基因共表达载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1整合表达载体pTEGC-BsmBI构建：

S1.1将G418抗性基因连入pGAPZaA质粒载体的多克隆位点Msc I和EcoR V之间，获得载体pGAPZaA-G418；

S1.2将碱基序列如SEQ ID NO：15所示的rDNA基因序列的连入载体pGAPZaA-G418多克隆位点BamHI和EcoRI之间，获得载体pGAPZaA-G418-rDNA；

S1.3将载体pGAPZaA-G418-rDNA经Bgl II和EcoRI双酶切后，回收大片段产物，得到线性化载体pTEGC，将碱基序列如SEQ ID NO：16所示的BsmBI-2片段与线性化载体pTEGC连接，得整合表达载体pTEGC-BsmBI；

S2启动子、终止子的扩增

S2.1启动子的扩增：以酿酒酵母基因组DNA为模板，分别用引物对PGK1F1-BsmBI和PGK1R1-BsmBI、PGK1F2-BsmBI和PGK1R2-BsmBI、PGK1F3-BsmBI和PGK1R3-BsmBI分别扩增出pgk1-1、pgk1-2、pgk1-3启动子片段；

S2.2终止子的扩增：以酿酒酵母基因组DNA为模板，分别用引物对PGKT1F1-BsmBI和PGKT1R1-BsmBI、PGKT1F2-BsmBI和PGKT1R2-BsmBI、PGKT1F3-BsmBI和PGKT1R3-BsmBI分别扩增出pgkt1-1、pgkt1-2、pgkt1-3终止子片段；

S3α-信号肽基因、α-淀粉酶基因、糖化酶基因、抗菌肽基因的获得

S3.1α-信号肽-α-淀粉酶基因的获得：分别以含α-信号肽基因序列的T载体、含α-淀粉酶基因序列的T载体为模板，通过引物MfaF1-BsmBI、Mfa-an-amyR、Mfa-an-amyF和An-amyR-BsmBI进行重叠延伸PCR将α-信号肽基因序列定向连入α-淀粉酶基因的5’端，扩增出mfa-an-amy基因片段，即含有α-信号肽基因序列和α-淀粉酶基因序列的片段；

S3.2α-信号肽-糖化酶基因的获得：分别以含α-信号肽基因序列的T载体、含糖化酶基因的T载体为模板，通过引物MfaF2-BsmBI、Mfa-ao-gaR、Mfa-ao-gaF和Ao-gaR-BsmBI进行重叠延伸PCR将α-信号肽序列定向连入无信号肽的糖化酶基因的5’端，扩增出基因片段mfa-ao-ga，即含α-信号肽基因序列和糖化酶基因的片段；

S3.3α-信号肽-抗菌肽基因的获得：分别以含α-信号肽基因序列的T载体、含抗菌肽的T载体为模板，通过重叠延伸PCR将α-信号肽序列定向连入无信号肽的抗菌肽基因的5’端，扩增出mfa-amp基因片段，即含有α-信号肽基因序列和抗菌肽基因序列的片段；所述重叠延伸PCR过程中，通过引物将扩增产物mfa-amp的两端引入切割方向相反的BsmBI的切割序列；

S4酿酒酵母多基因共表达载体的构建

将上述获得的α-淀粉酶基因表达盒元件pgk1-1、mfa-an-amy、pgkt1-1；糖化酶表达盒元件pgk1-2、mfa-ao-ga、pgkt1-2；抗菌肽基因表达盒元件pgk1-3、mfa-amp、pgkt1-3利用IIs型限制性内切酶BsmBI进行酶切，纯化回收；同时，利用IIs型限制性内切酶BsmBI切割上述整合表达载体pTEGC-BsmBI，将其线性化；将所用这些片段通过一步法定向连入线性化的整合表达载体pTEGC-BsmBI中，即得酿酒酵母多基因共表达载体；

上述所述引物的碱基序列如下：

PGK1F1-BsmBI：CGTCTCAgatc GAAGTACCTTCAAAG

PGK1R1-BsmBI：CGTCTCGgctaTATATTTGTTGTAAA

PGK1F2-BsmBI：CGTCTCAgtcaGAAGTACCTTCAAAG

PGK1R2-BsmBI：CGTCTCGgcatTATATTTGTTGTAAA

PGK1F3-BsmBI：CGTCTCAtgcaGAAGTACCTTCAAAG

PGK1R3-BsmBI：CGTCTCGtcgaTATATTTGTTGTAAA

PGKT1F1-BsmBI：CGTCTCAtgtacGATCTCCCATCGTCTCTACT

PGKT1R1-BsmBI：CGTCTCGgtcaAAGCTTTTTCGAAACGCAG

PGKT1F2-BsmBI：CGTCTCAtacgGATCTCCCATCGTCTCTACT

PGKT1R2-BsmBI：CGTCTCGtgcaAAGCTTTTTCGAAACGCAG

PGKT1F3-BsmBI：CGTCTCAatcgGATCTCCCATCGTCTCTACT

PGKT1R3-BsmBI：CGTCTCGagtcAAGCTTTTTCGAAACGCAG

MfaF1-BsmBI：CGTCTCAgctaATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC

Mfa-an-amyR：AACAAGAAAGACAACATTCTTTTCTCGAGAGA

Mfa-an-amyF：TCTCTCGAGAAAAGAATGTTGTCTTTCTTGTT

An-amyR-BsmBI：CGTCTCAgtacTTTAAGCCAACTTGTAGATGT

MfaF2-BsmBI：CGTCTCAgcatATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC

Mfa-ao-gaR：ACAAGTTGTTTCTCATTCTTTTCTCGAGAGA

Mfa-ao-gaF：TCTCTCGAGAAAAGAATGAGAAACAACTTGT

Ao-gaR-BsmBI：CGTCTCAtacgTTTACCAAGAACCAACAGTTGGAGT。

一种能高效利用淀粉并分泌抗菌肽的重组酿酒酵母的构建方法，将上述构建的酿酒酵母多基因共表达载体转化酿酒酵母宿主，筛选出阳性单克隆菌落，并测序验证正确，并分泌出α-淀粉酶、糖化酶以及抗菌肽等，即得能高效利用淀粉并分泌抗菌肽的重组酿酒酵母。

本发明的有益效果是：

本发明基因重组酿酒酵母通过在表达抗菌肽基因的同时，对淀粉降解酶中的淀粉酶和糖化酶间的共表达，发挥其降解淀粉间的协同作用，因而可以实现重组菌降解利用淀粉基料进行菌体生长、生产乙醇或者分泌抗菌肽等。从而，可以利用本发明构建的重组酵母实现在以淀粉基料为主的饲料添加、工业酒精生产、餐厨废弃物降解中同步实现淀粉降解利用、酵母菌体生长、酒精转化以及抑制杂菌生长等多种目的。

附图说明

图1为整合表达载体pTEGC-BsmBI构建流程；

图2为实施例2构建的重组酿酒酵母降解淀粉平板水解圈；0号为宿主酿酒酵母，1-20为挑取的不同单克隆；

图3为重组酿酒酵母对金色葡萄球菌ATCC25923的抑菌活性检测结果；图中A、B均为本发明重组酿酒酵母菌的发酵液，Amp为氨苄青霉素，作为阳性对照，H₂O为阴性对照；

