CN1891813A - 产核黄素的工程菌株及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产核黄素的工程菌株及其构建方法，属于工业微生物技术。所述的产核黄素的工程菌株为Bacillus subtilis F4－RH33，其特征在于，该菌株可抗150mg/L玫瑰黄素、200mg/L 8－氮鸟嘌呤、100mg/L 6－巯基鸟嘌呤、100mg/L德夸菌素和5mg/L卡那霉素。该菌株的构建过程包括：通过紫外线或亚硝基胍化学诱变剂诱变处理枯草芽孢杆菌168，筛选嘌呤和核黄素结构类似物抗性突变株，通过重复的原生质体融合对核黄素突变株的性状进行优化，并对枯草芽孢杆菌核黄素操纵子进行扩增来提高菌株的核黄素合成能力。本发明的优点在于综合应用传统的诱变育种、原生质体融合技术和重组DNA技术，通过各亲株的基因组之间的重组来修复诱变造成的负突变，筛选到快速高产核黄素的工程菌株。
Description
技术领域
本发明涉及一种产核黄素的工程菌株及其构建方法，属于工业微生物技术。
背景技术
核黄素(riboflavin)是一种水溶性B族维生素，亦称维生素B2，植物和许多微生物细胞都能合成这种维生素。由于人体细胞和其它动物细胞自身不能合成核黄素，而核黄素又在细胞的新陈代谢中发挥不可缺少的作用，因此核黄素是人体和动物所必需的维生素。在生物体内核黄素以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在，它作为黄素蛋白的辅酶参与传递氢的有关代谢，在呼吸和生物氧化中起重要作用，是生命活动中不可缺少的维生素。核黄素能促进蛋白质、脂肪、碳水化合物的代谢，具有维护皮肤和粘膜的生理功能。核黄素缺乏会妨碍细胞的氧化作用，使物质代谢发生障碍。核黄素作为常用临床药物，用于辅助治疗口角炎、角膜炎、白内障、眼角膜及口角血管增生等多种疾病；核黄素在食品工业中可作为食用色素和营养添加剂使用，以满足人体每天0.3～1.8mg核黄素的需要；核黄素在饲料工业中用做饲料添加剂，动物饲料中必须含有1～4mg/kg的核黄素才能满足其生长需要。
核黄素可以通过以葡萄糖为起始原料的全化学法合成，以D-核糖作为主要原料的化学半合成法，以及微生物发酵法生产，其中微生物发酵法生产核黄素至今已有约60年的历史。发酵法具有生产工艺简单、原料廉价并可再生、对环境污染小等优点。真菌和细菌均可用于生产核黄素，主要生产菌种有棉囊阿舒氏酵母(Ashbya gossypii)、解朊假丝酵母(Candida famata)、阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)、酿酒酵母(Saccharomyces sp.)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和产氨棒状杆菌(Corynebactia aminogensis)等。Stepanov等(法国专利2546907)用基因工程方法构建了产核黄素工程菌B.subtilis 304/pMX45，该菌携带含有核黄素操纵子的游离型质粒pMX45，同时具有8-氮鸟嘌呤和玫瑰黄素抗性标记，采用流加工艺发酵48小时产核黄素可达4.5g/L。Perkins等(美国专利5925538)利用基因扩增方法，在对宿主菌B.subtilis 168进行遗传改造的基础上构建了一系列工程菌，这些菌株在其染色体上的1-2个位点上分别整合了两个或多个核黄素操纵子拷贝。在此基础上，采用强启动子P15替换天然启动子ribP1和ribP2的方法进一步改进了工程菌的核黄素合成能力。通过上述方法构建的工程菌B.subtilis RB50∷[pRF69]60在限制流加葡萄糖的条件下发酵48小时后可产核黄素13-14g/L，56小时后达15g/L。Hümbelin等通过扩增ribA基因的方法使核黄素生产菌的核黄素合成能力提高25％(Hümbelin M，Griesser V，Keller T，et al.GTP cyclohydrolase II and 3，4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase arerate-limiting enzymes in riboflavin synthesis of an industrial Bacillus subtilis strain used forriboflavin production.J Ind Microbiol Biotechnol，1999，22：1-7)。