CN110016480B - 一种菌黄素合成相关基因及其在构建产无色黄原胶工程菌中的应用 - Google Patents

一种菌黄素合成相关基因及其在构建产无色黄原胶工程菌中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110016480B
CN110016480B CN201810021980.1A CN201810021980A CN110016480B CN 110016480 B CN110016480 B CN 110016480B CN 201810021980 A CN201810021980 A CN 201810021980A CN 110016480 B CN110016480 B CN 110016480B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
xanthan gum
seq
xcc
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810021980.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110016480A (zh
Inventor
余永红
王海洪
马建荣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Food and Drugs Vocational College
Original Assignee
Guangdong Food and Drugs Vocational College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Food and Drugs Vocational College filed Critical Guangdong Food and Drugs Vocational College
Priority to CN201810021980.1A priority Critical patent/CN110016480B/zh
Publication of CN110016480A publication Critical patent/CN110016480A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110016480B publication Critical patent/CN110016480B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C12P19/06—Xanthan, i.e. Xanthomonas-type heteropolysaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/011—3-Oxoacyl-[acyl-carrier-protein] reductase (1.1.1.100)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种菌黄素合成相关基因XC_4092，基因序列如SEQ ID NO.1所示，其编码产物具有3‑酮脂酰ACP还原酶活性，能够催化菌黄素合成中的还原反应。本发明进一步的公开了基因XC_4092在生产无色黄原胶方面的应用，以野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的野生菌株Xcc8004作为出发菌株，通过失活Xcc8004基因组中的基因XC_4092完成基因改造，构建产无色黄原胶工程菌。相较Xcc8004，本发明的工程菌在发酵过程中不能合成菌黄素，有效地改善了黄原胶的外观颜色，从而大大地提升了黄原胶产品的品质。

Description

一种菌黄素合成相关基因及其在构建产无色黄原胶工程菌中 的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的菌黄素合成基因，以及该菌黄素合成基因在构建产无色黄原胶工程菌中的应用。
背景技术
黄原胶是野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris，Xcc）产生的胞外多糖聚合物，是已经开发的微生物多糖中应用范围最为广泛的一种，其具有良好的增粘性和触变性，对热、酸、碱稳定性高，能够与多种溶剂相容。目前，黄原胶作为助悬剂、增稠剂、乳化剂、稳定剂等，应用于医药、食品、饮料、化妆品、洗涤剂、石油开采等领域中。
菌黄素是黄单胞菌属的重要代谢产物，其为溴化芳基多烯脂类衍生物，具有抗氧化、避免菌体遭受光照损害的功能。菌黄素不溶于水，能够与细胞外膜牢固结合，使得菌落颜色为黄色。在生产黄原胶工艺中，由于黄原胶产品质量标准的要求，需要去除发酵过程中产生的菌体细胞色素，而菌黄素是菌体细胞色素的主要成分，目前，行业内通常采用溶剂化学反应法去除细胞色素，存在着溶剂耗量大、操作繁琐、生产成本高的问题，因而去除细胞色素步骤成为制约黄原胶品质提升以及节约生产成本的重大障碍。
因此，拟通过阻断野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的菌黄素合成途径来解决上述问题，从而改善黄原胶产品的外观颜色，节约生产成本。
发明内容
本发明的目的在于：一方面公开一种与菌黄素合成相关的新基因（XC_4092）；另一方面是针对新基因（XC_4092），对黄原胶产生菌株（野油菜黄单胞菌野油菜致病变种）进行遗传改造，降低发酵生产过程中菌黄素的合成量，从而提高黄原胶产品品质，节约生产成本。