图4为重组酿酒酵母对伤寒沙门氏菌CMCC50071的抑菌活性；图中A、B均为本发明重组酿酒酵母菌的发酵液，Amp为氨苄青霉素，作为阳性对照，H₂O为阴性对照；

图5为实施例2重组酿酒酵母对淀粉利用情况；图中重组酿酒酵母在4d基本能够利用完淀粉，宿主酿酒酵母则基本不消耗利用淀粉；

图6为实施例2重组酿酒酵母利用淀粉的菌体生长情况；图中重组酿酒酵母菌体浓度快速增加，宿主酿酒酵母则基本不增长；

图7为实施例2重组酿酒酵母利用淀粉的生产乙醇情况；图中重组酿酒酵母有乙醇生成，宿主酿酒酵母则无乙醇生成。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1酿酒酵母多基因共表达载体的构建

一、整合表达载体pTEGC-BsmBI构建

1)G418抗性基因的获得

PCR扩增目的基因，以载体pPIC9k为模板，利用G418F-MscI和G418R-EcoRV引物(表1)扩增G418抗性基因。PCR反应条件：98℃10s，55℃15s，72℃50s，30个循环，72℃10min。经2％琼脂糖凝胶电泳验证。

目的基因回收、纯化、转化大肠杆菌、验证、送样测序。回收纯化目的片段，保存于-20℃备用。将得到的G418抗性基因与T载体连接，转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃培养，提取其质粒DNA，利用G418F-MscI和G418R-EcoRV引物进行菌落PCR筛选阳性菌株，将阳性克隆送至英潍捷基测序验证基因的正确性。测序结果表明：G418抗性基因及其酶切位点正确连入T载，未发生突变，G418抗性基因的碱基序列如SEQ ID NO：14所示。

表1扩增G418抗性基因引物

注：下划线处字母为限制性内切酶的识别/切割序列。

2)载体pGAPZaA-G418的构建

在37℃下，利用限制性内切酶MscI和EcoRV切割pGAPZaA质粒，并在1.5％的琼脂糖凝胶电泳验证；利用限制性内切酶切割MscI和EcoRV切割pMD-G418载体，获得G418抗性基因，在1.5％的琼脂糖凝胶电泳验证；回收纯化上述酶切产物中的pGAPZaA载体、G418抗性基因，利用T4连接酶将G418抗性基因连入载体pGAPZaA，获得载体pGAPZaA-G418。

3)rDNA基因扩增

以酿酒酵母基因组DNA为模板，采用引物rDNAF和rDNAR引物(见表2)PCR扩增25srDNA基因；PCR扩增条件为：98℃10s，55℃15s，72℃60s，30个循环，72℃10min；在1％琼脂糖凝胶电泳验证，并在上下游分别引入EcoRI和BamHI酶切位点。

将得到的rDNA基因与T载体连接，转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃培养，提取其质粒DNA，利用rDNAF和rDNAR引物进行菌落PCR筛选阳性菌株。测序结果表明：rDNA基因及其酶切位点正确连入T载，未发生突变，rDNA基因的碱基序列如SEQ ID NO：15所示。

表2扩增rDNA基因引物

注：下划线处字母为限制性内切酶的识别/切割序列。

4)载体pGAPZaA-G418-rDNA构建

利用限制性内切酶BamHI和EcoRI分切下上述T载体上的rDNA片段、切割质粒pGAPZaA-G418，回收纯化pGAPZaA-G418载体骨架，利用T4连接酶将rDNA连入线性化后的载体pGAPZaA-G418，获得重组载体pGAPZaA-G418-rDNA。

5)整合表达载体pTEGC-BsmBI构建

限制性内切酶切割Bgl II和EcoRI切割质粒pGAPZaA-G418-rDNA，切除该载体上BglII到EcoRI酶切位点间的GAP启动子、a-信号肽等序列，回收大片段产物，得到线性化载体pTEGC。

以pMD19-T simple载体为模板，通过引物PMDF-BsmBI和PMDR-BsmBI(见表3)扩增出含有2个BsmBI酶切位点识别序列，约233bp的片段BsmBI-2，连入T载体，送至英潍捷基测序，测序正确，未发生突变，BsmBI-2的碱基序列如SEQ ID NO：16所示。

利用限制性内切酶切割Bgl II和EcoR I切下含片段BsmBI-2的重组后的T载体，回收约233bp的DNA片段BsmBI-2，然后利用T4连接酶将其正确连入线性化载体pTEGC，获得整合表达载体pTEGC-BsmBI。

表3扩增含BsmBI骨架DNA引物

注：下划线处的大写字母为BglII或EcoRI酶切位点；小写字母为IIs型限制性内切酶BsmBI酶的识别序列。

上述整合表达载体pTEGC-BsmBI的构建流程示意图如图1所示。

二、启动子、终止子的扩增

1)启动子的扩增：

以酿酒酵母基因组DNA为模板，利用PGK1F1-BsmBI和PGK1R1-BsmBI引物(见表4)扩增出pgk1-1启动子片段(其碱基序列如SEQ ID NO：8所示)，用作表达α-淀粉酶基因的启动子。

同理，以酿酒酵母基因DNA为模板，利用PGK1F2-BsmBI和PGK1R2-BsmBI引物(见表4)扩增出pgk1-2启动子片段(其碱基序列如SEQ ID NO：10所示)，用作表达糖化酶基因的启动子。

同理，以酿酒酵母基因DNA为模板，利用PGK1F3-BsmBI和PGK1R3-BsmBI引物(见表4)扩增出pgk1-3启动子片段(其碱基序列如SEQ ID NO：12所示)，用作表达抗菌肽基因的启动子。

上述扩增所得启动子基因片段均分别连入到pMD19-T Simple载体中，测序验证，保留正确的阳性克隆。

2)终止子的扩增：

以酿酒酵母基因组DNA为模板，利用引物PGKT1F1-BsmBI和PGKT1R1-BsmBI(见表4)扩增pgkt1-1终止子(其碱基序列如SEQ ID NO：9所示)，用于表达α-淀粉酶基因的终止子。

以酿酒酵母基因组DNA为模板，利用引物PGKT1F2-BsmBI和PGKT1R2-BsmBI(见表4)扩增pgkt1-2终止子(其碱基序列如SEQ ID NO：11所示)，用于表达糖化酶基因的终止子。

以酿酒酵母基因组DNA为模板，利用引物PGKT1F3-BsmBI和PGKT1R3-BsmBI(见表4)扩增pgkt1-3终止子(其碱基序列如SEQ ID NO：13所示)，用于表达抗菌肽基因的终止子。

上述扩增得到终止子基因片段均连入到pMD19-T Simple载体中，测序验证，保留正确的阳性克隆。

表4扩增酿酒酵母启动子、终止子的引物

注：下划线处大写字母为IIs型限制性内切酶BsmBI的识别序列，下划线小写粗体字母为IIs型限制性内切酶BsmBI的切割序列。

三、α-信号肽基因、α-淀粉酶基因、糖化酶基因、抗菌肽基因的获得

1)α-信号肽基因的获得：以酿酒酵母基因组DNA为模板，利用MfaF和MfaR引物(见表5)扩增得到Mfa-BsmBI片段，扩增程序如下：98℃10s，55℃15s，72℃30s，30个循环，72℃10min；连入T载体，送样测序，挑选正确的阳性克隆，从而将α-信号肽基因(其碱基序列如SEQ ID NO：7所示)保存至T载体中。

表5扩增α-信号肽基因、α-淀粉酶基因、糖化酶基因、抗菌肽基因引物

注：下划线处大写字母为IIs型限制性内切酶BsmBI的识别序列，下划线处小写粗体字母为IIs型限制性内切酶BsmBI的切割序列。

2)α-淀粉酶基因的获得：参考黑曲酶(Aspergillus niger)的α-淀粉酶基因an-amy(XM_001389725.2)，经密码优化后，通过人工合成优化后的淀粉酶基因的(α-淀粉酶基因an-amy)的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。(氨基酸序列中含有信号肽)

