CN103060419A - 采用多菌种降解多酚污染物的协同作用及研究方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及采用多菌种降解多酚污染物的协同作用及研究方法。将铜绿假单胞菌GIMT1.074、鞘氨醇杆菌CICC 23249或苍白杆菌BJS2三种菌株的一种或两种及三种混合成菌悬液，接种到含不同浓度的苯酚、间甲酚和4-氯酚的无机盐培养基中进行培养，根据不同时间取出部分培养液，测量培养液中苯酚、间甲酚和4-氯酚的浓度，确定不同时刻的降解率，以及测量培养液中的细胞浓度考察不同细胞的生长情况。三种酚类降解菌的协同降解作用发现混合菌对混合酚类污染物的降解能力比每一种单独菌株的降解效率和效果都要好很多，而且菌株的生物量也增加到原来最优菌株——铜绿假单胞菌GIMT1.074的2倍。

Description

采用多菌种降解多酚污染物的协同作用及研究方法

技术领域

本发明涉及一种采用多菌种降解多酚污染物的协同作用及研究方法。

背景技术

酚类化合物是含氧芳香烃类的衍生化合物，对环境容易造成极高的污染。美国国家环境保护总局(EPA)列出的129种优先控制的污染物中就含有酚类污染物，也被我国对有毒有机污染物列于优先控制的黑名单之中。含酚类污染物的废水来源十分广泛，主要来自很多重工业及轻工业的工厂——煤气与炼焦工业的煤气厂、焦化厂、煤炼油厂，冶金、机械、玻璃、制造、陶瓷等工业的煤气发生站，石油工业的炼油厂、页岩干馏厂、石油化工厂，木材加工工业的木材防腐厂、木材干馏厂、木材纤维厂，林产化工、化学工业与有机合成工业，制药及食品添加剂生产工厂以及其他以酚类化合物作原料的各种企业等。随着工业生产的发展，排放到环境中的酚类化合物在数量上和种类上正在逐渐增加，造成了复杂多变的混合污染物系统。含酚废水的危害主要体现在对水生生物的高毒性，当水体中的酚类含量为0.1-0.2mg/L时，鱼肉就有异味而不能食用；当水体中的酚类含量达到1-10mg/L时，鱼类就会中毒死亡，酚类污染物还抑制水中微生物的生长速度，影响水中生物的生态平衡。另外，含酚类污染物的工业废水会影响农作物的正常生长，造成粮食减产，含低浓度酚类的废水灌溉农田会使一些农作物中含有酚类物质，不能被人类加工食用，而含高浓度酚类的废水灌溉农田会引起农作物的死亡。含酚类污染物的废水对环境的破坏程度日益严重，对人类造成的危害也逐渐加深。酚类的蒸气会刺激呼吸系统和眼睛；接触到皮肤则会造成皮肤软化和变白，并引起疼痛的灼伤，皮肤若长久与酚类溶液接触，会引起皮肤炎，若经皮肤迅速吸收进入体内会导致头痛、昏睡、呼吸困难和急促。酚类物质若由口被吞食会引起食道灼伤、腹部疼痛、恶心呕吐和肠胃损伤。酚类的慢性中毒效应则会引起消化障碍、神经失常、皮肤出疹、肝和肾脏受损等症状。由于酚类污染物的毒性较大，不仅影响水生生物的生长和繁殖，而且还污染到饮用水的水源，因此对含有酚类污染物的废水的排放必须有十分严格的规定。如何有效地处理含酚类污染物的工业废水是环境污染防治领域所必须解决的问题。因此，对含酚类污染物的工业废水的处理，尤其是含低浓度酚类的废水的高效处理方法，已经成为工业废水治理中亟待解决的问题之一。