Koizumi等用基因工程的方法改造产氨棒杆菌(Corynebactia aminogensis)的核黄素操纵子启动子及ribA基因的(核糖体结合位点)RBS序列从而增强这些基因的表达，并有效地提高了工程菌的核黄素生产能力，通过该方法构建的工程菌发酵72小时后可产核黄素15.3g/L(Koizumi S，Yonetani A，Maruyame S T.Production of riboflavin by metabolically engineered Corynebacteriumammoniagenes.Appl Microbiol Biotechnol，2000，53：674-679)。本发明综合利用经典诱变、基因工程和原生质体融合技术，对涉及核黄素产生的基因进行优化重组，从而产生能高效合成核黄素的工程菌株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产核黄素的工程菌株及其构建方法，克服了现有技术中核黄素产量低的不足，提供了对枯草芽孢杆菌进行遗传改良从而提高其核黄素产生能力的方法，得到高产核黄素的遗传工程菌株。
本发明是通过下述技术方案加以实现的，一种产核黄素的工程菌株，该菌名称为Bacillus subtilis F4-RH33，已保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号CGMCC1579，保藏时间：2005年12月26日。其特征在于，该菌株可抗150mg/L玫瑰黄素、200mg/L 8-氮鸟嘌呤、100mg/L 6-巯基鸟嘌呤、100mg/L德夸菌素和5mg/L卡那霉素。
上述的产核黄素的工程菌株的构建方法，其特征在于包括以下过程：
1.筛选不同结构类似物抗性突变株：用紫外线或亚硝基胍化学诱变剂诱变处理枯草芽孢杆菌168，将诱变后的菌液涂布在含150mg/L玫瑰黄素的基本培养基上，在37℃培养3～5天，筛选出生长良好并在培养基中分泌较多黄色色素的玫瑰黄素抗性突变株；用紫外线或亚硝基胍化学诱变剂处理所筛选出的玫瑰黄素抗性突变株，将诱变后的玫瑰黄素抗性突变株的菌液涂布在含100mg/L 6-巯基鸟嘌呤的基本培养基上，在37℃培养3～5天，筛选出生长良好并在培养基中分泌较多黄色色素的6-巯基鸟嘌呤突变株；再次用紫外线或亚硝基胍化学诱变剂处理6-巯基鸟嘌呤抗性突变株，将诱变后的6-巯基鸟嘌呤抗性突变株的菌液涂布在含100mg/L德夸菌素的基本培养基上，在37℃培养3～7天，筛选出生长良好并在培养基中分泌较多黄色色素的德夸菌素抗性突变株；再次用紫外线或亚硝基胍化学诱变剂处理德夸菌素抗性突变株，将诱变后的德夸菌素抗性突变株的菌液涂布在含200mg/L 8-氮鸟嘌呤的基本培养基上，在37℃培养3～7天，筛选出生长良好并在培养基中分泌较多黄色色素的8-氮鸟嘌呤抗性突变株，经过上述四轮诱变处理，筛选得到了在含50ml发酵培养基的500ml摇瓶中积累100～200mg/L核黄素，且同时具有玫瑰黄素、8-氮鸟嘌呤、6-巯基鸟嘌呤和德夸菌素抗性的6株突变菌株。
2.第一代融合子的获得：将经步骤1获得的6株抗性突变株在37℃、细菌完全培养基(LB)中培养到对数生长中后期，各取等量的菌液混合，将菌液离心后收集菌体悬浮于3～10mL蔗糖高渗溶液I(SMMP)中，用终浓度为0.4～1.0g/L的溶菌酶35～40℃处理30～60分钟制备原生质体，然后加入8～12mL 40％聚乙二醇溶液，混匀后在37℃水浴中保温2分钟进行多亲株的原生质体融合，3000r/min离心10分钟，弃上清液，用2mL蔗糖高渗溶液II(SMM)溶液充分悬浮，然后涂布在再生培养基(CMR)上，将融合后的菌液涂布在CMR上培养1～2天后，从长出的单菌落中选出在培养基上形成较大黄色圈的菌株，并进一步通过摇瓶发酵选出具有最高核黄素生产能力的菌株。筛选得到在含有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中41℃培养64小时后积累核黄素800～900mg/L的第一代融合子F2-798。
3.第二代融合子的获得：同步骤2的融合方法，将枯草芽孢杆菌DB104第一代融合子F2-798进行了第二轮原生质体融合。在该轮原生质体融合中筛选到第二代融合菌株F3-152，其在含有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中41℃培养64小时后积累核黄素400～500mg/L。
