CN104531745B - 一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用 - Google Patents
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Abstract
我们首次将抗性基因sat整合到质粒pMA5上构建出新的具有NTC抗性质粒pMA5‑sat。另外,实验室前期筛选获得一株核黄素生产菌Bacillus subtilis RF1,该菌株对多种常规抗生素都有一定的抗性,所以对于该菌株运用质粒表达外源基因的抗性筛选造成了困难。为了验证所构建新型质粒的实用性,首次将来自Bacillus subtilis RF1自身的葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶基因zwf连接抗性质粒pMA5‑sat上,得到表达载体pMA5‑sat‑zwf,将表达载体转化到核黄素生产菌Bacillus subtilis RF1中得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5‑sat‑zwf。多次发酵罐结果表明重组菌发酵60h核黄素产量达到12.01g/L,比原始菌的9.22g/L提高了30.3%。说明新构建的重组质粒pMA5‑sat能够用于枯草芽孢杆菌的代谢改造。
Description
技术领域
构建重组质粒pMA5-sat表达NTC抗性基因和运用抗性质粒表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf提高核黄素产量属于基因工程领域。
背景技术
诺瓦丝菌素Norseothricin(NTC)是一种链丝菌素Streptothricin类抗生素,能够抑制蛋白质的合成和正确编码。NTC被广泛运用于细菌、真菌、酵母、植物细胞等的抗性筛选,是一种对阳性筛选子没有副作用的一种抗生素。并且,NTC易溶于水,并且在4℃水溶液中可稳定保存2年。实验证实,由基因sat编码的链丝菌素乙酰基转移酶,能够乙酰化NTC的β-赖氨酸的β-氨基,使NTC失活。
实验室前期选育了一株核黄素高产菌Bacillus subtilis RF1,多次实验证明该菌株对于氨苄霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素等都有抗性,所以对于该菌株的抗性筛造成了困难。但是,通过实验证明该菌株不能够在浓度为20mg/L的NTC抗性培养基中生长。于是,我们考虑构建一种新型的抗性筛选质粒。而质粒pMA5作为一种稳定的穿梭质粒,被广泛运用于枯草芽孢杆菌的表达系统中。所以,我们尝试将抗性基因sat整合到质粒pMA5上构建出一种能够抗NTC抗生素的新型的抗性质粒。
核黄素是一种维生素,又称维生素B2,是人和动物体必需的维生素之一,为黄素酶类辅酶的组成部分,在生物体内主要以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在,参与机体组织呼吸链电子传递及氧化还原反应,在呼吸和生物氧化中起着重要作用,是生命活动中不可缺少的维生素。其中,在枯草芽孢杆菌中,核黄素的合成以GTP和核酮糖-5-磷酸(P5P)为前体物经过7步酶催化反应得到,并且整个过程可以总结为下列反应方程式:3P5P+Gly+14ATP+2NADPH+2C1→riboflavin+3NADH+2formate。所以核黄素的过量合成存在两个假说的瓶颈:一是前体物GTP和核酮糖-5-磷酸的有限供应;二是催化合成过程的酶的有限供应和活性。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是葡萄糖进入磷酸戊糖途的一个关键酶,课题组对前期选育的原始菌Bacillus subtilis RF1的磷酸戊糖途径的关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶进行加强表达以提高磷酸戊糖通量,一方面获得更高水平的前体物核酮糖-5-磷酸的积累,另一方面也提高了核黄素合成所需NADPH的剂量。从而提高核黄素的产量。
发明内容
本发明的主要研究内容:本发明利用分子技术克隆了链丝菌素因乙酰基转移酶基因sat,构建重组抗性表达载体pMA5-sat,并将其转化Bacillus subtilis RF1,得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat,并且重组菌能够在NTC抗性平板上稳定地生长。实验结果表明,重组质粒能够在宿主菌中正常表达抗性基因sat,使NTC抗生素失活,从而构建出一种新型的NTC抗生素抗性质粒。
首次运用抗性质粒pMA5-sat在核黄素生产菌Bacillus subtilis RF1加强表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf,得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf,并成功提高了核黄素产量,说明重组质粒pMA5-sat能够有效的用于枯草芽孢杆菌的改造。
