CN104667475A - 一种利用苍白杆菌高效降解嘧菌酯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种利用苍白杆菌高效降解嘧菌酯的方法。即将苍白杆菌SH14在温度30.2°C、pH7.9和接种量为0.2g/L的条件下降解嘧菌酯，苍白杆菌SH14对50 mg/L的嘧菌酯的降解率达85%以上；本发明所述方法为以后苍白杆菌SH14大规模工业生产和应用提供理论实践依据，具有广泛的意义。

Description

一种利用苍白杆菌高效降解嘧菌酯的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种利用苍白杆菌高效降解嘧菌酯的方法。
背景技术
嘧菌酯是一种常用的甲氧基丙烯酸酯类农药。该农药已被广泛用于防治作物病害，是农药市场上的主要品种之一。但是，近年研究发现嘧菌酯残留对非靶标生物具有潜在的危害，如对蜜蜂、鱼类和水生无脊椎动物具有很高的毒性，对人类和其他哺乳动物具有慢性毒性，长期接触或摄入将导致慢性疾病，甚至有致癌、致畸、致突变的危险。鉴于嘧菌酯使用的广泛性及其残留危害，消除嘧菌酯残留污染显得尤为必要。
微生物降解技术目前已成为治理农药残留污染的有效措施，与传统的物理化学方法相比具有操作简便、经济实用、环境友好等优点，拥有广阔的应用前景。但是，微生物降解农药残留受到诸多条件影响，如微生物接种量、温度、pH、湿度和农药性质等等。因此，如何优化微生物的降解工艺条件，使其降解效果达到最大化是科研工作者亟待解决的具有重大经济和社会意义的科研命题。优化微生物降解工艺的常规的方法是通过单因素试验逐个评估，因而试验次数多，工作量大，且因各因素之间可能存在交互作用，结果并不可靠。响应曲面法（Response Surface Methodology, RSM）是国外近些年来开发出的一种基于统计技术的优化方法，有试验次数少、精度高、预测性好等优点，可以有效优化和评价影响生物效能的各种因变量水平和交互作用，利用其曲面图及等高线图可直观地了解到自变量变化对因变量的影响过程，并可确定影响因素的最佳水平范围。如今，响应曲面虽已广泛应用于生物技术的各个领域，但用于优化微生物降解嘧菌酯的工艺条件尚未有相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中利用微生物降解嘧菌酯的效率低的缺陷，提供一种利用苍白杆菌高效降解嘧菌酯的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
一种利用苍白杆菌高效降解嘧菌酯的方法，是将苍白杆菌SH14在温度30.2 °C、pH 7.9和接种量为0.2 g/L的条件下降解嘧菌酯；所述苍白杆菌SH14于2013年12月20日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC M 2013681，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。
本发明所述苍白杆菌SH14来源于新加坡污水处理池中的活性污泥，是通过富集培养法分离、筛选获得，过程如下：
取活性污泥样品5 g加入50 mL基础培养基（配方为：2g (NH4)2SO4、0.2g MgSO4、0.01g CaCl2、0.005g FeSO4、0.002g MnCl2、10.5g K2HPO4、4.5g KH2PO4，蒸馏水1000 mL，调整培养基的pH为7.5），同时加入嘧菌酯原药母液（DMSO为溶剂），使嘧菌酯最终质量浓度为50 mg/L，于30 °C、150 r/min摇床下进行降解微生物富集培养。培养7d后，按10%的接种量转接到第二批含100 mg/L嘧菌酯的基础培养基中。相同条件培养7d后，再按10%的接种量转接到含嘧菌酯为200 mg/L的基础培养基中，继续培养7d。以此类推，不断增加嘧菌酯的质量浓度。最后取0.2 mL基础培养基发酵液均匀涂抹到含嘧菌酯的固体平板中反复进行划线分离，直至得到单菌落，并使用高效液相色谱法（HPLC）验证其降解效果。
上述获得的单菌落经形态学特征、生理生化特性、16S rDNA系统发育分析及API 20 NE系统鉴定为苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)，该菌株在LB固体平板中生长很快，呈现白色或淡黄色，菌落小而平、稍透明、边缘整齐、表面较湿润。通过生理生化特性测定，显示该菌株属于革兰氏阴性杆菌，好氧，接触酶、氧化酶阳性。该菌可利用葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、癸酸、柠檬酸、麦芽糖、萍果酸、硝酸钾和N-乙酰-D-葡萄糖胺；不利用精氨酸、明胶、七叶灵、己二酸、甘露醇、脲素、色氨酸、葡萄糖酸盐、苯乙酸和对硝基-β-D-甲基半乳糖。
