CN113025642B

CN113025642B - 一种用于重组表达糖化酶的构建物及其应用

Info

Publication number: CN113025642B
Application number: CN202110342874.5A
Authority: CN
Inventors: 孙雅芳; 肖明华; 覃先武; 王健; 郭天芬; 王龙
Original assignee: Angel Yeast Co Ltd
Current assignee: Angel Yeast Co Ltd
Priority date: 2021-03-30
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2024-01-02
Anticipated expiration: 2041-03-30
Also published as: CN113025642A

Abstract

本发明提供一种用于重组表达糖化酶的构建物及其应用。本发明提供的一种用于重组表达糖化酶的构建物，所述构建物从5'至3'端依次包括启动子、编码糖化酶的核苷酸序列、终止子；所述启动子选自ADH1p、ENO1p、PDC1p、HXT7p、FBA1p、PGK1p和TDH3p中的一种或两种以上；所述终止子选自TDH3t和CYC1t中的一种或两种。本发明提供的用于重组表达糖化酶的构建物能够高效表达糖化酶。

Description

一种用于重组表达糖化酶的构建物及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种用于重组表达糖化酶的构建物及其应用。

背景技术

乙醇是食品、化工等工业领域的重要原料，生物质乙醇已经吸引的大量注意，成为目前世界能源研究开发的热点之一。

生物质转化乙醇的两大原料为纤维质和淀粉质。显然，纤维质原料在我国不仅丰富，且价格非常低廉。由于技术原因，纤维质转化乙醇在原料处理和发酵工艺等方面技术并不理想，最终导致成本却比玉米淀粉转化乙醇高20％。相对而言，淀粉质转化乙醇更有优势，更能缓解能源问题的迫切。

淀粉质转化乙醇在国内不仅有整套优良的发酵工艺，并形成一定的产业规模。利用淀粉来生产酒精其方法有：在同一发酵液中共同培养能水解淀粉和能发酵酒精的两种或以上微生物，以满足在发酵液中即能及时水解淀粉又能发酵生产酒精；使用含淀粉酶类菌株先对淀粉水解后再利用酵母菌发醇生产酒精；先用葡萄糖淀粉酶水解发酵液中淀粉，再进行酵母的酒精发酵；上述三种方式在工业酒精发酵中均有应用。但是上述三种方式都很难使工业酒精发酵条件优化。共同培养糖化菌和发酵菌中大部分淀粉会被用于菌体自身生长繁殖而用，从而降低酒精产率。若先利用微生物或酶制剂糖化淀粉则增加了生产的成本。

所以目前最好的方法是利用遗传工程学的手段来改造微生物使之不仅能够水解淀粉并能进行发醇生产酒精，既能提高酒精生产量又能节约生产成本。

现有技术中公开的重组酵母菌株，发酵生产的乙醇量较低，如专利CN101717795A、CN105985969A、CN108239609A、CN108603186A、 CN109401991A和CN109251868A中公开的重组酵母菌株，其发酵生产乙醇能力较低，不能满足市场需求。

发明内容

为了解决现有技术中存在的以淀粉为原料的生物乙醇生产中存在的工艺复杂及生产成本较高的问题，本发明提供一种用于重组表达糖化酶的构建物。

第一方面，本发明提供一种用于重组表达糖化酶的构建物，所述构建物从5'至3'端依次包括启动子，编码糖化酶的核苷酸序列，终止子；

所述启动子选自ADH1p、ENO1p、PDC1p、HXT7p、FBA1p、PGK1p 和TDH3p中的一种或两种以上；

所述终止子选自TDH3t和CYC1t中的一种或两种。

优选地，所述启动子为ENO1p、ADH1p、HXT7p、PDC1p中的一种或两种以上，更优选地，所述启动子为HXT7p。

优选地，所述编码糖化酶的核苷酸序列编码得到的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述编码糖化酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

第二方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含所述的构建物。

优选地，所述载体中含有单拷贝、双拷贝或多拷贝的所述的构建物。

优选地，所述表达载体的结构为：

p1-GLU-t1-p2-GLU-t2-delta5'-pUCori-CEN6/ARS-delta3'-loxP-TEF1p-KanMX-TEF1t-loxP，其中，

所述GLU为SEQ ID NO.2中的一个或两个以上的拷贝；

p1和p2为启动子，所述p1或p2选自ADH1p、ENO1p、PDC1p、HXT7p、 FBA1p、PGK1p和TDH3p中的一种或两种以上；

t1和t2为终止子，所述t1或t2选自TDH3t和CYC1t两个终止子中的一种或两种；

TEF1p-KanMX-TEF1t为卡那霉素/G418抗性基因表达片段；

delta5'、delta3'为delta片段；

pUCori-CEN6/ARS为复制子序列；

loxP为抗性消除识别位点。

第三方面，本发明提供一种重组酵母，所述重组酵母细胞中含有所述的表达载体或整合有所述的构建物。

优选地，所述重组酵母的宿主酵母细胞为安琪高酒酵母YY (Saccharomycescerevisiae高酒酵母YY)保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2021171。

优选地，所述重组酵母为酿酒酵母YY-HXT7-1(Saccharomyces cerevisiae YY-HXT7-1)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为 CCTCC NO:M 20191127。

第四方面，本发明提供酿酒酵母YY-HXT7-1(Saccharomyces cerevisiae YY-HXT7-1)，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为 CCTCC NO:M 20191127。

第五方面，本发明提供所述的重组酵母或所述的酿酒酵母YY-HXT7-1(Saccharomyces cerevisiae YY-HXT7-1)的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

将所述的表达载体转化到宿主酵母细胞中或将所述的构建物整合到宿主酵母细胞的染色体基因组中。

优选地，将所述的表达载体转化到宿主酵母细胞中包括以下步骤：

将所述的表达载体转化到宿主酵母细胞中，消除抗性基因，得到所述重组酵母。

优选地，将所述的构建物整合到宿主酵母细胞的染色体基因组中是通过基因编辑技术和/或同源重组的方式对宿主细胞进行定向改造，使宿主酵母细胞的染色体基因组中含有所述基因编辑技术和/或同源重组的构建物，

优选地，所述的基因编辑技术选自ZFN编辑、TALEN编辑或 CRISPR/Cas9编辑中的一种或两种以上的组合，

优选地，所述的同源重组选自λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组。

第六方面，本发明还提供所述的制备方法得到的重组酵母。

第七方面，本发明提供一种发酵生产糖化酶的方法，所述方法包括培养本发明提供的重组酵母或所述的酿酒酵母YY-HXT7-1(Saccharomyces cerevisiae YY-HXT7-1)。

第八方面，本发明还提供一种发酵生产乙醇的方法，所述方法包括培养本发明提供的重组酵母或所述的酿酒酵母YY-HXT7-1(Saccharomyces cerevisiae YY-HXT7-1)。