含酚工业废水中含有多种其它酚类等有机污染成分，其中，最主要的污染成分是甲酚和（或）氯酚。甲酚以三种异构体形式存在，分别为邻甲酚、间甲酚和对甲酚，这三种形式的甲酚经常同时存在于含酚工业废水中。有文献专门报道了微生物对这三种形式甲酚的生物降解特性，研究结果证实间甲酚在三种形式的甲酚中相对较难降解。在氯酚类有机污染物中，也存在2、3和4-氯酚三种同分异构体形式，其中以4-氯酚为主要污染物，因其难于被微生物利用而相关研究和报道较少。综上所述，考察对苯酚、间甲酚和4-氯酚的生物降解特性具有重要意义。针对特定的污染物或者特定的菌种研究发现，在含有多酚污染物质的微生物降解体系中，某一种污染物的存在和降解对另外一种或几种污染物的降解有促进或者抑制作用；或者某几种纯培养微生物在特定混合培养过程中，对某一种或几种污染物的降解作用得到了提高，甚至能够获得原先没有的、对某种污染物的降解能力。不同污染物和不同菌种的代谢之间具有协同作用，或者不同菌种之间具有相互调控作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种研究采用多菌种降解多酚污染物协同作用的方法。

本发明的另一个目的是提供一种采用多菌种降解多酚污染物的协同作用。

本发明所提供的三种酚类污染物降解菌分别是铜绿假单胞菌GIMT1.074、鞘氨醇杆菌CICC 23249以及苍白杆菌BJS2，这三株菌株分别购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，该中心的地址是北京市海淀区中关村南大街12号。

本发明所提供的研究协同作用的底物为苯酚、间甲酚和4-氯酚，这三种酚类物质是多酚废水降解的主要的典型物质，具有代表多酚废水的性质。

本发明的技术方案如下：

一种采用多菌种降解多酚污染物协同作用的研究方法，将铜绿假单胞菌GIMT1.074、鞘氨醇杆菌CICC 23249或苍白杆菌BJS2三种菌株的一种或两种及三种混合成菌悬液，接种到含不同浓度的苯酚、间甲酚和4-氯酚的无机盐培养基中进行培养，根据不同时间取出部分培养液，测量培养液中苯酚、间甲酚和4-氯酚的浓度，确定不同时刻的降解率，以及测量培养液中的细胞浓度考察不同细胞的生长情况。

制备过程为：将菌悬液分别为七组：

第一组：最终OD₆₀₀值为0.1的铜绿假单胞菌GIMT1.074；

第二组：最终OD₆₀₀值为0.1的鞘氨醇杆菌CICC 23249；

第三组：最终OD₆₀₀值为0.1的苍白杆菌BJS2；

第四组：最终OD₆₀₀值分别为0.1的铜绿假单胞菌GIMT1.074和鞘氨醇杆菌CICC23249；

第五组：最终OD₆₀₀值分别为0.1的铜绿假单胞菌GIMT1.074和苍白杆菌BJS2；

第六组：最终OD₆₀₀值分别为0.1的鞘氨醇杆菌CICC 23249以及苍白杆菌BJS2；

第七组：最终OD₆₀₀值分别为0.1的铜绿假单胞菌GIMT1.074、鞘氨醇杆菌CICC 23249以及苍白杆菌BJS2。

所述的无机盐培养基的配方是：500mg(NH₄)₂SO₄，200mg KH₂PO₄，100mg MgSO₄，800mg Na₂HPO₄·12H₂O，痕量元素母液10mL和1000mL H₂O。

所述痕量元素母液成分如下：0.4g MnSO₄·4H₂O，0.4g ZnSO₄·7H₂O，0.1gNa₂MoO₄·2H₂O，0.1g CuSO₄·5H₂O，1.0g CaCl₂，10.0g Na₂SO₄，2.0g FeSO₄·7H2O，0.5mL H₂SO₄，2.0g NaOH，12.0g乙二胺四乙酸二钠和H₂O 1000mL。

所述的培养条件是：将不同组的菌悬液分别接种到含初始苯酚浓度为200mg/L、初始4-氯酚浓度为100mg/L和初始间甲酚浓度为100mg/L的50mL无机盐培养液的250mL三角瓶中；酚类灭菌经过0.22μm膜过滤，其他试剂和培养基灭菌在115℃下进行30min；在30℃的恒温下、200rpm的恒定转速下的摇床中进行培养。

