CN110643553B - 一株能够高效去除水体中有机质的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株能够高效去除水体中有机质的菌株及其应用，该菌株的分类命名为索诺拉沙漠芽孢杆菌（Bacillus sonorensis），其对水体中的有机质具有较高的去除能力，并且对水生生物无害，保藏编号为：CGMCC No.18277，保藏日期为2019年7月22日，该菌株可应用在污水处理当中，工作浓度为≥1.0×105CFU/mL，实施温度为15～30℃。该菌株对水体中的有机质具有较高的去除能力，对改善养殖水体水质、生活污水水质等具有重要的应用价值；该菌株无毒，可以放心使用；该菌株可以去除水体中的有机质，操作方便，容易推广。

Description

一株能够高效去除水体中有机质的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一株菌株及其应用，具体涉及一株能够高效去除水体中有机质的菌株及其应用，属于利用微生物处理污水技术领域。
背景技术
近年来，水污染问题一直是我国面临的重要环境问题之一。在我国，不仅生活污水和养殖废水中含有较高浓度的有机质，工业污水中也含有较高浓度的有机质。在污水排放中，有机质含量的重要判定指标是COD。COD 越高，表示污水中有机物污染越严重。如果污水中的有机质没有得到有效处理而排入水体，污染物会被水体底部的污泥吸附而沉积，对水生植物和动物会造成不同程度的毒害作用，人类若食用此类有毒的植物或动物会导致慢性中毒等疾病。因此，污水中有机物的处理问题亟需解决。
目前，有机质的去除方法主要包括：絮凝剂法、电化学法、微电解法、吸附法、氧化剂法和微生物法。其中，微生物法与前五种方法不同，微生物法主要依靠微生物酶氧化或还原有机物分子，破坏有机物分子不饱和键及发色基团，从而达到净化有机废水的目的。由于微生物具有繁殖速度快、适应性强、成本低廉等特点，所以探索利用功能微生物去除有机质的方法具有安全、经济、方便和无二次污染等优点，利用微生物法去除有机质已逐渐成为处理养殖污水、生活废水和工业污水的主要方式。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能够高效去除水体中有机质的菌株及其应用。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一株能够高效去除水体中有机质的菌株，其特征在于，该菌株的分类命名为索诺拉沙漠芽孢杆菌（Bacillus sonorensis），其筛选自海南省红树林区域的水样，对水体中的有机质具有较高的去除能力，并且对水生生物无害，保藏编号为：CGMCC No.18277，保藏日期为2019年7月22日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
前述的能够高效去除水体中有机质的菌株在污水除有机质中的应用，其特征在于，该菌株的工作浓度为≥1.0×105CFU/mL，实施温度为15～30℃。
本发明的有益之处在于：
（1）本发明筛选得到的菌株（保藏编号为CGMCC No.18277）对水体中的有机质具有较高的去除能力，是一株有机质高效去除菌株，其对改善养殖水体水质、生活污水水质、工业污水水质等具有重要的应用价值；
（2）本发明筛选得到的有机质高效去除菌株（保藏编号为CGMCC No.18277）无毒，可以放心使用；
（3）利用本发明筛选得到的有机质高效去除菌株（保藏编号为CGMCC No.18277）去除水体中的有机质操作方便，容易推广。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、筛选分离菌株
选择性液体培养基：
物质名称 用量
牛肉膏 3g
胰蛋白胨 6g
葡萄糖 5g
磷酸氢二钾 0.5g
磷酸二氢钠 0.3g
碳酸氢钠 1g
硫酸镁 0.1g
氯化铵 0.5g
纯水 定容至1L
选择性固体培养基：
物质名称 用量
牛肉膏 3g
胰蛋白胨 6g
葡萄糖 5g
磷酸氢二钾 0.5g
磷酸二氢钠 0.3g
碳酸氢钠 1g
硫酸镁 0.1g
氯化铵 0.5g
琼脂 20g
纯水 定容至1L
菌株筛选自海南省红树林区域的水样，该区域的水样有机质含量较高，其中可能含有能够高效去除有机质的菌株，所以我们从该区域的水样中来筛选菌株，筛选过程具体如下：
将10mL水样接入到100mL选择性液体培养基中，120r/min、30℃恒温振荡培养24h，重复驯化富集3次。将富集培养液梯度稀释，然后涂布于选择性固体培养基上，30℃恒温培养16h。之后从选择性固体培养基上挑取形态有差异的单菌落划线分离至最终菌落形态一致，在这一步我们共挑取了5个菌落形态有差异的单菌落。这5个单菌落纯化后分别接到5个LB培养基中，120r/min、30℃恒温振荡培养16h，然后收集菌体于30%甘油中，并置于-80℃冰箱保存，我们将这5株菌株分别命名为：CSCOD7-16、CSCOD5-3、CSCOD3-2、CSCOD2-4、CSCOD1-1。
二、分析菌株的安全性
用兔血琼脂平板划线法检测上述各菌株的安全性：
（1）若菌落周围有透明圈，则菌株为α溶血（严重），有毒性；
（2）若菌落周围有草绿圈，则菌株为β溶血（轻微），有毒性；
（3）若菌落周围无变化，则菌株为γ溶血（不溶血），安全无毒。
溶血结果如下：
菌株命名 溶血环类型 溶血类型
CSCOD7-16 —— 不溶血
CSCOD5-3 —— 不溶血
CSCOD3-2 —— 不溶血
CSCOD2-4 —— 不溶血
CSCOD1-1 —— 不溶血
由上表可知，这5株菌株均为无毒性菌株，都对水生生物无害，可以应用到污水处理（去除污水中的有机质）当中。
三、检测菌株去除有机质的能力
用微量移液器移取15µl步骤一所得的冻存菌（菌株CSCOD7-16、CSCOD5-3、CSCOD3-2、CSCOD2-4、CSCOD1-1），将它们分别接种于1.5mL液体LB培养基中，120r/min、30℃恒温振荡培养16h，将菌株活化。然后将活化菌株按1:1000的体积比加入到100mL实验室养殖污水（COD含量为400mg/L）中，室温下静置24h。
用重铬酸钾法，结合滴定测定污水中的COD含量，计算出有机质去除率，计算结果如下：
菌株命名 有机质去除率
CSCOD7-16 +++
CSCOD5-3 ++
CSCOD3-2 ++
CSCOD2-4 ++
CSCOD1-1 +
注：+表示有机质的去除能力
由上表可知，菌株CSCOD7-16、CSCOD5-3、CSCOD3-2、CSCOD2-4、CSCOD1-1均能降低水体中的COD含量，对污水中的有机质都具有去除能力，其中，菌株CSCOD7-16能够显著降低水体中的COD含量，对污水中的有机质具有较高的去除能力。
四、鉴定菌株
提取菌株CSCOD7-16、CSCOD5-3、CSCOD3-2、CSCOD2-4和CSCOD1-1的基因组，PCR扩增16S-rRNA基因，用少量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，其余PCR产物送于北京睿博（青岛）有限公司纯化并进行测序，测序结果用Blast软件进行序列分析，并与GenBank中已知的16S-rRNA基因进行最高同源性比对。
引物信息见下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAA
PCR反应体系见下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE004AAAAA
PCR反应程序为：94℃变性3min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸15min。
测序比对结果如下：
菌株命名 Blast结果 中文名称
CSCOD7-16 <i>Bacillus sonorensis</i> 索诺拉沙漠芽孢杆菌
CSCOD5-3 <i>Enterococcus faecium</i> HCD15-1 粪肠球菌HCD15-1
CSCOD3-2 <i>Staphylococcus capitis</i> 头葡萄球菌
CSCOD2-4 <i>Enterococcus faecium</i> ZDHHM1 粪肠球菌ZDHHM1
CSCOD1-1 <i>Brevibacillus laterosporus</i> 侧孢短芽孢杆
五、检测不同浓度的菌株CSCOD7-16的有机质去除能力
将活化菌株CSCOD7-16按照1%的接种量接种到200mL LB培养基中，120r/min、30℃恒温振荡培养16h。将菌液转入离心设备，高速离心收集菌体，以pH=7.4的PBS清洗菌体，并调节菌体浓度到1.0×109 CFU/mL。
将上述菌液进行梯度稀释，得到菌体浓度分别为1.0×104 CFU/mL、1.0×105CFU/mL、1.0×106 CFU/mL、1.0×107 CFU/mL、1.0×108 CFU/mL和1.0×109 CFU/mL的菌液，按照1:100的体积比将上述各浓度梯度的菌液分别加入到200mL实验室养殖污水（COD含量为400mg/L）中，室温下静置24h。
用重铬酸钾法，结合滴定测定污水中的COD含量，计算出有机质去除率，计算结果如下：
混合前菌体浓度（CFU/mL） 有机质去除率
1.0×10<sup>4</sup> ++
1.0×10<sup>5</sup> +++
1.0×10<sup>6</sup> +++
1.0×10<sup>7</sup> ++++
1.0×10<sup>8</sup> +++
1.0×10<sup>9</sup> ++
注：+表示有机质的去除能力
由上表可知，按照1:100的体积比混合菌液和污水，当菌株CSCOD7-16混合前的菌体浓度达到1.0×107CFU/mL时，其即可高效去除水体中的有机质，此时菌株CSCOD7-16的工作浓度为1.0×105CFU/mL。
六、验证菌株CSCOD7-16的有机质去除能力
案例1：取烟台某水产品加工厂排放的废水，测得其COD的含量为146mg/L。将菌株CSCOD7-16按照前述方法制成菌体浓度为1.0×107CFU/mL的菌剂，随后将该菌剂按照1:100的体积比加入到该废水中，24℃静置处理24h后测得该废水的COD的含量为20mg/L，去除有机质效果很好。
案例2：取烟台某水产品加工厂排放的废水，测得其COD的含量为120mg/L。将菌株CSCOD7-16按照前述方法制成菌体浓度为1.0×107CFU/mL的菌剂，随后将该菌剂用原池水（菌剂与原池水的体积比为1：99）添加红糖（每升混合水添加100g红糖）进行扩繁（扩繁的条件：37℃、静置24h），扩繁后将该菌剂按照1:100的体积比加入到该废水中，24℃静置处理24h后测得该废水的COD的含量为18mg/L，去除有机质效果很好。
案例2与案例1相比，施用前用原池水添加红糖进行扩繁，有机质去除效果差不多，但是减少了购买大量制剂的费用，降低了养殖成本。
由此可见，菌株CSCOD7-16确实可以显著降低水体中的COD含量，高效去除水体中的有机质，改善水质，但是处理能力受实施温度的影响，实施温度一般控制在15～30℃比较适宜。
理论上，菌株CSCOD7-16（工作浓度为1.0×105CFU/mL）对养殖废水、城市生活污水等高有机质污染水体亦有稳定的去有机质效果。
八、保藏
由前面的研究可知，本发明筛选得到的菌株CSCOD7-16在工作浓度为1.0×105CFU/mL及以上时，对水体中的有机质具有明显并且稳定的去除效果，相比其他4株菌株更易维持一个稳定良好的水质环境，所以该菌株可以应用到养殖污水、生活污水、工业污水等污水的去有机质处理当中，具有非常重要的应用价值和广泛的应用前景。
我们将筛选得到的对有机质具有较好的去除效果并且对水生生物无毒的菌株CSCOD7-16保藏在了中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏日期为：2019年7月22日，保藏编号为：CGMCC No. 18277。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一株能够高效去除水体中有机质的菌株，其特征在于，该菌株的分类命名为索诺拉沙漠芽孢杆菌（Bacillus sonorensis），其筛选自海南省红树林区域的水样，对水体中的有机质具有较高的去除能力，并且对水生生物无害，保藏编号为：CGMCC No.18277，保藏日期为2019年7月22日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.权利要求1所述的能够高效去除水体中有机质的菌株在污水去除有机质中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该菌株的工作浓度为≥1.0×105CFU/mL。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该菌株的实施温度为15～30℃。
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