4.含有核黄素操纵子的质粒载体的构建：构建了含枯草芽孢杆菌核黄素操纵子的整合型质粒。以步骤2获得的F2-798的染色体为模板，用PCR方法扩增核黄素操纵子基因(GenBank登录号：X51510)，上游引物：5’-G GGG GGA TCC ACA AAA GAG GGG AGGGAAAC-3’，下游引物：5’-G GGG GAA TTC CGG GAT CGG ACT GAC G-3’，在其上游引入BamH I酶切位点，下游引入EcoR I酶切位点，得到4.6kb的扩增产物。将4.6kb的扩增产物与pUC18连接后得到质粒pUC18-rib，随后将能够在枯草芽孢杆菌中表达的卡那霉素抗性基因片段作为筛选标记插入pUC18-rib，得到在枯草芽孢杆菌染色体核黄素操纵子位点进行整合的质粒pZH-rib。
5.基因工程菌的获得：将整合型质粒pZH-rib转化入第二代融合子F3-152中，在含有5mg/L卡那霉素的LB培养基上筛选到基因工程菌F3-152∷pZH-rib，其在含有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中41℃培养64小时后合成2.0～2.8g/L的核黄素。
6.第三代融合子的获得：同步骤2的融合方法，将F2-798和F3-152∷pZH-rib进行第三轮原生质体融合。在该轮原生质体融合中筛选第三代融合子F4-RH33，该融合子在含有150mg/L玫瑰黄素、200mg/L 8-氮鸟嘌呤、100mg/L 6-巯基鸟嘌呤、100mg/L德夸菌素和5mg/L卡那霉素的培养基中生长良好，其在含有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中41℃培养64小时后积累核黄素5g/L。
上述过程所使用的基本培养基组分及其浓度为：葡萄糖5g/L，(NH4)2SO40.2g/L，K2HPO41.8g/L，KH2PO40.6g/L，柠檬酸钠0.12g/L，L-色氨酸0.05g/L，16g/L琼脂粉，pH 7.0；
所使用的蔗糖高渗溶液I组分及其浓度为：6g/L牛肉膏，6g/L酵母抽提物，20g/L蛋白胨，14g/L NaCl，4g/L葡萄糖，14.7g/L K2HPO4，5.4g/L KH2PO4，170g/L蔗糖，2g/L顺丁烯二酸，4g/L MgCl2·6H2O，pH 7.0；
所使用的蔗糖高渗溶液II组分及其浓度为：蔗糖170g/L，顺丁烯二酸2g/L，MgCl2·6H2O4g/L，pH 7.0：
所使用的细菌完全培养基组分及其浓度为：蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0；
所使用的再生培养基组分及其浓度为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，蔗糖171g/L，MgCl2·6H2O 4g/L，琼脂20g/L，pH 7.2；
所使用的发酵培养基组分及其浓度为：80g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，5g/L酵母抽
提物，5g/L柠檬酸钠，0.5g/L MgSO4·7H2O，0.5g/L KH2PO4、1g/L K2HPO4，pH7.0。
本发明的优点：综合应用传统的诱变育种、原生质体融合技术和重组DNA技术，可以有效地消除诱变对菌株生理造成的不利影响，通过各亲株的基因组之间的重组来修复诱变造成的负突变，可以筛选到生长速度和糖代谢速度类似于野生型菌株，并同时高产核黄素的工程菌株。
附图说明
图1：pZH-rib质粒构建图。
具体实施方式
以下将通过具体的实例来描述本发明，提供下列实例仅为更好地解释本发明，因此本发明不被下列实例所限制。
本实施例以亚硝基胍为诱变剂进行第一次诱变：用pH7.0的0.1mol/L KH2PO4或0.1mol/L K2HPO4磷酸缓冲液制成新鲜的枯草芽孢杆菌168的菌悬液，用20mg/L的诱变剂亚硝基胍进行处理，在32℃处理约40分钟后用生理盐水洗涤2～3次，稀释后涂布在含有150mg/L玫瑰黄素的基本培养基上，37℃培养3天，得到生长良好的玫瑰黄素抗性突变株，然后筛选出7株具有微弱核黄素合成能力的突变株。用同样的方法第二次诱变处理7株玫瑰黄素抗性突变株，涂布在含有100mg/L 6-巯基鸟嘌呤的基本培养基平板上，37℃培养3天，得到生长良好的6-巯基鸟嘌呤抗性突变株，并从中筛选出核黄素合成能力最强的10株突变株。用同样的方法第三次诱变处理核黄素合成能力最强的10株6-巯基鸟嘌呤抗性突变株，然后涂布在含有100mg/L德夸菌素的基本培养基平板上，37℃培养5天，得到生长良好的德夸菌素抗性突变株，并从中筛选出核黄素合成能力最强的3株突变株。用同样的方法第四次诱变处理核黄素合成能力最强的3株德夸菌素抗性突变株，然后涂布在含有200mg/L 8-氮鸟嘌呤的基本培养基平板上，37℃培养5天，得到生长良好的8-氮鸟嘌呤抗性突变株，从中筛选出在含有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中41℃培养64小时后积累核黄素100～200mg/L的6株菌株。
