CN108823122B - 一株2,4-二氯苯酚降解菌及降解方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株2,4‑二氯苯酚降解菌及降解方法，属于农药降解的微生物学领域。针对我国废弃的农药厂及农田中残留着大量的农药污染等问题，从农药化工厂土壤中筛选出1株降解2,4‑二氯苯酚(2,4‑DCP)能力较高菌株HD‑1，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏编号：CGMCC NO.15123，保藏时间：2017年12月26日；建议的分类名为摩式假单胞菌属(Pseudomonas mosselii)；10d降解率达59.65％，并考察了不同浓度污染土壤条件下菌株对2,4‑DCP降解效果，为生物法降解土壤中2,4‑DCP提供理论依据及应用参考。

Description

一株2,4-二氯苯酚降解菌及降解方法
技术领域
本发明属于农药降解的微生物学领域，具体涉及一株2,4-二氯苯酚降解菌及降解土壤中 2,4-二氯苯酚的方法。
背景技术
2,4-二氯苯酚(英文名2,4-Dichlorophenol，简称2,4-DCP)长期用作合成杀虫剂和除草剂，容易通过食物链在生物体中富集，中毒严重者，会损伤人体造血系统和神经系统，严重威胁生态系统和人类健康。2008年用于生产酯类除草剂2,4-DCP及其合成物二氯苯氧酸生产总量达到8000t以上，至今为止，我国废弃的农药厂及农田中仍残留大量的2,4-DCP，如不进行修复会对土壤环境及人体健康造成巨大的危害。2,4-DCP已被美国和我国列为环境优先监测的有机污染物之一。
由于2,4-DCP具有很强的毒害作用，运用简单的氧化和水解方法治理2,4-DCP污染往往难以达到良好的处理效果，且成本及运行条件较高。近年来，微生物降解污染物备受国内外学者的广泛关注，自然界中微生物资源丰富，容易通过基因工程技术构建高效的降解菌。因此，本发明从南京某生产农药的废弃化工厂中筛选出一株能够降解2,4-DCP污染物的高效微生物菌种。
发明内容
本发明的主要目的是：
针对目前我国废弃的农药厂及农田中仍残留大量的2,4-DCP，如不进行修复会对土壤环境及人体健康造成巨大的危害。因而，本发明提出一株2,4-二氯苯酚降解菌及降解土壤中2,4- 二氯苯酚的方法。
本发明主要技术方案是：一种从农药化工厂土壤中筛选2,4-DCP降解菌HD-1，摩氏假单胞菌属(Pseudomonas mosselii)，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏编号：CGMCCNO.15123，保藏时间：2017年12月26日；建议的分类名为摩氏假单胞菌属Pseudomonasmosselii。
2,4-二氯苯酚降解菌降解土壤中2,4-二氯苯酚的方法，按照下述步骤进行：
(1)菌株的活化：将上述HD-1菌株从斜板上接种到富集培养基中，30℃、150r·min-1条件下震荡培养2d。
(2)将上述菌液投加到2,4-DCP浓度为20mg/kg的污染土壤中，保持土壤含水率为40％，即可通过微生物的溶解、酶解及细胞吞噬等作用降解土壤中2,4-DCP，10d降解率可达到 53.90％。。
其中所述的富集培养基组成为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5.0g，蒸馏水1L，pH7.0， 121℃、100KPa高温灭菌20min后使用。
本发明的有益效果：
(1)本发明从废弃农药厂土壤中筛选2,4-DCP降解菌，菌种来源广泛，易获取。
(2)本发明筛选的一株具有高效降解2,4-DCP的菌株，摩氏假单胞菌属(Pseudomonas mosselii)。接种到pH为7，温度为35℃，2,4-DCP浓度为20mg/L的外加碳源培养基中，10d 后2,4-DCP去除率达到59.65％，降解效果显著。本发明提供1株新的降解2,4-DCP的菌种，为生物法处理土壤中2,4-DCP提供理论依据。
(3)制备HD-1菌液，投加到2,4-DCP浓度为20mg/kg的土壤中，10d后检测残余浓度为 9.36mg/kg，降解率为53.90％，为利用菌种处理土壤中2,4-DCP提供应用参考。
具体实施方式
(1)降解菌株的富集与驯化培养：取10g某农药厂土壤样品，加入90mL无菌水，于30℃， 150r·min-1条件下震荡培养2h，再以10％接种量转接至新鲜富集培养基中，其中2,4-DCP浓度为5mg/L，至30℃，150r·min-1摇床培养7d，7d后再转接到新鲜富集培养基中，转接3次， 2,4-DCP浓度依次为10mg/L、20mg/L，50mg/L，再将富集培养液接入2,4-DCP浓度为50mg/L 的外加碳源培养基中，驯化两个周期，每个周期7d。
