CN107904223B - 一种褐藻胶裂解酶、分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞及其应用 - Google Patents

一种褐藻胶裂解酶、分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种褐藻胶裂解酶、分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞及其应用，所述褐藻胶裂解酶具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(II)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过1‑20个氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有褐藻胶裂解酶的活性。本发明中，将褐藻胶裂解酶全基因进行截短，降低分子量，显著提高了宿主细胞对褐藻胶裂解酶的表达量，分泌的褐藻胶裂解酶活性高、稳定性好、对褐藻酸钠的降解能力强。

Description

一种褐藻胶裂解酶、分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种褐藻胶裂解酶、分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞及其应用。
背景技术
褐藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，是一种由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸连接形成的天然多糖。研究发现，褐藻酸钠的降解产物褐藻寡糖具有降血糖、抗炎症、抗肿瘤、抗凝血、免疫调节和生长调节的作用，目前已广泛应用于医药领域、食品领域和饲料领域。
褐藻寡糖的制备主要通过酸降解法、氧化降解法、超声降解法和酶降解法进行，然而这些方法普遍具有效率低、产率低等问题。
采用褐藻胶裂解酶酶解褐藻酸钠生产褐藻寡糖的方法，具有条件温和、过程可控、得率高等优点，已逐渐取代传统的酸解方法成为褐藻寡糖生产的主要方式。然而，褐藻胶裂解酶的生产依然面临菌株不安全、酶活力较低、酶稳定性差、酶的底物谱窄等问题。
CN 102586216 A公开了一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法，所述方法提供了针对褐藻胶裂解酶生产菌株设计的适合发酵以及高产褐藻胶裂解酶的新型培养基，并提供了利用海洋弧菌高产褐藻胶裂解酶的新方法。然而该方法分泌的褐藻胶裂解酶的酶活最高仅35-40U/mL，存在酶活力较低的问题。
CN 106995811 A公开了一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用，所述褐藻胶裂解酶性质稳定、比酶活高达4600U/mL，然而该方法将褐藻胶裂解酶全基因转入宿主细胞，编码得到的褐藻胶裂解酶的前体蛋白的分子量较大，对宿主菌体的代谢产生较大的负荷，导致褐藻胶裂解酶的表达量偏低，不容易分泌到细胞外。
因此，构建一种褐藻胶裂解酶，并构建分泌所述褐藻胶裂解酶的宿主菌，在褐藻寡糖的制备领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种褐藻胶裂解酶、分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞及其应用，所述褐藻胶裂解酶酶活高、稳定性好、对褐藻酸钠的降解能力强。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种褐藻胶裂解酶，其具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：
(I)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
(II)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过1-20个氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有褐藻胶裂解酶的活性；
所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列如下：
EEREDVTYTEPGLINPDGSVHQLHSPNPVTGTVHNVLDFGADSQDNNHDDLPAILDAIEAASVGDEVYLPDGIYNLNSTLSNDGASHFNLKTGVNIRGESREGTVLVSSFSNEPNGKVMRAFGQHDIHISDLTVTSSFDGEFSTNHSENNPDASGPEYGIYIADGLGAVPSYNITIEDVTVEHFQTMGVRIQNSHDVVVTDSLFRKATDVGGGGAGYGVSIQGTAKTDRSGYQNDTRYNVVKDSVFEGPYIRHGVLLQFYAHNNLIINNTLTNTVLDAIDLHGEDEYLNVIEENTISGVTKGAGIALGNTGGSAPSNHDNSGPGNVILNNHITNSREGIKIHMGSPDTLIEGNVISDTTNPDNSKGILLMNAPGTVVKNNTIQNNSADNFWGVSFEYDNGDSNANNVGSGKPSNISLSGNTITGNTNGVRILDGENLTIDDTNTIRNNTGQDLVDNRITEPNPVEPPADAEIVEIEVIEDALIRDGQYAG.