本发明公开了一种与菌黄素合成相关的基因，即：3-酮脂酰ACP还原酶基因（XC_4092），XC_4092的基因序列如SEQ ID NO.1所示，由738个核苷酸组成，自5’端的第1~3位核苷酸为该基因的起始密码子ATG，自3’端的第736~738位核苷酸为该基因的终止密码子TGA。XC_4092基因编码产物具有3-酮脂酰ACP还原酶活性，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括245个氨基酸，分子量为24982道尔顿，等电点为7.21；3-酮脂酰ACP还原酶能够催化菌黄素合成中的还原反应。
本发明进一步的公开了基因XC_4092在生产无色黄原胶方面的应用，由于XC_4092基因编码产物具有3-酮脂酰ACP还原酶活性，能够催化菌黄素合成中的还原反应，因此，通过对黄原胶产生菌进行遗传改造来阻断这个还原反应途径，从而阻断菌黄素的合成，进而能够生产无色黄原胶。
本发明进一步地公开了基因XC_4092在构建生产无色黄原胶工程菌方面的应用。具体包括如下技术方案：
本发明提供了一种生产无色黄原胶的工程菌，其中，出发菌株为野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的野生菌株Xcc8004，通过失活Xcc8004基因组中的基因XC_4092完成基因改造。
进一步的，所述失活的方式为删除或沉默抑制基因XC_4092的全部或部分编码框。
进一步的，生产无色黄原胶的基因工程重组菌是通过采用两次同源重组的基因敲除方法删除所述的野生菌株Xcc8004基因组中的基因XC_4092所得。
进一步的，利用两次同源重组的基因敲除方法构建生产无色黄原胶的基因工程重组菌具体包括如下步骤：
S1、构建基因敲除重组质粒；
S2、将步骤S1获得的重组质粒转化E.coli S17-1感受态细胞，获得转化子；
S3、采用接合转移方式将重组质粒导入至野油菜黄单胞菌Xcc8004中，通过卡那霉素和利福平抗性培养基筛选，获得第一次同源重组菌；
S4、将步骤S3中得到的第一次同源重组菌株进行第二次同源重组培养，利用复制平板法筛选第二次同源重组菌；
S5、PCR法验证步骤S4中得到的第二次同源重组菌，将扩增片段测序，确认需要敲除的基因XC_4092已被删除，成功删除基因XC_4092的第二次同源重组菌即为生产无色黄原胶的基因工程重组菌。
进一步的，所述的步骤S1为：以野油菜黄单胞菌Xcc8004的基因组为模板，利用PCR法分别扩增XC_4092基因的上游片段和下游片段，其中，上游片段的引物序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示，下游片段的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；接着，采用融合PCR法，以XC_4092基因的上、下游片段为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6为引物，将XC_4092基因的上、下游片段连接起来，形成XC_4092基因的缺失片段；再将XC_4092基因的缺失片段酶切后连入自杀质粒pK18mobsacB，获得重组质粒。
进一步的，所述的步骤S5中，PCR验证引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
进一步的，所述的步骤S5中，验证PCR的程序包括如下：（1）95℃预变性10 min；（2）95℃变性1 min；（3）56℃退火30 s；（4）72℃延伸2.0 min；（5）重复（2）～（4）35个循环；（6）72℃，10 min。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种与菌黄素合成相关的新基因（XC_4092），可用于黄原胶生成菌株的遗传改造，达到降低发酵生产中菌黄素的合成量、改善黄原胶外观品质的目的。XC_4092基因编码产物具有3-酮脂酰ACP还原酶活性，能够催化菌黄素合成中的还原反应。
同时，通过采用现代分子生物学技术对野油菜黄单胞菌Xcc8004进行定向改造，采用两次同源重组的方式删除Xcc8004基因组中的基因XC_4092，以获得产无色黄原胶的基因工程菌。本发明在国内尚属首例，通过阻断菌黄素合成途径中重要的还原反应，以不能合成菌黄素来改变目前行业内去除黄原胶中菌体细胞色素难的困境，有效地提升了黄原胶产品品质，简化了生产工艺流程，节约了生产成本。
附图说明
图1为实施例3中步骤S4的验证PCR扩增片段琼脂糖凝胶电泳图。
图2为实施例4中Xcc8004和XccYH1在NYG平板上的菌落图。
图3为实施例5中Xcc8004和XccYH1的菌体细胞经过处理后的吸收曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的范围。
以下为实施例中涉及到的试剂与材料：
（1）LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L；
（2）NYG液体培养基：蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，甘油20g/L；
（3）10%蔗糖NYG液体培养基：蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，甘油20g/L，蔗糖100g/L；
（4）限制性内切酶、DNA连接酶、pMD19-T载体、自杀质粒pK18mobsacB、大肠杆菌S17-1等试剂购自宝日医生物技术（北京）有限公司；