所述的培养液取出方式是：每隔6小时取出5mL的培养液，利用高效液相色谱仪分别测量剩余的苯酚、间甲酚和4-氯酚的浓度；同时测量培养液中的细胞浓度，测量方法是利用紫外分光光度计在吸收峰为600nm的条件下测量其OD₆₀₀的数值。

本发明中测量培养液中细胞浓度是通过紫外分光光度计在吸收峰为600nm的条件下进行测量的；测量剩余底物浓度的方法是利用高效液相色谱仪进行测量分析的。

所述的确定培养液中苯酚、间甲酚和4-氯酚降解率所采用的计算公式是：

底物降解率（%）=（初始底物浓度-剩余底物浓度）/初始底物浓度×100%

经过本发明的方法，得出的采用多菌种降解多酚污染物的协同作用如下：

（一）铜绿假单胞菌GIMT1.074具有快速降解苯酚、间甲酚和4-氯酚的能力，在23h内可以将这三种酚类得混合物降解完全；

（二）鞘氨醇杆菌CICC 23249在28h内可以将苯酚、4-氯酚和间甲酚三混合底物降解完全；

（三）苍白杆菌BJS2降解缓慢，苯酚、4-氯酚和间甲酚三混合底物都未能完全降解；

（四）鞘氨醇杆菌CICC 23249不能降解4-氯酚以及4-氯酚的二元混合底物，但是对于含有这三种酚类的混合底物却能高效降解，并且菌株的生长能力高于降解力最好的铜绿假单胞菌GIMT1.074，表明苯酚的存在对鞘氨醇杆菌CICC 23249降解4-氯酚以及4-氯酚的二元混合底物具有激活和促进的作用；

（五）苍白杆菌BJS2能够降解苯酚，但是不能降解4-氯酚以及4-氯酚的二元混合底物，而且发现苍白杆菌BJS2对三种酚类得混合底物也不具有降解能力，说明了4-氯酚对苍白杆菌BJS2具有极高的毒性，抑制了苍白杆菌BJS2对苯酚和间甲酚的降解；

（六）三种酚类降解菌的协同降解作用发现混合菌对混合酚类污染物的降解能力比每一种单独菌株的降解效率和效果都要好很多，铜绿假单胞菌GIMT1.074完全降解200mg/L苯酚、100mg/L间甲酚和100mg/L 4-氯酚所需时间为24小时，而以优势菌株铜绿假单胞菌GIMT1.074、鞘细菌、苍白杆菌BJS2组成的菌群完全降解混合酚所需时间缩短为18小时，而且菌株的生物量也增加到原来最优菌株——铜绿假单胞菌GIMT1.074的2倍。

