CN106754573B - 一种香味菌及其在降解间苯二酚中的应用 - Google Patents

一种香味菌及其在降解间苯二酚中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种香味菌，所述香味菌为香味菌（Myroides sp.）JB‑4，于2017年1月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No.13608。本发明还公开了该香味菌（Myroides sp.）JB‑4在降解间苯二酚中的应用。本发明的香味菌（Myroides sp.）JB‑4用于含间苯二酚的工业废水或自然水体中降解间苯二酚，不仅具有很高的降解速率和耐受浓度，且无二次污染，使用安全，具有广阔的应用前景。

Description

一种香味菌及其在降解间苯二酚中的应用
技术领域
本发明属于环境微生物资源利用及有机污染废水处理领域，具体涉及一种香味菌及其在降解间苯二酚中的应用。
背景技术
间苯二酚（C6H6O2），亦被称为雷锁辛、1,3-苯二酚、间二苯酚，作为一种十分重要的精细化工原料，主要用于橡胶粘合剂、合成树脂、染料、医药、分析试剂等方面。间苯二酚是一种重要的有机化工产品和合成中间体，经加工后可加大帘子线与橡胶之间的粘接作用，改善钢丝对橡胶的粘接性能，广泛用于轮胎制造业、胶管制造业等橡胶制造行业。间苯二酚还是许多偶氮染料、毛皮染料的中间体；间苯二酚具有杀菌作用，可用作化妆品等的防腐剂；间苯二酚还可用于医药行业，主要作为皮肤科非处方药物，如复方人参间苯二酚搽剂等的原料。
酚类有机污染物能够引起蛋白质变性，从而导致细胞失活或者死亡。间苯二酚同样属于对人体和自然环境毒害较大的一类酚类污染物：在培养处理48h后，间苯二酚能显著抑制水生生物多刺裸腹溞体内的谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和乙酰胆碱酯酶（AChE）活力，并且对其半抑制效应浓度仅为10.75mg/L；间苯二酚浓度为27.04 mg/L时即可在24h毒死半数的泥鳅，且这种毒害作用可随着间苯二酚在泥鳅体内积聚浓度的增大、作用时间的增加而显著提高，96h的半致死浓度仅为17.40mg/L。间苯二酚还可随着生物富集和生物链等途径进入陆生动物和人体内，严重影响人类健康：一定浓度的间苯二酚可通过静电作用力与牛血清蛋白结合，继而破坏牛血清蛋白的空间构象并改变某些氨基酸的疏水性；间苯二酚易于被皮肤吸收, 人体吸收少量间苯二酚后可引起皮肤和粘膜的发炎、痉挛、发绀、甚至死亡。间苯二酚具有良好的稳定性，并且易于在动物体内积累、难以生物降解，若没有经过处理的含间苯二酚工业废水直接排放到环境中，势必会危害自然环境和生态安全。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种香味菌，该香味菌以间苯二酚为唯一碳源进行生长繁殖，可有效降解间苯二酚，为有效、安全处理含间苯二酚工业废水提供技术支持和微生物资源。
本发明还提供了该香味菌在降解间苯二酚中的应用。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种香味菌，所述香味菌为香味菌（Myroides sp.）JB-4，于2017年1月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No. 13608。
本发明的香味菌取样自山东省曲阜市某污水沟污泥，该菌株经过分离、纯化、驯化获得，可利用间苯二酚作为其生长的唯一碳源。本发明的香味菌经16 SrDNA鉴定属于香味菌属（Myroides sp.），在National Center for Biotechnology Information（NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov）上经BLAST比对后，与菌株Myroides sp. TF1-11（登录号为KJ127204.1）的同源性可以达到99%。菌落照片和革兰氏染色显微镜照片如图1所示；系统发育树图如图2所示。
所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4单细胞为短杆状，属于革兰氏阴性菌，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上纯培养时，菌落呈乳白略带淡黄色，圆形，表面光滑，有光泽，湿润，不透明，边缘整齐，易挑取。
所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的配方为：蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，121℃灭菌20 min。一种香味菌（Myroides sp.）JB-4在降解间苯二酚中的应用。
所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4降解间苯二酚的具体方法为：将香味菌（Myroides sp.）JB-4悬浮于含间苯二酚的水中，在24-38℃、pH值为5-9的条件下培养42-72h。
所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4的接种量为5%，v/v。
所述的，含间苯二酚的水中间苯二酚的初始浓度不大于700mg/L。
本发明的有益效果：本发明的香味菌（Myroides sp.）JB-4用于含间苯二酚的工业废水或自然水体中降解间苯二酚，不仅具有很高的降解速率和耐受浓度，且无二次污染，使用安全，具有广阔的应用前景。
菌种保藏信息
保藏时间：2017年01月13日，
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，
保藏编号：CGMCC No.13608，
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，
分类命名：香味菌Myroides sp.。
附图说明
图1为本发明香味菌Myroides sp. JB-4的照片；
其中：a为菌落照片，b为革兰氏染色显微镜照片；
图2为本发明香味菌Myroides sp. JB-4的系统发育树图。
具体实施方式
以下为列举的具体实施方式对本发明作进一步说明，但并不因此限制本发明的内容。
本发明所用的牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方为：蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，121℃灭菌20 min。
本发明所用的牛肉膏蛋白胨固体培养基的配方为：蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，121℃灭菌20 min。
本发明所用的无机盐液体培养基的其配方为：K2HPO4•3H2O 4g、NaH2PO4•2H2O 4g、(NH4)2SO4 2g、MgSO4 0.2g、CaCl2 0.01g、MnSO4•H2O 0.01g、FeSO4•7H2O 0.01g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，121℃灭菌20min。
