CN109554378B

CN109554378B - 一种黄原胶产量相关基因及其构建高产黄原胶工程菌的应用

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Publication number: CN109554378B
Application number: CN201710874952.XA
Authority: CN
Inventors: 余永红; 王海洪; 马建荣; 迟海洋; 黎壮伟
Original assignee: Guangdong Food and Drugs Vocational College
Current assignee: Guangdong Food and Drugs Vocational College
Priority date: 2017-09-25
Filing date: 2017-09-25
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2037-09-25
Also published as: CN109554378A

Abstract

本发明公开了一种黄胶原产量相关基因及其构建高产黄原胶工程菌的应用。所述黄胶原产量相关基因即新基因XC_1672，序列如SEQ ID NO.1所示。该基因可用于黄原胶生成菌株的遗传改造，提高黄胶原产量。本发明将基因XC_1672应用于构建高产黄原胶的工程菌中，通过失活生产黄原胶的野油菜黄单胞菌的野生菌株Xcc8004基因组中的基因XC_1672来完成基因改造。本发明的实验证明，通过两次同源重组的基因敲除方法删除Xcc8004基因组中的XC_1672基因，获得的工程菌相较于野油菜黄单胞菌Xcc8004，产黄原胶的能力提升了60%。

Description

一种黄原胶产量相关基因及其构建高产黄原胶工程菌的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种影响黄原胶产量的相关基因及其在构建高产黄原胶工程菌中的应用。

背景技术

黄原胶是野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.Campestris，Xcc）产生的胞外多糖聚合物，是已经开发的微生物多糖中应用范围最为广泛的一种，其具有良好的增粘性和触变性，对热、酸、碱稳定性高，能够与多种溶剂相容。目前，黄原胶作为助悬剂、增稠剂、乳化剂、稳定剂等，应用于医药、食品、饮料、化妆品、洗涤剂、石油开采等领域中。

目前国内黄原胶生成菌株的产量要显著低于发达国家，选育、改造、驯化以获得高产菌株是当前黄原胶应用领域研究的重点。黄原胶合成的代谢途径大致为：菌体细胞内生成的葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸，通过酶促反应生成黄原胶合成的前体物质（GDP-甘露糖、UDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖醛酸等），催化生成的“五碳糖”重复单元接合到细胞内膜脂载体上，转运至膜外侧后聚合生成黄原胶，并通过孔蛋白运输到胞外。随着对黄原胶合成机理的深入研究，Xcc染色体上与黄原胶合成相关的基因被陆续发现，因此，通过基因手段改造Xcc染色体上与黄原胶合成相关的基因，从而控制菌体中黄原胶合成代谢途径的关键酶系，改变代谢流走向，是增加黄原胶产量重要方法。

但是，目前尚无研究者成功地通过失活Xcc染色体上与黄原胶合成相关的基因，从而构建基因工程重组菌的方式来大幅度地提升黄原胶的产量。

发明内容

本发明针对上述现有技术的空白，公开了一种与黄原胶产量相关基因XC_1672，其编码产物具有3-酮脂酰ACP合成酶III活性，3-酮脂酰ACP合成酶III竞争黄原胶合成中的脂载体，从而极大地降低了黄原胶的合成量；此外，公开了基因XC_1672在构建高产黄原胶工程菌方面的应用，提供了一种高产黄原胶的基因工程重组菌，并且公开了其构建方法，此种基因工程重组菌产黄原胶的能力远远优于野油菜黄单胞菌的野生菌株Xcc8004。

本发明公开了一种与黄原胶产量相关基因XC_1672，XC_1672的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，由1317个核苷酸组成，自5’端的第1~3位核苷酸为该基因的起始密码子GTG，自5’端的第1315~1317位核苷酸为该基因的终止密码子TGA。基因XC_1672编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明进一步地公开了基因XC_1672在生产黄原胶方面的应用。XC_1672基因的编码产物具有3-酮脂酰ACP合成酶III的活性，能够竞争黄原胶合成中的脂载体，从而极大地降低黄原胶的合成量。XC_1672基因转录翻译后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由438个氨基酸组成，预测分子量为45921.8道尔顿，等电点为8.56。