本发明提供的用于重组表达糖化酶的构建物能够高效表达糖化酶。

本发明提供的重组酵母具有高效的糖化酶活性，有效降低生物乙醇工业生产成本。

本发明以安琪高酒酵母YY(CCTCC NO:M 2021171)为宿主，采用多个糖化酶结构基因与启动子的组合，获得了具有高效糖化功能的重组酿酒酵母菌株，在不额外添加糖化酶进行玉米淀粉发酵时，具有高效的糖化功能，可获得高产量的乙醇。

菌种保藏信息

本发明所用的Saccharomyces cerevisiae高酒酵母YY于2021年2月1日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2021171，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027) -68754052。

本发明中的Saccharomyces cerevisiae YY-HXT7-1于2019年12月30日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 20191127，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027) -68754052。

附图说明

图1所示为pYIE-delta质粒图谱；

图2所示为实施例1中含ENO1p-GLU-CYC1t-ENO1p-GLU-TDH3t的质粒图谱；

图3所示为实施例2中含ADH1p-GLU-CYC1t-ADH1p-GLU-TDH3t的质粒图谱；

图4所示为实施例3中含FBA1p-GLU-TCYC1t-FBA1p-GLU-TDH3t的质粒图谱；

图5所示为实施例4中含HXT7p-GLU-CYC1t-HXT7p-GLU-TDH3t的质粒图谱；

图6所示为实施例5中含TDH3p-GLU-CYC1t-TDH3p-GLU-TDH3t的质粒图谱；

图7所示为实施例6中含PDC1p-GLU-CYC1t-PDC1p-GLU-TDH3t的质粒图谱；

图8所示为实施例7中含PGK1p-GLU-CYC1t-PGK1p-GLU-TDH3t的质粒图谱；

图9所示为实施例1-7中得到的重组质粒中启动子的PCR检测电泳图；

图10所示为实施例1-7中得到的重组质粒中启动子的酶切检测电泳图；

图11所示为实施例1-7中得到的重组质粒中糖化酶基因GLU PCR检测电泳图，其中，泳道1，2，3，4，5，6，7分别为实施例1，2，3，4，5，6， 7所构建重组质粒；

图12所示为实施例1-7中得到的重组质粒中终止子CYC1t PCR检测电泳图，其中，泳道1，2，3，4，5，6，7分别为实施例1，2，3，4，5，6， 7所构建重组质粒；

图13所示为实施例1-7中得到的重组质粒中终止子TDH3t酶切检测电泳图，其中，泳道1，2，3，4，5，6，7分别为实施例1，2，3，4，5，6， 7所构建重组质粒；

图14所示为实施例1-7中得到的重组质粒中终止子TDH3t PCR检测电泳图，其中，泳道1，2，3，4，5，6，7分别为实施例1，2，3，4，5，6， 7所构建重组质粒；

图15所示为实施例1-7中得到的重组质粒中插入片段p-GLU-TDH3t PCR扩增电泳图，其中，泳道1，2，3，4，5，6，7分别为实施例1，2，3， 4，5，6，7所构建重组质粒；

图16所示为潮霉素(hph)抗性平板中的重组酵母单菌落。

具体实施方式

本发明提供一种用于重组表达糖化酶的构建物，所述构建物从5'至3'端依次包括启动子、编码糖化酶的核苷酸序列和终止子；

所述启动子ADH1p的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

所述启动子ENO1p的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：

所述启动子PDC1p的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：

所述启动子HXT7p的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：

所述启动子FBA1p的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：

所述启动子PGK1p的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：

所述启动子TDH3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：

所述终止子选自TDH3t和CYC1t中的一种或两种。

所述终止子TDH3t的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，具体为：

所述终止子CYC1t的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，具体为：

利用本发明提供的构建物的单拷贝、双拷贝或多拷贝制备表达载体或整合到宿主酵母细胞。

所述构建物的双拷贝或多拷贝满足如下形式：

p1-GLU-t1……pn-GLU-tn，

所述n为2-7中任意的整数，如，n为2，3，4，5，6，7。

所述p1……pn独立的选自ADH1p、ENO1p、PDC1p、HXT7p、FBA1p、 PGK1p和TDH3p中的一种或两种以上；

所述t1……tn独立的选自TDH3t和CYC1t中的一种或两种；

GLU为SEQ ID NO.2所示的序列。

优选地，利用本发明提供的构建物的双拷贝制备表达载体或整合到宿主酵母细胞。具体的，所述双拷贝的构建物包括但不限于如下所示的结构：

组合1：ENO1p-GLU-CYC1t-ENO1p-GLU-TDH3t；

组合2：ADH1p-GLU-CYC1t-ADH1p-GLU-TDH3t；

组合3：FBA1p-GLU-CYC1t-FBA1p-GLU-TDH3t；

组合4：HXT7p-GLU-CYC1t-HXT7p-GLU-TDH3t；

组合5：TDH3p-GLU-CYC1t-TDH3p-GLU-TDH3t；

组合6：PDC1p-GLU-CYC1t-PDC1p-GLU-TDH3t；

组合7：PGKp-GLU-CYC1t-PGKp-GLU-TDH3t；

其中，GLU为SEQ ID NO.2。

本发明中的所使用的核苷酸序列，如启动子、编码糖化酶的核苷酸序列、终止子及本发明提供的用于重组表达糖化酶的构建物，本领域技术人员可以依据现有技术手段获得，具体如序列合成或通过PCR扩增得到。

本发明提供的一种具体实施方式中，所述的启动子ADH1p、ENO1p、 PDC1p、HXT7p、FBA1p、TDH3p和PGK1p的制备方法为：

ADH1p：以MQadh11和MQadh12-2为引物，以安琪高酒酵母YY基因组为模板，扩增得到启动子ADH1p，其中MQadh11的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，MQadh12-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

ENO1p：以MQenol1和MQenol2-2为引物，以安琪高酒酵母YY基因组为模板，扩增得到启动子ENO1p，MQenol1的核苷酸序列如SEQ ID NO.14 所示，MQenol2-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

PDC1p：以MQ1pdca11和MQ1pdca12-2为引物，以安琪高酒酵母YY 基因组为模板，扩增得到启动子PDC1p，MQ1pdca11的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，MQ1pdca12-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

HXT7p：以MQhxt71和MQhxt72-2为引物，以安琪高酒酵母YY基因组为模板，扩增得到启动子HXT7p，MQhxt71的核苷酸序列如SEQ ID NO.18 所示，MQhxt72-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；

FBA1p：以MQFBA11和MQFBA12-2为引物，以安琪高酒酵母YY基因组为模板，扩增得到启动子FBA1p，MQFBA11的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，MQFBA12-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；

