CN101857847A - 一株铜绿假单胞菌菌株的分离纯化及其驯化方法与用途 - Google Patents

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程莎莎
于莹
李晓菊
王淮
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Abstract

一株铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY筛选自受三溴苯酚(TBP)污染的污泥并纯化，纯化后的菌株在无机盐培养基中以TBP浓度递增压力式驯化法进行驯化，驯化后的菌株可用于含苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、苯甲酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛、香兰素、4-氯酚、2，4-二氯酚、三氯苯酚、三溴苯酚等难降解有机污染物废水的生物治理，具有较高的研究和实用价值。

Description

一株铜绿假单胞菌菌株的分离纯化及其驯化方法与用途
一、技术领域
本发明涉及一种存在于污泥中的微生物的提取方法及其用途，确切地说是存在于三溴苯酚污染的污泥中的一株铜绿假单胞菌菌株的分离纯化及其驯化方法与用途。
二、背景技术
酚类化合物，尤其是卤代酚类化合物，是造成环境污染的一类主要物质，它们是工农业生产各个环节的产品或中间产物。这些化合物存在于土壤、空气和水体中，由于其较差的自然降解性，被排放到环境中后会长期滞留，对环境的累积污染效应显著。由于其具有相对较高的水溶性，这些污染物对水体的污染潜能更高，并污染地表径流与地下水源。多数卤代酚类具有刺激性强、易被皮肤吸收、易在生物体内积累等特点。此外，卤代酚类对生物组织具有较强的变性作用，强烈刺激皮肤、黏膜，有腐蚀性，且其本身在低浓度下就可散发出特殊恶臭，其毒性一般随着卤素取代基的增多而增强。
迄今，针对各种卤代酚类污染物的处理，国内外相关领域已展开了大量的研究工作，探讨了多种降解或处理途径。主要处理方法有：光解离与光催化、化学氧化法、化学还原法、辐解技术等物化处理法，还包括利用微生物法或酶法降解的生物处理法，其中微生物法是对环境友好、经济成本相对较低的处理方法，而获得一种降解特定污染物的功能微生物成为研究的核心。
三、发明内容
本发明旨在为高效生化处理酚类及其他芳香化合物污染物提供一种微生物，所要解决的技术问题是自受污染的污泥中遴选所需的微生物并予以驯化以提高菌株对难降解物质的降解率。
申请人经系统的条件试验，自受三溴苯酚污染的污泥中采集、分离、筛选到一株铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY可用于高效降解酚类及其他芳香化合物污染物。
本发明的技术方案包括：
1、自受三溴苯酚(TBP)污染的污泥中分离铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY
A、在无菌条件下，将受三溴苯酚污染的污泥加水混匀后静止0.5～2h，取上层清液1mL，梯度稀释10-1～10-6，得到6份稀释菌液；
B、在超净工作台上，取融化后降温至约45℃的分离纯化固体培养基倒在六个平板上，每个平板中注入15～20mL的培养基，待凝固后，取上述6份稀释菌液各0.1～0.2mL分别加至六个平板上，用无菌涂布棒涂布均匀；
C、将上述制备好的六个平板倒置于25～35℃的生化培养箱中培养20～60h；
2、铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY的纯化
D、当C步骤培养结束后，用接种环自六个平板中各挑取形态清晰的单菌落，编号，在分离纯化固体培养基平板上划线，将平板倒置于25～35℃的生化培养箱中培养20～60h；
上述D步骤至少重复两次，最后在光学显微镜下观察，确保是纯的单菌株后，将分离出的菌种接种到斜面培养基中，4℃下保存在冰箱中。
3、通过《伯杰氏细菌鉴定手册》比对及16S rDNA分析鉴定菌种
根据细菌形态、生理生化实验与《伯杰氏细菌鉴定手册》对照以及16S rDNA序列分析结果，鉴定该菌株为Pseudomonas aeruginosa.TBPY。
4、铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY的驯化
取纯化后的菌株按5％～10％(V/V)的接入量接种于无机盐培养基中，以TBP浓度由50mg/L到200mg/L递增压力式驯化法、于25～35℃、120～170rpm摇床中驯化培养，每隔5～10d按5％～10％(V/V)的接种量接种于新的培养基，驯化时间共为2～5个月。驯化后的铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY对TBP的降解率提高30％～60％。
5、铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY的优化培养条件为：在无机盐液体培养基中加入葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源，pH值为8.0。