（5）PCR引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司广州分公司；
（6）野油菜黄单胞菌的野生菌株Xcc8004源自华南农业大学保藏中心。野油菜黄单胞菌的野生菌株Xcc8004具有利福平抗性。
需要说明的是，若对（1）～（3）配置固体培养基时，需添加15g/L的琼脂粉；此外，（1）～（3）制备抗性培养基时，卡那霉素（Km）的工作浓度为30µg/mL，利福平（Rif）的工作浓度为50µg/mL。
实施例1：XC_4092基因的克隆
本实施例公开了XC_4092基因的克隆方法，包括如下步骤：
S1、根据XC_4092基因的DNA序列，设计扩增引物对：Up引物和Down引物，Up引物序列如SEQ ID NO.9所示，Down引物序列如SEQ ID NO.10所示；
S2、以Xcc8004的总DNA作为模板，采用Up引物和Down引物进行PCR扩增，获得约740bp 的XC_4092基因片段；
S3、将步骤S2获得的XC_4092基因片段连入pMD19-T载体，在16℃下连接2h，获得质粒pYYH-1；
S4、对步骤S3中的质粒pYYH-1进行测序，证明连入的基因片段正确。
对上述步骤需要说明的是，步骤S2中的PCR扩增程序为：①95℃预变性10 min；②95℃变性50 s；③56℃退火30 s；④72℃延伸1 min 20 s；⑤重复②～④35个循环；⑥72℃，10min。将PCR产物置于4℃条件下保存。PCR反应体系见表1：
表1为实施例1中步骤S2中的PCR反应体系。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
步骤S3中连接反应的体系详见表2：
表2为实施例1中步骤S3中的连接反应体系。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
实施例2：基因敲除重组质粒的构建
本实施例公开了一种构建基因敲除重组质粒的方法，旨在采用两次同源重组的基因敲除方法删除Xcc8004基因组中的基因XC_4092，从而达到构建产无色黄原胶工程菌的目的。XC_4092基因敲除重组质粒的构建方法如下所述：
S1、分别设计XC_4092基因上游片段（约520bp）的PCR引物对P1-F和P2-R，以及XC_4092基因下游片段（约570bp）的PCR引物对P3-F和P4-R；
S2、以Xcc8004的总DNA为模板，分别PCR扩增XC_4092基因上游片段和XC_4092基因下游片段；
S3、采用融合PCR法，以步骤S2中获得的XC_4092基因上游片段和下游片段为模板，以P1-F和P4-R为引物，将XC_4092基因的上、下游片段连接起来，形成XC_4092基因的缺失片段；
S4、先将步骤S3中获得的XC_4092基因缺失片段酶切，然后将酶切片段连入pK18mobsacB中，测序正确的重组质粒即为用于基因敲除的阻断质粒pYYH-2。
对上述步骤需要说明的是，P1-F的基因序列如SEQ ID NO.3所示，P2-R的基因序列如SEQ ID NO.4所示，P3-F的基因序列如SEQ ID NO.5所示，P4-R的基因序列如SEQ ID NO.6所示。
步骤S2中的PCR反应体系与表1相同。PCR扩增程序为：①95℃预变性10 min；②95℃变性50 s；③56℃退火30 s；④72℃延伸1 min 30 s；⑤重复②～④35个循环；⑥72℃，10min。将PCR产物置于4℃条件下保存。
步骤S3中融合PCR扩增程序为：①95℃预变性10 min；②95℃变性1 min；③56℃退火30 s；④72℃延伸2 min 15 s；⑤重复②～④35个循环；⑥72℃，10 min。将PCR产物置于4℃条件下保存。融合PCR的反应体系详见表3：
表3为实施例2中步骤S3中的融合PCR反应体系。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
步骤S4中用于酶切的酶为EcoRI和HindIII，酶切温度为37℃，酶切时间为4 h。具体的酶切反应体系详见下表4：
表4为实施例2中步骤S4中的酶切反应体系。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
步骤S4中酶切后的片段连入pK18mobsacB中，连接温度为16℃，连接时间为12 h。具体的连接体系详见表5：
表5为实施例2中步骤S4中的连接反应体系。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
实施例3：产无色黄原胶工程菌的构建
本实施例公开了一种产无色黄原胶工程菌的构建方法，即：通过两次同源重组的基因敲除方法构建产无色黄原胶工程菌，包括如下步骤：
S1、利用CaCl2诱导法制备感受态大肠杆菌S17-1，将实施例2中的重组质粒pYYH-2导入感受态大肠杆菌S17-1中，获得转化子E.coli S17-1/pYYH-2；
S2、将步骤S1中得到的转化子E.coli S17-1/pYYH-2以接合转移的方式导入Xcc8004，然后采用抗性平板培养，使得pYYH-2上的XC_4092基因缺失片段与Xcc8004基因组上的XC_4092基因片段发生同源重组交换，抗性平板上生长的单菌落即为第一同源重组菌；
S3、将步骤S2获得的第一同源重组菌株第二次同源重组培养，通过复制平板法筛选获得第二同源重组菌；
S4、设计PCR验证引物，以第二同源重组菌的基因组为模板，PCR扩增目的基因片段；
S5、将步骤S4中的扩增片段进行测序，确认基因XC_4092已被删除，而成功删除基因XC_4092的第二同源重组菌即为生产无色黄原胶的基因工程重组菌。