附图说明

图1.铜绿假单胞菌GIMT1.074对苯酚、间甲酚和4-氯酚混合底物的降解情况及细胞浓度变化

图2.鞘氨醇杆菌CICC 23249对苯酚、间甲酚和4-氯酚混合底物的降解情况及细胞浓度变化

图3.苍白杆菌BJS2对苯酚、间甲酚和4-氯酚混合底物的降解情况及细胞浓度变化

图4.铜绿假单胞菌GIMT1.074和鞘氨醇杆菌CICC 23249协同降解苯酚、间甲酚和4-氯酚混合底物的底物降解情况及细胞浓度变化

图5.铜绿假单胞菌GIMT1.074和苍白杆菌BJS2协同降解苯酚、间甲酚和4-氯酚混合底物的底物降解情况及细胞浓度变化

图6.鞘氨醇杆菌CICC 23249和苍白杆菌BJS2协同降解苯酚、间甲酚和4-氯酚混合底物的底物降解情况及细胞浓度变化

图7.铜绿假单胞菌GIMT1.074、鞘氨醇杆菌CICC 23249和苍白杆菌BJS2协同降解苯酚、间甲酚和4-氯酚混合底物的底物降解情况及细胞浓度变化

具体实施方式

通过下面结合具体实例将有助于进一步理解本发明，但本发明的保护范围并不限制于此：

实施例1

利用铜绿假单胞菌GIMT1.074降解多酚污染物

如图1所示，按照最终OD₆₀₀值为0.1将铜绿假单胞菌GIMT1.074接种于含初始苯酚浓度为200mg/L、初始4-氯酚浓度为100mg/L和初始间甲酚浓度为100mg/L的50mL无机盐培养液的250mL三角瓶中。放置于30℃、200rpm的摇床中进行培养。每隔6小时取出5mL培养液，测量培养液中的细胞浓度及残留三种底物的浓度。在第0h、6h、12h、18h、24h的苯酚浓度分别为168.58mg/L、173.96mg/L、171.39mg/L、11.88mg/L和0mg/L；4-氯酚浓度分别为84.03mg/L、86.02mg/L、94.01mg/L、37.57mg/L和0mg/L；间甲酚的浓度分别为78.48mg/L、82.93mg/L、88.43mg/L、24.06mg/L和0mg/L；细胞菌体量（OD₆₀₀）分别为0.133、0.166、0.192、0.357、0.347。结果表明铜绿假单胞菌GIMT1.074在24h内可以完全降解苯酚、4-氯酚和间甲酚三混合底物。

实施例2

利用鞘氨醇杆菌CICC 23249降解多酚污染物

如图2所示，按照最终OD₆₀₀值为0.1将鞘氨醇杆菌CICC 23249接种于含初始苯酚浓度为200mg/L、初始4-氯酚浓度为100mg/L和初始间甲酚浓度为100mg/L的50mL无机盐培养液的250mL三角瓶中。放置于30℃、200rpm的摇床中进行培养。每隔6小时取出5mL培养液，测量培养液中的细胞浓度及残留三种底物的浓度。在第0h、6h、12h、18h、24h和第30h的苯酚浓度分别为170.85mg/L、158.02mg/L、178.71mg/L、106.22mg/L和47.11mg/L和0mg/L；4-氯酚浓度分别为81.86mg/L、79.65mg/L、85.44mg/L、53.84mg/L、33.46mg/L和0mg/L；间甲酚的浓度分别为78.86mg/L、77.34mg/L、85.57mg/L、56.47mg/L、44.21mg/L和0mg/L；细胞菌体量（OD₆₀₀）分别为0.149、0.246、0.308、0.424、0.522和0.633。结果表明鞘氨醇杆菌CICC 23249在30h内可以完全降解苯酚、4-氯酚和间甲酚三混合底物。鞘氨醇杆菌CICC 23249对于只含有4-氯酚的培养液中不具有降解能力，且对于含4-氯酚的二元混合底物也不能降解。但对于苯酚、4-氯酚和间甲酚三混合底物，却都可以降解完全。

实施例3

利用苍白杆菌BJS2降解多酚污染物

如图3所示，按照最终OD₆₀₀值为0.1将苍白杆菌BJS2接种于含初始苯酚浓度为200mg/L、初始4-氯酚浓度为100mg/L和初始间甲酚浓度为100mg/L的50mL无机盐培养液的250mL三角瓶中。放置于30℃、200rpm的摇床中进行培养。每隔6小时取出5mL培养液，测量培养液中的细胞浓度及残留三种底物的浓度。在第0h、6h、12h、18h、24h和第30h的苯酚浓度分别为231.19mg/L、228.55mg/L、172.34mg/L、136.32mg/L、146.31mg/L和170.19mg/L；4-氯酚浓度分别为104.13mg/L、103.52mg/L、81.43mg/L、67.99mg/L69.06mg/L和78.76mg/L；间甲酚的浓度分别为100.05mg/L、99.22mg/L、77.78mg/L、62.54mg/L、65.24mg/L和78.52mg/L；细胞菌体量（OD₆₀₀）分别为0.149、0.246、0.297、0.339、0.334、0.359。结果表明苍白杆菌BJS2在30h内不能完全降解苯酚、4-氯酚和间甲酚三混合底物。苍白杆菌BJS2对于4-氯酚不具有降解能力，且对于含4-氯酚的二元混合底物同样也不能降解。苍白杆菌BJS2未能降解苯酚、4-氯酚和间甲酚三混合底物，说明4-氯酚对苍白杆菌BJS2毒害较大，同时抑制了对苯酚和间甲酚的降解。

实施例4

利用铜绿假单胞菌GIMT1.074和鞘氨醇杆菌CICC 23249协同降解多酚污染物

如图4所示，按照最终OD₆₀₀值为0.1将铜绿假单胞菌GIMT1.074和鞘氨醇杆菌CICC23249接种于含初始苯酚浓度为200mg/L、初始4-氯酚浓度为100mg/L和初始间甲酚浓度为100mg/L的50mL无机盐培养液的250mL三角瓶中。放置于30℃、200rpm的摇床中进行培养。每隔6小时取出5mL培养液，测量培养液中的细胞浓度及残留三种底物的浓度。在第0h、6h、12h、18h、24h的苯酚浓度分别为130.22mg/L、197.32mg/L、124.69mg/L、87.82mg/L、23.36mg/L、0mg/L；4-氯酚浓度分别为66.23mg/L、98.46mg/L、99.12mg/L、65.35mg/L、32.85mg/L、0mg/L；间甲酚的浓度分别为64.04mg/L、86.32mg/L、68.32mg/L、58.56mg/L、26.31mg/L、0mg/L；细胞菌体量（OD₆₀₀）分别为0.141、0.228、0.301、0.517、0.514、0.6。结果表明铜绿假单胞菌GIMT1.074和鞘氨醇杆菌CICC 23249在30h内可以完全降解苯酚、4-氯酚和间甲酚三混合底物，而且菌种生长有所上升。

实施例5

利用铜绿假单胞菌GIMT1.074和苍白杆菌BJS2协同降解多酚污染物

如图5所示，按照最终OD₆₀₀值为0.1将铜绿假单胞菌GIMT1.074和苍白杆菌BJS2接种于含初始苯酚浓度为200mg/L、初始4-氯酚浓度为100mg/L和初始间甲酚浓度为100mg/L的50mL无机盐培养液的250mL三角瓶中。放置于30℃、200rpm的摇床中进行培养。每隔6小时取出5mL培养液，测量培养液中的细胞浓度及残留三种底物的浓度。在第0h、6h、12h、18h、24h和第30h的苯酚浓度分别为158.43mg/L、144.49mg/L、166.89mg/L、94.97mg/L、40.06和0mg/L；4-氯酚浓度分别为80.77mg/L、79.41mg/L、85.51mg/L、67.07mg/L、53.65mg/L和0mg/L；间甲酚的浓度分别为80.27mg/L、76.12mg/L、79.51mg/L、62.91mg/L、43.85mg/L和0mg/L；细胞菌体量（OD₆₀₀）分别为0.142、0.227、0.285、0.395、0.404、0.56。结果表明铜绿假单胞菌GIMT1.074和苍白杆菌BJS2在30h内可以完全降解苯酚、4-氯酚和间甲酚三混合底物，菌种含量有所增加。

实施例6

利用鞘氨醇杆菌CICC 23249和苍白杆菌BJS2协同降解多酚污染物

如图6所示，按照最终OD₆₀₀值为0.1将鞘氨醇杆菌CICC 23249和苍白杆菌BJS2分别接种于含初始苯酚浓度为200mg/L、初始4-氯酚浓度为100mg/L和初始间甲酚浓度为100mg/L的50mL无机盐培养液的250mL三角瓶中。放置于30℃、200rpm的摇床中进行培养。每隔6小时取出5mL培养液，测量培养液中的细胞浓度及残留三种底物的浓度。在第0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h和54h的苯酚浓度分别为178.41mg/L、192.87mg/L、154.32mg/L、175.38mg/L、130.42mg/L、86.19mg/L、77.34mg/L、62.46mg/L、59.05mg/L和41.62mg/L；4-氯酚浓度分别为83.14mg/L、89.93mg/L、85.19mg/L、85.62mg/L、62.84mg/L、45.97mg/L、41.95mg/L、40.02mg/L、43.52mg/L和66.41mg/L；间甲酚的浓度分别为84.60mg/L、89.26mg/L、71.54mg/L、87.42mg/L、66.15mg/L、50.19mg/L、61.02mg/L、51.16mg/L、60.16mg/L和32.01mg/L；细胞菌体量（OD₆₀₀）分别为0.154、0.256、0.314、0.381、0.397、0.446、0.509、0.514、0.643、0.53。结果表明鞘氨醇杆菌CICC 23249和苍白杆菌BJS2在54h内不能完全降解苯酚、4-氯酚和间甲酚三混合底物，结果与苍白杆菌BJS2和鞘氨醇杆菌CICC 23249分别进行降解有很大的差异。