本发明进一步地公开了基因XC_1672在构建高产黄原胶工程菌方面的应用。具体包括如下技术方案：

本发明提供了一种高产黄原胶的工程菌，其中，出发菌株为野油菜黄单胞菌的野生菌株Xcc8004，通过失活Xcc8004基因组中的基因XC_1672完成基因改造。

进一步地，所述失活的方式为敲除或沉默抑制基因XC_1672的全部或部分编码框。

进一步地，采用两次同源重组的方式删除野油菜黄单胞菌的野生菌株Xcc8004基因组中的XC_1672所得。

进一步地，高产黄原胶工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：

S1、构建基因敲除重组质粒；

S2、将步骤S1获得的重组质粒转化E.coli S17-1感受态细胞，获得转化子；

S3、采用接合转移方式将重组质粒导入至野油菜黄单胞菌Xcc8004中，获得第一次同源重组菌；

S4、将步骤S3中得到的第一次同源重组菌株进行第二次同源重组培养，利用复制平板法筛选第二次同源重组菌；

S5、PCR法验证步骤S4中得到的第二次同源重组菌，将扩增片段测序，确认需要敲除的基因已被删除；

S6、将S5步骤中基因敲除成功的菌株进行液体发酵培养，以野油菜黄单胞菌Xcc8004作为对照，确定黄原胶产量，从而筛选获得高产黄原胶的野油菜黄单胞菌工程菌。

进一步地，所述的步骤S1为：以基因XC_1672的DNA序列为模板，设计上游引物对和下游引物对；所述的上游引物对包括上游正向引物P1-F1和上游反向引物P2-R1，分别为SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述的下游引物对包括P3-F2和P4-R2，分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；采用PCR法分别扩增上游片段和下游片段；将上游片段和下游片段酶切后连入自杀质粒pK18mobsacB，获得重组质粒。

进一步地，步骤S3中第一次同源重组培养采用无抗性NYG固体培养基，30℃正置培养36h～48h，实现重组质粒从E.coli S17-1进入野油菜黄单胞菌Xcc8004中，并整合至其染色体上。

进一步地，步骤S4中第二次同源重组培养采用无抗性NYG液体培养基，30℃下，200rpm振荡培养10h～16h，实现质粒携带敲除的基因从野油菜黄单胞菌Xcc8004的染色体上脱离。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种与黄原胶合成相关的新基因（XC_1672），可用于黄原胶生成菌株的遗传改造，提高黄胶原产量。基因XC_1672的编码产物具有3-酮脂酰ACP合成酶III活性，3-酮脂酰ACP合成酶通过竞争黄原胶合成中的脂载体，从而极大地降低了黄原胶的合成量。

同时，通过采用现代分子生物学技术对野油菜黄单胞菌Xcc8004进行定向改造，采用两次同源重组的方式删除Xcc8004基因组中的基因XC_1672，以获得高产黄原胶的重组基因工程菌。本发明在国内尚属首例，突破了基因敲除法构建高产黄原胶重组菌的技术瓶颈，解决了现有菌株产黄原胶能力低的问题。通过摇瓶发酵实验，本发明的基因工程重组菌合成黄原胶的产量较野油菜黄单胞菌Xcc8004提升60%。

附图说明

图1为实施例2验证PCR中扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为实施例3中野生菌株Xcc8004和突变株Xcc△1672的菌落图。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的范围。培养基的配方、试剂以及菌株如下：

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L；

NYG培养基：蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，甘油20g/L；

10%蔗糖NYG培养基：蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，甘油20g/L，蔗糖100g/L；

4%葡萄糖NYG培养基：蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，甘油20g/L，葡萄糖40g/L；

配置固体培养基时加入琼脂粉15g/L；

卡那霉素（Km）工作浓度：30µg/mL；

利福平（Rif）工作浓度：50µg/mL；

限制性内切酶（EcoRI、NdeI、SalI、HindIII）、T4 DNA连接酶等试剂购自宝日医生物技术（北京）有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司广州分公司合成；