3)糖化酶基因的获得：参考Genbank上公布的米曲霉(Aspergillus oryzae)糖化酶基因ao-ga(XM_001819466.2)，经密码子优化后，通过人工合成优化后的糖化酶基因(糖化酶基因ao-ga)的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；(氨基酸序列中含有信号肽)

4)抗菌肽基因的获得：本研究选用的抗菌肽有人工合成优化后的菌丝霉素，其碱基序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列为GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGG FVCKCY(SEQ ID NO：17)；鲶鱼抗菌肽突变体par-T，其碱基序列如SEQ ID NO：4所示，氨基酸序列为KGRGKQGGKVRKSS(SEQ ID NO：18)；乳铁蛋白肽，其碱基序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列为FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF(SEQ ID NO：19)；脆皮蛙的抗菌肽突变体Lf-cath-T，其碱基序列如SEQ ID NO：6所示，氨基酸序列为GKCNVLGQRKQLLRSIGSGSHIGSVVLPRG(SEQ IDNO：20)。本实施例选用脆皮蛙的抗菌肽突变体Lf-cath-T作为抗菌肽，用于后续酿酒酵母多基因共表达载体的构建。

将上述所得α-淀粉酶基因an-amy、糖化酶基因ao-ga、抗菌肽基因序列分别保存于pMD19-T Simple质粒中，备用。

5)α-信号肽-α-淀粉酶基因的获得：分别以含α-信号肽基因序列的T载体、含α-淀粉酶基因序列的T载体为模板，用特异引物MfaF1-BsmBI、Mfa-an-amyR、Mfa-an-amyF以及An-amyR-BsmBI(见表5)通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)将α-信号肽基因序列定向连入α-淀粉酶基因的5’端，扩增出mfa-an-amy基因片段(含α-信号肽基因序列和α-淀粉酶基因序列)。

6)α-信号肽-糖化酶基因的获得：分别以含α-信号肽基因序列的T载体、含糖化酶基因ao-ga的T载体为模板，用引物MfaF2-BsmBI、Mfa-ao-gaR、Mfa-ao-gaF以及Ao-gaR-BsmBI(见表5)通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)将α-信号肽序列定向连入无信号肽的糖化酶基因的5’端，扩增出基因片段mfa-ao-ga(含α-信号肽基因序列和糖化酶基因ao-ga)。

7)α-信号肽-抗菌肽基因的获得：分别以含α-信号肽基因序列的T载体、含脆皮蛙的抗菌肽突变体Lf-cath-T的T载体为模板，用引物MfaF3-BsmBI、Mfa-ampF、Mfa-ampR以及Mfa-ampR-BsmBI(见表5)通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)将α-信号肽序列定向连入无信号肽的抗菌肽基因的5’端，扩增出mfa-amp-cath-T基因片段(含α-信号肽基因序列和脆皮蛙的抗菌肽突变体Lf-cath-T)。

上述扩增得到基因片段均连入到pMD19-Simple载体中，测序验证，保留正确的阳性克隆。

四、酿酒酵母多基因共表达载体pTEGC-amy-ga-cath-T的构建

将上述“二”和“三”中获得的α-淀粉酶基因表达盒元件pgk1-1(启动子)、mfa-an-amy(含α-信号肽基因序列和α-淀粉酶基因序列)、pgkt1-1(终止子)；糖化酶表达盒元件pgk1-2(启动子)、mfa-ao-ga(含α-信号肽基因序列和糖化酶基因ao-ga)、pgkt1-2(终止子)；抗菌肽基因表达盒元件pgk1-3(启动子)、mfa-amp-cath-T(含α-信号肽基因序列和脆皮蛙的抗菌肽突变体Lf-cath-T)、pgkt1-3(终止子)利用IIs型限制性内切酶BsmBI分别从T载体切下，纯化回收；同时，利用IIs型限制性内切酶BsmBI切割上述“一”中构建的整合表达载体pTEGC-BsmBI，将其线性化。利用T4连接酶将上述片段“一步法”定向连入线性化的整合表达载体pTEGC-BsmBI中，获得酿酒酵母多基因共表达载体pTEGC-amy-ga-cath-T，转化大肠杆菌DH5a，挑选转化子，测序验证，获得正确连接的阳性转化子，提取质粒，即得能高效利用淀粉并分泌抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体。

实施例2一种能高效利用淀粉并分泌抗菌肽的重组酿酒酵母

一、重组酵母转化子的筛选与验证

在酿酒酵母进行电转化之前，对酿酒酵母进行抗性筛选标记G418的敏感性实验，结果发现在G418浓度为200μg/ml的YPD平板上酵母被抑制不能生长，选取200μg/ml以上的抗性浓度进行筛选，如300μg/ml。

将实施例1构建的酿酒酵母多基因共表达载体pTEGC-amy-ga-cath-T用限制性内切酶HpaI线性化，采用醋酸锂介导的电穿孔转化法转入酿酒酵母中，在G418浓度为300μg/ml的YPD平板上培养48h以上，挑取长出的单菌落为转化子。经PCR验证后的转化子逐步在含300μg/ml、500μg/ml、600μg/ml的G418的YPD液体培养基中筛选，获得阳性单克隆菌落，测序验证，获得正确连接的阳性重组酵母转化子，即能高效利用淀粉并分泌抗菌肽的重组酿酒酵母。

二、重组酿酒酵母分泌的淀粉降解酶的酶活性及抑菌活性检验

将上步所得能高效利用淀粉并分泌抗菌肽的重组酿酒酵母菌落转接到含有1％可溶性淀粉的YNBS培养基平板上，配方如下：YNB 6.7g/l，可溶性淀粉10g/l，琼脂粉15g/l，在30℃条件下培养48h以上，利用用固态的碘升华出蒸气熏蒸平板，观察有无透明的水解圈。

观察结果如图2所示，从中可以看出，本实施例构建的重组酿酒酵母菌落周围有明显淀粉水解透明圈出现，说明其能够降解利用淀粉。

将革兰氏阳性菌金色葡萄球菌ATCC22023、革兰氏阴性菌伤寒沙门氏菌CMCC50071作为受试菌，经液体培养基中培养至在OD₆₀₀nm＝0.4-1，适当稀释、混匀、均匀涂布至MH培养基中。将本实施例所得重组酿酒酵母菌的发酵液加入牛津杯中，以灭菌水为阴性对照，以氨苄青霉素(1μg)为阳性对照，在37℃培养16-18h，观察抑菌圈情况。

观察结果如图3和图4所示，从中可以看出，本实施例构建的重组酿酒酵母菌的发酵液对金色葡萄球菌ATCC22023和菌伤寒沙门氏菌CMCC50071均有明显的抑菌圈，说明所得重组菌成功分泌出抗菌肽。

实施例3酿酒酵母多基因共表达载体的构建

本实施例构建酿酒酵母多基因共表达载体的方法同实施例1，除了连入载体的抗菌肽基因为菌丝霉素的优化后基因(碱基序列如SEQ ID NO：3所示)外，其他均与实施例1相同，本实施例构建的酿酒酵母多基因共表达载体命名为pTEGC-amy-ga-plec。

实施例4酿酒酵母多基因共表达载体的构建

本实施例构建酿酒酵母多基因共表达载体的方法同实施例1，除了连入载体的抗菌肽基因为鲶鱼抗菌肽突变体的优化后基因(碱基序列如SEQ ID NO：4所示)外，其他均与实施例1相同，本实施例构建的酿酒酵母多基因共表达载体命名为pTEGC-amy-ga-par。

实施例5酿酒酵母多基因共表达载体的构建

本实施例构建酿酒酵母多基因共表达载体的方法同实施例1，除了连入载体的抗菌肽基因为乳铁蛋白肽基因(碱基序列如SEQ ID NO：5所示)外，其他均与实施例1相同，本实施例构建的酿酒酵母多基因共表达载体命名为pTEGC-amy-ga-Lfcin。