本发明所用的无机盐固体培养基的其配方为：K2HPO4•3H2O 4g、NaH2PO4•2H2O 4g、(NH4)2SO4 2g、MgSO4 0.2g、CaCl2 0.01g、MnSO4•H2O 0.01g、FeSO4•7H2O 0.01g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，121℃灭菌20min。
本发明采用比色法测定水体中间苯二酚的浓度含量。
实施例1
一种香味菌，所述香味菌为香味菌（Myroides sp.）JB-4，于2017年1月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No. 13608。
本发明的香味菌取样自山东省曲阜市某污水沟污泥，该菌株经过分离、纯化、驯化获得，可利用间苯二酚作为其生长的唯一碳源。本发明的香味菌经16 SrDNA鉴定属于香味菌属（Myroides sp.），在National Center for Biotechnology Information（NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov）上经BLAST比对后，与菌株Myroides sp. TF1-11（登录号为KJ127204.1）的同源性可以达到99%。
所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4单细胞为短杆状，属于革兰氏阴性菌，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上纯培养时，菌落呈乳白略带淡黄色，圆形，表面光滑，有光泽，湿润，不透明，边缘整齐，易挑取。
一种香味菌（Myroides sp.）JB-4在降解间苯二酚中的应用。
所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4降解间苯二酚的具体方法为：将香味菌（Myroides sp.）JB-4悬浮于含间苯二酚的水中，在24℃、pH值为9的条件下培养42h，间苯二酚的降解率为29.12%。
所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4的接种量为5%，v/v。
所述的，含间苯二酚的水中间苯二酚的初始浓度为600mg/L。
实施例2
一种香味菌，所述香味菌为香味菌（Myroides sp.）JB-4，于2017年1月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No. 13608。
本发明的香味菌取样自山东省曲阜市某污水沟污泥，该菌株经过分离、纯化、驯化获得，可利用间苯二酚作为其生长的唯一碳源。本发明的香味菌经16 SrDNA鉴定属于香味菌属（Myroides sp.），在National Center for Biotechnology Information（NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov）上经BLAST比对后，与菌株Myroides sp. TF1-11（登录号为KJ127204.1）的同源性可以达到99%。
所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4单细胞为短杆状，属于革兰氏阴性菌，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上纯培养时，菌落呈乳白略带淡黄色，圆形，表面光滑，有光泽，湿润，不透明，边缘整齐，易挑取。
一种香味菌（Myroides sp.）JB-4在降解间苯二酚中的应用。
所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4降解间苯二酚的具体方法为：将香味菌（Myroides sp.）JB-4悬浮于含间苯二酚的水中，在28℃、pH值为6的条件下培养72h，间苯二酚的降解率为26.35%。
所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4的接种量为5%，v/v。
所述的，含间苯二酚的水中间苯二酚的初始浓度为700mg/L。
在本实施例条件下，当含间苯二酚的水中间苯二酚的初始浓度分别为300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L时，间苯二酚的降解率分别为：100%、94.58%、30.75%、29.40%、26.35%。
实施例3
一种香味菌，所述香味菌为香味菌（Myroides sp.）JB-4，于2017年1月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No. 13608。
本发明的香味菌取样自山东省曲阜市某污水沟污泥，该菌株经过分离、纯化、驯化获得，可利用间苯二酚作为其生长的唯一碳源。本发明的香味菌经16 SrDNA鉴定属于香味菌属（Myroides sp.），在National Center for Biotechnology Information（NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov）上经BLAST比对后，与菌株Myroides sp. TF1-11（登录号为KJ127204.1）的同源性可以达到99%。
所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4单细胞为短杆状，属于革兰氏阴性菌，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上纯培养时，菌落呈乳白略带淡黄色，圆形，表面光滑，有光泽，湿润，不透明，边缘整齐，易挑取。
一种香味菌（Myroides sp.）JB-4在降解间苯二酚中的应用。
所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4降解间苯二酚的具体方法为：将香味菌（Myroides sp.）JB-4悬浮于含间苯二酚的水中，在38℃、pH值为5的条件下培养60h，间苯二酚的降解率为30.35%。
所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4的接种量为5%，v/v。
所述的，含间苯二酚的水中间苯二酚的初始浓度为500mg/L。
香味菌（Myroides sp.）JB-4的初筛、复筛和驯化
香味菌（Myroides sp.）JB-4是从山东省曲阜市某污水沟污泥取样，经初筛和复筛得到的一株革兰氏阴性菌，具体步骤如下：
一、初筛
（1）富集培养：样品取自山东省济宁市曲阜市某污水沟污泥，称取该污泥5g接种于45ml牛肉膏蛋白胨液体培养基（内含数粒小玻璃珠，为使污泥更充分分散至培养基中）中，于30℃、150 r/min摇床中富集培养24h，获得富集菌液；
（2）分离纯化：在无菌环境下，用移液枪取富集菌液0.5ml加入到4.5ml无菌水中，充分混匀，制备成10-1的菌液；再吸取该稀释菌液0.5ml加入到4.5ml无菌水中，充分混匀，制备成10-2的菌液；同样的方法依次制备成梯度为10-3、10-4、10-5、10-6的菌液；分别取稀释梯度为10-4、10-5、10-6的菌液200μl，涂布于间苯二酚浓度为100mg/L的筛选培养基-无机盐固体培养基上，先将制得的平板正置于30℃培养箱中30min，后倒置于30℃培养箱培养48h；挑取平板上形态、大小不同的单菌落划线于纯化培养基-牛肉膏蛋白胨固体培养基，倒置于30℃培养箱中培养24h；多次重复上一步骤，直至获得纯菌落，接种于斜面培养基-牛肉膏蛋白胨固体培养基，于4℃冰箱中保存待用。
