CN103013848A

CN103013848A - 一种降解mc-lr的赖氨酸芽孢杆菌原生质体制备与再生的方法

Info

Publication number: CN103013848A
Application number: CN2012103422025A
Authority: CN
Inventors: 张文艺; 陈雪珍; 李仁霞; 李秋艳
Original assignee: Changzhou University
Current assignee: Anhui Shuiyun Environmental Protection Co ltd
Priority date: 2012-09-17
Filing date: 2012-09-17
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2032-09-17
Also published as: CN103013848B

Abstract

本发明一种降解MC-LR的赖氨酸芽孢杆菌原生质体制备与再生的方法，涉及生物工程中原生质体制备与再生的方法技术领域。本方法以原生质体融合技术构建工程菌为基础，从已分离的MC-LR高效降解菌T1（Bacillussphaericus）的原生质体制备。本研究选用灭活原生质体融合法，既减少了工作量，又保证了后续研究中融合子的质量。采用本发明的原生质体制备与再生方法，工艺简单，便于操作，可重复性强；所获得的原生质体制备率最高可达96.64%，且再生率可达83.95%，原生质体制备率高且原生质体活性保持较好，有利于后续融合子的制备与再生。

Description

一种降解MC-LR的赖氨酸芽孢杆菌原生质体制备与再生的方法

技术领域

本发明涉及生物工程中原生质体制备与再生的方法技术领域，尤其是降解MC-LR的赖氨酸芽孢杆菌原生质体的制备与再生。

背景技术

近年来，随着水体富营养化程度的加剧，夏秋季节蓝藻大面积快速繁殖，蓝藻水华频繁暴发，大量的蓝藻覆盖在水体表面，严重阻碍了水体的流动，水体的自净能力降低，复氧率减小，透明度下降，水质恶臭，水体内的鱼、虾等浮游生物因生活环境发生恶化而死亡。目前控制蓝藻最常用的依然是传统的机械打捞，然而，毕竟人力、物力有限，仅能打捞小部分的蓝藻，大部分的蓝藻在水体内因腐烂而消失，而蓝藻危害并没有随着其消失而减弱，腐烂的蓝藻细胞破碎后就会向水体释放各种藻类毒素，其中属于蓝藻门的微囊藻在世界蓝藻水华水体中占有相当大的比例，我国的太湖流域就以微囊藻为主，它在繁殖的过程中产生大量的毒性较大的MCs，并储存在细胞内，随着微囊藻的死亡及藻细胞的破碎，MCs被释放到水体中，且以溶解性状态存在，严重威胁流域附近居民的健康。在现有的物理、化学及生物等传统方法达不到理想控制效果的情况下，利用溶藻细菌和MCs降解菌联合处理蓝藻，构建兼具溶藻和MCs降解功能的双效工程菌即成为一个新的研究方向。

原生质体融合重组可使两亲本菌株的优良性状同时表达出来，也可能使隐性基因因重组而暴露表达或随机产生新的基因表达出新的性状，从而成为微生物育种的一种途径。应用原生质体融合技术构建高效降解菌株用以处理污水的研究已经有报道。《食品与生物技术学报》2005年第24卷第2期34-37页报道了廖劲松等以单重抗药性的突变菌株（S27和K215）为亲本菌株，通过原生质体融合获得高效PVA降解菌F-4。《河南科学》2009年第27卷第7期809-812页报道了张琪等利用原生质体融合技术获得兼具两个亲本优良性状的红霉素高产菌株，对提高红霉素产量及化学药价具有较大的应用价值。

微生物溶藻、降解MCs是一个很有效的方法，国内外不少学者已筛选出多种溶藻菌、MCs降解菌，溶藻菌在溶藻过程中，破坏蓝藻细胞，释放出胞内MCs，而在正常蓝藻细胞环境中单独的MCs降解菌只能降解胞外MCs，这就要求溶藻细菌与MCs降解菌联合使用，从而在溶藻的同时降解毒性较大的MCs，真正做到治标且治本。但是多种菌的优化组合来溶藻并降解MCs是一个很复杂的课题。利用原生质体融合技术可能将两株分别具有溶藻、MCs降解能力的细菌构建成兼具两个亲本菌株优良性状的高效降解工程菌。目前，原生质体融合技术在MCs降解工程菌构建上的应用，国内外鲜有报道。

通过分离筛选分别获得溶藻细菌F8、TL，其对铜绿微囊藻FACHB-905均有较好的溶藻效果。然而已发现的溶藻细菌在溶解藻细胞的同时使胞内藻毒素释放到水体中，加剧了蓝藻水华带来的藻毒素污染，其中以MC的危害最为严重。为从根本上解决蓝藻水华带来的MC污染问题，即去除蓝藻的同时降解MC，可从以下两个思路出发：一是制备溶藻细菌、MC降解菌复合菌剂；二是构建兼具溶藻和MC降解功能的转基因工程菌。本方法以原生质体融合技术构建工程菌为基础，主要研究实验室已分离的MC-LR高效降解菌T1（Bacillus sphaericus）的原生质体制备，该菌是本实验室从太湖河浜底泥中筛选出的1株降解MC-LR的球形芽孢杆菌，已申请发明专利，公开号为CN102154170，保藏号为CGMCC NO.4498。鉴于亲本菌株的抗性标记工作量大，天然抗性难以确定，抗性突变亦可能使优良性状发生不定向改变，为确保亲本菌株保持其各自的优良生物学特性，本研究选用灭活原生质体融合法，既减少了工作量，又保证了后续研究中融合子的质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种赖氨酸芽孢杆菌原生质体制备与再生的方法，使得其制备率与再生率都达到较高范围。

本发明所采用的技术方案如下：

一种降解MC-LR的赖氨酸芽孢杆菌的原生质体制备与再生方法，按照下述步骤进行：

（1）菌种活化培养：

将保藏的菌株T1 （Bacillus sphaericus）重新转接至平板划线分离3次，挑取单菌落接种至新鲜的细菌液体培养基中，置于温度为30℃，转速120 r/min的振荡培养箱中纯培养至对数期，约为10⁸-10⁹个/mL；

（2）原生质体的破壁酶解：

取4 mL活化的菌液，4500 r/min离心10 min，收集菌体，经SMM缓冲液洗涤3次，用1.2-1.8mL的SMM缓冲液重悬；加入0.1-1 mg/mL的溶菌酶0.2-0.8mL和2 mL加热至酶解温度的EDTA溶液，在水浴温度35℃条件下酶解0.5-1.5 h；酶解结束后，3000 r/min离心收集原生质体，用0.55 mol/L的NaCl溶液洗涤3次，洗去酶解液后用4 mL 0.55 mol/L NaCl溶液悬浮即可制备得到原生质体；

（3）原生质体的再生：

取上述步骤的原生质体悬浮液，用高渗NaCl溶液稀释到合适的三个梯度，分别吸取200 μl涂布于高渗固体培养基，每个梯度做三个平行，置于30℃恒温培养箱培养48 h，使得原生质体再生。

其中所述的菌株T1 （Bacillus sphaericus）是从太湖河浜底泥中筛选出的1株降解MC-LR的球形芽孢杆菌，保藏号为CGMCC NO.4498。其保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC4498，建议的分类命名为：芽孢杆菌 Bacillus sp.。

其中步骤（1）中所述的菌种活化培养用的培养基组成如下：（1）细菌培养基：牛肉膏3 g；蛋白胨10 g；NaCl 5 g；蒸馏水1000 mL；pH 7.0-7.2；若为固体培养基则添加琼脂粉2.4%；上述培养基根据要求在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌20 min。

其中步骤（3）中所述的原生质体的再生用的高渗液体培养基组成如下：蛋白胨 10 g，酵母浸出汁 5 g，牛肉膏 5 g，蔗糖 170 g（0.5 mol/L），蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.2；若为高渗固体培养基则加入琼脂粉20-24 g；上述培养基根据要求在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌20 min。

其中所述的溶液配制如下：（1）高渗NaCl溶液：NaCl 0.55 mol/L。（2）SMM缓冲液：蔗糖 0.55 mol/L，顺丁希二酸 20 mmol/L，MgCl₂·6H₂O 20 mmol/L，pH 6.8。（3）EDTA溶液：EDTA 0.8 g/L，SMM缓冲液配制。（4）溶菌酶：0.1 mg/mL，SMM缓冲液配制。上述溶液根据要求在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌20 min。