对上述步骤需要说明的是，步骤S1中获得转化子E.coli S17-1/pYYH-2的具体方法是：①取3 μl的 pYYH-2加入至100 μl的E.coli S17-1感受态中，冰浴30 min；②冰浴后的体系在42℃下，热激120 s；③向热激后的体系中加入1 mL无抗LB培养基，37℃培养1 h；④将培养液涂布于含有Km的LB抗性平板上，37℃培养10 h，其上生长出的单菌落即为E.coli S17-1/pYYH-2转化子。
步骤S2中，接合转移操作的具体流程为：①挑取E.coliS17-1/pYYH-2于液体LB培养基中，37℃振荡培养16h；②挑取Xcc 8004于NYG液体培养中，30℃振荡培养24h；③分别将①和②中的菌悬液离心并收集菌体，将两种菌体混合于1 mL的NYG液体培养基中，洗涤两次后重悬于0.1 mL的NYG液体培养基中；④将③中的菌体重悬液滴至无抗NYG平板上，正置培养48 h。此外，由于第一同源重组菌具有Km和Rif抗性，因此，通过在NYG平板中添加Km和Rif来筛选第一同源重组菌，30℃倒置培养48 h，生长出的单菌落即为第一同源重组菌。
步骤S3中，所述的第二次同源重组培养具体操作流程为：①将第一同源重组菌置于无抗NYG液体培养基中振荡培养12～16 h，培养温度为30℃；②将①的培养液涂布于添加有Rif的10%蔗糖NYG平板上，在30℃下培养48 h获得单菌落。而筛选第二同源重组菌的具体流程为：将第二次同源重组培养获得的单菌落对应接种至含Km和Rif的NYG平板和仅含Rif的NYG平板上，对Km敏感的单菌落即为第二同源重组菌。
步骤S4中，PCR验证正向引物序列以及反向引物序列分别如SEQ ID NO.7和
SEQ ID NO.8所示。验证PCR反应体系详见表6，PCR反应程序为：①95℃预变性10min；②95℃变性1 min；③56℃退火30 s；④72℃延伸2 min；⑤重复②～④35个循环；⑥72℃，10 min。将PCR产物置于4℃条件下保存。如图1所示，扩增片段大小约为1 kb。
表6为实施例3中步骤S4中的验证PCR反应体系。
Figure DEST_PATH_IMAGE006
对于步骤S5，将步骤S4中通过验证PCR获得的扩增片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司广州分公司测序，证明XC_4092已被删除，获得基因敲除突变株XccYH1，即为生产无色黄原胶的工程菌。
实施例4：定性分析XccYH1的菌黄素合成能力
本实施例公开了一种利用平板定性方法分析基因敲除突变株XccYH1的菌黄素合成能力，本实施例的参照对象为野生菌株Xcc8004，具体步骤如下所述：
S1、分别将XccYH1和Xcc8004接种至NYG液体培养基，在30℃下培养24 h；
S2、分别取2μl的XccYH1培养液和Xcc8004培养液，接种至NYG无抗平板上，在30℃下培养3 d，比较XccYH1和Xcc8004的菌落颜色。
如图2所示，基因敲除突变株XccYH1在NYG无抗平板上形成的菌落为白色，而Xcc8004在NYG无抗平板上形成的菌落为黄色，定性说明基因敲除突变株XccYH1的菌黄素合成途径被阻断，从而不能合成菌黄素。
实施例5：分光光度法分析XccYH1的菌黄素合成能力
本实施例公开了一种利用分光光度法分析基因敲除突变株XccYH1的菌黄素合成能力，本实施例的参照对象为野生菌株Xcc8004，具体步骤如下所述：
S1、分别将XccYH1和Xcc8004接种至NYG液体培养基中，在30℃下振荡培养2 d；
S2、分别取10 mL的XccYH1培养液和Xcc8004培养液，离心去上清，获得细胞沉淀物；
S3、用1 mL的甲醇重悬步骤S2的细胞沉淀物，室温下振荡混匀10 min以萃取菌体细胞色素，离心取含有菌体细胞色素的上清液；
S4、通过分光光度计测定步骤S3获得的上清液在400～500 nm范围内的吸收值，并通过吸收值的大小判断XccYH1和Xcc8004的菌黄素合成能力。
如图3的吸收曲线所示，在445nm处，突变株XccYH1的含有菌体细胞色素的上清液没有特征性吸收峰，OD值相较野生菌株Xcc8004显著下降，证明突变株XccYH1的菌黄素合成途径被阻断，突变株XccYH1可用作生产无色黄原胶产品的工程菌。需要说明的是，突变株XccYH1的含有菌体细胞色素的上清液在445nm处还存在光吸收现象，是由于其他中间代谢产物所致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东食品药品职业学院
<120> 一种菌黄素合成相关基因及其在构建产无色黄原胶工程菌中的应用
<130> 1810026HZQT012
<141> 2018-01-10
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 738
<212> DNA
<213> 野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)
<400> 1
atgagcacat ctgttccaca gcgccgtgcg ctggtcaccg gcggtagcgg cgatcttggc 60
ggtgcgatct gccgtcagct agcggcgcag ggccggcacg tccttgtgca tgccaatcgc 120
aatctcgccc gggccgagga agtggtggcg tccatcgtgg ccgctggcgg cagtgccgaa 180
gcggtggcct tcgatgtggc cgatgcgcag gccagtgcgg atgcattggc ggcgttgctg 240