实施例6一种重组酿酒酵母的构建

将实施例3构建的酿酒酵母多基因共表达载体pTEGC-amy-ga-plec用限制性内切酶线性化，采用醋酸锂介导的电穿孔转化法转入酿酒酵母中，在G418浓度为300μg/ml的YPD平板上培养48h以上，挑取长出的单菌落为转化子。经PCR验证后的转化子逐步在含300μg/ml、500μg/ml、600μg/ml的G418的YPD液体培养基中筛选，获得阳性单克隆菌落，测序验证，获得正确连接的阳性重组酵母转化子，即可。

实施例7一种重组酿酒酵母的构建

将实施例4构建的酿酒酵母多基因共表达载体pTEGC-amy-ga-par用限制性内切酶线性化，采用醋酸锂介导的电穿孔转化法转入酿酒酵母中，在G418浓度为300μg/ml的YPD平板上培养48h以上，挑取长出的单菌落为转化子。经PCR验证后的转化子逐步在含300μg/ml、500μg/ml、600μg/ml的G418的YPD液体培养基中筛选，获得阳性单克隆菌落，测序验证，获得正确连接的阳性重组酵母转化子，即可。

实施例8一种重组酿酒酵母的构建

将实施例5构建的酿酒酵母多基因共表达载体pTEGC-amy-ga-Lfcin用限制性内切酶线性化，采用醋酸锂介导的电穿孔转化法转入酿酒酵母中，在G418浓度为300μg/ml的YPD平板上培养48h以上，挑取长出的单菌落为转化子。经PCR验证后的转化子逐步在含300μg/ml、500μg/ml、600μg/ml的G418的YPD液体培养基中筛选，获得阳性单克隆菌落，测序验证，获得正确连接的阳性重组酵母转化子，即可。

实施例9抗菌肽突变体与原抗菌肽的抗菌性能对比

通过多肽合成公司进行合成鲶鱼抗菌肽parasin及突变体par-T(其碱基序列如SEQ ID NO：3所示)、脆皮蛙的抗菌肽Lf-cath及其突变体Lf-cath-T(其碱基序列如SEQ IDNO：6所示)。分别以大肠杆菌CICC10899和金色葡萄球菌ATCC22023作为指示菌，采用牛津杯法检测不同类别抗菌肽的抑菌圈的大小(重复3次)，比较抗菌肽在突变前后抑菌圈的大小。

实验结果如表6所示，鲶鱼抗菌肽突变体和脆皮蛙的抗菌肽突变体对大肠杆菌CICC10899和金色葡萄球菌ATCC2202的抑菌圈均大于未突变的鲶鱼抗菌肽和未突变的脆皮蛙抗菌肽，说明，本发明所用的鲶鱼抗菌肽突变体和脆皮蛙的抗菌肽突变体的抗菌性能均优于未突变的抗菌肽。

表6抗菌肽抗菌性能表

注：牛津杯的外径为7.8mm。

下面对上述不同实施例制备的重组酿酒酵母作进一步的性能检测。

一、不同重组酿酒酵母的淀粉水解酶活性的检测

实验方法：

经YNBS培养平板筛选实施例2、6、7、8构建的重组酿酒酵母菌，挑选其中各实施例中淀粉水解圈最大的单克隆，分别取等量的活化后的实施例2、6、7、8构建的重组酿酒酵母菌和未经改造的原始宿主酿酒酵母菌，分别接入以淀粉为唯一碳源的YPS(酵母提取物10g/l、胰蛋白胨20g/l、10g/l可溶性淀粉)液体培养基中培养，各组培养基用量相等，在不同的培养时间点分别取各组培养液上清液测定其中的菌体生长情况、淀粉浓度及淀粉水解酶总酶活；其中淀粉含量测定参考GB/T 20194-2006的“饲料中淀粉含量的测定”进行测定；利用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定α-淀粉酶和糖化酶的总酶活(淀粉水解酶总酶活)。

实验结果：

检测结果如表7所示，其中展示了实施例2和实施例6～8构建的重组酿酒酵母菌的在不同时间点的菌体浓度、淀粉消耗以及淀粉水解酶总酶活情况。从中可以看出，实施例2的重组酿酒酵母利用淀粉速率显著较快，72h后淀粉浓度仅剩1.8g/l；菌体生长良好、菌体浓度最高，培养72h后菌液OD₆₀₀值为22.1；且淀粉水解酶活力最高，培养72h后达6.8U/ml。实施例6～8构建的重组酿酒酵母菌虽然也能够利用淀粉生长，但对淀粉的利用率较低，消耗慢，培养72小后淀粉浓度在9.8g/l以上；菌体生长慢，培养72小后菌液OD₆₀₀值在15.3以下；且淀粉水解酶活力低于实施例2的重组酿酒酵母。

表7不同酿酒酵母利用淀粉结果

二、不同重组酿酒酵母利用淀粉发酵的能力检测

利用以淀粉为唯一碳源的YPS(酵母提取物10g/l、胰蛋白胨20g/l、10g/l可溶性淀粉)液体培养基中培养进一步分析实施例2构建的重组酿酒酵母菌，中重组酿酒酵母的发酵能力。利用GB/T 20194-2006的“饲料中淀粉含量的测定”进行测定淀粉浓度，利用分光光度法测定菌体浓度，利用HPLC测定乙醇浓度。

检测结果如图5～7所示，从中可以看出，实施例2构建重组酿酒酵母菌能够利用淀粉生长，4天后可将淀粉基本消耗完，培养过程中有大量的乙醇生成等；而宿主酿酒酵母基本不能在YPS培养基上生长，不能有效地利用淀粉，没有明显的乙醇生成。

上述结果说明实施例2构建重组酿酒酵母菌具有很好的分泌降解淀粉的淀粉酶和糖化酶的性能，即在重组酿酒酵母菌中将α-淀粉酶基因an-amy、糖化酶基因ao-ga和脆皮蛙的抗菌肽突变体Lf-cath-T进行共同表达时，重组酿酒酵母菌所具有的淀粉酶和糖化酶活性最好，优于同菌丝霉素、鲶鱼抗菌肽突变体或乳铁蛋白肽共表达时的活性，且表现出良好的利用淀粉生产乙醇的能力。

三、不同重组酿酒酵母抑菌效果的检测

实验方法：

将革兰氏阳性菌金色葡萄球菌ATCC22023、革兰氏阴性菌伤寒沙门氏菌CMCC50071以及大肠杆菌CICC10899作为受试菌，经液体培养基中培养至在OD₆₀₀nm＝0.4～1，适当稀释、混匀、均匀涂布至MH培养基中。分别取等量的活化后的实施例2、6、7、8构建的重组酿酒酵母菌和未经改造的原始宿主酿酒酵母菌的发酵液，加入牛津杯中，以灭菌水为阴性对照，以氨苄青霉素(1μg)为阳性对照，在37℃培养16-18h，统计观察抑菌圈情况。

实验结果：

检测结果如图如表8所示，宿主酿酒酵母对所选的三种受试菌均无抑菌效果；而实施例2、6、7、8的重组酿酒酵母对所选的受试菌均有抑菌效果，其中实施例2的重组酿酒酵母对革兰氏阳性菌金色葡萄球菌的抑菌效果最好，且对革兰氏阴性菌伤寒沙门氏菌和大肠杆菌均有较好效果。实施例6的重组酿酒酵母对金色葡萄球菌抑菌效果较好，但伤寒沙门氏菌和大肠杆菌抑菌效果较较弱，而实施例7-8的重组酿酒酵母对金色葡萄球菌抑菌效果较弱，但伤寒沙门氏菌和大肠杆菌抑菌效果与实施例2的相近。综上，实施例2的重组酿酒酵母的对多种细菌的综合抑菌效果最佳。