PGK1p：以MQ1pgk11和MQ1pgk12-2为引物，以安琪高酒酵母YY基因组为模板，扩增得到启动子PGK1p，MQ1pgk11的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，MQ1pgk12-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；

TDH3p：以MQTDH31和MQTDH32-2为引物，以安琪高酒酵母YY基因组为模板，扩增得到启动子TDH3p，MQTDH31的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，MQTDH32-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；

如上所述的引物中，上游引物均含KpnI酶切位点，下游引物均含NdeI 酶切位点。

本发明的一种具体实施方式中，采用以下方法制备含有p1-GLU-t1的质粒：

(i)MQenol1和MQenol2-2，MQadh11和MQadh12-2，MQ1pdca11和 MQ1pdca12-2，MQTDH31和MQTDH32-2，MQhxt71和MQhxt72-2， MQFBA11和MQFBA12-2，MQpgk11和MQ1pgk12-2为引物对(上游均含 KpnI酶切位点，下游含NdeI酶切位点)，以安琪高酒酵母YY基因组为模板，分别扩增7种启动子p；

(ii)sfGLU-p11(含KpnI/NdeI酶切位点)和sfGLU-p2(含EcoRI/BamHI 酶切位点)为引物对，以扣囊覆膜酵母的总DNA为模板，扩增GLU；

(iii)MQTDH35(含EcoRI酶切位点)和MQTDH36(含BamHI酶切位点),T-CYC1-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示，含EcoRI酶切位点)和 T-CYC1-R(核苷酸序列如SEQ IDNO.39所示，含BamHI酶切位点)为引物，以安琪高酒酵母YY基因组DNA为模板，扩增终止子TDH3t，CYC1t；

(iv)KpnI/BamHI酶切GLU扩增产物纯化物，回收纯化后与带有粘性末端delta5'-pUCori-CEN6/ARS-delta3'-loxP-TEF1p-KanMX-TEF1t-loxP连接，获得含GLU的质粒；

(v)EcoRI/BamHI酶切iv)中重组质粒，EcoRI/BamHI酶切终止子扩增产物纯化物，分别回收纯化后，连接获得含GLU-TDH3t，GLU-CYC1t的质粒；

(vi)KpnI/NdeI酶切v)中重组质粒，KpnI/NdeI酶切7种启动子扩增产物纯化物，分别回收纯化后，连接获得含p-GLU-t的2种不同终止子(p-GLU-TDH3t，p-GLU-CYC1t)质粒；

本发明的一种具体实施方式中，采用以下方法制备含有 p1-GLU-t1-p2-GLU-t2的质粒：

(i)以获得的p-GLU-TDH3t重组质粒模板，分别设计引物ADH1-BglII-F (核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示)，ENOL-BglII-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示)，PDC1-BglII-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示)， HXT7-BglII-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示)，FBA1-BglII-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示)，PGK1-BglII-F(核苷酸序列如SEQ IDNO.31 所示)，TDH-BglII-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示，含BglII酶切位点)分别与TTDH-BamHI-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，含BamHI 酶切位点)为引物对，进行PCR扩增，产物纯化后用BglII/BamHI酶进行双酶切，获取酶切片段；

(ii)对上步vi)中获得的含p-GLU-CYC1t的质粒进行BamHI单酶切，获得纯化酶切产物；

(iii)对i)ii)获得的纯化产物进行连接，获得含p1-GLU-t1-p2-GLU-t2 的质粒。

为了使本领域技术人员更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。本领域技术人员应当理解的是，这不应被理解为对本发明权利要求范围的限定。同时需要注意的是，本发明中的试剂或仪器无特别说明的均可通过市售购买得到。

本发明所用试剂具体来源列于下面的表1中。

表1本发明所用试剂厂商

本发明具体实施方式中使用的引物序列信息如表2中所示。

表2

实施例1构建含p1-GLU-t1-p2-GLU-t2的质粒

片段2制备：

采用以下方法制备delta5'-pUCori-CEN6/ARS-delta3'-loxP-TEF1p- KanMX-TEF1t-loxP：

采用BamHI和KpnI双酶切实验室保存的质粒pYIE-delta(上海工业生物技术研发中心馈赠)，质粒pYIE-delta的图谱如图1所示，得到带有粘性末端的delta5'-pUCori-CEN6/ARS-delta3'-loxP-TEF1p-KanMX-TEF1t-loxP，即得到片段2。

片段1制备：

采用以下方法制备p1-GLU-t1：

(i)MQenol1(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)和MQenol2-2(核苷酸序列如SEQID NO.15所示)为引物对，上游含KpnI酶切位点，下游含NdeI 酶切位点，以安琪高酒酵母YY基因组为模板，扩增得到启动子ENO1p；

(ii)sfglu1-p11(核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示，含KpnI/NdeI酶切位点)和sfglu1-p2(核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示，含EcoRI/BamHI酶切位点)为引物对，以扣囊覆膜酵母的总DNA为模板，扩增GLU；

(iii)MQTDH35(核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示，含EcoRI酶切位点) 和MQTDH36(核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示，含BamHI酶切位点)，为引物，以安琪高酒酵母YY基因组DNA为模板，扩增终止子TDH3t。

T-CYC1-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示，含EcoRI酶切位点)和 T-CYC1-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示，含BamHI酶切位点)为引物，扩增终止子CYC1t；

(iv)KpnI/BamHI酶切GLU扩增产物纯化物，回收纯化后与带有粘性末端的片段2连接，获得含GLU的质粒；

(v)EcoRI/BamHI酶切iv)中重组质粒，EcoRI/BamHI酶切终止子扩增产物纯化物CYC1t与TDH3t(备用)，分别回收纯化后，连接获得含GLU-CYC1t 的质粒；

(vi)KpnI/NdeI酶切v)中重组质粒，KpnI/NdeI酶切ENO1p启动子扩增产物纯化物，回收纯化后，连接获得启动子为ENO1p、终止子为CYC1t的 ENO1p-GLU-CYC1t的质粒，在此基础上再用EcoRI/BamHI酶切切除CYC1t, 替换成v)获得的TDH3t，获得启动子为ENO1p、终止子为TDH3t的ENO1p-GLU-TDH3t的质粒；

采用以下方法制备p1-GLU-t1-p2-GLU-t2：

(i)以获得的ENO1p-GLU-TDH3t重组质粒为模板，以引物 ENOL-BglII-F(SEQ IDNO.27，含BglII酶切位点)与TTDH-BamHI-R(SEQ ID NO.33，含BamHI酶切位点)为引物对，进行PCR扩增，产物纯化后用 BglII/BamHI酶(同尾酶)进行双酶切，获取酶切片段；