(2)降解菌株的分离纯化：菌株分离采用梯度稀释平板法，取1mL富集菌悬液逐步稀释成10-1～10-9稀释液，分别取0.1mL稀释液用涂布棒均匀接种在2,4-DCP浓度为50mg/L固体平板培养基上，倒扣置于温度为30℃的恒温培养箱中数日，待平板长出单菌落。用接种环挑选出生长旺盛的不同的单菌落，接种到新的固体培养基上3-4d，再挑选出分离后的菌株重复划线转接4-5次，最终得到降解菌株HD-1、HD-2。最后通过降解实验，将降解效果最好的 HD-1菌株转接至斜管中于4℃冰箱中保藏。
上述2,4-DCP降解菌HD-1，摩氏假单胞菌属(Pseudomonas mosselii)，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏编号：CGMCC NO.15123，保藏时间：2017年12月26日；建议的分类名为摩氏假单胞菌属Pseudomonas mosselii。
(3)取适量未灭菌农田土，自然风干，过60目筛，配置一定浓度的2,4-DCP土壤，搅拌均匀后，取500g土壤加入333mL的HD-1菌液，保持含水率为40％，不加菌做空白样，每隔2d取10g通过超声波提取30min，4000r·min-1条件下离心20min，取上清液过0.45μm针孔过滤器，转入试剂瓶通过286nm波长紫外分光光度计检测。
参照《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰细菌鉴定手册(第八版)》鉴定方法进行实验，HD-1 菌株生理生化结果如下表所示：
Figure RE-GDA0001803146980000031
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性
以下提供3个实施例进一步说明本发明。实施例用于说明本发明内容，而不是限定本发明内容。
实施例1
取适量未灭菌农田土，自然风干，过60目筛，制备2,4-DCP浓度为20mg/kg农药土壤500g，加入新鲜制备过夜的HD-1菌液333mL，使土壤含水率为40％，制作不加菌剂空白对照组，每隔2d取10g土测定2,4-DCP在土壤中的残余浓度。10d后，不加菌空白土壤2,4-DCP 残余浓度为15.46mg/kg，自然降解率为22.70％，添加HD-1菌液的土壤残余浓度为9.36mg/kg，降解率提升到53.20％，降解提升效果显著。
实施例2
取适量未灭菌农田土，自然风干，过60目筛，制备2,4-DCP浓度为30mg/kg农药土壤500g，加入新鲜制备过夜的HD-1菌液333mL，使土壤含水率为40％，制作不加菌剂空白对照组，每隔2d取10g土测定2,4-DCP在土壤中的残余浓度。10d后，不加菌空白土壤2,4-DCP 残余浓度为22.25mg/kg，自然降解率为25.83％，添加HD-1菌液的土壤残余浓度为10.83mg/kg，降解率提升到64.16％，降解提升效果显著。
实施例3
取适量未灭菌农田土，自然风干，过60目筛，制备2,4-DCP浓度为50mg/kg农药土壤500g，加入新鲜制备过夜的HD-1菌液333mL，使土壤含水率为40％，制作不加菌剂空白对照组，每隔2d取10g土测定2,4-DCP在土壤中的残余浓度。10d后，不加菌空白土壤2,4-DCP 残余浓度为39.46mg/kg，自然降解率为21.08％，添加HD-1菌液的土壤残余浓度为22.61mg/kg，降解率提升到54.78％，降解提升效果显著。

Claims (2)

1.一株2,4-二氯苯酚降解菌HD-1 ，其特征在于：保藏编号：CGMCC NO.15123，建议的分类名为摩氏假单胞菌（ Pseudomonas mosselii） 。
2.权利要求1所述的2,4-二氯苯酚降解菌降解土壤中2,4-二氯苯酚的方法，按照下述步骤进行：
(1)菌株的活化：将上述HD-1菌株从斜板上接种到富集培养基中，30℃、150r·min-1条件下震荡培养2d；
(2)将上述菌液投加到2,4-DCP浓度为20mg/kg的污染土壤中，保持土壤含水率为40％，即可通过微生物的溶解、酶解及细胞吞噬等作用降解土壤中2,4-DCP，10d降解率可达到53.90％；
富集培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5.0g，蒸馏水1L，pH7.0，121℃、100KPa高温灭菌20min后使用。
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