表8重组菌抑菌效果统计表

注：“-”无抑菌效果，“+”抑菌圈直径在8-12mm，“++”抑菌圈直径在12-17mm，“+++”抑菌圈直径在17mm以上。

四、不同重组酿酒酵母进行高淀粉固态发酵的效果检测

实验方法：

分别取等量的活化后的实施例2、6、7、8构建的重组酿酒酵母菌和未经改造的原始宿主酿酒酵母菌进行生料发酵，生料培养基配方如下：豆粕20g，麸皮15g，玉米粉20g，硫酸铵10g，谷壳5g，料水比为1:1。利用凯氏定氮法测定粗蛋白含量；参考国标GB/T 22492-2008“大豆肽粉”提取并测定酸溶蛋白含量；参考GB/T 13093-2006“饲料中细菌总数的测定”检测细菌和酵母活菌数。

实验结果：

检测结果如表9所示，从中可以看出，实施例2重组酿酒酵母发酵含高淀粉物料的培养基后，酵母活菌数最高，粗蛋白含量最多且杂菌(芽孢菌)数最少，不用加入红糖或葡萄糖等单糖或低聚糖作为碳源，可直接通过降解物料中淀粉来提供碳源。实施例6-8的重组酿酒酵母发酵含高淀粉物料的培养基后，酵母活菌数也高于宿主酿酒酵母，但少于实施例2的；粗蛋白也略低于实施例2的，杂菌(芽孢菌)数低于宿主酿酒酵母，但高于实施例2的。

表9不同酿酒酵母固态发酵结果

综上所述，本发明获得的多功能重组酿酒酵母能够高效降解淀粉物料，抑制致病菌等杂菌生长。本发明基因重组酿酒酵母通过在表达抗菌肽基因的同时，对淀粉降解酶中的淀粉酶和糖化酶间的共表达，发挥其降解淀粉间的协同作用，因而可以实现重组菌降解利用淀粉基料进行菌体生长、生产乙醇或者分泌抗菌肽等。从而，可以利用本发明构建的重组酵母实现在以淀粉基料为主的饲料添加、工业酒精生产、餐厨废弃物降解中同步实现淀粉降解利用、酵母菌体生长、酒精转化以及抑制杂菌生长等多种目的。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东益生种畜禽股份有限公司

广州格拉姆生物科技有限公司

<120> 一种能利用淀粉并分泌抗菌肽的重组酿酒酵母

<130>

<160> 52

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1674

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgttgtctt tcttgttgtg gtgtcaccca aagaagagaa aggaaagaca attgtggaag 60

caaatcgaag aagaagctga acacttggac caattgccat cttgggacgc tccagacaac 120

actttgatgt tgcaagcttt cgaatggcac gttccagctg accaaggtca ctggagaaga 180

ttgcaccaag ctttgccaaa cttcaaggct atcggtgttg acaacatctg gatcccacca 240

ggttgtaagg ctatgaaccc atctggtaac ggttacgaca tctacgactt gtacgacttg 300

ggtgaattcg aacaaaaggg ttctagagct actaagtggg gtactaagga agaattgcaa 360

tctttggttg ctgctgctca agacttcggt atcggtatct actgggacgc tgttttgaac 420

cacaaggctg gtgctgacta cgctgaaaga ttccaagctg ttagagttga cccacaagaa 480

agaaacatga agatcgctcc agctgaagaa atcgaaggtt gggttggttt caacttctct 540

ggtagaggta accactactc ttctatgaag tacaacaaga accacttctc tggtatcgac 600

tgggaccaat ctagacaaaa gtgtggtgtt tacaagatcc aaggtcacga atgggctaac 660

gacgttgcta acgaaaacgg taactacgac tacttgatgt tcgctaactt ggactactct 720

aacgctgaag ttagaaggga cgttttgaag tgggctgaat ggttgaacgc tcaattgcca 780

ttgtctggta tgagattgga cgctgttaag cactactctg ctggtttcca aaaggaattg 840

atcgaccact tgagaactat cgctggtcca gactacttca tcgttggtga atactggaag 900

ggtgaaacta agccattggt tgactacttg aagcaaatgg actacaagtt gtctttgttc 960

gactctgctt tggttggtag attctcttct atctctcaaa ctccaggtgc tgacttgaga 1020

aacatcttct acaacacttt ggttcaattg tacccagacc actctgttac tttcgttgct 1080

aaccacgaca ctcaaccagg tcaatctttg gaagctccag ttacttcttt cttcaagcca 1140

ttggcttacg ctttgatctt gttgagagac caaggtcaac catgtatctt ctacggtgac 1200

ttgtacggtt tgcaagctga cgttaaggac ccaatgactc catcttgtag aggtaagttg 1260

tctatcttga ctagagctag aaagttgtac gcttacggtt tgcaaagaga ctacttcgac 1320

aagccaaact gtatcggttt cgttagatac ggtaacagaa gacacccatc tggtttggct 1380

tgtgttatgt ctaacgctgg tccatctaga aagagaatgt acgttggtag aagacacgct 1440

aagcaaactt ggactgacat cttgcaatgg tgtgaccaaa ctgttgttat cgacgctaag 1500

ggttacggtg aattcccagt ttctgctatg tctgtttctg tttgggttaa ttctgaagct 1560

gaaggtagag actctttgtc tcaccacttg tacgttccag ctcactcttt gtctactgac 1620

gacttgttga cttctgctga aatctctgac gaaaacatct acaagttggc ttaa 1674

<210> 2

<211> 1482

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagaaaca acttgttgtt ctctttgaac gctatcgctg gtgctgttgc tcacccatct 60

ttcccaatcc acaagagaca atctgacttg aacgctttca tcgaaactca aactccaatc 120

gctaagcaag gtgttttgaa caacatcggt gctgacggta agttggttga aggtgctgct 180

gctggtatcg ttgttgcttc tccatctaag tctaacccag actacttcta cacttggact 240

agggacgctg gtttgactat ggaagaagtt atcgaacaat tcatcggtgg tgacgctact 300

ttggaatcta ctatccaaaa ctacgttgac tctcaagcta agcaacaagc tgtttctaac 360

ccatctggtg gtttgtctga cggttctggt ttggctgaac caaagttcta cgttaatatc 420

tctcaattca ctgactcttg gggtagacca caaagggacg gtccagcttt gagagcttct 480

gctttgatcg cttacggtaa ctctttgatc tcttctgaca agcaatctgt tgttaaggct 540

aacatctggc caatcgttca aaacgacttg tcttacgttg gtcaatactg gaaccaaact 600

ggtttcgact tgtgggaaga agttcaaggt tcttctttct tcactgttgc tgttcaacac 660

aaggctttgg ttgaaggtga cgctttcgct aaggctttgg gtgaagaatg tcaagcttgt 720

tctgttgctc cacaaatctt gtgtcacttg caagacttct ggaacggttc tgctgttttg 780

tctaacttgc caactaacgg tagatctggt ttggacacta actctttgtt gggttctatc 840

cacactttcg acccagctgc tgcttgtgac gacactactt tccaaccatg ttcttctaga 900

gctttgtcta accacaagtt ggttgttgac tctttcagat ctgtttacgg tatcaacaac 960

ggtagaggtg ctggtaaggc tgctgctgtt ggtagatacg ctgaagacac ttaccaaggt 1020

ggtaacccat ggtacttgac tactttggtt gctgctgaat tgttgtacga cgctttgtac 1080

caatgggaca agcaaggtca agttaatgtt actgaaactt ctttgccatt cttcaaggac 1140

ttgtcttcta acgttactac tggttcttac gctaagtctt cttctgctta cgaatctttg 1200

acttctgctg ttaagactta cgctgacggt ttcatctctg ttgttcaaga atacactcca 1260

gacggtggtg ctttggctga acaatactct agagaccaag gtactccagt ttctgcttct 1320

gacttgactt ggtcttacgc tgctttcttg tctgctgttg gtagaagaaa cggtactgtt 1380

ccagcttctt ggggttcttc tactgctaac gctgttccat ctcaatgttc tggtggtact 1440

gtttctggtt cttacactac tccaactgtt ggttcttggt aa 1482

<210> 3

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggttttggtt gtaatggtcc ttgggatgaa gatgatatgc aatgtcataa ccattgtaag 60

tctattaagg gttacaaagg tggttattgt gctaaaggtg gttttgtttg taagtgttac 120

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Lys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Lys Ser Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aagggtagag gtaagcaagg tggtaaggtt agaaagtctt ct 42