上述分离纯化固体培养基配方：每1000mL水中含牛肉膏2～6g、蛋白胨8～12g、NaCl 3～6g、K2HPO4 4～8g、KH2PO4 0.2～0.8g、TBP 50～200mg、pH值为5.0～9.0、琼脂12～20g。
上述无机盐液体培养基配方：每1000mL水中含K2HPO4 4～8g、KH2PO4 0.2～0.8g、MgSO40.2～0.6g、(NH4)2SO4 1～5g、MnSO4·H2O 0.04～0.08g、FeSO4·7H2O 0.008～0.02g、CaCl2 0.01～0.03g、TBP 50～200mg。
实验证明，本发明提供的铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY经驯化后可以高效降解或利用苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、苯甲酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛、香兰素、4-氯酚、2，4-二氯酚、三氯苯酚、三溴苯酚等难降解有机污染物，48h内可将初始浓度为180mg/L的TBP完全降解。
本发明的优点在于：纯化分离得到一株能有效降解酚类以及其它芳香化合物污染物的铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY，为含该类物质的工农业废水的生物治理提供功能显著的菌株，具有较高的实用价值。
四、具体实施方式
实施例1：铜绿假单胞菌菌(Pseudomonas aeruginosa)TBPY的分离和纯化
A、在无菌条件下，将受三溴苯酚污染的污泥加水混匀后静止0.5～2h，取上层清液1mL，以0.85％生理盐水梯度稀释10-1～10-6，得到6份稀释菌液；
B、在超净工作台上，取融化后降温至约45℃的分离纯化固体培养基倒在六个平板上，每个平板中注入15～20mL的培养基，待凝固后，取上述6份稀释菌液0.1～0.2mL分别加至六个平板上，用无菌涂布棒涂布均匀；
C、将上述制备好的六个平板倒置于28～32℃生化培养箱中培养20～60h；
D、用接种环挑取形态清晰的单菌落，编号，在分离纯化固体培养基平板上划线，将平板倒置于28～32℃的生化培养箱中培养20～60h；
上述D步骤重复三次，并在光学显微镜下观察，确保是纯的单菌株。将分离出的菌种接种到斜面培养基中，4℃下保存。
上述B步骤、D步骤中的分离纯化固体培养基配方：牛肉膏2～6g、蛋白胨8～12g、NaCl3～6g、K2HPO4 4～8g、KH2PO4 0.2～0.8g、TBP 50～200mg、pH值为5.0～9.0、琼脂12～20g、水1000mL。
实施例2：铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY的菌种鉴定
分离纯化获得的铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY菌落形态呈圆形、边缘整齐；颜色成乳白或乳黄色，湿润有光泽；菌落的表面形态呈高凸面。光学显微镜下观察到，该菌株为短杆菌，单个、成对或成短链。按照《伯杰氏细菌鉴定手册》对该菌株进行菌种鉴定的结果显示，该菌株革兰氏染色呈阴性，呼吸代谢，永不发酵，接触酶阳性，能利用多种有机化合物为唯一碳源生长，初步鉴定其属于假单胞菌属。
对该菌株进行16S rDNA序列测序，将所得序列在NCBI数据库中比对，结果显示，16SrDNA基因序列与Pseudomonas aeruginosa最为相近，相似性达99％，根据细菌系统分类原则，若两菌的16S rDNA同源性大于99％，基因水平上为同一种细菌，因此推测其属于Pseudomonas aeruginosa。以16S rDNA基因序列为依据，将TBPY与亲缘关系最近的几株Pseudomonas的遗传进化关系进行分析，结果显示TBPY菌株与Pseudomonas aeruginosa的亲缘关系最近。
综上所述，根据细菌形态、生理生化实验与《伯杰氏细菌鉴定手册》对照以及16S rDNA序列分析结果，鉴定该菌株为Pseudomonas aeruginosaTBPY。
实施例3：铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY的驯化
取纯化后的菌株按5％～10％(W/V)的接入量接种于无机盐培养基中，以TBP浓度递增压力式驯化法进行驯化，使得TBP的最大浓度为100～200mg/L。于25～35℃、120～170rpm摇床中驯化培养，每隔5～10d按5％～10％的接种量接种于新的培养基，驯化时间共为2～5个月。
上述无机盐液体培养基配方：每1000mL水中含K2HPO4 4～8g、KH2PO4 0.2～0.8g、MgSO40.2～0.6g、(NH4)2SO4 1～5g、MnSO4·H2O 0.04～0.08g、FeSO4·7H2O 0.008～0.02g、CaCl2 0.01～0.03g、TBP 50～200mg。
在上述无机盐液体培养基中，加入TBP使浓度为100mg/L，分别以相同接种量接入驯化前后的铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY，置于温度30℃、转速150rpm的恒温摇床避光培养。结果显示，驯化后的铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY对TBP的降解率比驯化前的提高30％～60％。这说明铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonasaeruginosa)TBPY经过驯化大大增强其对难降解有机物的降解能力。
实施例4：铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY培养条件的优化
一、最适生长pH值的确定
考察铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY在不同培养基初始pH值的环境中的生长状况，具体方法为：固定其他培养条件如温度30℃、转速150rpm，调整牛肉膏蛋白胨液体培养基(配方同分离纯化培养基)的初始pH值为5、6、7、8、9，振荡培养30h后取样，用吸光度法测定细菌浓度OD600。试验结果显示，铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonasaeruginosa)TBPY的最适生长pH值为8。
二、碳源的优化
考察铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY对葡萄糖、乳糖、蔗糖几种碳源的利用状况，具体方法为：采取单因素试验，固定氮源成分硫酸铵2.5g/L与无机盐液体培养基其他组分，改变碳源成分为葡萄糖、乳糖、蔗糖(含量均为0.05～0.3g/L)，pH值5～9，接种铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY，恒温摇床温度25～35℃、转速120～150rpm，避光培养48h，测定OD600。试验结果显示，适宜的碳源为葡萄糖。
三、氮源的优化
考察铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY对硫酸铵和硝酸钠的利用状况，具体方法为：采取单因素试验，固定碳源成分TBP 100mg/L与无机盐液体培养基其他组分，改变氮源成分为硫酸铵或硝酸钠(浓度均为0.2～0.8g/L)，pH值5～9接种铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY，恒温摇床温度25～35℃、转速120～150rpm，避光培养48h，测定OD600。试验结果显示，适宜的氮源为硫酸铵。
实施例5：检测铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY对一些有机污染物的降解或利用状况
考察驯化后铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY对苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、苯甲酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛、香兰素、4-氯酚、2，4-二氯酚、三氯苯酚、三溴苯酚的降解或利用状况。具体试验过程如下：采用无机盐液体培养基，以上述待检验底物作为唯一的碳源，添加的浓度均为200mg/L，置于温度30℃、转速150rpm的恒温摇床避光培养。结果显示，铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY均能以上述底物为碳源生长。此外，经过48h培养，取样检测各底物含量，结果显示铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY对各底物的降解率，分别达到：苯酚：87％；邻苯二酚：93％；间苯二酚：92％；苯甲酸：85％；对羟基苯甲酸：89％；对羟基苯甲醛：90％；香兰素：88％；4-氯酚：100％；2，4-二氯酚：80％；三氯苯酚：89％；三溴苯酚：80％。这表明该菌株可以有效利用苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、苯甲酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛、香兰素、4-氯酚、2，4-二氯酚、三氯苯酚、三溴苯酚，对含该类有机污染物的废水具有较好的降解能力。
实施例6：检测铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY对三溴苯酚(TBP)的微生物降解能力
在无机盐液体培养基中，TBP添加浓度为50mg/L，采取单因素试验，分别考察了接种量、培养基初始pH值以及不同生长期细胞对铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY的生长和TBP降解的影响。
A、在考察接种量的试验中，固定其他培养条件不变，培养基初始pH值8.0、试验菌体为对数期细胞，TBP添加浓度为50mg/L，分别以0.1％、0.3％、0.5％、0.7％、0.9％、1.5％的接种量接入铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY，置于温度30℃、转速150rpm的恒温摇床避光培养，间隔一定时间取样测OD600和TBP含量。试验结果显示，在以TBP为碳源的条件下，接种量为0.3％时，铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY生长状况以及对TBP的降解能力最好。
B、如实施例5中A的培养条件，改变无机盐液体培养基初始pH值分别为6、7、8、9，以0.3％的接种量接入铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY对数期细胞，检测方法同上述实施例5中A。试验结果显示，在以TBP为碳源的条件下，无机盐液体培养基初始pH值为8时，铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY生长状况以及对TBP的降解能力最好。
C、试验操作同实施例5中A与B，分别接入铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY对数期细胞、稳定期细胞。结果显示，在以TBP为碳源的条件下，接入铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY对数期细胞，铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonasaeruginosa)TBPY生长状况以及对TBP的降解能力最好。
在优化的降解条件下，即在以对数期细胞作为降解菌体、接种量为0.3％、无机盐培养基初始pH值为8的条件下，TBP添加浓度为180mg/L，置于温度30℃、转速150rpm的恒温摇床避光培养，间隔一定时间取样测OD600和TBP含量。试验结果显示，经过48h，铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY将180mg/L的TBP完全降解。

Claims (7)

1.一株铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY的分离纯化，其特征在于：
A、在无菌条件下，将受三溴苯酚污染的污泥加水混匀后静止0.5～2h，取上层清液1mL，梯度稀释10-1～10-6，得到6份稀释菌液；
B、在超净工作台上，取融化后降温至约45℃的分离纯化固体培养基倒在六个平板上，每个平板中注入15～20mL的培养基，待凝固后，取上述6份稀释菌液各0.1～0.2mL分别加至六个平板上，用无菌涂布棒涂布均匀；
C、将上述制备好的六个平板倒置于25～35℃的生化培养箱中培养20～60h；
D、用接种环自六个平板上各挑取形态清晰的单菌落，编号，在分离纯化固体培养基平板上划线，将平板倒置于25～35℃的生化培养箱中培养20～60h；
上述D步骤至少重复两次，分离得到纯化的菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的分离纯化固体培养基配方：每1000mL水中含牛肉膏2～6g、蛋白胨8～12g、NaCl 3～6g、K2HPO4 4～8g、KH2PO4 0.2～0.8g、TBP50～200mg、pH值为5.0～9.0、琼脂12～20g。
3.如权利要求1所述的铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY的驯化方法，其特征在于：将纯化后的菌株按5％～10％(V/V)的接入量接种于无机盐培养基中，以TBP浓度由50mg/L到200mg/L递增压力式驯化法、于25～35℃、120～170rpm摇床中驯化培养，每隔5～10d按5％～10％的接种量接种于新的培养基，驯化时间共为2～5个月。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的无机盐液体培养基配方：每1000mL水中含K2HPO4 4～8g、KH2PO4 0.2～0.8g、MgSO4 0.2～0.6g、(NH4)2SO4 1～5g、MnSO4·H2O0.04～0.08g、FeSO4·7H2O 0.008～0.02g、CaCl2 0.01～0.03g、TBP 50～200mg。
5.如权利要求1所述的铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY的用途，其特征在于：本菌株在生物治理有机废水中的应用。
6.根据权利要求4所述的铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY的用途，其特征在于：本菌株在生物治理卤代酚废水中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)TBPY的用途，其特征在于：本菌株在生物治理三溴苯酚废水中的应用。
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