由于褐藻胶裂解酶全基因编码的褐藻胶裂解酶的前体蛋白的分子量较大，长度约143kDa，宿主菌体代谢困难，使得褐藻胶裂解酶的表达量偏低，且不容易分泌到细胞外。本发明中，将褐藻胶裂解酶全基因进行截短，显著提高了宿主细胞对褐藻胶裂解酶的表达量，分泌的褐藻胶裂解酶保留有降解褐藻酸钠的活性，但分子量大大降低。
本发明中，将所述SEQ ID NO.1经过1-20个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列同样具有褐藻胶裂解酶功能。
第二方面，本发明提供了一种编码如第一方面所述的褐藻胶裂解酶的核苷酸序列。
优选地，所述褐藻胶裂解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列如下：
gaggaaagagaagatgtcacttatactgaaccaggattaattaatccagatggttctgtccaccaattgcattctccgaaccctgtaacaggtactgtgcacaatgtactcgatttcggcgcagatagtcaagataacaatcatgatgatctacctgctatattagacgctattgaggcagcttcagttggagacgaagtatatttaccagatggtatctataatttaaatagtacgttaagtaacgatggtgcctcccattttaatctcaaaacaggggtaaatatccgtggtgaaagtcgagagggaacggtactggtatctagcttttcaaacgagccaaatggcaaggtaatgagagcattcggacaacatgacattcacatttctgatttaaccgttacgtcaagctttgatggagagtttagtacgaaccatagtgaaaacaaccctgacgcatctggaccagaatacggtatatatattgctgatggtttaggagctgtaccatcctacaatataacgatagaggatgtaaccgtagaacacttccaaacaatgggtgttcgtatacaaaatagccatgatgtagtggtaacagattctctatttagaaaagcgactgatgtaggtggcggtggagctggttatggtgtatccattcagggtactgctaaaacagaccgcagtggttatcaaaatgatacgagatacaatgtagtaaaggattcagtatttgaaggtccctatattcgccatggtgtattgttacaattttatgcacataataatttaattataaataacacactgacaaatacagtgttggatgcaatcgaccttcatggtgaagatgagtatttaaatgttattgaagaaaatacaattagtggagtgacaaaaggggcaggtattgccttagggaatacaggtggatcagctccatccaatcatgataattctggtccaggcaatgttattctaaataatcacattacaaattcaagagaaggcataaagattcacatgggaagtccagacacactaattgaaggaaatgtcatatccgacacaacaaacccagataattctaaaggtattttactgatgaatgctcctggtacagtagtaaaaaataatacgattcagaataacagtgctgacaatttctggggcgtatcatttgagtatgataatggtgactctaatgcgaataatgtcggttcaggaaagccaagtaacatttctttgtcaggaaatacgataacaggaaatacgaatggagtcagaattttagacggagaaaatcttaccatcgatgacactaatacaataaggaataatacaggacaggacttagtagataatcgaataacggaaccaaacccagttgaacctccagcggacgcggagatagttgaaattgaggtaattgaagatgcattaattcgagatggtcaatatgctgga.
优选地，所述褐藻胶裂解酶的长度为50-52kDa。
本发明中，长度为52kDa的截短蛋白的活性最高，酶活超过20000U/mL。
第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括D-丙氨酸消旋酶启动子、D-丙氨酸消旋酶基因、褐藻胶裂解酶基因启动子、信号肽基因和如第一方面所述的褐藻胶裂解酶的核苷酸序列。
本发明中，通过表达载体向宿主细胞导入外源性D-丙氨酸消旋酶基因，代替卡那霉素作为筛选标记，使得宿主细胞不含有抗生素基因，培养时不需要加入抗生素，是一种食品级安全的宿主细胞；同时通过表达载体向宿主细胞导入褐藻胶裂解酶基因和信号肽基因，实现了宿主细胞对褐藻胶裂解酶的表达。
本发明利用敲除D-丙氨酸消旋酶基因的宿主细胞不能在LB培养基中生长的性质，利用LB培养基筛选得到能够高效分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞。
本发明中，所述表达载体的D-丙氨酸消旋酶启动子、D-丙氨酸消旋酶基因、信号肽基因和褐藻胶裂解酶基因之间还可以插入其他基因元件。
优选地，所述褐藻胶裂解酶基因启动子包括hpaII启动子、p43启动子或pglv启动子中的任意一种或至少两种的组合，优选为hpaII启动子。
本发明中，hpaII启动子为第二质粒自身的启动子，p43启动子为枯草芽孢杆菌组成型启动子，pglv启动子为麦芽糖诱导型启动子，其中，携带hpaII启动子的宿主细胞分泌的褐藻胶裂解酶的活性最高。
优选地，所述信号肽包括褐藻胶裂解酶信号肽98sp、yuiC信号肽、csn信号肽、yesW信号肽、bpr信号肽、lipA信号肽、lipB信号肽、nprB信号肽、nprE信号肽、amyE信号肽、yfk信号肽、wap信号肽、yclQ信号肽、oppA信号肽、pcl信号肽、ywbN信号肽或phoD信号肽中的任意一种或至少两种的组合，优选为褐藻胶裂解酶信号肽98sp、yuiC信号肽或pel信号肽中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述褐藻胶裂解酶信号肽包括如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
所述SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列为：
MVTSTLSTYFNLLVLLKCMPFVFGVVLA.
优选地，所述编码信号肽的基因和如第一方面所述的褐藻胶裂解酶的核苷酸序列以基因融合方式连接。
第四方面，本发明提供了一种褐藻胶裂解酶的宿主细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建敲除D-丙氨酸消旋酶基因的宿主细胞；
优选地，利用同源重组的方式构建敲除载体对D-丙氨酸消旋酶基因进行敲除，所述敲除载体包括宿主细胞的D-丙氨酸消旋酶基因的上下游核苷酸序列作为同源重组的同源臂、抗生素基因、及木糖启动子控制表达的插入大肠杆菌致死因子基因；然后将敲除载体导入宿主细胞，利用抗生素筛选敲除载体插入染色体的宿主细胞，然后利用木糖筛选二次重组的宿主细胞，筛选获得敲除D-丙氨酸消旋酶且不含有抗生素基因的宿主细胞；
优选地，所述抗生素为红霉素；
(2)构建褐藻胶裂解酶分泌表达载体，将D-丙氨酸消旋酶启动子及基因、褐藻胶裂解酶基因启动子、编码信号肽的基因和如第二方面所述的褐藻胶裂解酶的核苷酸序列连接到表达载体上；
(3)将步骤(2)所述的表达载体导入步骤(1)所述的敲除D-丙氨酸消旋酶的宿主细胞中。
本发明中，通过将敲除载体导入宿主细胞，与宿主细胞的基因同源重组，不仅达到了敲除宿主细胞的D-丙氨酸消旋酶基因的目的，而且通过木糖筛选得到了一种氨基酸缺陷型宿主细胞，未发生同源重组的宿主细胞通过木糖诱导大肠杆菌致死因子的表达，进行致死，所述氨基酸缺陷型宿主细胞的筛选不需要添加抗生素，安全性高，在蛋白表达或酶表达领域具有广泛应用前景。
本发明中，所述敲除载体的敲除D-丙氨酸消旋酶基因的基因、木糖启动子和大肠杆菌致死因子基因之间还可以插入其他基因元件。
本发明中，敲除D-丙氨酸消旋酶的宿主细胞不能在LB培养基中生长，需要添加D-丙氨酸后才能生长，因此，可以利用LB培养基培养获得高效分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞；获得的宿主细胞不含有抗生素基因，培养时不需要加入抗生素，且褐藻胶裂解酶为组成型表达，不需要添加诱导剂进行诱导，是一种食品级安全的宿主细胞。
优选地，所述褐藻胶裂解酶的信号肽为褐藻胶裂解酶信号肽98sp、yuiC信号肽或pel信号肽中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述褐藻胶裂解酶基因启动子为HpaII启动子。
所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌和/或海洋嗜盐单胞菌，优选为枯草芽孢杆菌。
作为优选技术方案，本发明提供了一种褐藻胶裂解酶的宿主细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将宿主细胞染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因的上下游核苷酸序列进行同源臂连接，得到敲除D-丙氨酸消旋酶基因的片段，在木糖启动子后插入大肠杆菌致死因子基因，PCR扩增获得含有木糖启动子和大肠杆菌致死因子的片段，将所述敲除D-丙氨酸消旋酶基因的片段和所述含有木糖启动子和大肠杆菌致死因子的片段插入载体的多克隆位点，构建得到敲除载体；
(2)将步骤(1)所述的敲除载体导入宿主细胞，利用红霉素筛选质粒插入染色体的宿主细胞，然后利用木糖筛选二次重组的宿主细胞，筛选获得敲除D-丙氨酸消旋酶的宿主细胞；
(3)构建如第二方面所述的表达载体；
(4)将步骤(3)所述的表达载体导入步骤(2)所述的敲除D-丙氨酸消旋酶的宿主细胞，利用LB培养基培养获得分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞。
第五方面，本发明提供了一种宿主细胞，包括如第三方面所述的表达载体。
优选地，所述宿主细胞中的D-丙氨酸消旋酶被敲除。
优选地，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌和/或海洋嗜盐单胞菌中的任意一种，优选为枯草芽孢杆菌。
第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的褐藻胶裂解酶、如第二方面所述的褐藻胶裂解酶的核苷酸序列、如第三方面所述的表达载体、如第四方面所述的方法或如第四方面所述的宿主细胞在制备褐藻寡糖、食品风味配料、保健品、化妆品或海藻肥料中的任意一种或至少两种中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过向宿主细胞导入第一质粒，与宿主细胞的基因同源重组，不仅敲除了宿主细胞的D-丙氨酸消旋酶基因，而且通过木糖筛选得到了一种氨基酸缺陷型宿主细胞，所述氨基酸缺陷型宿主细胞应用于蛋白表达领域，不需要添加抗生素进行筛选，是一种食品级安全的宿主细胞，具有广泛应用前景；
(2)本发明通过第二质粒向敲除D-丙氨酸消旋酶基因的宿主细胞导入了外源性D-丙氨酸消旋酶基因，代替卡那霉素作为筛选标记，实现了不依赖抗生素的筛选，同时通过第二质粒向宿主细胞导入了褐藻胶裂解酶基因，利用LB培养基，筛选得到能够高效分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞；
(3)褐藻胶裂解酶信号肽98sp具有较强的引导褐藻胶裂解酶分泌的能力，分泌的褐藻胶裂解酶的酶活达到10000U/mL；
(4)hpaII启动子具有促进褐藻胶裂解酶分泌的能力，分泌的褐藻胶裂解酶的酶活达到10000U/mL；
(5)褐藻胶裂解酶核心结构域为一段长度为52kDa的截短蛋白，将所述52kDa的截短蛋白基因转入宿主细胞，可以显著增加蛋白的表达量和分泌量；
(6)本发明制备的褐藻胶裂解酶酶活高、稳定性好，降解得到的褐藻寡糖的聚合度为2-7。
附图说明
图1为不同信号肽对枯草芽孢杆菌分泌的褐藻胶裂解酶活性的影响；
图2为不同启动子对枯草芽孢杆菌分泌的褐藻胶裂解酶活性的影响；
图3(a)为不同的褐藻胶裂解酶基因片段对枯草芽孢杆菌分泌的褐藻胶裂解酶活性的影响，图3(b)为含有不同的褐藻胶裂解酶基因片段的枯草芽孢杆菌分泌的褐藻胶裂解酶的活性随时间的变化曲线；
图4为枯草芽孢杆菌分泌的褐藻胶裂解酶的活性随发酵时间的变化曲线；
图5为褐藻寡糖的聚合度随反应时间的变化曲线。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1 第一质粒的构建
(1)在枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因(dal)的上下游各选取1000bp的片段作为同源臂，进行PCR扩增，通过重组PCR将两段同源臂相连，获得敲除D-丙氨酸消旋酶基因的dalU-dalD片段；
(2)在pAX01载体的木糖启动子xylA’后插入大肠杆菌的致死因子基因(mazF)，PCR扩增获得含有xylR-xylA’-macF-erm的片段；
(3)将dalU-dalD片段和xylR-xylA’-macF-erm片段插入pUC19质粒的多克隆位点中，构建获得敲除D-丙氨酸消旋酶基因的第一质粒pUC-dalU-dalD-xylR-xylA’-macF-erm。
实施例2 D-丙氨酸消旋酶基因敲除菌株的制备
(1)将第一质粒pUC-dalU-dalD-xylR-xylA’-macF-erm转化入枯草芽孢杆菌1A751，利用红霉素筛选第一质粒插入染色体的菌株；
(2)利用木糖作为生长压力，筛选二次重组的质粒以及dal基因被敲除的菌株，对于未进行二次重组的菌株，木糖作为木糖启动子的诱导剂，诱导macF的表达，进行致死，获得D-丙氨酸消旋酶基因敲除的枯草芽孢杆菌1A751-△dal。
实施例3 第二质粒的构建
(1)PCR扩增获得枯草芽孢杆菌1A751的D-丙氨酸消旋酶基因及其启动子片段，利用该片段替换枯草芽孢杆菌表达质粒pMA5上的卡那霉素抗性基因，得到pMA5-dal质粒；
(2)利用重叠PCR将扩增获得的褐藻胶裂解酶基因和信号肽基因进行基因融合，连接到pMA5-dal质粒的NdeI和BamHI之间，获得分泌褐藻胶裂解酶的第二质粒pMA5-dal-Aly。
实施例4 分泌褐藻胶裂解酶的菌株的制备
将第二质粒转入枯草芽孢杆菌1A751-△dal，利用LB培养基筛选获得高效分泌褐藻胶裂解酶的菌株。
实施例5 信号肽对褐藻胶裂解酶活性的影响
扩增获得褐藻胶裂解酶信号肽基因、以及枯草芽孢杆菌常见分泌蛋白Ywbn、Yuic、Csn、Yesw、Bpr、LipB、NprE、AmyE、yfk、wap、yclQ、NprB、LipA、OppA、Pcl和pHod的信号肽基因，并与褐藻胶裂解酶基因进行融合，连接到pMA5-dal质粒的NdeI和BamHI之间，构建带有不同信号肽的第二质粒，转化枯草芽孢杆菌1A751-△dal。以SR培养基培养48h，测定上清液中褐藻胶裂解酶的活性。
结果如图1所示，除了Ywbn和pHod分泌蛋白(Tat分泌途径)的信号肽外，其余信号肽均能引导褐藻胶裂解酶分泌到细胞外，其中Yuic和Pcl的信号肽引导的褐藻胶裂解酶活性最高。褐藻胶裂解酶信号肽98sp同样具有较强的引导褐藻胶裂解酶分泌到细胞外的能力，分泌的褐藻胶裂解酶的酶活达到10000U/mL。经SignalP 4.1Server预测，褐藻胶裂解酶信号肽98sp为Sec途径典型的信号肽，且来源于新型海洋芽孢杆菌属细菌。
实施例6 启动子对褐藻胶裂解酶活性的影响
扩增获得枯草芽孢杆菌组成型启动子p43和麦芽糖诱导型启动子pglv的基因片段，替换第二质粒上的hpaII启动子，构建带有不同启动子的第二质粒，之间，构建带有不同信号肽的第二质粒，转化枯草芽孢杆菌1A751-△dal。以SR培养基培养48h，测定上清液中褐藻胶裂解酶的活性。
结果如图2所示，携带hpaII启动子的菌株分泌的褐藻胶裂解酶的活性最高，为10000U/mL。
实施例7 不同的褐藻胶裂解酶基因片段对褐藻胶裂解酶活性的影响
尝试截短表达褐藻胶裂解酶基因，探索不同的褐藻胶裂解酶基因片段对褐藻胶裂解酶活性的影响。
扩增褐藻胶裂解酶基因，5'端固定，3'端逐步向后延伸，形成长度不同的基因片段，编码长度分别为48、50、51、52、53和54kDa的蛋白。将不同长度的基因片段分别连接到大肠杆菌表达载体pET-21a的多克隆位点中，构建载体转化大肠杆菌BL21。IPTG诱导表达后，超声破碎上清液经Ni柱纯化，获得褐藻胶裂解酶，进行酶活性测定。
结果如图3(a)和图3(b)所示，长度为52kDa的截短蛋白的活性最高，且该蛋白活性随发酵时间的延长而增加，因此确定褐藻胶裂解酶的核心区是一段长度为52kDa的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。并且，该52kDa的截短蛋白比全长褐藻胶裂解酶的酶活提高了10-15倍。
实施例8 褐藻胶裂解酶的制备
将制备的高效分泌褐藻胶裂解酶的菌株(长度52kDa、信号肽为98sp、启动子为HpaII)接种于SR培养基，装液量为3L，转速为500rpm，通气量为4-6L/min，在37℃下发酵培养24h；添加葡萄糖至终浓度为20g/L，继续发酵培养至48h，得到褐藻胶裂解酶。
结果如图4所示，褐藻胶裂解酶的终产量超过20000U/mL。
实施例9 利用褐藻胶裂解酶制备褐藻寡糖
向浓度为100g/L的褐藻酸钠中添加200U/mL褐藻胶裂解酶，在40℃下反应10-24h。反应产物采用凝胶色谱进行分离，并用质谱进行分子量分析，确定褐藻寡糖的聚合度。
结果如图5所示，褐藻寡糖的聚合度为2-6，收率达80％以上。反应10h时，产物为褐藻二糖、褐藻三糖、褐藻四糖、褐藻五糖和褐藻六糖；反应24h时，褐藻五糖、褐藻六糖几乎被全部降解，褐藻二糖的含量显著提升。由此可知，可以通过控制反应时间，获得不同聚合度的褐藻寡糖。
综述所述，本发明通过向宿主细胞导入敲除D-丙氨酸消旋酶基因的第一质粒，得到了一种氨基酸缺陷型宿主细胞，不需要添加抗生素进行筛选，是一种食品级安全的宿主细胞；向敲除D-丙氨酸消旋酶基因的宿主细胞导入第二质粒，利用LB培养基培养得到高效分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞；宿主细胞分泌褐藻胶裂解酶的能力受到褐藻胶裂解酶信号肽、启动子和褐藻胶裂解酶基因片段的影响，制备得到的褐藻胶裂解酶酶活高、稳定性好，可用于降解褐藻酸钠制备褐藻寡糖。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种褐藻胶裂解酶、分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞及其应用
<130> 20171225
<141> 2017-12-26
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 490
<212> PRT
<213> 人工合成()
<400> 1
Glu Glu Arg Glu Asp Val Thr Tyr Thr Glu Pro Gly Leu Ile Asn Pro
1 5 10 15
Asp Gly Ser Val His Gln Leu His Ser Pro Asn Pro Val Thr Gly Thr
20 25 30
Val His Asn Val Leu Asp Phe Gly Ala Asp Ser Gln Asp Asn Asn His
35 40 45
Asp Asp Leu Pro Ala Ile Leu Asp Ala Ile Glu Ala Ala Ser Val Gly
50 55 60
Asp Glu Val Tyr Leu Pro Asp Gly Ile Tyr Asn Leu Asn Ser Thr Leu
65 70 75 80
Ser Asn Asp Gly Ala Ser His Phe Asn Leu Lys Thr Gly Val Asn Ile
85 90 95
Arg Gly Glu Ser Arg Glu Gly Thr Val Leu Val Ser Ser Phe Ser Asn
100 105 110
Glu Pro Asn Gly Lys Val Met Arg Ala Phe Gly Gln His Asp Ile His
115 120 125
Ile Ser Asp Leu Thr Val Thr Ser Ser Phe Asp Gly Glu Phe Ser Thr
130 135 140
Asn His Ser Glu Asn Asn Pro Asp Ala Ser Gly Pro Glu Tyr Gly Ile
145 150 155 160
Tyr Ile Ala Asp Gly Leu Gly Ala Val Pro Ser Tyr Asn Ile Thr Ile
165 170 175
Glu Asp Val Thr Val Glu His Phe Gln Thr Met Gly Val Arg Ile Gln
180 185 190
Asn Ser His Asp Val Val Val Thr Asp Ser Leu Phe Arg Lys Ala Thr
195 200 205
Asp Val Gly Gly Gly Gly Ala Gly Tyr Gly Val Ser Ile Gln Gly Thr
210 215 220
Ala Lys Thr Asp Arg Ser Gly Tyr Gln Asn Asp Thr Arg Tyr Asn Val
225 230 235 240
Val Lys Asp Ser Val Phe Glu Gly Pro Tyr Ile Arg His Gly Val Leu
245 250 255
Leu Gln Phe Tyr Ala His Asn Asn Leu Ile Ile Asn Asn Thr Leu Thr
260 265 270
Asn Thr Val Leu Asp Ala Ile Asp Leu His Gly Glu Asp Glu Tyr Leu
275 280 285
Asn Val Ile Glu Glu Asn Thr Ile Ser Gly Val Thr Lys Gly Ala Gly
290 295 300
Ile Ala Leu Gly Asn Thr Gly Gly Ser Ala Pro Ser Asn His Asp Asn
305 310 315 320
Ser Gly Pro Gly Asn Val Ile Leu Asn Asn His Ile Thr Asn Ser Arg
325 330 335
Glu Gly Ile Lys Ile His Met Gly Ser Pro Asp Thr Leu Ile Glu Gly
340 345 350
Asn Val Ile Ser Asp Thr Thr Asn Pro Asp Asn Ser Lys Gly Ile Leu
355 360 365
Leu Met Asn Ala Pro Gly Thr Val Val Lys Asn Asn Thr Ile Gln Asn
370 375 380
Asn Ser Ala Asp Asn Phe Trp Gly Val Ser Phe Glu Tyr Asp Asn Gly
385 390 395 400
Asp Ser Asn Ala Asn Asn Val Gly Ser Gly Lys Pro Ser Asn Ile Ser
405 410 415
Leu Ser Gly Asn Thr Ile Thr Gly Asn Thr Asn Gly Val Arg Ile Leu
420 425 430
Asp Gly Glu Asn Leu Thr Ile Asp Asp Thr Asn Thr Ile Arg Asn Asn
435 440 445
Thr Gly Gln Asp Leu Val Asp Asn Arg Ile Thr Glu Pro Asn Pro Val
450 455 460
Glu Pro Pro Ala Asp Ala Glu Ile Val Glu Ile Glu Val Ile Glu Asp
465 470 475 480
Ala Leu Ile Arg Asp Gly Gln Tyr Ala Gly
485 490
<210> 2
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
gaggaaagag aagatgtcac ttatactgaa ccaggattaa ttaatccaga tggttctgtc 60
caccaattgc attctccgaa ccctgtaaca ggtactgtgc acaatgtact cgatttcggc 120
gcagatagtc aagataacaa tcatgatgat ctacctgcta tattagacgc tattgaggca 180
gcttcagttg gagacgaagt atatttacca gatggtatct ataatttaaa tagtacgtta 240
agtaacgatg gtgcctccca ttttaatctc aaaacagggg taaatatccg tggtgaaagt 300
cgagagggaa cggtactggt atctagcttt tcaaacgagc caaatggcaa ggtaatgaga 360
gcattcggac aacatgacat tcacatttct gatttaaccg ttacgtcaag ctttgatgga 420
gagtttagta cgaaccatag tgaaaacaac cctgacgcat ctggaccaga atacggtata 480
tatattgctg atggtttagg agctgtacca tcctacaata taacgataga ggatgtaacc 540
gtagaacact tccaaacaat gggtgttcgt atacaaaata gccatgatgt agtggtaaca 600
gattctctat ttagaaaagc gactgatgta ggtggcggtg gagctggtta tggtgtatcc 660
attcagggta ctgctaaaac agaccgcagt ggttatcaaa atgatacgag atacaatgta 720
gtaaaggatt cagtatttga aggtccctat attcgccatg gtgtattgtt acaattttat 780
gcacataata atttaattat aaataacaca ctgacaaata cagtgttgga tgcaatcgac 840
cttcatggtg aagatgagta tttaaatgtt attgaagaaa atacaattag tggagtgaca 900
aaaggggcag gtattgcctt agggaataca ggtggatcag ctccatccaa tcatgataat 960
tctggtccag gcaatgttat tctaaataat cacattacaa attcaagaga aggcataaag 1020
attcacatgg gaagtccaga cacactaatt gaaggaaatg tcatatccga cacaacaaac 1080
ccagataatt ctaaaggtat tttactgatg aatgctcctg gtacagtagt aaaaaataat 1140
acgattcaga ataacagtgc tgacaatttc tggggcgtat catttgagta tgataatggt 1200
gactctaatg cgaataatgt cggttcagga aagccaagta acatttcttt gtcaggaaat 1260
acgataacag gaaatacgaa tggagtcaga attttagacg gagaaaatct taccatcgat 1320
gacactaata caataaggaa taatacagga caggacttag tagataatcg aataacggaa 1380
ccaaacccag ttgaacctcc agcggacgcg gagatagttg aaattgaggt aattgaagat 1440
gcattaattc gagatggtca atatgctgga 1470
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工合成()
<400> 3
Met Val Thr Ser Thr Leu Ser Thr Tyr Phe Asn Leu Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Lys Cys Met Pro Phe Val Phe Gly Val Val Leu Ala
20 25

Claims (19)