<210> 6

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttcaagtgta gaagatggca atggagaatg aagaagttgg gtgctccatc tatcacttgt 60

gttagaagag ctttc 75

<210> 7

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggtaagtgta acgttttggg tcaaagaaag caattgttga gatctatcgg ttctggttct 60

cacatcggtt ctgttgtttt gccaagaggt taa 93

<210> 8

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaaga 255

<210> 9

<211> 999

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgtctcagat cgaagtacct tcaaagaatg gggtctcatc ttgttttgca tgtaccactg 60

agcaggataa taatagaaat gataatatac tatagtagag ataacgtcga tgacttccca 120

tactgtaatt gcttttagtt gtgtattttt agtgtgcaag tttctgtaaa tcgattaatt 180

tttttttctt tcctcttttt attaacctta atttttattt tagattcctg acttcaactc 240

aagacgcaca gatattataa catctgcaca ataggcattt gcaagaatta ctcgtgagta 300

aggaaagagt gaggaactat cgcatacctg catttaaaga tgccgatttg ggcgcgaatc 360

ctttattttg gcttcaccct catactatta tcagggccag aaaaaggaag tgtttccctc 420

cttcttgaat tgatgttacc ctcataaaac acgtggcctc ttatcaagaa agaaattacc 480

gtcgctcgtg atttgtttgc aaagagaaca aaactgaaaa aacccagaca cgctcgactt 540

cctgtcttcc tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc 600

tcacaggttt tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca 660

catgctatga tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct 720

ctctctttca aacagaaatg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc 780

ttttcttcta accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca 840

tatatataaa cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt 900

cgtagttttt caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag 960

taattatcta ctttttacaa caaatatata gccgagacg 999

<210> 10

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgtctcagta cgatctccca tgtctctact ggtggtggtg cttctttgga attattggaa 60

ggcaaggaat tgccaggtgt tgctttctta tccgaaaaga aataaattga attgaattga 120

aatcgataga tcaatttttt tcttttctct ttccccatcc tttacgctaa aataatagtt 180

tattttattt tttgaatatt ttttatttat atacgtatat atagactatt atttactttt 240

aatagattat taagattttt attaaaaaaa aattcgtccc tctttttaat gccttttatg 300

cagttttttt ttcccattcg atatttctat gttcgggttt cagcgtattt taagtttaat 360

aactcgaaaa ttctgcgttt cgaaaaagct ttgaccgaga cg 402

<210> 11

<211> 999

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgtctcagtc agaagtacct tcaaagaatg gggtctcatc ttgttttgca tgtaccactg 60

agcaggataa taatagaaat gataatatac tatagtagag ataacgtcga tgacttccca 120

tactgtaatt gcttttagtt gtgtattttt agtgtgcaag tttctgtaaa tcgattaatt 180

tttttttctt tcctcttttt attaacctta atttttattt tagattcctg acttcaactc 240

aagacgcaca gatattataa catctgcaca ataggcattt gcaagaatta ctcgtgagta 300

aggaaagagt gaggaactat cgcatacctg catttaaaga tgccgatttg ggcgcgaatc 360

ctttattttg gcttcaccct catactatta tcagggccag aaaaaggaag tgtttccctc 420

cttcttgaat tgatgttacc ctcataaaac acgtggcctc ttatcaagaa agaaattacc 480

gtcgctcgtg atttgtttgc aaagagaaca aaactgaaaa aacccagaca cgctcgactt 540

cctgtcttcc tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc 600

tcacaggttt tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca 660

catgctatga tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct 720

ctctctttca aacagaaatg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc 780

ttttcttcta accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca 840

tatatataaa cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt 900

cgtagttttt caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag 960

taattatcta ctttttacaa caaatataat gccgagacg 999

<210> 12

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgtctcatac ggatctccca tgtctctact ggtggtggtg cttctttgga attattggaa 60

ggcaaggaat tgccaggtgt tgctttctta tccgaaaaga aataaattga attgaattga 120

aatcgataga tcaatttttt tcttttctct ttccccatcc tttacgctaa aataatagtt 180

tattttattt tttgaatatt ttttatttat atacgtatat atagactatt atttactttt 240

aatagattat taagattttt attaaaaaaa aattcgtccc tctttttaat gccttttatg 300

cagttttttt ttcccattcg atatttctat gttcgggttt cagcgtattt taagtttaat 360

aactcgaaaa ttctgcgttt cgaaaaagct ttgcacgaga cg 402

<210> 13

<211> 999

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgtctcatgc agaagtacct tcaaagaatg gggtctcatc ttgttttgca tgtaccactg 60

agcaggataa taatagaaat gataatatac tatagtagag ataacgtcga tgacttccca 120

tactgtaatt gcttttagtt gtgtattttt agtgtgcaag tttctgtaaa tcgattaatt 180

tttttttctt tcctcttttt attaacctta atttttattt tagattcctg acttcaactc 240

aagacgcaca gatattataa catctgcaca ataggcattt gcaagaatta ctcgtgagta 300

aggaaagagt gaggaactat cgcatacctg catttaaaga tgccgatttg ggcgcgaatc 360

ctttattttg gcttcaccct catactatta tcagggccag aaaaaggaag tgtttccctc 420

cttcttgaat tgatgttacc ctcataaaac acgtggcctc ttatcaagaa agaaattacc 480

gtcgctcgtg atttgtttgc aaagagaaca aaactgaaaa aacccagaca cgctcgactt 540

cctgtcttcc tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc 600

tcacaggttt tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca 660

catgctatga tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct 720

ctctctttca aacagaaatg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc 780

ttttcttcta accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca 840

tatatataaa cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt 900

cgtagttttt caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag 960

taattatcta ctttttacaa caaatatatc gacgagacg 999

<210> 14

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgtctcaatc ggatctccca tgtctctact ggtggtggtg cttctttgga attattggaa 60

ggcaaggaat tgccaggtgt tgctttctta tccgaaaaga aataaattga attgaattga 120

aatcgataga tcaatttttt tcttttctct ttccccatcc tttacgctaa aataatagtt 180

tattttattt tttgaatatt ttttatttat atacgtatat atagactatt atttactttt 240

aatagattat taagattttt attaaaaaaa aattcgtccc tctttttaat gccttttatg 300

cagttttttt ttcccattcg atatttctat gttcgggttt cagcgtattt taagtttaat 360

aactcgaaaa ttctgcgttt cgaaaaagct tgactcgaga cg 402

<210> 15

<211> 806

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat 60

accatatttt tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca 120

taggatggca agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caatacaacc 180

tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac 240

tgaatccggt gagaatggca aaagcttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca 300