(ii)对上步vi)获得的含ENO1p-GLU-CYC1t的质粒进行BamHI单酶切，获得纯化酶切产物；

(iii)对i)ii)获得的纯化产物进行连接，获得含ENO1p-GLU-CYC1t- ENO1p-GLU-TDH3t的重组表达质粒，质粒图谱如图2所示。

实施例2构建含p1-GLU-t1-p2-GLU-t2的质粒

以实施例1中的方法制备重组表达质粒，不同之处在于，本实施例中以 MQadh11(SEQ ID NO.12)和MQadh12-2(SEQ ID NO.13)为引物，以安琪高酒酵母YY基因组DNA为模板，扩增得到启动子ADH1p，以ADH1-BglII-F (SEQ ID NO.26)与TTDH-BamHI-R(SEQ IDNO.33)为引物，PCR扩增得到ADH1p-GLU-TDH3t，获得含ADH1p-GLU-CYC1t-ADH1p-GLU-TDH3t的重组表达质粒，质粒图谱如图3所示。

实施例3构建含p1-GLU-t1-p2-GLU-t2的质粒

以实施例1中的方法制备重组表达质粒，不同之处在于，本实施例中以 MQFBA11(SEQ ID NO.20)和MQFBA12-2(SEQ ID NO.21)为引物，以安琪高酒酵母YY基因组DNA为模板，扩增得到启动子FBA1p，以 FBA1-BglII-F(SEQ ID NO.30)与TTDH-BamHI-R(SEQ IDNO.33)为引物， PCR扩增得到FBA1p-GLU-TDH3t，获得含FBA1p-GLU-TCYC1t-FBA1p-GLU-TDH3t的重组表达质粒，质粒图谱如图4所示。

实施例4构建含p1-GLU-t1-p2-GLU-t2的质粒

以实施例1中的方法制备重组表达质粒，不同之处在于，本实施例中以 MQhxt71(SEQ ID NO.18)和MQhxt72-2(SEQ ID NO.19)为引物，以安琪高酒酵母YY基因组DNA为模板，扩增得到启动子HXT7p，以HXT7-BglII-F (SEQ ID NO.29)与TTDH-BamHI-R(SEQ IDNO.33)为引物，PCR扩增得到HXT7p-GLU-TDH3t，获得含HXT7p-GLU-CYC1t-HXT7p-GLU-TDH3t的重组表达质粒，质粒图谱如图5所示。

实施例5构建含p1-GLU-t1-p2-GLU-t2的质粒

以实施例1中的方法制备重组表达质粒，不同之处在于，本实施例中以 MQTDH31(SEQ ID NO.24)和MQTDH32-2(SEQ ID NO.25)为引物，以安琪高酒酵母YY基因组DNA为模板，扩增得到启动子TDH3p，以 TDH-BglII-F(SEQ ID NO.32)与TTDH-BamHI-R(SEQ IDNO.33)为引物，PCR扩增得到TDH3p-GLU-TDH3t，获得含TDH3p-GLU-CYC1t-TDH3p- GLU-TDH3t的重组表达质粒，质粒图谱如图6所示。

实施例6构建含p1-GLU-t1-p2-GLU-t2的质粒

以实施例1中的方法制备重组表达质粒，不同之处在于，本实施例中以 MQ1pdca11(SEQ ID NO.16)和MQ1pdca12-2(SEQ ID NO.17)为引物，以安琪高酒酵母YY基因组DNA为模板，扩增得到启动子PDC1p，以 PDC1-BglII-F(SEQ ID NO.28)与TTDH-BamHI-R(SEQ IDNO.33)为引物， PCR扩增得到PDC1p-GLU-TDH3t，获得含PDC1p-GLU-CYC1t-PDC1p-GLU-TDH3t的重组表达质粒，质粒图谱如图7所示。

实施例7构建含p1-GLU-t1-p2-GLU-t2的质粒

以实施例1中的方法制备重组表达质粒，不同之处在于，本实施例中以 MQ1pgk11(SEQ ID NO.22)和MQpgk12-2(SEQ ID NO.23)为引物，以安琪高酒酵母YY基因组DNA为模板，扩增得到启动子PGK1p，以 PGK1-BglII-F(SEQ ID NO.31)与TTDH-BamHI-R(SEQ IDNO.33)为引物 PCR扩增PGK1p-GLU-TDH3t，获得含PGK1p-GLU-CYC1t-PGK1p-GLU-TDH3t的重组表达质粒，质粒图谱如图8所示。

验证得到的重组表达质粒中含有启动子、糖化酶基因GLU、终止子和 p-GLU-TDH3t。

以实施例1-7中的p-GLU-CYC1t质粒为模板，分别使用引物 MQenol1/MQenol 2-2,MQadh11/MQadh12-2,MQFBA11/MQFBA12-2,MQhxt71/MQhxt72-2,MQTDH31/MQTDH32-2,MQ1pdca11/MQ1pdca12-2。结果如图9所示，MQ1pgk11/MQ1pgk2-2扩增启动子ENO1p产物大小515bp， ADH1p产物大小750bp，FBA1p产物大小630bp，HXT7p产物大小391bp， TDH3p产物大小698bp，PDC1p产物大小706bp，PGK1p产物大小628bp。

以实施例1-7中的p-GLU-CYC1t质粒为酶切底物，使用KpnI/NdeI内切酶双酶切。结果如图10所示，酶切产物载体骨架4814bp，启动子ENO1p 515bp，ADH1p 750bp，FBA1p630bp，HXT7p 391bp，TDH3p 698bp，PDC1p 706bp，PGK1p 628bp。

对实施例1-7中构建的p-GLU-CYC1t重组质粒中的糖化酶基因GLU使用引物sfglu1-p11/sfglu1-p2进行PCR扩增。如图11所示，得到的产物为 1560bp。

对实施例1-7中构建的p-GLU-CYC1t重组质粒中终止子CYC1t使用引物T-CYC1-F/T-CYC1-R进行PCR检测。结果如图12所示，扩增产物为 275bp。

对实施例1-7中构建的p-GLU-TDH3t重组质粒中终止子TDH3t进行 EcoRI/BamHI双酶切检测。结果如图13所示，酶切产物载体5814bp，终止子片段726bp。

对实施例1-7中构建的p-GLU-TDH3t重组质粒中终止子TDH3t使用引物MQTDH35/MQTDH36进行PCR检测。结果如图14所示，扩增产物为 726bp的终止子片段。

对实施例1-7中p-GLU-CYC1t重组质粒BamHI单酶切后插入 p-GLU-TDH3t片段而构建的p1-GLU-t1-p2-GLU-t2进行插入片段 p-GLU-TDH3t的PCR检测，使用引物TDH-BglII-F，ENOL-BglII-F， FBA1-BglII-F，HXT7-BglII-F，PDC1-BglII-F，ADH1-BglII-F，PGK1-BglII-F 与TTDH-BamHI-R配对。检测结果如图15所示，扩增产物为2900bp片段。