1.一种褐藻胶裂解酶，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括D-丙氨酸消旋酶启动子、D-丙氨酸消旋酶基因、褐藻胶裂解酶基因启动子、编码信号肽的基因和如权利要求2所述的褐藻胶裂解酶的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶基因启动子包括hpaII启动子、p43启动子或pglv启动子中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶基因启动子为hpaII启动子。
6.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述信号肽包括褐藻胶裂解酶信号肽98sp、yuiC信号肽、csn信号肽、yesW信号肽、bpr信号肽、lipA信号肽、lipB信号肽、nprB信号肽、nprE信号肽、amyE信号肽、yfk信号肽、wap信号肽、yclQ信号肽、oppA信号肽或pel信号肽中的任意一种或至少两种的组合。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述信号肽为褐藻胶裂解酶信号肽98sp、yuiC信号肽或pel信号肽中的任意一种或至少两种的组合。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶信号肽98sp的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
9.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述编码信号肽的基因和如权利要求2所述的褐藻胶裂解酶的核苷酸序列以基因融合方式连接。
10.一种分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建敲除D-丙氨酸消旋酶基因的宿主细胞；
(2)构建褐藻胶裂解酶分泌表达载体，将D-丙氨酸消旋酶启动子及基因、褐藻胶裂解酶基因启动子、编码信号肽的基因和如权利要求2所述的褐藻胶裂解酶的核苷酸序列连接到表达载体上；
(3)将步骤(2)所述的表达载体导入步骤(1)所述的敲除D-丙氨酸消旋酶的宿主细胞中。
11.根据权利要求10所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述构建敲除D-丙氨酸消旋酶基因的宿主细胞的方法为：
利用同源重组的方式构建敲除载体对D-丙氨酸消旋酶基因进行敲除，所述敲除载体包括宿主细胞的D-丙氨酸消旋酶基因的上下游核苷酸序列作为同源重组的同源臂、抗生素基因、及木糖启动子控制表达的插入大肠杆菌致死因子基因；然后将敲除载体导入宿主细胞，利用抗生素筛选敲除载体插入染色体的宿主细胞，然后利用木糖筛选二次重组的宿主细胞，筛选获得敲除D-丙氨酸消旋酶且不含有抗生素基因的宿主细胞。
12.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于，所述抗生素为红霉素。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶的信号肽为褐藻胶裂解酶信号肽98sp、yuiC信号肽或pel信号肽中的任意一种或至少两种的组合。
14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶基因启动子为HpaII启动子。
15.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌。
16.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求3-9任一项所述的表达载体。
17.根据权利要求16所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中的D-丙氨酸消旋酶被敲除。
18.根据权利要求17所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌。
19.一种如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶、如权利要求2所述的褐藻胶裂解酶的核苷酸序列、如权利要求3-9任一项所述的表达载体、如权利要求10-15任一项所述的方法或如权利要求16-18任一项所述的宿主细胞在制备褐藻寡糖、食品风味配料、保健品、化妆品或海藻肥料中的任意一种或至少两种中的应用。
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