gccattacgc tcgtcatcaa aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg 360

cgcctgagcg agactaaata cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga 420

atgcaaccgg cgcaggaaca ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata 480

ttcttctaat acctggaatg ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta accatgcatc 540

atcaggagta cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt 600

tagtctgacc atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa 660

caactctggc gcatcgggct tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac 720

attatcgcga gcccatttat acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg 780

cctcgagcaa gacgtttccc gttgaa 806

<210> 16

<211> 1812

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccagcatcct tgacttacgt cgcagtcctc agtcccagct ggcagtattc ccacaggcta 60

taatacttac cgaggcaagc tacattccta tggatttatc ctgccaccaa aactgatgct 120

ggcccagtga aatgcgagat tcccctaccc acaaggagca gagggcacaa aacaccatgt 180

ctgatcaaat gcccttccct ttcaacaatt tcacgtactt tttcactctc ttttcaaagt 240

tcttttcatc tttccatcac tgtacttgtt cgctatcgcg actctcgcca atatttagct 300

ttagatggaa tttaccaccc acttagagct gcattcccaa acaactcgac tcttcgaagg 360

cactttacaa agaaccgcac tcctcgccac acgggattct caccctctat gacgtcctgt 420

tccaaggaac atagacaagg aacggcccca aagttgccct ctccaaatta caactcgggc 480

accgaaggta ccagatttca aatttgagct tttgccgctt cactcgccgt tactaaggca 540

atcccggttg gtttcttttc ctccgcttat tgatatgctt aagttcagcg ggtactccta 600

cctgatttga ggtcaaactt taagaacatt gttcgcctag acgctctctt cttatcgata 660

acgttccaat acgctcagta taaaaaaaga ttagccgcag ttggtaaaac ctaaaacgac 720

cgtacttgca ttatacctca agcacgcaga gaaacctctc tttggaaaaa aaacatccaa 780

tgaaaaggcc agcaatttca agttaactcc aaagagtatc actcactacc aaacagaatg 840

tttgagaagg aaatgacgct caaacaggca tgccccctgg aataccaagg ggcgcaatgt 900

gcgttcaaag attcgatgat tcacggactt ctgcaattca cattacgtat cgcatttcgc 960

tgcgttcttc atcgatgcga gaaccaagag atccgttgtt gaaagttttt aatattttaa 1020

aatttccagt tacgaaaatt cttgtttttg acaaaaattt aatgaataga taaaattgtt 1080

tgtgtttgtt acctctgggc cccgattgct cgaatgccca aagaaaaagt tgcaaagata 1140

tgaaaactcc acagtgtgtt gtattgaaac ggttttaatt gtcctataac aaaagcacag 1200

aaatctctca ccgtttggaa tagcaagaaa gaaacttaca agcctagcaa gaccgcgcac 1260

ttaagcgcag gcccggctgg actctccatc tcttgtcttc ttgcccagta aaagctctca 1320

tgctcttgcc aaaacaaaaa aatccatttt caaaattatt aaatttcttt aatgatcctt 1380

ccgcaggttc acctacggaa accttgttac gacttttagt tcctctaaat gaccaagttt 1440

gtccaaattc tccgctctga gatggagttg cccccttctc taagcagatc ctgaggcctc 1500

actaagccat tcaatcggta ctagcgacgg gcggtgtgta caaagggcag ggacgtaatc 1560

aacgcaagct gatgacttgc gcttactagg acttcctcgt tgaagagcaa taattacaat 1620

gctctatccc cagcacgacg gagtttcaca agattaccaa gacctctcgg ccaaggttag 1680

actcgctggc tccgtcagtg tagcgcgcgt gcggcccaga acgtctaagg gcatcacaga 1740

cctgttattg cctcaaactt ccatcggctt gaaaccgata gtccctctaa gaagtggata 1800

accagcaaat gc 1812

<210> 17

<211> 221

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gatcagagac gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 60

gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 120

ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 180

aaacccgaca ggactataac tctgctctat cgtctctcta t 221

<210> 18

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 18

Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp Glu Asp Asp Met Gln Cys His

1 5 10 15

Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys

20 25 30

Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr

35 40

<210> 19

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 19

Gly Lys Cys Asn Val Leu Gly Gln Arg Lys Gln Leu Leu Arg Ser Ile

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ser His Ile Gly Ser Val Val Leu Pro Arg Gly

20 25 30

<210> 20

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 20

Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro

1 5 10 15

Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe

20 25

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tggccattag aaaaactcat cgagcatca 29

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gatatcttca acgggaaacg tcttgctcga g 31

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cggaattcgc atgccatcct accgacc 27

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cgggatccgg gtttagaccg tcgtgagac 29

<210> 25

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

agatctgatc agagacgcgg taatacggtt atccac 36

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gaattcgact agagacgtta tagtcctgtc gggttt 36

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cgtctcagat cgaagtacct tcaaag 26

<210> 28

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cgtctcggct atatatttgt tgtaaa 26

<210> 29

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

cgtctcatgt acgatctccc atcgtctcta ct 32

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cgtctcggtc aaagcttttt cgaaacgcag 30

<210> 31

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

cgtctcagtc agaagtacct tcaaag 26

<210> 32

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cgtctcggca ttatatttgt tgtaaa 26

<210> 33

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

cgtctcatac ggatctccca tcgtctctac t 31

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

cgtctcgtgc aaagcttttt cgaaacgcag 30

<210> 35

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

cgtctcatgc agaagtacct tcaaag 26

<210> 36

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

cgtctcgtcg atatatttgt tgtaaa 26

<210> 37

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

cgtctcaatc ggatctccca tcgtctctac t 31

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

cgtctcgagt caagcttttt cgaaacgcag 30

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

atgagatttc cttcaatttt tac 23

<210> 40

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

tcttttctcg agagataccc cttcttct 28

<210> 41

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

cgtctcagct aatgagattt ccttcaattt ttac 34

<210> 42

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

aacaagaaag acaacattct tttctcgaga ga 32

<210> 43

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

tctctcgaga aaagaatgtt gtctttcttg tt 32

<210> 44

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

cgtctcagta ctttaagcca acttgtagat gt 32

<210> 45

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

cgtctcagca tatgagattt ccttcaattt ttac 34

<210> 46

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

acaagttgtt tctcattctt ttctcgagag a 31

<210> 47

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

tctctcgaga aaagaatgag aaacaacttg t 31

<210> 48

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

cgtctcatac gtttaccaag aaccaacagt tggagt 36

<210> 49

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

cgtctcatcg aatgagattt ccttcaattt ttac 34

<210> 50

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

ggtaagtgta acgttctttt ctcgagaga 29

<210> 51

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

tctctcgaga aaagaggtaa gtgtaacgt 29

<210> 52

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

cgtctcatag ctctgttgtt ttgccaagag gt 32

Claims (10)

1.一种酿酒酵母多基因共表达载体，其特征在于：该载体中含有α-淀粉酶基因、糖化酶基因、抗菌肽基因；

所述α-淀粉酶基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；

所述糖化酶基因的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母多基因共表达载体，其特征在于：所述抗菌肽基因选自菌丝霉素、鲶鱼抗菌肽突变体、乳铁蛋白肽、脆皮蛙的抗菌肽突变体；

所述菌丝霉素的碱基序列如SEQ ID NO：3所示；

所述鲶鱼抗菌肽突变体的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；

所述乳铁蛋白肽的碱基序列如SEQ ID NO：5所示；

所述脆皮蛙的抗菌肽突变体的碱基序列如SEQ ID NO：6所示。

3.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母多基因共表达载体，其特征在于：所述α-淀粉酶基因、糖化酶基因、抗菌肽基因上游均引入α-信号肽基因序列，α-信号肽基因的碱基序列如SEQ ID NO：7所示。