实施例8重组酵母菌株的构建

利用实施例1-7制备得到的单拷贝及双拷贝质粒制备重组酵母，具体操作过程如下：

将实施例1-7制备得到的单拷贝及双拷贝质粒经限制性内切酶NotI线性化后，分别1.5KV，5ms电转化宿主酿酒酵母安琪高酒酵母YY(CCTCC M 2021171)得到转化子；

消除获得转化子培养的菌株中的抗性基因，得到重组酵母YY-P-G。

采用以下方法消除获得转化子培养的菌株中的抗性基因：(i)向所述转化子培养获得的菌株中分别1.5KV，5ms电转入pSH47-hph质粒(上海工业生物技术研发中心馈赠)，使用半乳糖诱导Cre酶表达，消去G418抗性；(ii) 通过传代培养(目标质粒通过线性化已经整合到宿主基因组，宿主中没有游离的本发明目标质粒；pSH47-hph质粒游离在宿主细胞中，通过传代就可以消除)消去pSH47-hph质粒。如图16所示，转入pSH47-hph质粒的重组酵母在潮霉素(hph)抗性平板中能够生长，说明pSH47-hph质粒已成功转入重组酵母中。

实施例9不同菌株发酵生产乙醇的效率

参照酒精酵母检测方法比较实施例1-7得到的重组酵母，初始宿主酵母菌株安琪高酒酵母YY及市售糖化酵母N发酵玉米淀粉生产乙醇的效率。

实验材料：玉米粉，初始宿主酵母菌株安琪高酒酵母YY及市售诺维信糖化酶酵母NS50382，本发明中的重组酵母YY-P-G。

试验方法：参照酒精酵母检测方法，料水比1:2.2，尿素0.35g，不加糖化酶，加0.045ml液化酶，安琪高酒酵母YY对照不加糖化酶。

操作步骤：

(i)称15份玉米粉，每份100g，加入到1000ml锥形瓶中，标记为实施例1-7，各组锥形瓶中分别加入220ml水，再分别加入0.2ml液化酶，液化酶酶活为6万单位，沸水水浴液化2小时；水浴过程搅拌两次，每十分钟搅拌一次，让液化效果均匀，减少因液化差异造成的实验误差。

(ii)液化完成后将锥形瓶取出，冷却至34℃，每组锥形瓶中各加尿素 0.35g，为酵母提供氮源，调酸，加干酵母0.1g(用水溶解后移液管添加)；

(iii)补水至料水比(玉米淀粉：水)1:2.2，封口后置于32℃，170rpm/min 摇床，在培养68-72小时，检测酒精度。

(iv)量筒取100ml发酵液至蒸馏瓶中蒸酒，容量瓶定容100ml，测酒度和温度。

(v)蒸酒方法：量筒取100ml发酵液至蒸馏瓶中，加消泡剂，开冷凝水，密封好用100ml容量瓶接酒，容量瓶接至100ml后停止蒸酒，测酒度和温度，查表换算成标准酒度。酒精产量结果如表3所示。

表3各菌株酒精产量

如表3所示，双拷贝质粒较单拷贝质粒转化获得的重组酵母有明显优势，尤其是本发明实施例4提供的含双拷贝构建物的载体制备得到的重组酵母发酵生产酒精产量达到16.5g/100ml，而初始菌株酒精产量仅3g/100ml，市售糖化酵母的酒精产量仅13g/100ml，本发明提供的重组酵母大幅提高了酒精的产量。将本发明实施例4提供的含双拷贝构建物的载体制备得到的重组酵母命名为酿酒酵母YY-HXT7-1(Saccharomycescerevisiae YY-HXT7-1)，并进行保藏，于2019年12月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 20191127。

序列表

<110> 安琪酵母股份有限公司

<120> 一种用于重组表达糖化酶的构建物及其应用

<160> 39

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 519

<212> PRT

<213> 扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)

<400> 1

Met Lys Phe Gly Val Leu Phe Ser Val Phe Ala Ala Ile Val Ser Ala

1 5 10 15

Leu Pro Leu Gln Glu Gly Pro Leu Asn Lys Arg Ala Tyr Pro Ser Phe

20 25 30

Glu Ala Tyr Ser Asn Tyr Lys Val Asp Arg Thr Asp Leu Glu Thr Phe

35 40 45

Leu Asp Lys Gln Lys Glu Val Ser Leu Tyr Tyr Leu Leu Gln Asn Ile

50 55 60

Ala Tyr Pro Glu Gly Gln Phe Asn Asn Gly Val Pro Gly Thr Val Ile

65 70 75 80

Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asn Pro Asp Tyr Tyr Tyr Gln Trp Thr Arg

85 90 95

Asp Ser Ala Ile Thr Phe Leu Thr Val Leu Ser Glu Leu Glu Asp Asn

100 105 110

Asn Phe Asn Thr Thr Leu Ala Lys Ala Val Glu Tyr Tyr Ile Asn Thr

115 120 125

Ser Tyr Asn Leu Gln Arg Thr Ser Asn Pro Ser Gly Ser Phe Asp Asp

130 135 140

Glu Asn His Lys Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Thr Asp Gly Ser

145 150 155 160

Ala Tyr Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Asn Asp Gly Pro Ala Leu

165 170 175

Arg Ala Tyr Ala Ile Ser Arg Tyr Leu Asn Asp Val Asn Ser Leu Asn

180 185 190

Glu Gly Lys Leu Val Leu Thr Asp Ser Gly Asp Ile Asn Phe Ser Ser

195 200 205

Thr Glu Asp Ile Tyr Lys Asn Ile Ile Lys Pro Asp Leu Glu Tyr Val

210 215 220

Ile Gly Tyr Trp Asp Ser Thr Gly Phe Asp Leu Trp Glu Glu Asn Gln

225 230 235 240

Gly Arg His Phe Phe Thr Ser Leu Val Gln Gln Lys Ala Leu Ala Tyr

245 250 255

Ala Val Asp Ile Ala Lys Ser Phe Asp Asp Gly Asp Phe Ala Asn Thr

260 265 270

Leu Ser Ser Thr Ala Ser Thr Leu Glu Ser Tyr Leu Ser Gly Ser Asp

275 280 285

Gly Gly Phe Val Asn Thr Asp Val Asn His Ile Val Glu Asn Pro Asp

290 295 300

Leu Leu Gln Gln Asn Ser Arg Gln Gly Leu Asp Ser Ala Thr Tyr Ile

305 310 315 320

Gly Pro Leu Leu Thr His Asp Ile Gly Glu Ser Ser Ser Thr Pro Phe

325 330 335

Asp Val Asp Asn Glu Tyr Val Leu Gln Ser Tyr Tyr Leu Leu Leu Glu

340 345 350

Asp Asn Lys Asp Arg Tyr Ser Val Asn Ser Ala Tyr Ser Ala Gly Ala

355 360 365

Ala Ile Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Asn Gly Asp Gly Ser Ser

370 375 380

Glu Gly Asn Pro Trp Phe Leu Ala Thr Ala Tyr Ala Ala Gln Val Pro

385 390 395 400

Tyr Lys Leu Ala Tyr Asp Ala Lys Ser Ala Ser Asn Asp Ile Thr Ile

405 410 415

Asn Lys Ile Asn Tyr Asp Phe Phe Asn Lys Tyr Ile Val Asp Leu Ser

420 425 430

Thr Ile Asn Ser Ala Tyr Gln Ser Ser Asp Ser Val Thr Ile Lys Ser

435 440 445

Gly Ser Asp Glu Phe Asn Thr Val Ala Asp Asn Leu Val Thr Phe Gly

450 455 460

Asp Ser Phe Leu Gln Val Ile Leu Asp His Ile Asn Asp Asp Gly Ser

465 470 475 480

Leu Asn Glu Gln Leu Asn Arg Tyr Thr Gly Tyr Ser Thr Gly Ala Tyr

485 490 495

Ser Leu Thr Trp Ser Ser Gly Ala Leu Leu Glu Ala Ile Arg Leu Arg

500 505 510

Asn Lys Val Lys Ala Leu Ala

515

<210> 2

<211> 1560

<212> DNA

<213> 扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)

<400> 2

atgaaattcg gtgttttatt ttccgtcttt gctgctattg ttagtgcttt acctttgcaa 60

gaaggtcctt tgaacaaaag agcctatcct tcttttgaag cttattcaaa ctataaagtt 120

gacagaactg acttggaaac cttcttggac aaacaaaaag aagtatcttt atactatctt 180

ttacaaaaca ttgcttatcc tgaaggccaa tttaataatg gtgttcctgg tactgttatt 240

gcttctccat caacctctaa tccggactac tattaccaat ggaccagaga ttccgcaatt 300

acatttttga cagttctttc tgaactagaa gataataact tcaataccac tttggccaag 360

gcagttgagt actacattaa caccagttac aaccttcaaa gaaccagtaa cccaagtggc 420

agctttgatg atgaaaatca taaaggcttg ggagaaccaa aatttaacac agatggttct 480

gcatacaccg gagcttgggg gagaccgcaa aatgatggtc ctgctttgag agcttatgct 540

atcagtagat acttgaatga tgtcaattct ttaaatgaag gtaaattagt attgactgat 600

tcaggtgata tcaacttttc ttcaactgaa gatatttaca aaaatatcat caaaccagac 660

ttggaatatg ttatagggta ctgggattct actgggtttg atctttggga ggaaaaccaa 720

ggcagacact tttttacaag cttggttcaa cagaaagccc ttgcttatgc tgtcgatatt 780

gccaaaagtt ttgacgacgg cgactttgcg aacacacttt cttcgactgc ttctaccctc 840

gaaagttatt tgagtggcag tgatggtgga tttgttaata ctgatgttaa ccacattgtt 900

gaaaacccag atttgcttca acaaaactct agacaaggtc tagattcagc cacatatatt 960

ggcccacttt tgactcatga tattggtgaa agcagctcaa ctccatttga tgttgacaat 1020

gagtatgttt tgcaatcata ttacttgtta ttggaggata acaaagacag atactctgtt 1080

aacagtgctt attctgctgg tgcagctatt ggcagatacc cagaagatgt ttacaatggt 1140

gatggttcat ctgaaggcaa tccatggttc ttagctactg cctatgctgc ccaagttcca 1200

tacaaacttg cttatgatgc aaagtcggcc tcaaatgaca ttaccattaa caagattaac 1260

tacgattttt ttaacaagta tattgttgat ttatctacca tcaattctgc ttaccagtct 1320

tctgatagtg tcaccattaa aagtggctct gatgaattta acacggttgc tgataatttg 1380

gtcacattcg gtgattcctt tttgcaagtc attttggatc atattaatga tgatggctcc 1440

ttgaatgaac aacttaacag atataccggt tattccaccg gtgcctactc tttgacatgg 1500

agcagtggtg ctcttcttga agctattaga cttagaaata aggtcaaggc tttggcttaa 1560

<210> 3

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgattttttt ctaaaccgtg gaatatttcg gatatccttt tgttgtttcc gggtgtacaa 60

tatggacttc ctcttttctg gcaaccaaac ccatacatcg ggattcctat aataccttcg 120

ttggtctccc taacatgtag gtggcggagg ggagatatac aatagaacag ataccagaca 180

agacataatg ggctaaacaa gactacacca attacactgc ctcattgatg gtggtacata 240

acgaactaat actgtagccc tagacttgat agccatcatc atatcgaagt ttcactaccc 300

tttttccatt tgccatctat tgaagtaata ataggcgcat gcaacttctt ttcttttttt 360

ttcttttctc tctcccccgt tgttgtctca ccatatccgc aatgacaaaa aaatgatgga 420

agacactaaa ggaaaaaatt aacgacaaag acagcaccaa cagatgtcgt tgttccagag 480

ctgatgaggg gtatctcgaa gcacacgaaa ctttttcctt ccttcattca cgcacactac 540

tctctaatga gcaacggtat acggccttcc ttccagttac ttgaatttga aataaaaaaa 600

agtttgctgt cttgctatca agtataaata gacctgcaat tattaatctt ttgtttcctc 660

gtcattgttc tcgttccctt tcttccttgt ttctttttct gcacaatatt tcaagctata 720

ccaagcatac aatcaactat ctcatataca 750

<210> 4

<211> 515

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgcttctag gcgggttatc tactgatccg agcttccact aggatagcac ccaaacacct 60

gcatatttgg acgaccttta cttacaccac caaaaaccac tttcgcctct cccgcccctg 120

ataacgtcca ctaattgagc gattacctga gcggtcctct tttgtttgca gcatgagact 180

tgcatactgc aaatcgtaag tagcaacgtc tcaaggtcaa aactgtatgg aaaccttgtc 240

acctcactta attctagcta gcctaccctg caagtcaaga ggtctccgtg attcctagcc 300

acctcaaggt atgcctctcc ccggaaactg tggccttttc tggcacacat gatctccacg 360

atttcaacat ataaatagct tttgataatg gcaatattaa tcaaatttat tttacttctt 420

tcttgtaaca tctctcttgt aatcccttat tccttctagc tatttttcat aaaaaaccaa 480

gcaactgctt atcaacacac aaacactaaa tcaaa 515

<210> 5

<211> 706

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgcgtttat ttacctatct ctaaacttca acaccttata tcataactaa tatttcttga 60

gataagcaca ctgcacccat accttcctta aaaacgtagc ttccagtttt tggtggttcc 120

ggcttccttc ccgattccgc ccgctaaacg catatttttg ttgcctggtg gcatttgcaa 180

aatgcataac ctatgcattt aaaagattat gtatgctctt ctgacttttc gtgtgatgag 240

gctcgtggaa aaaatgaata atttatgaat ttgagaacaa ttttgtgttg ttacggtatt 300

ttactatgga ataatcaatc aattgaggat tttatgcaaa tatcgtttga atatttttcc 360

gaccctttga gtacttttct tcataattgc ataatattgt ccgctgcccc tttttctgtt 420

agacggtgtc ttgatctact tgctatcgtt caacaccacc ttattttcta actatttttt 480

ttttagctca tttgaatcag cttatggtga tggcacattt ttgcataaac ctagctgtcc 540

tcgttgaaca taggaaaaaa aaatatataa acaaggctct ttcactctcc ttgcaatcag 600

atttgggttt gttcccttta ttttcatatt tcttgtcata ttcctttctc aattattatt 660

ttctactcat aacctcacgc aaaataacac agtcaaatca atcaaa 706

<210> 6

<211> 391

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcgtaggaa caatttcggg cccctgcgtg ttcttctgag gttcatcttt tacatttgct 60

tctgctggat aattttcaga ggcaacaagg aaaaattaga tggcaaaaag tcgtctttca 120

aggaaaaatc cccaccatct ttcgagatcc cctgtaactt attggcaact gaaagaatga 180

aaaggaggaa aatacaaaat atactagaac tgaaaaaaaa aaagtataaa tagagacgat 240

atatgccaat acttcacaat gttcgaatct attcttcatt tgcagctatt gtaaaataat 300

aaaacatcaa gaacaaacaa gctcaacttg tcttttctaa gaacaaagaa taaacacaaa 360

aacaaaaagt ttttttaatt ttaatcaaaa a 391

<210> 7

<211> 630

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ataacaatac tgacagtact aaataattgc ctacttggct tcacatacgt tgcatacgtc 60

gatatagata ataatgataa tgacagcagg attatcgtaa tacgtaatag ttgaaaatct 120

caaaaatgtg tgggtcatta cgtaaataat gataggaatg ggattcttct atttttcctt 180

tttccattct agcagccgtc gggaaaacgt ggcatcctct ctttcgggct caattggagt 240

cacgctgccg tgagcatcct ctctttccat atctaacaac tgagcacgta accaatggaa 300

aagcatgagc ttagcgttgc tccaaaaaag tattggatgg ttaataccat ttgtctgttc 360

tcttctgact ttgactcctc aaaaaaaaaa aatctacaat caacagatcg cttcaattac 420

gccctcacaa aaactttttt ccttcttctt cgcccacgtt aaattttatc cctcatgttg 480

tctaacggat ttctgcactt gatttattat aaaaagacaa agacataata cttctctatc 540

aatttcagtt attgttcttc cttgcgttat tcttctgttc ttctttttct tttgtcatat 600

ataaccataa ccaagtaata catattcaaa 630

<210> 8

<211> 628

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttttggcttc accctcatac tattatcagg gccagaaaaa ggaagtgttt ccctccttct 60

tgaattgatg ttaccctcat aaagcacgtg gcctcttatc gagaaagaaa ttaccgtcgc 120

tcgtgatttg tttgcaaaaa gaacaaaact gaaaaaaccc agacacgctc gacttcctgt 180

cttcctattg attgcagctt ccaatttcgt cacacaacaa ggtcctagcg acggctcaca 240

ggttttgtaa caagcaatcg aaggttctgg aatggcggga aagggtttag taccacatgc 300

tatgatgccc actgtgatct ccagagcaaa gttcgttcga tcgtactgtt actctctctc 360

tttcaaacag aattgtccga atcgtgtgac aacaacagcc tgttctcaca cactcttttc 420

ttctaaccaa gggggtggtt tagtttagta gaacctcgtg aaacttacat ttacatatat 480

ataaacttgc ataaattggt caatgcaaga aatacatatt tggtcttttc taattcgtag 540

tttttcaagt tcttagatgc tttctttttc tcttttttac agatcatcaa ggaagtaatt 600

atctactttt tacaacaaat ataaaaca 628

<210> 9

<211> 698

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ataaaaaaca cgctttttca gttcgagttt atcattatca atactgccat ttcaaagaat 60

acgtaaataa ttaatagtag tgattttcct aactttattt agtcaaaaaa ttagcctttt 120

aattctgctg taacccgtac atgcccaaaa tagggggcgg gttacacaga atatataaca 180

tcgtaggtgt ctgggtgaac agtttattcc tggcatccac taaatataat ggagcccgct 240

ttttaagctg gcatccagaa aaaaaaagaa tcccagcacc aaaatattgt tttcttcacc 300

aaccatcagt tcataggtcc attctcttag cgcaactaca gagaacaggg gcacaaacag 360

gcaaaaaacg ggcacaacct caatggagtg atgcaacctg cctggagtaa atgatgacac 420

aaggcaattg acccacgcat gtatctatct cattttctta caccttctat taccttctgc 480

tctctctgat ttggaaaaag ctgaaaaaaa aggttgaaac cagttccctg aaattattcc 540

cctacttgac taataagtat ataaagacgg taggtattga ttgtaattct gtaaatctat 600

ttcttaaact tcttaaattc tacttttata gttagtcttt tttttagttt taaaacacca 660

agaacttagt ttcgaataaa cacacataaa caaacaaa 698

<210> 10

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtgaatttac tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatgacttag 60

tttcaattta tatactattt taatgacatt ttcgattcat tgattgaaag ctttgtgttt 120

tttcttgatg cgctattgca ttgttcttgt ctttttcgcc acatgtaata tctgtagtag 180

atacctgata cattgtggat gctgagtgaa attttagtta ataatggagg cgctcttaat 240

aattttgggg atattggctt ttttttttaa agtttacaaa tgaatttttt ccgccaggat 300

aacgattctg aagttactct tagcgttcct atcggtacag ccatcaaatc atgcctataa 360

atcatgccta tatttgcgtg cagtcagtat catctacatg aaaaaaactc ccgcaatttc 420

ttatagaata cgttgaaaat taaatgtacg cgccaagata agataacata tatctagatg 480

cagtaatata cacagattcc cgcggacgtg ggaaggaaaa aattagataa caaaatctga 540

gtgatatgga aattccgctg tatagctcat atctttccct tcaacaccag aaatgtaaaa 600

atcttgttac gaaggatctt tttgctaatg tttctcgctc aatcctcatt tcttccctac 660

gaagagtcaa atctacttgt tttctgccgg tatcaagatc catatcttct agtttcacca 720

tcaaag 726

<210> 11

<211> 275

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acaggcccct tttcctttgt cgatatcatg taattagtta tgtcacgctt acattcacgc 60

cctcctccca catccgctct aaccgaaaag gaaggagtta gacaacctga agtctaggtc 120

cctatttatt ttttttaata gttatgttag tattaagaac gttatttata tttcaaattt 180

ttcttttttt tctgtacaaa cgcgtgtacg catgtaacat tatactgaaa accttgcttg 240

agaaggtttt gggacgctcg aaggctttaa tttgc 275

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgggtacccg atttttttct aaaccgtgga ata 33

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gatatatcat atgtgtatat gagatagttg attgtatg 38

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtaggtaccc ttctaggcgg gttatctact gatc 34

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gatatttcat atgtttgatt tagtgtttgt gtgttgat 38

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tcggtaccgc gtttatttac ctatctc 27

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gatatgtcat atgtttgatt gatttgactg tg 32

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

taggtaccct cgtaggaaca atttcgg 27

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gatatgtcat atgtttttga ttaaaattaa aaaaactt 38

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gcggtaccat aacaatactg acagtact 28

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gatatgtcat atgtttgaat atgtattact tgg 33

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

taggtacctt ttggcttcac cctcatac 28

<210> 23

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gatatgtcat atgtgtttta tatttgttgt a 31

<210> 24

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gcggtacctt ataaaaaaca cgctttttca gtt 33

<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gatatgtcat atgttttgtt tgtttatgtg tgtttatt 38

<210> 26

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

atagatctcg atttttttct aaaccgtgga ata 33

<210> 27

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

atagatctct tctaggcggg ttatctactg atc 33

<210> 28

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

atagatctgc gtttatttac ctatctctaa actt 34

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

atagatctct cgtaggaaca atttcgg 27

<210> 30

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

atagatctat aacaatactg acagtactaa ataattgc 38

<210> 31

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

atagatcttt tggcttcacc ctcatac 27

<210> 32

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

taagatctat aaaaaacacg ctttttcagt t 31

<210> 33

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

taggatcctt tgatggtgaa actagaagat atg 33

<210> 34

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tagggtaccc atatgaaatt cggtgtttta ttttccgt 38

<210> 35

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ttaggatccg aattcttaag ccaaagcctt gacctt 36

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tagaattcgt gaatttactt taaatcttgc 30

<210> 37

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

taggatccct ttgatggtga aactagaag 29

<210> 38

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

tagaattcac aggccccttt tcctttgtc 29

<210> 39

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

taggatccgc aaattaaagc cttcgagc 28

Claims

1.一种重组酵母，其特征在于，所述重组酵母的宿主酵母细胞为安琪高酒酵母YY（Saccharomyces cerevisiae 高酒酵母YY），保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO: M 2021171；

所述重组酵母细胞中含有一种表达载体，

所述表达载体中含有双拷贝的用于重组表达糖化酶的构建物，

所述构建物从5'至3'端依次包括启动子，编码糖化酶的核苷酸序列，终止子；

所述双拷贝的用于重组表达糖化酶的构建物为：

ENO1p- GLU-CYC1t- ENO1p- GLU-TDH3t；

或，ADH1p-GLU-CYC1t-ADH1p- GLU-TDH3t；

或，FBA1p - GLU-CYC1t- FBA1p - GLU-TDH3t；

或，HXT7p - GLU-CYC1t- HXT7p- GLU-TDH3t；

或，TDH3p- GLU-CYC1t- TDH3p- GLU-TDH3t；

或，PDC1p- GLU-CYC1t- PDC1p - GLU-TDH3t；

或，PGKp- GLU-CYC1t- PGKp - GLU-TDH3t；

其中，所述GLU 为SEQ ID NO.2中的一个或两个以上的拷贝。

2.根据权利要求1所述的重组酵母，其特征在于，所述编码糖化酶的核苷酸序列编码得到的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的重组酵母，其特征在于，所述表达载体的结构为：p1-GLU-t1-p2-GLU-t2-delta5'-pUCori-CEN6/ARS-delta3'-loxP-TEF1p-KanMX-TEF1t-loxP ，其中，

p1-GLU-t1-p2-GLU-t2为

ENO1p- GLU-CYC1t- ENO1p- GLU-TDH3t，

或，ADH1p-GLU-CYC1t-ADH1p- GLU-TDH3t，

或，FBA1p - GLU-CYC1t- FBA1p - GLU-TDH3t，

或，HXT7p - GLU-CYC1t- HXT7p- GLU-TDH3t，

或，TDH3p- GLU-CYC1t- TDH3p- GLU-TDH3t，

或，PDC1p- GLU-CYC1t- PDC1p - GLU-TDH3t，

或，PGKp- GLU-CYC1t- PGKp - GLU-TDH3t；

所述GLU 为SEQ ID NO.2中的一个或两个以上的拷贝；

TEF1p-KanMX-TEF1t 为卡那霉素/G418 抗性基因表达片段；

delta5'、delta3'为 delta 片段；

pUCori-CEN6/ARS 为复制子序列；

loxP为抗性消除识别位点。

4.根据权利要求1所述的重组酵母，其特征在于，所述重组酵母为酿酒酵母YY-HXT7-1（Saccharomyces cerevisiae YY-HXT7-1），保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO: M 20191127。

5.酿酒酵母YY-HXT7-1（Saccharomyces cerevisiae YY-HXT7-1），其保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO: M 20191127。

6.权利要求1-3任意一项所述的重组酵母的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的重组酵母的制备方法，其特征在于，将所述的表达载体转化到宿主酵母细胞中包括以下步骤：

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将所述的构建物整合到宿主酵母细胞的染色体基因组中是通过基因编辑技术和/或同源重组的方式对宿主细胞进行定向改造，使宿主酵母细胞的染色体基因组中含有所述基因编辑技术和/或同源重组的构建物。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的基因编辑技术选自ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑中的一种或两种以上的组合。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的同源重组选自λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组。

11.权利要求7-10任意一项所述的制备方法得到的重组酵母。

12.一种发酵生产糖化酶的方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求1-4任意一项所述的重组酵母或权利要求5所述的酿酒酵母YY-HXT7-1（Saccharomyces cerevisiaeYY-HXT7-1）或权利要求11所述的重组酵母。

13.一种发酵生产乙醇的方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求1-4任意一项所述的重组酵母或权利要求5所述的酿酒酵母YY-HXT7-1（Saccharomyces cerevisiae YY-HXT7-1）或权利要求11所述的重组酵母。