CN113293153B - 一种重组毕赤酵母分泌表达左聚糖蔗糖酶的方法及其应用 - Google Patents

一种重组毕赤酵母分泌表达左聚糖蔗糖酶的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组毕赤酵母，将来自枯草芽孢杆菌的左聚糖蔗糖酶(Levansucrase)基因克隆到毕赤酵母整合质粒上，得到的重组质粒线性化后转化到宿主毕赤酵母，通过同源重组将左聚糖蔗糖酶(Levansucrase)基因整合到毕赤酵母染色体中，挑选出携带高拷贝外源基因的重组毕赤酵母菌株，即得。本发明能够高效分泌表达耐热型左聚糖蔗糖酶，分泌率约100％，重组酶的最适聚合反应温度提高到45℃，具有良好的耐热性，通过简单离心去除毕赤酵母细胞所得的上清液即可作为酶制剂，用于高分子量左聚糖的生产，产物中分子量约2000kDa的左聚糖组分可占比90％以上，蔗糖转化率达27.8％。

Description

一种重组毕赤酵母分泌表达左聚糖蔗糖酶的方法及其应用
技术领域
本发明涉及微生物重组工程，特别涉及一种重组毕赤酵母分泌表达左聚糖蔗糖酶的方法及其应用。
背景技术
左聚糖(Levan)是一类分子中含有大量β-(2,6)果糖苷键主链和少量β-(2,1)果糖苷键支链的聚糖，左聚糖因具备高水溶性和低固有粘度等独特优良特性，在医药、食品、日化用品等领域应用广泛。其中，高分子量左聚糖具有更好的抑瘤活性而受到人们重视，具有广阔应用价值。
制备左聚糖主要方法有：直接提取、化学合成、微生物发酵及酶法合成，其中酶法合成左聚糖方法简单、纯化方便、产量较高，有利于左聚糖工业化大规模生产，因此寻求分泌型高产左聚糖蔗糖酶菌株成为关键。
毕赤酵母作为高效外源表达系统，具有诱导水平高、自身分泌蛋白少、适合高密度发酵等优点，广泛用于外源蛋白表达。并且毕赤酵母可以实现外源蛋白胞外表达，便于产物分离纯化，大大降低生产成本。目前，毕赤酵母已被美国FDA 认定为GRAS(Generallyrecognized as safe)微生物，可应用于医药食品生产。
虽然毕赤酵母表达系统在产物胞外分泌、修饰加工方面具有天然优势，但外源基因能否在毕赤酵母中高效分泌表达有较大的外源基因依赖性，即不同的外源蛋白常常有不同的分泌效率，并且和信号肽的选用、密码子的改造以及外源蛋白匹配性均相关。此外，来自原核微生物的基因在真核微生物酵母中表达，更是有许多关于蛋白质翻译和后加工导致重组蛋白功能变化的不确定性。因此，目前尚缺乏在毕赤酵母中高效分泌表达左聚糖蔗糖酶的技术报道。左聚糖蔗糖酶可以通过催化聚合反应将蔗糖底物转化为左聚糖，但目前报道的左聚糖蔗糖酶普遍存在聚合反应中酶热稳定性低、所得产物分子量分布不均一的缺点，尤其是缺乏能够产生较均一的高分子量左聚糖的耐热酶。构建能够高效分泌表达耐热左聚糖蔗糖酶的重组毕赤酵母，并用于生产高分子量为主的左聚糖，对于推进左聚糖在化妆品、食品和医疗的产业化应用具有重大意义。
2019年，Hyunjun Ko et al.报道了在酿酒酵母中整合表达来自水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)左聚糖蔗糖酶的研究(Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology(2019)46:1611–1620)，其重组左聚糖蔗糖酶的胞外分泌率达到了63％，作者在研究中表示这是在已有报道中不同种类酵母分泌表达左聚糖蔗糖酶的最高分泌率。然而，该酶以蔗糖为底物生产左聚糖的酶促反应性能较差，其蔗糖转化率仅12.8％，以50％(W/V)的蔗糖底物反应仅能得到59.1g/L的左聚糖产物；并且该酶热稳定性较差，在40℃时酶活力迅速下降。由此可见，高分泌水平表达高性能耐热左聚糖蔗糖酶的技术仍然亟待突破。
发明内容
本发明针对上述现有技术问题，发明一种以整合型重组毕赤酵母高效分泌表达耐热左聚糖蔗糖酶，并用于生产高分子量为主的左聚糖的方法。利用整合质粒将左聚糖蔗糖酶基因整合到毕赤酵母染色体基因组，构建整合型重组毕赤酵母，经发酵过程诱导表达得到耐热左聚糖蔗糖酶。经简单离心去除毕赤酵母细胞，得到的上清液即可作为左聚糖蔗糖酶制剂，可直接用于高分子量左聚糖的生产。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种重组毕赤酵母分泌表达左聚糖蔗糖酶的方法，将左聚糖蔗糖酶(Levansucrase)基因克隆到毕赤酵母整合质粒上，得到的重组质粒线性化后转化到宿主毕赤酵母，通过同源重组将左聚糖蔗糖酶(Levansucrase)基因整合到毕赤酵母染色体中，挑选出携带高拷贝外源基因的重组毕赤酵母菌株，即得。
作为优选，所述的左聚糖蔗糖酶基因来源于枯草芽孢杆菌。
作为优选，所述的毕赤酵母整合质粒为携带α-MF信号肽的pPIC9K整合质粒，该质粒将α-MF信号肽与外源基因同时整合到毕赤酵母染色体上。
作为优选，所述的宿主毕赤酵母为毕赤酵母GS115菌株。