实施例7

如图7所示，利用铜绿假单胞菌GIMT1.074、鞘氨醇杆菌CICC 23249和苍白杆菌BJS2协同降解多酚污染物

按照最终OD₆₀₀值为0.1将铜绿假单胞菌GIMT1.074、鞘氨醇杆菌CICC 23249和苍白杆菌BJS2接种于含初始苯酚浓度为200mg/L、初始4-氯酚浓度为100mg/L和初始间甲酚浓度为100mg/L的50mL无机盐培养液的250mL三角瓶中。放置于30℃、200rpm的摇床中进行培养。每隔6小时取出5mL培养液，测量培养液中的细胞浓度及残留三种底物的浓度。在第0h、6h、12h、18h、24h的苯酚浓度分别为166.17mg/L、176.72mg/L、99.64mg/L、1mg/L和0mg/L、；4-氯酚浓度分别为81.89mg/L、90.56mg/L、61.23mg/L、23.38mg/L和0mg/L；间甲酚的浓度分别为81.69mg/L、88.32mg/L、57.02mg/L、7.96mg/L和0mg/L；细胞菌体量（OD₆₀₀）分别为0.148、0.242、0.303、0.416、0.52。结果表明铜绿假单胞菌GIMT1.074、鞘氨醇杆菌CICC 23249和苍白杆菌BJS2在18h内可以完全降解苯酚、4-氯酚和间甲酚三混合底物。铜绿假单胞菌GIMT1.074完全降解200mg/L苯酚、100mg/L间甲酚和100mg/L 4-氯酚所需时间为22小时，而以优势菌株铜绿假单胞菌GIMT1.074、鞘细菌、苍白杆菌BJS2组成的菌群完全降解混合酚所需时间缩短为16小时，菌体量增大了100％。

实施例8

利用这种采用多菌种降解多酚污染物的协同作用及研究方法对实际含酚废水的处理效果

按照最终OD₆₀₀值为0.1将铜绿假单胞菌GIMT1.074、鞘氨醇杆菌CICC 23249和苍白杆菌BJS2接种于含初始苯酚浓度为1400mg/L，初始间甲酚96mg/L，初始4-氯酚197mg/L的实际含酚废水中，含酚废水经过0.22μm膜过滤除菌。取50mL含酚废水置于250mL三角瓶中，放置于30℃、200rpm的摇床中进行培养。在5天的摇瓶发酵处理方法中最终苯酚降解率为97.3%，间甲酚的降解率为81.1%，4-氯酚的降解率为69.7%，细菌浓度增长为OD600达到0.97。在实验室条件下，利用多菌种协同降解酚类废水的实际应用中达到了良好的处理效果。

Claims (8)

1.一种采用多菌种降解多酚污染物协同作用的研究方法，其特征是将铜绿假单胞菌GIMT1.074、鞘氨醇杆菌CICC 23249或苍白杆菌BJS2三种菌株单独或两种或三只混合成菌悬液，接种到含不同浓度的苯酚、间甲酚和4-氯酚的无机盐培养基中进行培养，根据不同时间取出部分培养液，测量培养液中苯酚、间甲酚和4-氯酚的浓度，确定不同时刻的降解率，以及测量培养液中的细胞浓度考察不同细胞的生长情况。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的菌悬液分别为七组：