野油菜黄单胞菌的野生菌株Xcc8004、自杀质粒pK18mobsacB、表达载体pSRK-Gm、大肠杆菌S17-1源自广东食品药品职业学院的保藏中心。野油菜黄单胞菌的野生菌株Xcc8004具有利福平抗性。

实施例1: XC_1672基因的克隆

根据XC_1672基因的DNA序列，设计XC_1672基因扩增引物对：Up引物和Down引物，Up引物序列如SEQ ID NO.7所示，Down引物序列如SEQ ID NO.8所示。以Xcc8004的总DNA作为模板，采用Up引物和Down引物进行PCR扩增，获得XC_1672基因片段。PCR扩增程序为：①95℃预变性10 min；②95℃变性50 s；③56℃退火30 s；④72℃延伸2 min；⑤重复②～④35个循环；⑥72℃，10min。将PCR产物置于4℃条件下保存。PCR反应体系见表1。

PCR扩增获得的XC_1672基因片段经NdeI和HindIII双酶切后，连入表达载体pSRK-Gm中，获得pSRK-XC_1672。酶切反应条件为：片段或质粒60μl，10×酶切buffer 10μl，每种限制性内切酶各2μl，双蒸水补至100μl，酶切温度为37℃，反应时间为4h。连接条件为：酶切后片段 10 μl，酶切后载体5 μl，10×连接酶buffer 2 μl，DNA 连接酶1 μl，双蒸水补至20μl，16℃连接12 h。

获得XC_1672基因序列，如SEQ ID NO.1所示。

实施例2:基因敲除重组质粒的构建

（1）设计引物。

根据XC_1672基因的核苷酸序列，设计上游序列的PCR扩增引物P1-F1/P2-R1以及下游序列的PCR扩增引物P3-F2/P4-R2，上游序列约为750bp，下游序列约为700bp。此外，基因敲除的验证引物为P1-F1/ P4-R2。其中，P1-F1的序列如SEQ ID NO.3所示，P2-R1的序列如SEQ ID NO.4所示；P3-F2的序列如SEQ ID NO.5所示，P4-R2的序列如SEQ ID NO.6所示。

（2）PCR扩增。

将Xcc8004的总DNA作为模板，以P1-F1/P2-R1为引物PCR扩增XC_1672基因的上游序列得到片段P1P2，以P3-F2/P4-R2为引物PCR扩增XC_1672基因的下游序列得到片段P3P4。PCR扩增程序为：①95℃预变性10 min；②95℃变性50 s；③56℃退火30 s；④72℃延伸1.5min；⑤重复②～④35个循环；⑥72℃，10min。将PCR产物置于4℃条件下保存。PCR反应体系见表2。

（3）PCR产物酶切后连入质粒。

将P1P2片段经EcoRI和SalI酶切后连入自杀质粒pK18mobsacB中，获得重组质粒pYYH-1；P3P4片段经SalI和HindIII酶切后连入pYYH-1中SalI和HindIII位点，获得重组质粒pYYH-2。酶切反应条件为：片段或质粒60μl，10×酶切buffer 10μl，每种限制性内切酶各2μl，双蒸水补至100μl，酶切温度为37℃，反应时间为4h。连接条件为：酶切后片段 10 μl，酶切后载体 5 μl，10×连接酶buffer 2 μl，DNA 连接酶 1 μl，双蒸水补至20 μl，16℃连接12 h。

获得基因敲除重组质粒pYYH-1。

实施例3：高产黄原胶的工程菌构建

（1）利用CaCl₂诱导法制备感受态大肠杆菌（E.coli）S17-1，将实施例2中获得的重组质粒pYYH-2导入至感受态大肠杆菌（E.coli）S17-1中，获得转化子E.coli S17-1/pYYH-2。具体包括：①将3 μl的质粒pYYH-2加入至100 μl的E.coli S17-1感受态中，冰浴30 min；②42℃热激120 s；③加入1 mL无抗LB培养基，37℃、100rpm培养1 h后，取菌液涂布于含有卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养16h，挑取阳性克隆子，即为转化子E.coli S17-1/pYYH-2。