本发明通过响应曲面法优化了苍白杆菌SH14降解嘧菌酯的降解工艺条件，响应曲面法可以减少实验次数，同时可进行因子的单次效应、二次效应以及交互效应的分析，因此用响应曲面法可以快速并高效获得菌株SH14降解嘧菌酯的最优降解工艺条件。
具体地，所述响应曲面法优化包含以下步骤：
S1.将菌株SH14进行单因素降解试验，通过依次改变影响降解的因素，如温度、pH值、菌种接种量、装液量、振荡速率，测定菌株SH14对嘧菌酯降解率，确定影响菌株SH14降解率的显著因素；
S2.选取显著因素进行响应曲面优化设计（Response Surface Methodology, RSM），根据中心复合旋转设计（Central Composite Rotatable Design, CCRD）原则进行试验设计，以显著因素为自变量（X 1, X 2, X 3），以嘧菌酯降解率为响应值（Y 1），建立多元二次回归方程：
Y 1 = 86.49 + 1.39X 1 + 2.05X 2 + 1.0X 3 - 11.22X 1 2 - 1.2X 1 X 2 - 0.13X 1 X 3 - 3.23X 2 2 - 0.53X 2 X 3 - 1.78X 3 2
S3.利用SAS 9.0统计软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应曲面图及其等高线图；
    S4.对多元二次回归方程求一阶偏导，通过解方程得到该模型的极值点，即理论最优降解工艺条件：温度30.2 °C、pH 7.9和菌种接种量0.2 g/L。
优选地，本发明所述苍白杆菌SH14降解嘧菌酯的时间为5 d。
优选地，上述高效降解嘧菌酯的方法中，所述苍白杆菌SH14的基础培养基的组分为：2g (NH4)2SO4、0.2g MgSO4、0.01g CaCl2、0.005g FeSO4、0.002g MnCl2、10.5g K2HPO4、4.5g KH2PO4，蒸馏水1000 mL，调整培养基的pH为7.9。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种利用苍白杆菌高效降解嘧菌酯的方法，即将苍白杆菌SH14在温度30.2 °C、pH 7.9条件下降解嘧菌酯，所述苍白杆菌SH14的接种量为0.2 g/L；利用上述降解工艺条件，苍白杆菌SH14对50 mg/L的嘧菌酯的降解率达85%以上；本发明所述方法可以为以后大规模工业应用提供理论实践依据，具有广泛的意义。
附图说明
图1. 主要因子影响菌株SH14降解效果的预测模型。
图2. 温度（X 1）与pH （X 2）交互影响菌株SH14降解效果的响应曲面图（a）及其等高线图（b）。
 图3. 温度（X 1）与接种量（X 3）交互影响菌株SH14降解效果的响应曲面图（a）及其等高线图（b）。
 图4. pH（X 2）与接种量（X 3）交互影响菌株SH14降解效果的响应曲面图（a）及其等高线图（b）。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明所述菌株降解嘧菌酯的实验过程如下：
菌株的基础培养基：2g (NH4)2SO4、0.2g MgSO4、0.01g CaCl2、0.005g FeSO4、0.002g MnCl2、10.5g K2HPO4、4.5g KH2PO4，蒸馏水1000 mL，调整培养基的pH为7.9。
在菌株的液体培养基中加入嘧菌酯进行菌株SH14降解嘧菌酯的实验，应用高效液相色谱法（HPLC）测定菌株SH14对嘧菌酯的降解率。
实施例1 单因素考察实验
选取温度、pH值、菌种接种量、装液量、振荡速率作为影响嘧菌酯降解率的主要因素，并依次改变上述各个因素，考察降解菌Ochrobactrum anthropi SH14（苍白杆菌SH14）对嘧菌酯的降解效果，结果发现，温度、pH值和菌种接种量这三个因素对嘧菌酯的降解率影响显著。
实施例2 响应曲面优化实验
根据单因素实验结果，选取温度、pH值和菌种接种量这三个因素进行响应曲面优化设计，利用SAS 9.0统计软件根据中心复合旋转设计(Central Composite Rotatable Design, CCRD)原则进行试验设计（表1），以温度(X 1)、pH值(X 2)和菌种接种量(X 3)为自变量，以嘧菌酯的降解率为响应值(Y 1)，建立多元二次回归方程：