第一组：最终OD₆₀₀值为0.1的铜绿假单胞菌GIMT1.074；

第二组：最终OD₆₀₀值为0.1的鞘氨醇杆菌CICC 23249；

第三组：最终OD₆₀₀值为0.1的苍白杆菌BJS2；

第四组：最终OD₆₀₀值分别为0.1的铜绿假单胞菌GIMT1.074和鞘氨醇杆菌CICC23249；

第五组：最终OD₆₀₀值分别为0.1的铜绿假单胞菌GIMT1.074和苍白杆菌BJS2；

第六组：最终OD₆₀₀值分别为0.1的鞘氨醇杆菌CICC 23249以及苍白杆菌BJS2；

第七组：最终OD₆₀₀值分别为0.1的铜绿假单胞菌GIMT1.074、鞘氨醇杆菌CICC 23249以及苍白杆菌BJS2。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的无机盐培养基的配方是：500mg(NH₄)₂SO₄，200mg KH₂PO₄，100mg MgSO₄，800mg Na₂HPO₄·12H₂O，痕量元素母液10mL和1000mL H₂O。

4.如权利要求4所述的方法，其特征是所述痕量元素母液成分如下：0.4g MnSO₄·4H₂O，0.4g ZnSO₄·7H₂O，0.1g Na₂MoO₄·2H₂O，0.1g CuSO₄·5H₂O，1.0g CaCl₂，10.0g Na₂SO₄，2.0g FeSO₄·7H2O，0.5mL H₂SO₄，2.0g NaOH，12.0g乙二胺四乙酸二钠和H₂O 1000mL。

5.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的培养条件是：将不同组的菌悬液分别接种到含初始苯酚浓度为200mg/L、初始4-氯酚浓度为100mg/L和初始间甲酚浓度为100mg/L的50mL无机盐培养液的250mL三角瓶中；酚类灭菌经过0.22μm膜过滤，其他试剂和培养基灭菌在115℃下进行30min；在30℃的恒温下、200rpm的恒定转速下的摇床中进行培养。

6.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的培养液取出方式是：每隔6小时取出5mL的培养液，利用高效液相色谱仪分别测量剩余的苯酚、间甲酚和4-氯酚的浓度；同时测量培养液中的细胞浓度，测量方法是利用紫外分光光度计在吸收峰为600nm的条件下测量其OD₆₀₀的数值。

7.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的确定培养液中苯酚、间甲酚和4-氯酚降解率所采用的计算公式是：

底物降解率（%）=（初始底物浓度-剩余底物浓度）/初始底物浓度×100%

8.采用多菌种降解多酚污染物的协同作用，其特征是协同作用如下：

（一）铜绿假单胞菌GIMT1.074具有快速降解苯酚、间甲酚和4-氯酚的能力，在23h内可以将这三种酚类得混合物降解完全；

（二）鞘氨醇杆菌CICC 23249在28h内可以将苯酚、4-氯酚和间甲酚三混合底物降解完全；

（三）苍白杆菌BJS2降解缓慢，苯酚、4-氯酚和间甲酚三混合底物都未能完全降解；

（四）鞘氨醇杆菌CICC 23249不能降解4-氯酚以及4-氯酚的二元混合底物，但是对于含有这三种酚类的混合底物却能高效降解，并且菌株的生长能力高于降解力最好的铜绿假单胞菌GIMT1.074，表明苯酚的存在对鞘氨醇杆菌CICC 23249降解4-氯酚以及4-氯酚的二元混合底物具有激活和促进的作用；

（五）苍白杆菌BJS2能够降解苯酚，但是不能降解4-氯酚以及4-氯酚的二元混合底物，而且发现苍白杆菌BJS2对三种酚类得混合底物也不具有降解能力，说明了4-氯酚对苍白杆菌BJS2具有极高的毒性，抑制了苍白杆菌BJS2对苯酚和间甲酚的降解；

（六）三种酚类降解菌的协同降解作用发现混合菌对混合酚类污染物的降解能力比每一种单独菌株的降解效率和效果都要好很多，铜绿假单胞菌GIMT1.074完全降解200mg/L苯酚、100mg/L间甲酚和100mg/L 4-氯酚所需时间为24小时，而以优势菌株铜绿假单胞菌GIMT1.074、鞘细菌、苍白杆菌BJS2组成的菌群完全降解混合酚所需时间缩短为18小时，而且菌株的生物量也增加到原来最优菌株——铜绿假单胞菌GIMT1.074的2倍。

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