gaggccgggc cgatccacat cgtggtcaac aacgccggca tccacgacga tgcgccgatg 300
gccggcatga acgcgcaaca gtggcatcgg gtcatcgatg tgtcgctgca cggtttcttc 360
aatgtcaccc aaccgctgct gctgccgatg gcgcgcgcgc gctggggccg catcgtcagc 420
gtgtcgtcgg tggcggcggt gctgggcaat cgcggccaga ccaattacgc cgctgccaag 480
gccgcgctgc acggcgccag taaatcgctc gcgcgcgaga tggccagccg cggcatcgcc 540
gtcaacgtgg tcgcaccggg cgtgatcgaa agcgagatgg tcggcgacag cttcgcgccg 600
gagatgatca agcagatggt gccggctggc cgcgttggca aacccgacga agttgccgcg 660
ctggtggcgt tcctgtgctc ggatgtggct ggttacatca acggccaggt gattggcatc 720
aacggcggca tgggctga 738
<210> 2
<211> 245
<212> PRT
<213> 野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)
<400> 2
Met Ser Thr Ser Val Pro Gln Arg Arg Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Asp Leu Gly Gly Ala Ile Cys Arg Gln Leu Ala Ala Gln Gly Arg
20 25 30
His Val Leu Val His Ala Asn Arg Asn Leu Ala Arg Ala Glu Glu Val
35 40 45
Val Ala Ser Ile Val Ala Ala Gly Gly Ser Ala Glu Ala Val Ala Phe
50 55 60
Asp Val Ala Asp Ala Gln Ala Ser Ala Asp Ala Leu Ala Ala Leu Leu
65 70 75 80
Glu Ala Gly Pro Ile His Ile Val Val Asn Asn Ala Gly Ile His Asp
85 90 95
Asp Ala Pro Met Ala Gly Met Asn Ala Gln Gln Trp His Arg Val Ile
100 105 110
Asp Val Ser Leu His Gly Phe Phe Asn Val Thr Gln Pro Leu Leu Leu
115 120 125
Pro Met Ala Arg Ala Arg Trp Gly Arg Ile Val Ser Val Ser Ser Val
130 135 140
Ala Ala Val Leu Gly Asn Arg Gly Gln Thr Asn Tyr Ala Ala Ala Lys
145 150 155 160
Ala Ala Leu His Gly Ala Ser Lys Ser Leu Ala Arg Glu Met Ala Ser
165 170 175
Arg Gly Ile Ala Val Asn Val Val Ala Pro Gly Val Ile Glu Ser Glu
180 185 190
Met Val Gly Asp Ser Phe Ala Pro Glu Met Ile Lys Gln Met Val Pro
195 200 205
Ala Gly Arg Val Gly Lys Pro Asp Glu Val Ala Ala Leu Val Ala Phe
210 215 220
Leu Cys Ser Asp Val Ala Gly Tyr Ile Asn Gly Gln Val Ile Gly Ile
225 230 235 240
Asn Gly Gly Met Gly
245
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Xanthomonas campestris)
<400> 3
aattgaattc gcagcgcatc gtggtg 26
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Xanthomonas campestris)
<400> 4
gataagcata cctgagaaaa tggaaacctc gtcggggc 38
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Xanthomonas campestris)
<400> 5
gacgaggttt ccattttctc aggtatgctt atcatattta g 41
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Xanthomonas campestris)
<400> 6
tataaagctt ccctaaactt tgccgcactc 30
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Xanthomonas campestris)