Y 1 = 86.49 + 1.39X 1 + 2.05X 2 + 1.0X 3 - 11.22X 1 2 - 1.2X 1 X 2 - 0.13X 1 X 3 - 3.23X 2 2 - 0.53X 2 X 3 - 1.78X 3 2
统计分析结果见表2～4，统计分析结果表明，本试验所选用响应面模型稳定可靠，其决定系数(R 2)和校正决定系数(Adj.R 2)分别为0.9858和0.9759，表明试验实测值与预测值之间具有高度的相关性。均方根误差(Root Mean Square Error, RMSE)和变异系数(Coefficient of Variation, CV)分别为1.6和2.1%，说明该模型方程能够很好地反映真实的试验值。
回归方程各项的方差分析表明，温度(X 1)、pH(X 2)和接种量(X 3)对菌株SH14降解效果的一次效应均达到显著水平(P<0.05)，其中温度(X 1)和pH(X 2)对菌株SH14降解效果达到极显著水平(P<0.01)；其二次效应X 1 2、X 2 2和X 3 2对菌株SH14降解效果也达到极显著水平(P<0.01)；温度(X 1)和pH(X 2)的交互效应(X 1 X 2)达到显著水平(P<0.05)，但其他交互效应X 1 X 3和X 2 X 3影响不显著(P>0.05)。
 [0025] 为了能更直观的反映出各因素及其交互效应，利用SAS软件程序作出响应曲面图及其等高线图，如图2～4，温度(X 1)和pH(X 2)交互效应的响应曲面图及其等高线图见图2。该图表示当菌种接种量为试验水平中心点时(X 3 = 0.2 g/L)，温度和pH对响应值即菌株SH14对50 mg/L嘧菌酯降解效果的交互影响效应。随着温度和pH的增加，菌株SH14对嘧菌酯的降解率也会随之增大，但当温度和pH增加到一定值后，嘧菌酯降解率开始下降。温度(X 1)和接种量(X 3)、pH(X 2)和接种量(X 3)交互效应的响应曲面图及其等高线图分别见图3和图4。
根据所拟合响应曲面的形状可知，回归模型存在稳定点，此方程的二次方项系数均为负值，且抛物面的开口向下，因而有最大值点。为了获得菌株SH14降解工艺条件的最佳组合，对多元二次回归模型方程求一阶偏导，通过解方程得到该模型的临界值，即理论最优降解工艺条件：X 1、X 2和X 3分别对应值为0.0450、0.28947和0.23597，即温度 30.2 °C、pH 7.9和菌种接种量0.2 g/L（表5）。
    为了检验上述响应曲面法获得的最优降解条件的准确性，使用苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi )SH14并按照温度30.2 °C、pH 7.9和接种量0.2 g/L的工艺条件去降解嘧菌酯，处理后5 d后，对50 mg/L的嘧菌酯的降解率达到85%以上，该结果与上述应用响应曲面法获得的最优工艺条件的预测降解率（即理论预测最大降解率）86.9%基本一致，表明应用本发明所述最优降解工艺条件十分可靠，并可高效降解嘧菌酯。

Claims (4)

1.一种利用苍白杆菌高效降解嘧菌酯的方法，其特征在于，将苍白杆菌SH14在温度30.2 °C、pH 7.9和接种量为0.2 g/L的条件下降解嘧菌酯，所述苍白杆菌SH14于2013年12月20日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2013681。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苍白杆菌SH14降解嘧菌酯的工艺条件由响应曲面优化设计得到。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苍白杆菌SH14降解嘧菌酯的时间为5 d。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述苍白杆菌SH14的基础培养基的组分为：2g (NH4)2SO4、0.2g MgSO4、0.01g CaCl2、0.005g FeSO4、0.002g MnCl2、10.5g K2HPO4、4.5g KH2PO4，蒸馏水1000 mL，调整培养基的pH为7.9。
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