作为优选，所述的线性化位点选择为Sac I，得到对应菌株表型为Mut+。
如上所述重组毕赤酵母在生产左聚糖(Levan)方面的应用。
作为优选，所述重组毕赤酵母在生产左聚糖方面的应用，操作方法为所得重组毕赤酵母经甲醇诱导培养，离心去除细胞，上清液作为酶制剂，以蔗糖为底物，酶法合成高分子量的左聚糖
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首次将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的左聚糖蔗糖酶基因在毕赤酵母中进行高水平分泌表达，该表达系统能够高效分泌表达耐热型左聚糖蔗糖酶，分泌率约100％，重组酶的最适聚合反应温度提高到45℃，具有良好的耐热性，通过简单离心去除毕赤酵母细胞所得的上清液即可作为酶制剂，用于高分子量左聚糖的生产，产物中分子量约2000kDa的左聚糖组分可占比90％以上，蔗糖转化率达27.8％。
附图说明
图1是为本发明重组毕赤酵母分泌所得左聚糖蔗糖酶Lev(α-MF)的电泳(SDS-PAGE)图谱。
图2是本发明重组毕赤酵母分泌所得左聚糖蔗糖酶Lev(α-MF)合成左聚糖的分子量分布GPC图谱。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、培养基、试剂、菌株若无特殊说明，皆为市售所得或根据公开文献可知。
下列实施例中YPD平板指YPD固体培养基(加有琼脂)，YPD培养基指的是液体培养基(没有琼脂，其余组分与YPD固体培养基相同)。
实施例1
构建重组质粒pPIC9K-lev(α-MF)
1.扩增目的基因
采用来自枯草芽孢杆菌的左聚糖蔗糖酶，基因序列如SEQ ID NO.1所示，根据所述左聚糖蔗糖酶基因序列，设计上游引物(Primer F1)为5’GTAGAATTCCCTAGGAAAGAAACGAACCAAAAGCCATATAAGGAAACA 3’和下游引物(Primer R1)为5’TTAATTCGCGGCCGCATGATGATGATGATGATGTTTGTTAATT 3’；
PCR反应体系：DNA模板(包含上述左聚糖蔗糖酶基因的pSE380质粒)0.4μL(约20ng)；5×Fast Pfu buffer 4μL；TransStart FastPfu DNA Polymerase 0.4μL；2.5mMdNTPs 1.6μL；Primer F1(10μM)0.5μL；Primer F2(10μM)0.5μL；添加ddH2O至25μL；
反应程序：95℃，2min；95℃20s，61℃20s，72℃45s，32个循环；72℃5min；4℃保存；
2.扩增载体
根据pPIC9K基因序列，设计上游引物(Primer F2)为5’GCGGCCGCGAATTAATTCGCCTTA3’和下游引物(Primer R2)为5’CCTAGGGAATTCTACGTAAGCTTCAGCCTCTCTTTT3’；
PCR反应体系：DNA模板(pPIC9K质粒)0.4μL(约20ng)；5×Prime STAR GXL buffer5μL；Prime STAR GXL DNA Polymerase 1μL；2.5mM dNTPs 2μL；Primer F2(10μM)0.5μL；Primer R2(10μM)0.5μL；添加ddH2O至25μL；
反应程序：95℃，2min；98℃10s，60℃15s，68℃100s，32个循环；68℃5min；4℃保存；
3.无缝克隆(In-Fusion cloning)构建重组质粒pPIC9K-lev(α-MF)
In-Fusion反应体系为：目的基因2μL(约100ng)；载体2μL(约50ng)；5×In-FusionHD Enzyme Premix 1μL；
反应条件：37℃15min；50℃15min，转化到大肠杆菌DH5α，经鉴定获得重组质粒pPIC9K-lev(α-MF)。
实施例2
重组质粒pPIC9K-lev(α-MF)转化到毕赤酵母GS115。
1.毕赤酵母GS115感受态细胞的制备
根据Invitrogen公司的毕赤酵母表达手册，选择氯化锂转化法，步骤如下：
(1)从-80℃冰箱中取出保存的毕赤酵母菌种GS115，划线接种在YPD平板上，30℃恒温培养2d；
(2)挑取YPD平板上的菌落，接到含5mL YPD培养基的指形瓶中，30℃、220r/min振荡培养过夜；
(3)按照1％接种量，将步骤(2)中培养过夜后所得毕赤酵母菌种GS115接到50mLYPD培养基中培养至毕赤酵母菌浓OD600＝0.6～0.8；
(4)在超净台上，将步骤(3)中培养后所得毕赤酵母分装到两个50mL离心管中，室温5000r/min，10min离心收集菌体，弃去上清液，用25mL无菌ddH2O洗涤；
(5)再次室温5000r/min，10min离心收集菌体，弃去上清液，用1mL 100mmol/LLiCl重悬菌体，得到细胞悬液；
(6)将细胞悬液转至1.5mL离心管中，13000r/min 15s沉淀细胞，小心吸取上清液；
(7)用400μL 100mmol/L LiCl重悬菌体(即步骤(6)中吸取所得上清液)，分装到1.5mL无菌离心管中，每管50μL，每次用一管，现做现用，不需置于冰上或-20℃保存；
2.重组质粒线性化
根据左聚糖蔗糖酶基因内的酶切位点和质粒pPIC9K上酶切位点，选择SacⅠ酶切位点作为线性化位点；
反应体系：重组质粒pPIC9K-lev(α-MF)43μL(约2μg)，10×Buffer SacⅠ6μL，SacⅠ3μL，添加ddH2O至60μL，37℃过夜酶切；电泳验证后进行纯化(电泳结果如图1所示)，纯化后浓度在100～200ng/μL，保证50μL中含DNA 5～10μg；
3.重组质粒转化到毕赤酵母GS115，步骤如下：
(1)将2mg/mL鲑鱼精DNA沸水浴5min，而后快速放于冰水中使变冷，最后置于冰上待用；
(2)取现做好的感受态细胞，简短离心，除去LiCl溶液；
(3)按顺序依次加入感受态细胞管中，240μL 50％PEG(3350)，涡旋振荡5s，36μL1mol/L LiCl，25μL 2mg/mL鲑鱼精DNA，50μL重组质粒ddH2O溶液(含DNA 6μg)，斡旋混匀；
(4)30℃水浴30min，42℃水浴热击25min，1000r/min，离心1min，除净上清液；
(5)用1mL YPD培养基重悬细胞，然后30℃，220r/min，孵育1h，1000r/min，离心1min收集细胞，再用1mL无菌ddH2O重悬细胞；
(6)将重悬菌液涂布在MD平板上，每个平板涂200μL，30℃培养2d。
实施例3
重组子的筛选，步骤如下：
用无菌ddH2O，将实施例2第3小节步骤(6)中MD平板上的菌落洗下(1mL ddH2O洗一个平板，甘油保存两管)，分装到1.5mL EP管中，将无菌ddH2O洗下的菌适度稀释，分别涂布在含浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL G418的YPD平板，30℃培养2-5d；待G418的YPD平板上长出菌落后，挑取菌落，YPD液体培养基扩大培养，最后甘油保存于-80℃冰箱。
实施例4
左聚糖蔗糖酶的生产，具体操作步骤如下：
(1)菌种活化：从实施例3-80℃取重组毕赤酵母菌株划线于YPD平板上，30℃培养48h；
(2)种子液：从步骤(1)YPD平板上挑取上述重组毕赤酵母菌株单菌落至5mL YPD液体培养基，30℃，220r/min培养至OD600≈2.0-6.0(18-20h)；
(3)菌种富集：步骤(2)中培养后所得毕赤酵母菌株按照1％种子液接种至25mLBMGY培养基，30℃，220r/min培养至OD≈15-20(16-20h)；
(4)摇瓶诱导产酶：离心收集步骤(3)中培养后所得菌体，将重组毕赤酵母菌株转移至25mL BMMY培养基，每24h添加1％(V/V)甲醇，28℃，250r/min诱导发酵96h；
(5)步骤(4)中所得发酵液经4℃离心后的上清液即为左聚糖蔗糖酶制剂(胞外粗酶液)；细胞沉淀经ddH2O清洗、50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)重悬、玻璃珠涡旋震荡法破胞、低温离心后得到破胞上清液；用DNS法测定水解活力，结果显示破胞上清液未检出活力，胞外粗酶液具有全部的表达活力，且经SDS-PAGE检测细胞内未明显发现对应重组酶大小的特异电泳条带，亦无包涵体检出，从而表明左聚糖蔗糖酶分泌率约100％。
实施例5
生产高分子量左聚糖
以蔗糖为原料，利用实施例4步骤(5)中所得左聚糖蔗糖酶制剂通过常规酶法转化生产高分子量左聚糖，在45℃，pH 5.0，酶浓度0.2U/mL，20％蔗糖浓度(m/v)条件下反应24h，即可得到约56g/L高分子量左聚糖，蔗糖转化率可达27.8％。利用GPC渗透凝胶色谱法测定多糖的分子量，测定结果如图2，重组毕赤酵母分泌所得左聚糖蔗糖酶Lev(α-MF)合成的左聚糖朱峰出峰时间在22min左右，对应的分子量为2000kD左右，主峰在所有产物中的占比为90％以上。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西大学
<120> 一种重组毕赤酵母分泌表达左聚糖蔗糖酶的方法及其应用
<130> JC
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 1
atgaacatca aaaagtttgc aaaacaagca acagtattaa cctttactac cgcactgctg 60
gcaggaggcg caactcaagc gtttgcgaaa gaaacgaacc aaaagccata taaggaaaca 120
tacggcattt cccatattac acgccatgat atgctgcaaa tccctgaaca gcaaaaaaat 180
gaaaaatatc aagttcctga attcgattcg tccacaatta aaaatatctc ttctgcaaaa 240
ggcctggacg tttgggacag ctggccatta caaaacgctg acggcactgt cgcaaactat 300
catggctacc acatcgtctt tgcattagcc ggagatccta aaaatgcgga tgacacatcg 360
atttacatgt tctatcaaaa agtcggcgaa acttctattg acagctggaa aaacgctggc 420
cgcgtcttta aagacagcga caaattcgat gcaaatgatt ctatcctaaa agaccaaacg 480
caagaatggt caggttcagc cacatttaca tctgacggaa aaatccgttt attctacact 540
gatttctccg gtaaacatta cggcaaacaa acactgacaa ctgcacaggt taacgtatca 600
gcatcagaca gctctctgaa catcaacggt gtagaggatt ataaatcaat ctttgacggt 660
gacggcaaaa cgtatcaaaa tgtacagcag ttcatcgatg aaggcaacta cagctcaggc 720
gacaaccata cgctgagaga tcctcactac gtagaagata aaggccacaa atacttagta 780
tttgaagcaa acactggaac tgaagatggc taccaaggcg aagaatcttt atttaacaaa 840
gcatactatg gcaaaagcac atcattcttc cgtcaagaaa gtcaaaagct tctgcaaagt 900
gataaaaagc gcgctgctga attagctaac ggcgctctcg gtatgattga gctaaacgat 960
gattacacac tgaaaaaagt gatgaaaccg ctgattgcat ctaacacagt aacagatgaa 1020
attgaacgcg cgaacgtctt taaaatgaac ggcaaatggt atctgttcac tgactcccgc 1080
gggtcaaaaa tgacgattga cggcattacg tctaacgata tttacatgct tggctatgtt 1140
tctaattctt taactggccc atacaagccg ctgaacaaaa ctggccttgt gttaaaaatg 1200
gatcttgatc ctaacgatgt aacctttact tactcacact tcgctgtacc tcaagcgaaa 1260
ggaaacaatg tcgtgattac aagctatatg acaaacagag gattctacgc agacaaacaa 1320
tcaacgtttg cgccaagctt cctgctgaac atcaaaggca agaaaacatc tgttgtcaaa 1380
gacagcatcc ttgaacaagg acaattaaca attaacaaat aa 1422

Claims (3)

1.一种重组毕赤酵母分泌表达左聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于，将左聚糖蔗糖酶(Levansucrase)基因克隆到毕赤酵母整合质粒上，得到的重组质粒线性化后转化到宿主毕赤酵母，通过同源重组将左聚糖蔗糖酶(Levansucrase)基因整合到毕赤酵母染色体中，挑选出携带高拷贝外源基因的重组毕赤酵母菌株，即得；
其中，所述的左聚糖蔗糖酶基因来源于枯草芽孢杆菌，所述左聚糖蔗糖酶基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示；
其中，所述的毕赤酵母整合质粒为携带α-MF信号肽的pPIC9K整合质粒，该质粒将α-MF信号肽与外源基因同时整合到毕赤酵母染色体上；所述的宿主毕赤酵母为毕赤酵母GS115菌株；所述的线性化位点选择为SacI。
2.根据权利要求1所述的方法得到的重组毕赤酵母在生产左聚糖方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述重组毕赤酵母在生产左聚糖方面的应用操作方法为所得重组毕赤酵母经甲醇诱导培养，离心，上清液作为酶制剂，以蔗糖为底物，酶法合成高分子量的左聚糖。
CN202110666077.2A 2021-06-16 2021-06-16 一种重组毕赤酵母分泌表达左聚糖蔗糖酶的方法及其应用 Active CN113293153B (zh)

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