<400> 7
ccatgtgcct gtgggaagcg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Xanthomonas campestris)
<400> 8
taaaacctgc accttttcgt 20

Claims (9)

1.一种菌黄素合成相关基因XC_4092在构建生产无色黄原胶工程菌方面的应用，所述菌黄素合成相关基因XC_4092的基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述的基因XC_4092编码产物具有3-酮脂酰ACP还原酶活性，基因XC_4092编码产物氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其特征在于，出发菌株为野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris）的野生菌株Xcc8004，通过失活Xcc8004基因组中的基因XC_4092完成基因改造，获得产无色黄原胶的基因工程菌。
2.一种生产无色黄原胶的基因工程重组菌，其特征在于，是将野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的野生菌株Xcc8004基因组中的基因XC_4092失活所得；所述菌黄素合成相关基因XC_4092的基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述的基因XC_4092编码产物具有3-酮脂酰ACP还原酶活性，基因XC_4092编码产物氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的生产无色黄原胶的基因工程重组菌，其特征在于，所述失活的方式为删除或沉默抑制基因XC_4092的全部或部分编码框。
4.根据权利要求2或3所述的生产无色黄原胶的基因工程重组菌，其特征在于，是通过采用两次同源重组的基因敲除方法删除所述的野生菌株Xcc8004基因组中的基因XC_4092所得。
5.根据权利要求4所述的生产无色黄原胶的基因工程重组菌，其特征在于，由包括如下步骤的方法构建得到：
S1、构建基因敲除重组质粒；
S2、将步骤S1获得的重组质粒转化E.coli S17-1感受态细胞，获得转化子；
S3、采用接合转移方式将重组质粒导入至野油菜黄单胞菌Xcc8004中，通过卡那霉素和利福平抗性培养基筛选，获得第一次同源重组菌；
S4、将步骤S3中得到的第一次同源重组菌株进行第二次同源重组培养，利用复制平板法筛选第二次同源重组菌；
S5、PCR法验证步骤S4中得到的第二次同源重组菌，将扩增片段测序，确认需要敲除的基因XC_4092已被删除，成功删除基因XC_4092的第二次同源重组菌即为生产无色黄原胶的基因工程重组菌。
6.根据权利要求5所述的生产无色黄原胶的基因工程重组菌，其特征在于，所述的步骤S1为：以野油菜黄单胞菌Xcc8004的基因组为模板，利用PCR法分别扩增XC_4092基因的上游片段和下游片段，其中，上游片段的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，下游片段的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；接着，采用融合PCR法，以XC_4092基因的上、下游片段为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6为引物，将XC_4092基因的上、下游片段连接起来，形成XC_4092基因的缺失片段；再将XC_4092基因的缺失片段酶切后连入自杀质粒pK18mobsacB，获得重组质粒。
7.根据权利要求5所述的生产无色黄原胶的基因工程重组菌，其特征在于，所述的步骤S5中，PCR验证引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
8.根据权利要求7所述的生产无色黄原胶的基因工程重组菌，其特征在于，所述的步骤S5中，验证PCR的程序包括如下：（1）95℃预变性10 min；（2）95℃变性1 min；（3）56℃退火30s；（4）72℃延伸2.0 min；（5）重复（2）～（4）35个循环；（6）72℃，10 min。
9.权利要求2-8任一项所述的生产无色黄原胶的基因工程重组菌在生产无色黄原胶方面的应用。
CN201810021980.1A 2018-01-10 2018-01-10 一种菌黄素合成相关基因及其在构建产无色黄原胶工程菌中的应用 Active CN110016480B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810021980.1A CN110016480B (zh) 2018-01-10 2018-01-10 一种菌黄素合成相关基因及其在构建产无色黄原胶工程菌中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810021980.1A CN110016480B (zh) 2018-01-10 2018-01-10 一种菌黄素合成相关基因及其在构建产无色黄原胶工程菌中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110016480A CN110016480A (zh) 2019-07-16
CN110016480B true CN110016480B (zh) 2022-09-13

Family