4.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母多基因共表达载体，其特征在于：所述α-淀粉酶基因的启动子为pgk1-1，其碱基序列如SEQ ID NO：8所示，终止子为pgkt1-1，其碱基序列如SEQ ID NO：9所示；

所述糖化酶基因的启动子为pgk1-2，其碱基序列如SEQ ID NO：10所示，终止子为pgkt1-2，其碱基序列如SEQ ID NO：11所示；

所述抗菌肽基因的启动子为pgk1-3，其碱基序列如SEQ ID NO：12所示，终止子为pgkt1-3，其碱基序列如SEQ ID NO：13所示。

5.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母多基因共表达载体，其特征在于：该载体的筛选基因中含有G418抗性基因。

6.根据权利要求1~5任一所述的一种酿酒酵母多基因共表达载体，其特征在于：所述载体的骨架为pGAPZaA质粒。

7.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母多基因共表达载体，其特征在于：该载体中含有酿酒酵母菌的25s rDNA基因片段，其碱基序列如SEQ ID NO：15所示。

8.一种能高效利用淀粉并分泌抗菌肽的重组酿酒酵母，其特征在于，该重组酿酒酵母基因组中插入有权利要求1~7任一所述的多基因共表达载体。

9.权利要求1~6任一所述酿酒酵母多基因共表达载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1 整合表达载体pTEGC-BsmBI构建：

S1.1 将G418抗性基因连入pGAPZaA质粒载体的多克隆位点Msc I和EcoR V之间，获得载体pGAPZaA-G418;

S1.2 将碱基序列如SEQ ID NO：15所示的rDNA基因序列的连入载体pGAPZaA-G418多克隆位点BamHI和EcoRI之间，获得载体pGAPZaA-G418-rDNA；

S1.3 将载体pGAPZaA-G418-rDNA经Bgl II和EcoRI双酶切后，回收大片段产物，得到线性化载体pTEGC，将碱基序列如SEQ ID NO：16所示的BsmBI-2片段与线性化载体pTEGC连接，得整合表达载体pTEGC-BsmBI；

S2 启动子、终止子的扩增

S2.1启动子的扩增：以酿酒酵母基因组DNA为模板，分别用引物对PGK1F1-BsmBI和PGK1R1-BsmBI、PGK1F2-BsmBI和PGK1R2-BsmBI、PGK1F3-BsmBI和PGK1R3-BsmBI分别扩增出pgk1-1、pgk1-2、pgk1-3启动子片段；

S2.2终止子的扩增：以酿酒酵母基因组DNA为模板，分别用引物对PGKT1F1-BsmBI和PGKT1R1-BsmBI、PGKT1F2-BsmBI和PGKT1R2-BsmBI、PGKT1F3-BsmBI和PGKT1R3-BsmBI分别扩增出pgkt1-1、pgkt1-2、pgkt1-3终止子片段；

S3 α-信号肽基因、α-淀粉酶基因、糖化酶基因、抗菌肽基因的获得

S3.1 α-信号肽-α-淀粉酶基因的获得：分别以含α-信号肽基因序列的T载体、含α-淀粉酶基因序列的T载体为模板，通过引物MfaF1-BsmBI、Mfa-an-amyR、Mfa-an-amyF和An-amyR-BsmBI进行重叠延伸PCR将α-信号肽基因序列定向连入α-淀粉酶基因的5’端，扩增出mfa-an-amy基因片段，即含有α-信号肽基因序列和α-淀粉酶基因序列的片段；

S3.2 α-信号肽-糖化酶基因的获得：分别以含α-信号肽基因序列的T载体、含糖化酶基因的T载体为模板，通过引物MfaF2-BsmBI、Mfa-ao-gaR、Mfa-ao-gaF和Ao-gaR-BsmBI进行重叠延伸PCR将α-信号肽序列定向连入无信号肽的糖化酶基因的5’端，扩增出基因片段mfa-ao-ga，即含α-信号肽基因序列和糖化酶基因的片段；

S3.3α-信号肽-抗菌肽基因的获得：分别以含α-信号肽基因序列的T载体、含抗菌肽的T载体为模板，通过重叠延伸PCR将α-信号肽序列定向连入无信号肽的抗菌肽基因的5’端，扩增出mfa-amp基因片段，即含有α-信号肽基因序列和抗菌肽基因序列的片段；所述重叠延伸PCR过程中，通过引物将扩增产物mfa-amp的两端引入切割方向相反的BsmBI的切割序列；

S4 酿酒酵母多基因共表达载体的构建

将上述获得的α-淀粉酶基因表达盒元件pgk1-1、mfa-an-amy、pgkt1-1；糖化酶表达盒元件pgk1-2、mfa-ao-ga、pgkt1-2；抗菌肽基因表达盒元件pgk1-3、mfa-amp、pgkt1-3利用IIs型限制性内切酶BsmBI进行酶切，纯化回收；同时，利用IIs型限制性内切酶BsmBI切割上述整合表达载体pTEGC-BsmBI，将其线性化；将所用这些片段通过一步法定向连入线性化的整合表达载体pTEGC-BsmBI中，即得酿酒酵母多基因共表达载体；

上述所述引物的碱基序列如下：

PGK1F1-BsmBI：CGTCTCAgatc GAAGTACCTTCAAAG

PGK1R1-BsmBI：CGTCTCGgctaTATATTTGTTGTAAA

PGK1F2-BsmBI：CGTCTCAgtcaGAAGTACCTTCAAAG

PGK1R2-BsmBI：CGTCTCGgcatTATATTTGTTGTAAA

PGK1F3-BsmBI：CGTCTCAtgcaGAAGTACCTTCAAAG

PGK1R3-BsmBI：CGTCTCGtcgaTATATTTGTTGTAAA

PGKT1F1-BsmBI：CGTCTCAtgtacGATCTCCCATCGTCTCTACT

PGKT1R1-BsmBI：CGTCTCGgtcaAAGCTTTTTCGAAACGCAG

PGKT1F2-BsmBI：CGTCTCAtacgGATCTCCCATCGTCTCTACT

PGKT1R2-BsmBI：CGTCTCGtgcaAAGCTTTTTCGAAACGCAG

PGKT1F3-BsmBI：CGTCTCAatcgGATCTCCCATCGTCTCTACT

PGKT1R3-BsmBI： CGTCTCGagtcAAGCTTTTTCGAAACGCAG

MfaF1-BsmBI：CGTCTCAgctaATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC

Mfa-an-amyR：AACAAGAAAGACAACATTCTTTTCTCGAGAGA

Mfa-an-amyF：TCTCTCGAGAAAAGAATGTTGTCTTTCTTGTT

An-amyR-BsmBI：CGTCTCAgtacTTTAAGCCAACTTGTAGATGT

MfaF2-BsmBI：CGTCTCAgcatATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC

Mfa-ao-gaR：ACAAGTTGTTTCTCATTCTTTTCTCGAGAGA

Mfa-ao-gaF：TCTCTCGAGAAAAGAATGAGAAACAACTTGT

Ao-gaR-BsmBI：CGTCTCAtacgTTTACCAAGAACCAACAGTTGGAGT。

10.一种能高效利用淀粉并分泌抗菌肽的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于，将权利要求9构建的酿酒酵母多基因共表达载体转化酿酒酵母宿主，筛选出阳性单克隆菌落，并测序验证正确，并分泌出α-淀粉酶、糖化酶以及抗菌肽等，即得能高效利用淀粉并分泌抗菌肽的重组酿酒酵母。