二、复筛
（1）菌株活化：在无菌环境下，分别挑取初筛步骤（2）获得的纯菌落一环，接种于活化培养基-牛肉膏蛋白胨固体培养基，倒置于30℃培养箱培养24h，得活化菌株；
（2）种子培养：在无菌环境下，将活化菌株以5%（V/V）接种量接种于种子培养基-牛肉膏蛋白胨固体培养基，于30℃、150 r/min摇床培养24h，得种子液；
（3）发酵降解：将种子液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为100mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床培养72h，得发酵液；
（4）离心：将发酵液用12000 r/min离心10 min，获得上清液；
（5）间苯二酚浓度检测：采用比色法分别测定上清液中的间苯二酚的浓度含量，获得高效降解间苯二酚的香味菌（Myroides sp.）JB-4。
三、驯化
（1）菌株活化：在无菌条件下，挑取复筛步骤获得的香味菌（Myroides sp.）JB-4纯菌落一环，接种于5ml活化培养基-牛肉膏蛋白胨液体培养基，置于30℃、150 r/min摇床震荡培养24h，得活化种子液；
（2）将活化种子液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为100mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床培养72h，得驯化菌液；取驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用比色法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（3）将步骤（2）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为200mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用比色法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（4）将步骤（3）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为300mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用比色法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（5）将步骤（4）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为400mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用比色法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（6）将步骤（5）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为500mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用比色法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（7）将步骤（6）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为600mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床中培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用比色法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（8）将步骤（7）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为700mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床中培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用比色法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（9）将步骤（8）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为800mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床中培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用比色法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（10）将步骤（9）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为900mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床中培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用比色法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（11）经驯化后发现间苯二酚降解菌香味菌（Myroides sp.）JB-4能有效降解初始浓度不大于700mg/L的间苯二酚。

Claims (4)

1.一种香味菌，其特征在于，所述香味菌为香味菌（Myroides sp.）JB-4，于2017年1月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No. 13608。
2.根据权利要求1所述的香味菌，其特征在于，所述香味菌（Myroides sp.）JB-4单细胞为短杆状，属于革兰氏阴性菌，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上纯培养时，菌落呈乳白略带淡黄色，圆形，表面光滑，有光泽，湿润，不透明，边缘整齐，易挑取。
3.一种权利要求1或2所述的香味菌在降解间苯二酚中的应用，其特征在于，所述香味菌（Myroides sp.）JB-4在降解间苯二酚中的应用；
所述香味菌（Myroides sp.）JB-4降解间苯二酚的具体方法为：将香味菌（Myroidessp.）JB-4悬浮于含间苯二酚的水中，在24-38℃、pH值为5-9的条件下培养42-72h；
所述含间苯二酚的水中间苯二酚的初始浓度不大于700mg/L。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述香味菌（Myroides sp.）JB-4的接种量为5%，v/v。
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