ID=67188075

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810021980.1A Active CN110016480B (zh) 2018-01-10 2018-01-10 一种菌黄素合成相关基因及其在构建产无色黄原胶工程菌中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110016480B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110777105A (zh) * 2019-11-20 2020-02-11 上海交通大学 一种高产白原胶的工程菌株及其构建与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102212499A (zh) * 2010-04-09 2011-10-12 广西大学 一种编码4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的基因的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102212499A (zh) * 2010-04-09 2011-10-12 广西大学 一种编码4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的基因的应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
无.无.《CP000050.1》.2014,全文. *
无;无;《CP000050.1》;20140130;全文 *
野油菜黄单胞菌中烯脂酞ACP还原酶的功能鉴定;余永红等;《生物化学与生物物理进展》;20161231;第43卷(第5期);第514-522页 *
野油菜黄单胞菌中长链3-酮脂酰ACP合成酶的鉴定;董会娟等;《华南农业大学学报》;20150121;第36卷(第2期);第49-54页 *
野油菜黄单胞菌菌黄素的生物合成机制研究;曹雪强等;《中国植物病理学会2016年学术年会论文集》;20160805;第341页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110016480A (zh) 2019-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105420154B (zh) 双基因敲除重组红球菌、构建方法及其应用
CN107904223B (zh) 一种褐藻胶裂解酶、分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞及其应用
CN112725319B (zh) polyG底物特异性的褐藻胶裂解酶FaAly7及其应用
WO2019136618A1 (zh) 高产尿苷的基因工程菌及其构建方法与应用
CN110016480B (zh) 一种菌黄素合成相关基因及其在构建产无色黄原胶工程菌中的应用
CN107602707B (zh) 一种特异性调节枯草芽孢杆菌外源基因表达的dcas9-ω融合蛋白及其应用
CN112852764B (zh) 酮基化酶的突变体蛋白及应用
CN111471636B (zh) 表达人表皮生长因子的基因工程菌及其应用
CN102212499B (zh) 一种编码4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的基因的应用
CN114409751A (zh) 一种yh66_04470基因突变的重组菌及其在制备精氨酸中的应用
CN114672525A (zh) N-乙酰基-5-甲氧基色胺的生物合成方法及其应用
CN108795832B (zh) 一种内源l-门冬酰胺酶ii基因敲除的宿主菌、其制备方法及其应用
CN105647898A (zh) 一种海洋褐藻酸裂解酶及其表达基因与应用
CN107083375B (zh) 一种中温α-淀粉酶及其基因和应用
WO2024114637A1 (zh) 生产阿卡波糖的工程菌及其构建方法和应用
CN110591993A (zh) 一种基于盐酸刺激的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法
CN111196845B (zh) 一种Gal4蛋白突变体及其应用
CN115786229B (zh) 一种用于红球菌基因敲除的重组系统及其应用
CN114703116B (zh) 一种生产2-羟基吩嗪的绿针假单胞菌及制备方法与应用
CN115109793B (zh) 一种从头合成络缌的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
CN114560918B (zh) Yh66_14275蛋白或其突变体在制备l-精氨酸中的应用
CN114605509B (zh) Yh66_01475蛋白及其编码基因在调控细菌精氨酸产量中的应用
CN114940963B (zh) 一种高效表达褐藻酸裂解酶的枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法与应用
CN117264989A (zh) 一种少动鞘氨醇单胞菌的CRISPRi/dCas9基因抑制系统及其构建方法和应用
CN110777105A (zh) 一种高产白原胶的工程菌株及其构建与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant