CN107739722A - 一种从太湖激浪鱼内脏中筛选藻毒素降解菌的方法 - Google Patents

Abstract

一种从太湖激浪鱼内脏中筛选藻毒素降解菌的方法，属于MC‑LR降解的微生物学领域。针对有害藻类暴发，水体中藻毒素污染严重问题，以从太湖水体中的蓝藻干藻粉中提取的MC‑LR为唯一碳源、氮源，从太湖激浪鱼内脏中筛选出1株降解MC‑LR能力较高菌株JZ‑4，杀鲑气单胞菌亚种(Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida)，7d降解率达89.72％。考察了不同pH条件及不同MC‑LR添加量对菌株降解MC‑LR的影响。本发明提供了1种新的降解藻毒素的菌种并考察最适降解MC‑LR条件，为生物法处理水体微囊藻藻毒素提供了理论及应用参考。

Description

一种从太湖激浪鱼内脏中筛选藻毒素降解菌的方法

技术领域

本发明属于藻毒素降解的微生物学领域，涉及一种从太湖激浪鱼内脏中筛选藻毒素降解菌的方法。

背景技术

随着经济的发展与社会的进步，大量N、P物质进入水体中，致使水体富营养化越来越严重，有害藻华(HAB)频繁暴发，给水环境带来极大威胁。一方面会导致水体溶解氧的下降从而严重制约了水体生物的生长；另一方面蓝藻细胞会释放出藻毒素到水体中，其中微囊藻毒素(简称MCs)是危害最大的藻毒素。据报道MCs有80多个变体，其中分布最广、毒性最大的是MC-LR，是目前治理的重点。MCs是稳固的环状结构，在300℃高温下还能维持很长时间不分解，传统的水处理方法很难将其除去，一般的多肽分解酶也难以分解。

目前国内外MCs的降解方法有物理方法、化学方法、生物方法三类。物理方法包括：混凝沉淀及过滤、活性炭吸附、膜技术等。沉淀过滤等常规的处理工艺对MCs仅有很微小的去除效果；活性炭能够有效的去除MCs，但在常规的水处理工艺受吸附竞争的影响，其性能会降低；膜技术处理MCs去除效果好，但其成本太高，难以大规模推广。化学法包括：高锰酸钾、臭氧等氧化剂氧化、光降解光催化等。利用化学法处理藻毒素能源消耗大，且易产生二次污染。生物法包括人工湿地、水生生物、生物膜、微生物降解等。生物法主要是通过微生物降解MCs。自然界中一些微生物能够分泌出特殊的酶，能够降解藻毒素，利用微生物降解藻毒素成本低、安全性强、无二次污染和利于生态修复等优点。

目前许多学者对细菌藻毒素的降解菌的研究已有诸多报道。《环境科学学报》2017年第 37卷第1期201-206页报道了从太湖水华腐烂蓝藻中筛选出1株MC-LR降解细菌缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)，7d后该菌能把初始浓度为0.96mg L^-1的MC-LR降解为0.37 mg L^-1，降解率达61.5％。《环境科学》2014年35卷第1期313-318页报道了从巢湖沉积物中筛选出1株MC高效降解菌CH菌(Paucibacter sp)，10h内可将11.6μg mL^-1的MC-LR 降解至检测限以下。

太湖蓝藻爆发频繁，大面积水华后，水体中富集了大量的MCs，MCs是肝毒素其靶细胞是肝脏，具有较高的细胞选择性和专一生物活性，长期生活在水中的鱼的内脏可能存在具有降解MCs的菌种。因此，本文从太湖激浪鱼内脏中筛选出具有降解MC-LR能力的菌株。

发明内容

本发明的目的：以太湖激浪鱼内脏为原料，从中筛选分离出能够高效降解MC-LR的菌株，并提供利用筛出来的菌进行降解MC-LR的方法。

本发明所采用的的技术方案如下：一种从太湖激浪鱼内脏中筛选出的MC-LR降解菌 JZ-4，杀鲑气单胞菌亚种(Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida)，现保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心(CGMCC)，保藏时间为：2017年4月20日，保藏编号：CGMCC No.14051。

利用上述菌种降解MC-LR的方法，按照下述步骤进行：

(1)菌株的活化：将上述菌株从斜板上接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、150r min^-1恒温振荡培养3d；

(2)菌株降解过程：取上述菌液接种到20mL仅添加MC-LR做底物的M9液体培养基中， pH为7-7.4，接种量3％，30℃、150r min^-1恒温振荡培养3d，既能够高效的降解MC-LR。

本发明所用的牛肉膏蛋白胨液体培养基组为：牛肉膏3g；蛋白胨10g；氯化钠5g，加水到1000mL，充分溶解，用1mol L^-1的NaOH和HCl调节溶液pH值至7.0，121℃灭菌20 min。