本发明的技术方案:
(1)抗性质粒pMA5-sat的构建:
以上海生工公司合成的sat全基因片段DNA为模板,根据sat基因的特异性设计引物,P1:5’-ACCGGGATCCATGAAAATTTCGGTGATC-3’(BamHI);P2:5’-GGCACGCGTTTAGGCGTCATCCTGTGCTCC-3’(MluI);扩增条件:94℃预变性,5min,一个循环;94℃变性,1min,58℃退火,1min,72℃延伸,30s,35个循环;72℃,10min,一个循环;15℃,10min,一个循环。PCR扩增体系:合成的sat全基因片段DNA 1μL,上下游引物各0.5μL,dNTPMix 4μL,10×Ex Taq Buffer 5μL,灭菌的双蒸水38μL,Ex Taq DNA聚合酶1μL,扩增sat基因,大小为525bp。将基因sat连接表达载体pMA5,得到重组质粒pMA5-sat,通过转化大肠杆菌感受态转入大肠杆菌E.coli JM109中,在含氨苄霉素的抗性平板上挑取抗性转化子,提取质粒酶切验证,并送样至生工测序正确,得到重组菌E.coli JM109/pMA5-sat;
(2)抗性质粒pMA5-sat转化Bacillus subtilis RF1:
从重组菌E.coli JM109/pMA5-sat中提取构建正确的重组质粒pMA5-sat,用改进的Spizizen法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞,将重组质粒转化感受态枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1,在含NTC抗生素的抗性平板上挑取抗性转化子,提取质粒酶切验证正确,得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat。
(3)表达载体的构建pMA5-sat-zwf:
以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1基因组DNA为模板,根据NCBI中提供的Bacillus subtilis 168的zwf基因序列,用Primer 5.0软件设计引物P3:AGGCGGATCCGTGAAAACAAACCAACAACC、P4:ACCGACGCGTTTATATGTTCCACCAGTGTA,并在其上下游引入酶切位点BamH I和Mlu I。以Bacillus subtilis RF1基因组DNA为模板,克隆出基因片段。PCR产物经胶回收后得到zwf基因片段,连接克隆载体pMD-18T,转化E.coli JM109,阳性转化子经酶切验证后,由上海生工生物有限公司测序,并将重组质粒命名为T-zwf。载体T-zwf和pMA5通过BamH I与MluI双酶切,经琼脂糖凝胶电泳后,回收目的片段,16℃连接过夜后转化E.coli JM109,通过酶切验证,最终得到表达载体pMA5-zwf。再设计引物P5:AGGCGATATCGTAAGCTAGACAAAAC、P6:ACCGGGTACCTTATATGTTCCACCAGTG,并在其上下游引入酶切位点EcoR V和Kpn I。以质粒pMA5-zwf为模板克隆出带启动子HpaII的基因片段HpaII-zwf。基因片段HpaII-zwf和载体pMA5-sat通过EcoR V与Kpn I双酶切,经琼脂糖凝胶电泳后,回收目的片段,16℃连接过夜后转化E.coli JM109,通过酶切验证,最终得到表达载体pMA5-sat-zwf。
(4)表达载体pMA5-sat-zwf转化Bacillus subtilis RF1:
从重组菌E.coli JM109/pMA5-sat-zwf中提取构建正确的重组质粒pMA5-sat-zwf,用改进的Spizizen法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞,将重组质粒转化感受态枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1,在含NTC抗生素的抗性平板上挑取抗性转化子,提取质粒酶切验证正确,得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf。
用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素的方法:
出发菌株:枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1和Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf;
培养基组成:种子培养基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10。发酵罐发酵培养基(g/L):葡萄糖40,酵母粉10,二水合柠檬酸三钠0.11,(NH4)2HPO46,KH2PO45,MgSO4·7H2O1.5,ZnSO4·7H2O 0.03,MnCl2·4H2O 0.05,FeSO4·7H2O 0.02。发酵罐补料培养基(g/L):葡萄糖600,酵母粉10,(NH4)2HPO46,KH2PO45。
发酵罐培养条件:5L发酵罐装液量2L,转速600rpm,用30%(v/v)NH4OH和1M H2SO4控制pH为6.8,温度40℃,采取葡萄糖浓度限制补料策略使发酵液葡萄糖浓度保持在10-15g/L。用生物传感分析仪(SBA-40C山东,中国)测定发酵液中残余葡萄糖的含量。
本发明的有益效果:构建出一种新型的抗性质粒,可用于宿主菌的抗性筛选,为宿主菌表达外源基因提供了条件。运用抗性质粒在核黄素生产菌Bacillus subtilis RF1中加强表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,有效地增强了细胞内磷酸戊糖途径的通量,为核黄素的合成提供了充足的前体物和辅酶NADPH供应。对重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf进行发酵分析,多次发酵罐结果表明重组菌发酵60h核黄素产量达到12.01g/L,比原始菌的9.22g/L提高了30.3%。
具体实施方式
实施例1:抗性质粒pMA5-sat的构建:
以上海生工公司合成的sat全基因片段DNA为模板,根据sat基因的特异性设计引物,P1:5’-ACCGGGATCCATGAAAATTTCGGTGATC-3’(BamHI);P2:5’-GGCACGCGTTTAGGCGTCATCCTGTGCTCC-3’(MluI);扩增条件:94℃预变性,5min,一个循环;94℃变性,1min,58℃退火,1min,72℃延伸,30s,35个循环;72℃,10min,一个循环;15℃,10min,一个循环。PCR扩增体系:合成的sat全基因片段DNA 1μL,上下游引物各0.5μL,dNTPMix 4μL,10×Ex Taq Buffer 5μL,灭菌的双蒸水38μL,Ex Taq DNA聚合酶1μL,扩增sat基因,大小为525bp。将基因sat连接表达载体pMA5,得到重组质粒pMA5-sat,通过转化大肠杆菌感受态转入大肠杆菌E.coli JM109中,在含氨苄霉素的抗性平板上挑取抗性转化子,提取质粒酶切验证,并送样至生工测序正确,得到重组菌E.coli JM109/pMA5-sat;
实施例2:抗性质粒pMA5-sat转化Bacillus subtilis RF1:
从重组菌E.coli JM109/pMA5-sat中提取构建正确的重组质粒pMA5-sat,用改进的Spizizen法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞,将重组质粒转化感受态枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1,在含NTC抗生素的抗性平板上挑取抗性转化子,提取质粒酶切验证正确,得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat。
实施例3:表达载体的构建pMA5-sat-zwf:
以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1基因组DNA为模板,根据NCBI中提供的Bacillus subtilis 168的zwf基因序列,用Primer 5.0软件设计引物P3:AGGCGGATCCGTGAAAACAAACCAACAACC、P4:ACCGACGCGTTTATATGTTCCACCAGTGTA,并在其上下游引入酶切位点BamH I和Mlu I。以Bacillus subtilis RF1基因组DNA为模板,克隆出基因片段。PCR产物经胶回收后得到zwf基因片段,连接克隆载体pMD-18T,转化E.coli JM109,阳性转化子经酶切验证后,由上海生工生物有限公司测序,并将重组质粒命名为T-zwf。载体T-zwf和pMA5通过BamH I与Mlu I双酶切,经琼脂糖凝胶电泳后,回收目的片段,16℃连接过夜后转化E.coli JM109,通过酶切验证,最终得到表达载体pMA5-zwf。再设计引物P5:AGGCGATATCGTAAGCTAGACAAAAC、P6:ACCGGGTACCTTATATGTTCCACCAGTG,并在其上下游引入酶切位点EcoR V和Kpn I。以质粒pMA5-zwf为模板克隆出带启动子HpaII的基因片段HpaII-zwf。基因片段HpaII-zwf和载体pMA5-sat通过EcoR V与Kpn I双酶切,经琼脂糖凝胶电泳后,回收目的片段,16℃连接过夜后转化E.coli JM109,通过酶切验证,最终得到表达载体pMA5-sat-zwf。
实施例4:表达载体pMA5-sat-zwf转化Bacillus subtilis RF1:
从重组菌E.coli JM109/pMA5-sat-zwf中提取构建正确的重组质粒pMA5-sat-zwf,用改进的Spizizen法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞,将重组质粒转化感受态枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1,在含NTC抗生素的抗性平板上挑取抗性转化子,提取质粒酶切验证正确,得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf。
实施例5:用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素
发酵条件如上本发明技术方案所述。对重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf进行发酵分析,多次发酵罐结果表明重组菌发酵60h核黄素产量达到12.01g/L,比原始菌的9.22g/L提高了30.3%。
Claims (1)
1.一种重组枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素的方法,其特征是:
培养基组成:种子培养基g/L:蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10;发酵罐发酵培养基g/L:葡萄糖40,酵母粉10,二水合柠檬酸三钠0.11,(NH4)2HPO4 6,KH2PO4 5,MgSO4·7H2O 1.5,ZnSO4·7H2O 0.03,MnCl2·4H2O 0.05,FeSO4·7H2O 0.02;发酵罐补料培养基g/L:葡萄糖600,酵母粉10,(NH4)2HPO4 6,KH2PO4 5;
发酵罐培养条件:5L发酵罐装液量2L,转速600rpm,用30%v/v NH4OH和1M H2SO4控制pH为6.8,温度40℃,采取葡萄糖浓度限制补料策略使发酵液葡萄糖浓度保持在10-15g/L;其中所述的重组枯草芽孢杆菌的制备方法如下:
(1)构建重组质粒pMA5-sat:以合成的sat全基因片段DNA为模板,根据sat基因的特异性设计引物,P1:5’-ACCGGGATCCATGAAAATTTCGGTGATC-3’BamHI;P2:5’-GGCACGCGTTTAGGCGTCATCCTGTGCTCC-3’MluI;扩增条件:94℃预变性,5min,一个循环;94℃变性,1min,58℃退火,1min,72℃延伸,30s,35个循环;72℃,10min,一个循环;15℃,10min,一个循环;PCR扩增体系:合成的sat全基因片段DNA 1μL,上下游引物各0.5μL,dNTP Mix4μL,10×Ex Taq Buffer5μL,灭菌的双蒸水38μL,Ex Taq DNA聚合酶1μL,扩增sat基因,大小为525bp;将基因sat连接表达载体pMA5,得到重组质粒pMA5-sat;
(2)重组质粒pMA5-sat-zwf的构建:以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1基因组DNA为模板,根据NCBI中提供的Bacillus subtilis 168的zwf基因序列,用Primer 5.0软件设计引物P3:AGGCGGATCCGTGAAAACAAACCAACAACC、P4:ACCGACGCGTTTATATGTTCCACCAGTGTA,并在其上下游引入酶切位点BamH I和Mlu I;以Bacillus subtilis RF1基因组DNA为模板,克隆出基因片段;PCR产物经胶回收后得到zwf基因片段和pMA5通过BamH I与Mlu I双酶切,经琼脂糖凝胶电泳后,回收目的片段,16℃连接过夜后转化E.coli JM109,通过酶切验证,最终得到表达载体pMA5-zwf;再设计引物P5:AGGCGATATCGTAAGCTAGACAAAAC、P6:ACCGGGTACCTTATATGTTCCACCAGTG,并在其上下游引入酶切位点EcoR V和Kpn I;以质粒pMA5-zwf为模板克隆出带启动子HpaII的基因片段HpaII-zwf;基因片段HpaII-zwf和步骤(1)所述载体pMA5-sat通过EcoR V与Kpn I双酶切,经琼脂糖凝胶电泳后,回收目的片段,16℃连接过夜后转化E.coli JM109,通过酶切验证,最终得到表达载体pMA5-sat-zwf;
(3)重组枯草芽孢杆菌重组菌的获得:步骤(2)获得的所述载体用改进的Spizizen法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞,将重组质粒转化感受态枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisRF1,在含NTC抗生素的抗性平板上挑取抗性转化子,提取质粒酶切验证正确,得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf。
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