（2）利用接合转移方式将重组质粒pYYH-2导入野油菜黄单胞菌Xcc8004。具体操作步骤为：①挑取E.coliS17-1/pYYH-2于液体LB培养基中，37℃振荡培养16h；②挑取Xcc8004于NYG液体培养中，30℃振荡培养16h；③分别将①和②中的菌悬液离心并收集菌体，将两种菌体混合于1 mL的NYG液体培养基中，洗涤两次后重悬于0.1 mL的NYG液体培养基中；④将③中的菌体重悬液滴至无抗NYG平板上，正置培养48 h。⑤用无菌水洗涤④中无抗NYG平板上生长的菌苔，然后稀释涂布于含有卡那霉素和利福平的NYG平板上，30℃倒置培养48h，获得的单菌落为第一次同源重组菌。

（3）第二次重组菌株的获得。具体包括如下步骤：①将获得的一次重组菌株置于抗NYG液体培养基，30℃振荡16h后，将菌液涂布于含有利福平10%蔗糖的NYG平板，30℃培养48h后获得单菌落；②利用复制平板法，将①中单菌落分别对应接种至含有卡那霉素和利福平的NYG平板上，以及仅含有利福平的NYG平板上，挑取卡那霉素敏感菌落，即为第二次重组菌株。

（4）PCR法验证第二次同源重组菌，确认需要敲除的基因已被删除。①挑取卡那霉素敏感菌落，提取总DNA；②选择P1-F1和P4-R2作为验证引物，对①中总DNA进行PCR扩增，验证PCR的反应体系详见下表3：

需要说明的是，②中PCR扩增程序同（2）中所述。此外，如图1所示，PCR扩增得到大小为1.45kb的片段，将此基因片段测序，确认XC_1672已被删除，获得突变株Xcc△1672。

实施例4：定性实验验证突变株Xcc△1672产黄原胶的能力

将突变株Xcc△1672接种到NYG培养基中，30℃培养24h后，取2 μl培养液点种至含有4%葡萄糖的NYG平板上，同时以野生菌株Xcc8004作为对照，培养5d。如图2所示，突变株Xcc△1672形成的菌落较野生菌株Xcc8004菌落大，且圆润粘稠。因此，与野生菌株Xcc8004相比，突变株Xcc△1672合成的黄原胶产量上升。

实施例5：定量实验验证突变株Xcc△1672产黄原胶的能力

采用摇瓶发酵法进行定量实验，将突变株Xcc△1672和野生菌株Xcc8004分别接种至添加4%葡萄糖的NYG液体培养基中，30℃摇床培养5d。采用四倍体积的无水乙醇沉淀培养液，然后烘干称重，突变株Xcc△1672和野生菌株Xcc8004的黄原胶产量如表4所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东食品药品职业学院

<120> 一种黄原胶产量相关基因及其构建高产黄原胶工程菌的应用

<130> 1711303HZQT012

<141> 2017-09-25

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1317

<212> DNA

<213> 野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)

<400> 1

gtgtatcgaa tgcatgctgc ccgcggtgac gaaaggagag ggcggcgcgc gagtttcagt 60

gccaccccgg tgtcggacgt tattgcgaaa accgcagcgc gcccaacatg tgccctggct 120

cgccacgcat gcgcccgcgc ggccaggtgg gcgatgccag tctcgacccg caccaagtgc 180

cgccatcccc atcccatcgc tacggatggc gctgtgctcg ccgtgcaagc cccacgactg 240

cgccaacatt gcgcaggcag ctgggtctgc ctggccggcc acggtatgct gcgcgccttc 300

accaacgagg cggatctgtt gaacgcattg ccgctgcgca tcctgggcac cgggtgccac 360

gttcccgcca cggaagtgac gtcgcaagaa ctggacgcac gctggcagtt gccgccggga 420

accacgttcg cgcggctggg cgtcgccacg cgccactatg caggcgaggg cgaaacggcc 480

tcgtccatgg gcgccgccgc cgcgcaagcg gcattggtca gcgccggtat cgatagcggc 540

gagatcgact gcctgatctc cgcctgcagc gtgatggagc agccgatccc gtgccaggca 600

gtgctgatcc agcgtgccct ggggctgggt gactctggca tcccggcatt cgatgtcaac 660

gccacctgcc tgagttttct ggtcgcattg gacatggcca caaacgcgct ggccctgggc 720

cgctatcgcc gcgtgctcat cgtctccagc gaagtggcgt cgggcgggct ggatgcggcg 780

gtgccatcga ccgccggctt gttcggcgat ggcgctgccg ccgtggtggt cgggcgcagc 840

gcgcctgacg aagactcggc gctgctgtcc agccgcctgg ccagctacgg cagcggtgcc 900

gagctgtgcc gcatccgcgg tggcggcagc cgctatccgc gtggcgaaga cagcacgccc 960

gaagccacgc gggtcttcac catggatggg cgcggtgcgt atcgctttgc ggcgcgccac 1020

ctgccggcgt tctgggacca gctgctgcgc gacgccggta ccgagaccac cgcactgcgc 1080

tgcctgatcc cgcatcaagc ctccggtggc ggcctggatc atgtggtgca ggcgctcggc 1140

ctgcgcccgg agcaggtggt gcgcatcctg cacgcgcatg gcaaccaggt ggcggcatcg 1200

ctgccacacg cgctgcatca ggccagggtc acgcagcagc tgcagcgcgg cgaactattc 1260

gcgatgctcg gcaccggtgc cggcctgtcg atcggcggca tggtgttgag gtactga 1317

<210> 2

<211> 438

<212> PRT

<213> 野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)

<400> 2

Met Tyr Arg Met His Ala Ala Arg Gly Asp Glu Arg Arg Gly Arg Arg

1 5 10 15

Ala Ser Phe Ser Ala Thr Pro Val Ser Asp Val Ile Ala Lys Thr Ala

20 25 30

Ala Arg Pro Thr Cys Ala Leu Ala Arg His Ala Cys Ala Arg Ala Ala

35 40 45

Arg Trp Ala Met Pro Val Ser Thr Arg Thr Lys Cys Arg His Pro His

50 55 60

Pro Ile Ala Thr Asp Gly Ala Val Leu Ala Val Gln Ala Pro Arg Leu

65 70 75 80

Arg Gln His Cys Ala Gly Ser Trp Val Cys Leu Ala Gly His Gly Met

85 90 95

Leu Arg Ala Phe Thr Asn Glu Ala Asp Leu Leu Asn Ala Leu Pro Leu

100 105 110

Arg Ile Leu Gly Thr Gly Cys His Val Pro Ala Thr Glu Val Thr Ser

115 120 125

Gln Glu Leu Asp Ala Arg Trp Gln Leu Pro Pro Gly Thr Thr Phe Ala

130 135 140

Arg Leu Gly Val Ala Thr Arg His Tyr Ala Gly Glu Gly Glu Thr Ala

145 150 155 160

Ser Ser Met Gly Ala Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Val Ser Ala Gly

165 170 175

Ile Asp Ser Gly Glu Ile Asp Cys Leu Ile Ser Ala Cys Ser Val Met

180 185 190

Glu Gln Pro Ile Pro Cys Gln Ala Val Leu Ile Gln Arg Ala Leu Gly

195 200 205

Leu Gly Asp Ser Gly Ile Pro Ala Phe Asp Val Asn Ala Thr Cys Leu

210 215 220

Ser Phe Leu Val Ala Leu Asp Met Ala Thr Asn Ala Leu Ala Leu Gly

225 230 235 240

Arg Tyr Arg Arg Val Leu Ile Val Ser Ser Glu Val Ala Ser Gly Gly

245 250 255

Leu Asp Ala Ala Val Pro Ser Thr Ala Gly Leu Phe Gly Asp Gly Ala

260 265 270

Ala Ala Val Val Val Gly Arg Ser Ala Pro Asp Glu Asp Ser Ala Leu

275 280 285

Leu Ser Ser Arg Leu Ala Ser Tyr Gly Ser Gly Ala Glu Leu Cys Arg

290 295 300

Ile Arg Gly Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Arg Gly Glu Asp Ser Thr Pro

305 310 315 320

Glu Ala Thr Arg Val Phe Thr Met Asp Gly Arg Gly Ala Tyr Arg Phe

325 330 335

Ala Ala Arg His Leu Pro Ala Phe Trp Asp Gln Leu Leu Arg Asp Ala

340 345 350

Gly Thr Glu Thr Thr Ala Leu Arg Cys Leu Ile Pro His Gln Ala Ser

355 360 365

Gly Gly Gly Leu Asp His Val Val Gln Ala Leu Gly Leu Arg Pro Glu

370 375 380

Gln Val Val Arg Ile Leu His Ala His Gly Asn Gln Val Ala Ala Ser

385 390 395 400

Leu Pro His Ala Leu His Gln Ala Arg Val Thr Gln Gln Leu Gln Arg

405 410 415

Gly Glu Leu Phe Ala Met Leu Gly Thr Gly Ala Gly Leu Ser Ile Gly

420 425 430

Gly Met Val Leu Arg Tyr

435

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Xanthomonas campestris)

<400> 3

aattggatcc cgatgaaggc gatgaagaac g 31

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Xanthomonas campestris)

<400> 4

cccgaccacc acggagtcga ccaccggtcc aagcgcac 38

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Xanthomonas campestris)

<400> 5

gcttggaccg gtggtcgact ccgtggtggt cgggcgc 37

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Xanthomonas campestris)

<400> 6

aattaagctt ggcacggaag aaatgctctg 30

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Xanthomonas campestris)

<400> 7

taataaccat atgtatcgaa tgcatgctgc cc 32

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Xanthomonas campestris)

<400> 8

aattaagctt cttcgggcgt gctgtctt 28

Claims

1.一种高产黄原胶的工程菌，其特征在于，是将野油菜黄单胞菌基因组中的基因XC_1672失活所得；所述野油菜黄单胞菌是指野油菜黄单胞菌的野生菌株Xcc8004；所述失活的方式是采用两次同源重组的方式删除基因XC_1672；所述基因XC_1672的基因序列如SEQ IDNO .1所示。

2.根据权利要求1所述的高产黄原胶的工程菌，其特征在于，由包括如下步骤的方法构建得到：

S1、构建基因敲除重组质粒；

S2、将步骤S1获得的重组质粒转化E .coli S17-1感受态细胞，获得转化子；

S6、将S5步骤中基因敲除成功的菌株进行液体发酵培养，筛选获得高产黄原胶的野油菜黄单胞菌工程菌。

3.根据权利要求2所述的高产黄原胶的工程菌，其特征在于，所述的步骤S1为：以基因XC_1672的DNA序列为模板，设计上游引物对和下游引物对；所述的上游引物对包括上游正向引物P1-F1和上游反向引物P2-R1，分别为SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示；所述的下游引物对包括P3-F2和P4-R2，分别为SEQ ID NO .5和SEQ ID NO .6所示；采用PCR法分别扩增上游片段和下游片段；将上游片段和下游片段酶切后连入自杀质粒pK18mobsacB，获得重组质粒。

4.根据权利要求2所述的高产黄原胶的工程菌，其特征在于，所述的步骤S3中第一次同源重组培养采用无抗性NYG固体培养基，30℃正置培养36h～48h。

5.根据权利要求2所述的高产黄原胶的工程菌，其特征在于，所述的步骤S4中第二次同源重组培养采用无抗性NYG液体培养基，30℃下，200rpm振荡培养10h～16h。