本发明所用的M9液体培养基组为：Na₂PO₄·7H₂O 12g；KH₂PO₄ 3g；NaCl 0.5g；NH₄Cl1g，加水到1000mL，充分溶解，用1mol L^-1的NaOH和HCl调节溶液pH值至7.0，121℃灭菌20min。

本发明的有益效果：

(1)本发明用作底物的MC-LR提取自太湖干蓝藻研磨的藻粉，提取成本较低，方法简单可行。

(2)本发明以太湖激浪鱼内脏中分离筛选出一株具有高效降解MC-LR的菌株，杀鲑气单胞菌亚种(Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida)，接种3％此菌株到pH为7-7.4，添加MC-LR做底物(初始浓度为13.98μg L^-1)的M9培养基中培养，7d后MC-LR的去除率达到89.72％，降解效果显著。本发明提供了1种新的降解藻毒素的菌种，为生物法处理水体微囊藻藻毒素提供理论参考。

(3)本发明考察了不同pH条件及不同MC-LR添加量下，降解菌JZ-4对菌株降解MC-LR 的影响，为利用菌株处理水体微囊藻藻毒素应用参考。

具体实施方案

MC-LR提取方法：

从太湖干蓝藻中提取高藻毒素，提取比例：1g藻粉：50mL 60％甲醇溶液具体步骤：(1) 搅拌：对混合溶液进行磁力搅拌2h(1600r min^-1)，使其充分溶解；(2)细胞破碎：对混合溶液进行超声波细胞破碎60min，静止20min，取上清液；(3)离心：使用离心机离心 15min(10000r min^-1)；(4)调pH去除蛋白：收集离心后上清液，用稀硫酸调节pH值为 4，静止12h；(5)过滤：通过0.45μm滤膜过滤；(6)调pH至中性：收集滤液，用稀氨水(5％)调节pH值至7左右；(7)旋转蒸发：滤液60℃旋转蒸发去甲醇；(8)固相萃取：稀释后的粗提液流经固相萃取柱进行富集浓缩，并用甲醇梯度洗脱；(9)氮气吹干：利用氮气吹干仪吹干洗脱液中的残留液体；(10)灭菌保存：用甲醇相或水相重新溶解，高温消毒灭菌20min(1×10⁵Pa)，-20℃保存作为MCs储备液。

菌株的分离与筛选：

(1)称取3g已研磨的鱼内脏加入27mL蒸馏水中，30℃恒温振荡6h(134r min^-1)；静置2h后用移液枪(枪头灭菌)吸取1mL上层清液，按照倍比稀释法，依次制备10^-2、 10^-3......10^-8稀释液；后用移液枪吸取0.1mL稀释液进行涂布，稀释涂布的培养基采用M9培养基(添加MC-LR做底物)，30℃恒温培养3d，挑取优势菌落进行划线纯化。将纯化的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面上，30℃恒温培养3d，4℃保存，每月继代一次。

(2)将分离出来的菌株分别接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃恒温振荡培养(150 r min^-1)；3d后，取菌液接种于20mL添加MC-LR做底物的M9液体培养基中，接种量为3％，30℃恒温振荡培养(150r min^-1)，设置3组重复。同时做空白对照实验，空白对照中加3％的无菌水。3d后测菌液中MC-LR的含量。

(3)经过反复的平板划线及MC-LR去除效率的检验，最终得到1株高效的MC-LR降解菌。

形态观察、生理生化实验及DNA鉴定：

(1)将挑选出来的优势菌株分离纯化，并进行革兰氏染色、显微镜观察及电镜观察。经形态观察，菌株培养2d后，菌株JZ-4，菌落形状为圆形，直径大约1-2mm，颜色为粉白色，表面光滑，微微凸起，边缘光滑，生长快速。电镜观察显示，菌株呈杆状；革兰氏染色结果表明其为阴性菌。

(2)根据《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，2001)中的鉴定项目和鉴定方法进行实验。生理生化特征如下：

注:“+”表示阳性，“—”表示阴性。

(3)上述筛选到的菌株经鉴定为杀鲑气单胞菌亚种(Aeromonas salmonicidasubsp.salmonicida)。

利用上述菌株降解MC-LR的具体实施例如下：

实施例1

将菌液接种于装有20mL添加MC-LR作底物的M9的液体培养基的锥形瓶中，pH为7-7.4 接种量为3％，30℃，150r min^-1恒温振荡培养，每隔24h取样，采用酶联免疫法测定MC-LR 含量，考察菌株7d的降解效果。降解结果显示：7d内菌株能把初始浓度为13.98μg L^-1的MC-LR降解到1.43μg L^-1，降解率为89.72％，降解效果显著。