本实施例将这6株菌在37℃、LB培养基中培养到对数生长中后期，各取5mL菌悬液混合后离心，用SMMP洗涤1～2次，重新悬浮于3mL SMMP溶液中，加入终浓度为0.6mg/mL的溶菌酶，在37℃水浴中保温处理30分钟，立即以3000r/min离心10分钟，再用5mL SMMP溶液洗涤后重新悬浮于1mL SMM溶液中，然后加入9mL 40％聚乙二醇溶液，立即混匀后在37℃水浴中保温2分钟，3000r/min离心10分钟，弃上清液，用2mL SMM溶液充分悬浮，然后涂布在CMR再生培养基平板上，培养1～2天后，从长出的单菌落中选出在培养基上能形成较大黄色圈的菌株，并进一步通过发酵初筛选出具有最高核黄素生产能力的菌株，筛选到在含有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中4l℃培养64小时后积累核黄素900mg/L的第一代融合子F2-798。
本实施例将未经过诱变处理的枯草芽孢杆菌DB104同F2-798进行了第二轮原生质体融合，将2株菌在37℃、LB培养基中培养到对数生长中后期，各取5mL等量菌液混合，用SMMP洗涤1～2次，重新悬浮于1mL SMMP溶液中，加入终浓度为0.7mg/mL的溶菌酶，在37℃水浴中保温处理45分钟，立即以3000r/min离心10分钟，再用1mL SMMP溶液洗涤后重新悬浮于0.2mL SMM溶液中，然后加入1.8mL40％聚乙二醇(PEG)溶液，立即混匀后在37℃水浴保温2分钟。3000r/min离心10分钟，弃上清液，用2mL SMM溶液充分悬浮，然后适当稀释后涂布在CMR再生培养基上，培养1～2天后，从长出的单菌落中选出在培养基上能形成较大黄色圈的菌株，并进一步通过发酵初筛优出具有最好核黄素生产能力的菌株。在本实施例中优选到生长迅速、具有较高的糖代谢速度、但核黄素合成能力较F2-798有所下降的第二代融合菌株F3-152，其在含有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中41℃培养64小时后积累核黄素400～500mg/L。
本实施例通过重组DNA技术来进一步增强菌株的核黄素合成：根据枯草芽孢杆菌中核黄素操纵子基因表达的要求设计PCR扩增引物，其上游引入BamH I酶切位点，下游引入EcoR I酶切位点，上游引物为5’-G GGG GGA TCC ACA AAA GAG GGG AGG GAAAC-3’，下游引物为5’-G GGG GAA TTC CGG GAT CGG ACT GAC G-3’。以F2-798的染色体为模板，用PCR方法扩增核黄素操纵子，将PCR产物和载体pUC18经过EcoR I和BamH I双酶消化，将酶切后的产物连接起来得到质粒pUCl8-rib，再将在枯草芽孢杆菌中表达的卡那霉素抗性基因经BamH I消化后插入pUCl 8-rib的BamH I位点，得到在枯草芽孢杆菌染色体核黄素操纵子位点进行整合的质粒pZH-rib，见图1。将整合型质粒pZH-rib转化入第二代融合子F3-152中，在含有5mg/L卡那霉素的LB培养基上筛选到基因工程菌F3-152∷pZH-rib，其在含有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中41℃培养64小时后积累核黄素2.0～2.8g/L。
本实施例以同样的方法将F2-798和F3-152∷pZH-rib进行原生质体融合，从长出的单菌落中选出在培养基上能形成较大黄色圈的菌株，并进一步通过发酵初筛选出具有最好核黄素生产能力的菌株。在本实施例中选到第三代融合子F4-RH33，该融合子在含有150mg/L玫瑰黄素、200mg/L8-氮鸟嘌呤、100mg/L6-巯基鸟嘌呤、100mg/L德夸菌素和5mg/L卡那霉素的培养基中生长良好，其在含有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中4l℃培养64小时后积累核黄素约5g/L。
本实施例上述过程使用的培养基组分及其浓度为：
基本培养基：葡萄糖5g/L，(NH4)2SO4 0.2g/L，K2HPO4 1.8g/L，KH2PO4 0.6g/L，柠檬酸钠0.12g/L，L-色氨酸0.05g/L，16g/L琼脂粉，pH 7.0；
蔗糖高渗溶液I：6g/L牛肉膏，6g/L酵母抽提物，20g/L蛋白胨，14g/LNaCl，4g/L葡萄糖，14.7g/L K2HPO4，5.4g/L KH2PO4，170g/L蔗糖，2g/L顺丁烯二酸，4g/LMgCl2·6H2O，pH 7.0；
蔗糖高渗溶液II：蔗糖170g/L，顺丁烯二酸2g/L，MgCl2·6H2O 4g/L，pH 7.0；
细菌完全培养基：蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0；
再生培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，牛肉膏5g/L，NaCl5g/L，蔗糖171 g/L，MgCl2·6H2O 4g/L，琼脂20g/L，pH 7.2；
发酵培养基：80g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，5g/L酵母抽提物，5g/L柠檬酸钠，0.5g/L MgSO4·7H2O，0.5g/L KH2PO4、1g/L K2HPO4，pH7.0。
Claims (2)
1.一种产核黄素的工程菌株，该菌名称为Bacillus subtilis F4-RH33，已保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号CGMCC1579，保藏时间：2005年12月26日；其特征在于，该菌株可抗150mg/L玫瑰黄素、200mg/L 8-氮鸟嘌呤、100mg/L6-巯基鸟嘌呤、100mg/L德夸菌素和5mg/L卡那霉素。
2.一种按权利要求1所述的产核黄素的工程菌株的构建方法，其特征在于包括以下过程：
1).选不同结构类似物抗性突变株：用紫外线或亚硝基胍化学诱变剂诱变处理枯草芽孢杆菌168，将诱变后的菌液涂布在含150mg/L玫瑰黄素的基本培养基上，在37℃培养3～5天，筛选出生长良好并在培养基中分泌较多黄色色素的玫瑰黄素抗性突变株；用紫外线或亚硝基胍化学诱变剂处理所筛选出的玫瑰黄素抗性突变株，将诱变后的玫瑰黄素抗性突变株的菌液涂布在含100mg/L 6-巯基鸟嘌呤的基本培养基上，在37℃培养3～5天，筛选出生长良好并在培养基中分泌较多黄色色素的6-巯基鸟嘌呤突变株；再次用紫外线或亚硝基胍化学诱变剂处理6-巯基鸟嘌呤抗性突变株，将诱变后的6-巯基鸟嘌呤抗性突变株的菌液涂布在含100mg/L德夸菌素的基本培养基上，在37℃培养3～7天，筛选出生长良好并在培养基中分泌较多黄色色素的德夸菌素抗性突变株；再次用紫外线或亚硝基胍化学诱变剂处理德夸菌素抗性突变株，将诱变后的德夸菌素抗性突变株的菌液涂布在含200mg/L 8-氮鸟嘌呤的基本培养基上，在37℃培养3～7天，筛选出生长良好并在培养基中分泌较多黄色色素的8-氮鸟嘌呤抗性突变株，经过上述四轮诱变处理，筛选得到了在含50ml发酵培养基的500ml摇瓶中积累100～200mg/L核黄素，且同时具有玫瑰黄素、8-氮鸟嘌呤、6-巯基鸟嘌呤和德夸菌素抗性的6株突变菌株；
2).第一代融合子的获得：将经步骤1)获得的6株抗性突变株在37℃、细菌完全培养基中培养到对数生长中后期，各取等量的菌液混合，将菌液离心后收集菌体悬浮于3～10mL蔗糖高渗溶液I中，用终浓度为0.4～1.0g/L的溶菌酶35～40℃处理30～60分钟制备原生质体，然后加入8～12mL40％聚乙二醇溶液，混匀后在37℃水浴中保温2分钟进行多亲株的原生质体融合，3000r/min离心10分钟，弃上清液，用2mL蔗糖高渗溶液I溶液充分悬浮，然后涂布在再生培养基上，将融合后的菌液涂布在再生培养基上培养1～2天后，从长出的单菌落中选出在培养基上能形成较大黄色圈的菌株，并进一步通过摇瓶发酵选出具有最高核黄素生产能力的菌株，筛选得到在含有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中41℃培养64小时后积累核黄素800～900mg/L的第一代融合子F2-798；
3).第二代融合子的获得：同步骤2)的融合方法，将枯草芽孢杆菌DB104第一代融合子F2-798进行了第二轮原生质体融合，在该轮原生质体融合中筛选到第二代融合菌株F3-152，其在含有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中41℃培养64小时后积累核黄素400～500mg/L；
4).含有核黄素操纵子的质粒载体的构建：构建了含枯草芽孢杆菌核黄素操纵子的整合型质粒，以步骤20获得的F2-798的染色体为模板，用PCR方法扩增核黄素操纵子基因，上游引物：5’-G GGG GGA TCC ACA AAA GAG GGG AGG GAA AC-3’，下游引物：5’-GGGG GAA TTC CGG GAT CGG ACT GAC G-3’，在其上游引入BamH I酶切位点，下游引入EcoR I酶切位点，得到4.6kb的扩增产物，将4.6kb的扩增产物与pUC18连接后得到质粒pUC18-rib，随后将能够在枯草芽孢杆菌中表达的卡那霉素抗性基因片段作为筛选标记插入pUC18-rib，得到在枯草芽孢杆菌染色体核黄素操纵子位点进行整合的质粒pZH-rib；
5).基因工程菌的获得：将整合型质粒pZH-rib转化入第二代融合子F3-152中，在含有5mg/L卡那霉素的LB培养基上筛选到基因工程菌F3-152∷pZH-rib，其在含有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中41℃培养64小时后合成2.0～2.8g/L的核黄素；
6).第三代融合子的获得：同步骤2的融合方法，将F2-798和F3-152∷pZH-rib进行第三轮原生质体融合，在该轮原生质体融合中筛选第三代融合子F4-RH33，该融合子在含有150mg/L玫瑰黄素、200mg/L 8-氮鸟嘌呤、100mg/L 6-巯基鸟嘌呤、100mg/L德夸菌素和5mg/L卡那霉素的培养基中生长良好，其在含有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中41℃培养64小时后积累核黄素5g/L；
上述过程所使用的基本培养基组分及其浓度为：葡萄糖5g/L，(NH4)2SO4 0.2g/L，K2HPO4 1.8g/L，KH2PO4 0.6g/L，柠檬酸钠0.12g/L，L-色氨酸0.05g/L，16g/L琼脂粉，pH 7.0；
所使用的蔗糖高渗溶液I组分及其浓度为：6g/L牛肉膏，6g/L酵母抽提物，20g/L蛋白胨，14g/L NaCl，4g/L葡萄糖，14.7g/L K2HPO4，5.4g/L KH2PO4，170g/L蔗糖，2g/L顺丁烯二酸，4g/L MgCl2·6H2O，pH 7.0；
所使用的蔗糖高渗溶液II组分及其浓度为：蔗糖170g/L，顺丁烯二酸2g/L，MgCl2·6H2O4g/L，pH 7.0；
所使用的细菌完全培养基组分及其浓度为：蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0；
所使用的再生培养基组分及其浓度为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，蔗糖171g/L，MgCl2·6H2O 4g/L，琼脂20g/L，pH 7.2；
所使用的发酵培养基组分及其浓度为：80g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，5g/L酵母抽提物，5g/L柠檬酸钠，0.5g/L MgSO4·7H2O，0.5g/L KH2PO4、1g/L K2HPO4，pH7.0。
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Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100430471C (zh) * | 2006-05-17 | 2008-11-05 | 天津大学 | 产核黄素的工程菌株及其生产核黄素的方法 |
| WO2011035492A1 (zh) * | 2009-09-24 | 2011-03-31 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种抗生素的高产菌株及其制备方法和用途 |
| WO2012016445A1 (zh) * | 2010-08-06 | 2012-02-09 | 新发药业有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌及其应用 |
| CN102080056B (zh) * | 2009-12-01 | 2012-09-05 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 恩拉霉素新产生菌及其高产突变株 |