上述原生质体制备与再生方法优选：加入溶菌酶使得体系中酶浓度为0.05 mg/ mL，在温度为30℃时酶解1h，该赖氨酸芽孢杆菌原生质体制备率与再生率最佳，有利于后续融合子的制备与再生。

本发明的有益效果：

采用本发明的原生质体制备与再生方法，工艺简单，便于操作，可重复性强；所获得的原生质体制备率最高可达96.64%，且再生率可达83.95%，原生质体制备率高且原生质体活性保持较好，有利于后续融合子的制备与再生。

具体实施方式

一种降解MC-LR的赖氨酸芽孢杆菌原生质体制备与再生的方法提供了适合该菌原生质体制备及高效再生的方法。

以下提供本发明利用上述方法的5个实施例：

实施例1

将保藏的菌株T1重新转接至平板划线分离3次，挑取单菌落接种至新鲜的细菌液体培养基中，置于温度为30℃，转速120 r/min的振荡培养箱中纯培养至对数期，约为10⁸-10⁹个/mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min离心10 min，收集菌体，经SMM缓冲液洗涤3次，用1.2mL的SMM缓冲液重悬；加入0.1 mg/mL的溶菌酶0.8mL和2 mL加热至酶解温度的EDTA溶液，在水浴温度35℃条件下酶解1 h；酶解结束后，3000 r/min离心收集原生质体，用0.55 mol/L的NaCl溶液洗涤3次，洗去酶解液后用4 mL 0.55 mol/L NaCl溶液悬浮备用，该过程所获得的原生质体制备率为94.64%，再生率为79.87%。

其中原生质体制备率测定方法如下：

将溶菌酶处理前的细胞和酶解后的原生质体悬液均用无菌蒸馏水稀释，放置约10 min，使原生质体吸水胀破，分别吸取100 μl涂布在细菌固体平板培养基上，每个梯度做三个平行，于30℃恒温培养箱中倒置培养48 h，分别计菌落数A和B，根据下述公式计算原生质体制备率，以检验制备效果。

其中A为总菌落数，即未经溶菌酶处理的菌液涂布于细菌平板上生长的菌落数；B为未原生质体化的细菌菌落数，即原生质体悬液经无菌蒸馏水稀释后涂布于细菌平板上生长的菌落数。

其中原生质体的再生率的计算方法如下：

取上述步骤的原生质体悬浮液，用高渗NaCl溶液稀释到合适的三个梯度，分别吸取200 μl涂布于高渗固体培养基，每个梯度做三个平行，置于30℃恒温培养箱培养48 h，计再生菌落数C，根据下述公式计算原生质体再生率，以检验再生效果。

其中A为总菌落数，即未经溶菌酶处理的菌液涂布于细菌平板上生长的菌落数；B为未原生质体化的细菌菌落数，即原生质体悬液经无菌蒸馏水稀释后涂布于细菌平板上生长的菌落数；C为再生菌落数，即原生质体悬液，经高渗NaCl溶液稀释后在高渗平板上长出来的菌落数。

实施例2

将保藏的菌株T1重新转接至平板划线分离3次，挑取单菌落接种至新鲜的细菌液体培养基中，置于温度为30℃，转速120 r/min的振荡培养箱中纯培养至对数期，约为10⁸-10⁹个/mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min离心10 min，收集菌体，经SMM缓冲液洗涤3次，用1.8mL的SMM缓冲液重悬；加入1 mg/mL的溶菌酶0.2mL和2 mL加热至酶解温度的EDTA溶液，在水浴温度35℃条件下酶解1 h；酶解结束后，3000 r/min离心收集原生质体，用0.55 mol/L的NaCl溶液洗涤3次，洗去酶解液后用4 mL 0.55 mol/L NaCl溶液悬浮备用，该过程所获得的原生质体制备率为96.43%，再生率为83.95%。

实施例3

将保藏的菌株T1重新转接至平板划线分离3次，挑取单菌落接种至新鲜的细菌液体培养基中，置于温度为30℃，转速120 r/min的振荡培养箱中纯培养至对数期，约为10⁸-10⁹个/mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min离心10 min，收集菌体，经SMM缓冲液洗涤3次，用1.6mL的SMM缓冲液重悬；加入1 mg/mL的溶菌酶0.4mL和2 mL加热至酶解温度的EDTA溶液，在水浴温度35℃条件下酶解1 h；酶解结束后，3000 r/min离心收集原生质体，用0.55 mol/L的NaCl溶液洗涤3次，洗去酶解液后用4 mL 0.55 mol/L NaCl溶液悬浮备用，该过程所获得的原生质体制备率为97.38%，再生率为79.22%。

实施例4

将保藏的菌株T1重新转接至平板划线分离3次，挑取单菌落接种至新鲜的细菌液体培养基中，置于温度为30℃，转速120 r/min的振荡培养箱中纯培养至对数期，约为10⁸-10⁹个/mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min离心10 min，收集菌体，经SMM缓冲液洗涤3次，用1.8mL的SMM缓冲液重悬；加入1 mg/mL的溶菌酶0.2mL和2 mL加热至酶解温度的EDTA溶液，在水浴温度35℃条件下酶解0.5 h；酶解结束后，3000 r/min离心收集原生质体，用0.55 mol/L的NaCl溶液洗涤3次，洗去酶解液后用4 mL 0.55 mol/L NaCl溶液悬浮备用，该过程所获得的原生质体制备率为89.53%，再生率49.43%。

实施例5

将保藏的菌株T1重新转接至平板划线分离3次，挑取单菌落接种至新鲜的细菌液体培养基中，置于温度为30℃，转速120 r/min的振荡培养箱中纯培养至对数期，约为10⁸-10⁹个/mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min离心10 min，收集菌体，经SMM缓冲液洗涤3次，用1.8mL的SMM缓冲液重悬；加入1 mg/mL的溶菌酶0.2mL和2 mL加热至酶解温度的EDTA溶液，在水浴温度35℃条件下酶解1.5 h；酶解结束后，3000 r/min离心收集原生质体，用0.55 mol/L的NaCl溶液洗涤3次，洗去酶解液后用4 mL 0.55 mol/L NaCl溶液悬浮备用，该过程所获得的原生质体制备率为96.22%，再生率19.24%。

Claims

1.一种降解MC-LR的赖氨酸芽孢杆菌的原生质体制备与再生方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）菌种活化培养：

将保藏的菌株T1 （Bacillus sphaericus）重新转接至平板划线分离3次，挑取单菌落接种至新鲜的细菌液体培养基中，置于温度为30℃，转速120 r/min的振荡培养箱中纯培养至对数期，为10⁸-10⁹个/mL；

（2）原生质体的破壁酶解：

（3）原生质体的再生：

2.根据权利要求1所述的一种降解MC-LR的赖氨酸芽孢杆菌的原生质体制备与再生方法，其特征在于其中所述的菌株T1（Bacillus sphaericus），保藏号为CGMCC NO.4498。

3.根据权利要求1所述的一种降解MC-LR的赖氨酸芽孢杆菌的原生质体制备与再生方法，其特征在于其中步骤（1）中所述的菌种活化培养用的培养基组成如下：（1）细菌培养基：牛肉膏3 g；蛋白胨10 g；NaCl 5 g；蒸馏水1000 mL；pH 7.0-7.2；若为固体培养基则添加琼脂粉2.4%；上述培养基根据要求在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌20 min。

4.根据权利要求1所述的一种降解MC-LR的赖氨酸芽孢杆菌的原生质体制备与再生方法，其特征在于其中步骤（3）中所述的原生质体的再生用的高渗液体培养基组成如下：蛋白胨 10 g，酵母浸出汁 5 g，牛肉膏 5 g，蔗糖 170 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.2；若为高渗固体培养基则加入琼脂粉20-24 g；上述培养基根据要求在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌20 min。

5.根据权利要求1所述的一种降解MC-LR的赖氨酸芽孢杆菌的原生质体制备与再生方法，其特征在于其中所述的溶液配制如下：（1）高渗NaCl溶液：NaCl 0.55 mol/L;（2）SMM缓冲液：蔗糖 0.55 mol/L，顺丁希二酸 20 mmol/L，MgCl₂·6H₂O 20 mmol/L，pH 6.8;（3）EDTA溶液：EDTA 0.8 g/L，SMM缓冲液配制;（4）溶菌酶：0.1-1 mg/mL，SMM缓冲液配制;上述溶液根据要求在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌20 min。