实施例2

将菌液接种于装有20mL添加MC-LR作底物的M9的液体培养基的锥形瓶中，接种量为3％，pH为5.5、7.0、8.5，30℃，150r min^-1恒温振荡培养，5d后采用酶联免疫法测定 MC-LR含量。降解结果显示：pH为5.5、7.0、8.5时，5d能把初始浓度为13.98μg L^-1的MC-LR 降解到9.25μg L^-1、6.24μg L^-1、7.34μg L^-1，降解率分别为33.8％、55.36％、47.50％，pH为 7.0时降解效果最好。

实施例3

将菌液接种于装有20mL添加MC-LR作底物的M9的液体培养基的锥形瓶中，pH为 7-7.4，接种量为3％，考察MC-LR添加量5μg L^-1、10μg L^-1、20μg L^-1、30μg L^-1，30℃， 150rmin^-1恒温振荡培养，5d后采用酶联免疫法测定MC-LR含量。降解结果显示：5d后，混合液中剩余MC-LR的含量为0.21μg L^-1、1.56μg L^-1、5.67μg L^-1、13.21μg L^-1，降解率分别为95.8％、84.40％、71.65％、55.97％，可见MC-LR添加量20μg L^-1以下时降解效率较高。

Claims (5)

1.一种通过添加提取的藻毒素做底物从太湖激浪鱼内脏分离筛选出来的MC-LR降解菌JZ-4，杀鲑气单胞菌亚种(Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida)，保藏编号：CGMCCNo.14051。

2.权利要求1所述的一种从太湖干蓝藻中提取高藻毒素MC-LR的方法，按照下述步骤进行：

①搅拌：对提取比例为100g藻粉：100mL 60％甲醇溶液的混合液进行磁力搅拌2h(160rmin^-1)，使其充分溶解；

②细胞破碎：对混合溶液进行超声波细胞破碎60min，静止20min，取上清液；

③离心：使用离心机离心15min(10000r min^-1)；

④调pH去除蛋白：收集离心后上清液，用稀硫酸调节pH值为4，静止12h；

⑤过滤：通过0.45μm滤膜过滤；

⑥调pH至中性：收集滤液，用稀氨水(5％)调节pH值至7左右；

⑦旋转蒸发：滤液60℃旋转蒸发去甲醇；

⑧固相萃取：稀释后的粗提液流经固相萃取柱进行富集浓缩，并用甲醇梯度洗脱；

⑨氮气吹干：利用氮气吹干仪吹干洗脱液中的残留液体；

⑩灭菌保存：用甲醇相或水相重新溶解，高温消毒灭菌20min(1×10⁵Pa)，-20℃保存作为MCs储备液。

3.权利要求1所述的一种MC-LR降解菌的分离方法，按照下述步骤进行：

①MC-LR降解菌初筛培养基组为牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g；蛋白胨10g；氯化钠5g，加水到1000mL，充分溶解，用1mol/L的NaOH和HCl调节溶液pH值到7.0，121℃灭菌20min，牛肉膏蛋白胨固体培养基则在此基础上加1％-2％的琼脂粉。

②MC-LR降解菌复筛培养基组M9培养基：Na₂PO₄·7H₂O 12g；KH₂PO₄ 3g；NaCl 0.5g；NH₄Cl 1g，加水到1000mL，充分溶解，用1mol L^-1的NaOH和HCl调节溶液pH值到7.0，121℃灭菌20min。

③称取3g已研磨的太湖激浪鱼内脏加入27mL蒸馏水中，30℃恒温振荡6h(134r min^-1)使得鱼内脏与水完全混合。

③取1mL上层清液，按照倍比稀释法，依次制备10^-2、10^-3…...10^-8稀释液；后用移液枪吸取0.1mL稀释液进行涂布，稀释涂布的培养基采用M9培养基(添加MC-LR做底物)，30℃恒温培养3d，挑取优势菌落进行划线纯化。将纯化的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面上，30℃恒温培养3d，4℃保存，每月继代一次。

④将分离出来的菌株分别接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃恒温振荡培养(150rmin^-1)。

⑤3d后，取菌液接种于20mL添加MC-LR做底物的M9液体培养基中，接种量为3％，30℃恒温振荡培养(150r min^-1)，设置3组重复，同时做空白对照实验，空白对照中加3％的无菌水，3d后测菌液中MC-LR的含量。

⑥经过反复的平板划线及MC-LR去除效率的检验，最终得到1株高效的MC-LR降解菌。

4.根据权利要求书1所述的藻毒素降解方法，其特征在于按照下述步骤进行：

将菌液接种于装有20mL添加MC-LR作底物的M9的液体培养基的锥形瓶中，接种量为3％，30℃，150r min^-1恒温振荡培养，每隔24h取样，采用酶联免疫法测定MC-LR含量，考察降解能力。

5.根据权利要求书1所述的藻毒素降解方法，其特征在于：

考察不同pH(5.5、7.0、8.5)及不同MC-LR添加量(5μg L^-1、10μg L^-1、20μg L^-1、30μg L^-1)时的，对菌株降解MC-LR降解效果的影响，最终得到最佳降解条件。