| CN102816823A (zh) * | 2012-09-18 | 2012-12-12 | 江南大学 | 利用多阶段转速调控策略提高Bacillus subtilis发酵生产核黄素产量的方法 |
| CN103013848A (zh) * | 2012-09-17 | 2013-04-03 | 常州大学 | 一种降解mc-lr的赖氨酸芽孢杆菌原生质体制备与再生的方法 |
| CN103952419A (zh) * | 2014-04-15 | 2014-07-30 | 天津大学 | 枯草芽孢杆菌腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA及应用 |
| CN103952422A (zh) * | 2014-04-15 | 2014-07-30 | 天津大学 | 枯草芽孢杆菌编码PRPP转酰胺酶突变基因purF及应用 |
| CN104531745A (zh) * | 2014-12-09 | 2015-04-22 | 江南大学 | 一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用 |
| CN105483071A (zh) * | 2015-12-29 | 2016-04-13 | 天津大学 | 一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建及发酵方法 |
| CN108913747A (zh) * | 2018-07-28 | 2018-11-30 | 广济药业（孟州）有限公司 | 一种高密度发酵维生素b2的方法 |
| CN110591990A (zh) * | 2019-07-05 | 2019-12-20 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一株高产核黄素工程菌株及其应用 |
| CN112538453A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-03-23 | 通辽梅花生物科技有限公司 | 一种产核黄素的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 |
| CN112575021A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-03-30 | 通辽梅花生物科技有限公司 | 一种生产核黄素的方法 |
-
2006
- 2006-05-17 CN CNB2006100137226A patent/CN100467590C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100430471C (zh) * | 2006-05-17 | 2008-11-05 | 天津大学 | 产核黄素的工程菌株及其生产核黄素的方法 |
| WO2011035492A1 (zh) * | 2009-09-24 | 2011-03-31 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种抗生素的高产菌株及其制备方法和用途 |
| CN101928670B (zh) * | 2009-09-24 | 2012-02-22 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种抗生素的高产菌株及其制备方法和用途 |
| US8431383B2 (en) | 2009-09-24 | 2013-04-30 | Shanghai Techwell Biopharmaceutical Co., Ltd. | Mutagenized strain of Glarea lozoyensis and a method of preparing a compound from the mutagenized strain |
| CN102080056B (zh) * | 2009-12-01 | 2012-09-05 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 恩拉霉素新产生菌及其高产突变株 |
| WO2012016445A1 (zh) * | 2010-08-06 | 2012-02-09 | 新发药业有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌及其应用 |
| CN103013848B (zh) * | 2012-09-17 | 2015-04-22 | 常州大学 | 一种降解mc-lr的赖氨酸芽孢杆菌原生质体制备与再生的方法 |
| CN103013848A (zh) * | 2012-09-17 | 2013-04-03 | 常州大学 | 一种降解mc-lr的赖氨酸芽孢杆菌原生质体制备与再生的方法 |
| CN102816823B (zh) * | 2012-09-18 | 2014-10-22 | 江南大学 | 利用多阶段转速调控策略提高Bacillus subtilis发酵生产核黄素产量的方法 |
| CN102816823A (zh) * | 2012-09-18 | 2012-12-12 | 江南大学 | 利用多阶段转速调控策略提高Bacillus subtilis发酵生产核黄素产量的方法 |
| CN103952422B (zh) * | 2014-04-15 | 2016-06-29 | 天津大学 | 枯草芽孢杆菌编码PRPP转酰胺酶突变基因purF及应用 |
| CN103952419A (zh) * | 2014-04-15 | 2014-07-30 | 天津大学 | 枯草芽孢杆菌腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA及应用 |
| CN103952422A (zh) * | 2014-04-15 | 2014-07-30 | 天津大学 | 枯草芽孢杆菌编码PRPP转酰胺酶突变基因purF及应用 |
| CN103952419B (zh) * | 2014-04-15 | 2016-06-29 | 天津大学 | 枯草芽孢杆菌腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA及应用 |
| CN104531745A (zh) * | 2014-12-09 | 2015-04-22 | 江南大学 | 一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用 |
| CN104531745B (zh) * | 2014-12-09 | 2018-05-04 | 江南大学 | 一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用 |
| CN105483071A (zh) * | 2015-12-29 | 2016-04-13 | 天津大学 | 一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建及发酵方法 |
| CN105483071B (zh) * | 2015-12-29 | 2018-11-09 | 天津大学 | 一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建及发酵方法 |
| CN108913747A (zh) * | 2018-07-28 | 2018-11-30 | 广济药业（孟州）有限公司 | 一种高密度发酵维生素b2的方法 |
| CN110591990A (zh) * | 2019-07-05 | 2019-12-20 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一株高产核黄素工程菌株及其应用 |
| CN110591990B (zh) * | 2019-07-05 | 2021-09-07 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一株高产核黄素工程菌株及其应用 |
| CN112538453A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-03-23 | 通辽梅花生物科技有限公司 | 一种产核黄素的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 |
| CN112575021A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-03-30 | 通辽梅花生物科技有限公司 | 一种生产核黄素的方法 |
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