CN110255717A - 一种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的降解菌及其应用 - Google Patents

一种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的降解菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的降解菌及其应用。本发明首次发现副球菌(Paracoccus communis)对嘧菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的降解作用，并筛选得到一株高效快速降解嘧菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的副球菌菌株ZX‑3。基于本发明，副球菌对嘧菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的生物降解效果显著，且在较宽的pH和温度范围内均能发挥有效降解，并耐受较高浓度杀菌剂，可用于修复嘧菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂污染的水体、土壤等污染环境的生物修复方面。本发明为打破现有治理农药残留污染瓶颈提供了新的开发途径，丰富了农药降解菌的种质资源库，应用前景广阔。

Description

一种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的降解菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物降解技术领域。更具体地，涉及一种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的降解菌及其应用。
背景技术
甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是目前全球销量额最高的保护性杀菌剂，是化学保护性杀菌剂中持效期最长的成分。该类杀菌剂内吸活性好，杀菌谱广，对几乎所有真菌性病害均有防治效果。另外，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂除杀菌活性外，也具有一定的生长调节作用。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂常见成分如嘧菌酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯。其中嘧菌酯(Azoxystrobin)又称(E)-[2-[6-(2-氰基苯氧基)嘧啶-4-基氧]苯基]-3-甲氧基丙烯酸甲酯，商品名阿米西达，是先正达公司在1996年成功研发的一种广谱、高效型农用杀菌剂；这种杀菌剂对草莓白粉病、黄瓜白粉病、梨黑星病、稻瘟病等真菌性植物病害具有良好的防效。醚菌酯与三唑类杀菌剂有着相似的植物生长调节功能，施用后能够增加植物的生物量和作物产量，更重要的是，这种杀菌剂能替代施用于一些已经对三唑类杀菌剂产生抗性的病害，因此已逐渐成为市场应用广泛的农用杀菌剂之一。
然而，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂不同成分，安全性存在较大差别。而且化学合成农药普遍具有难于降解、半衰期长的特点，大量施用或操作不规范都会残留在作物、水体和土壤等环境中，长久下来会影响土壤肥力，甚至降低农作物产量，更会对生态环境和人类健康造成危害。研究报道表明，水体环境中残留的嘧菌酯不仅对非靶标生物(大型溞、鱼类等)生长、繁殖和遗传产生不良影响，而且会直接影响浮游动植物的群落结构；此外，大量研究表明嘧菌酯还对哺乳类动物甚至人体健康具有潜在威胁。因此，如何消除环境中的嘧菌酯等农药残留已成为科研工作者亟待解决的具有重大经济和社会意义的科研命题。
生物修复技术是一种利用微生物或其他生物将环境中的有害污染物降解为无机小分子化合物的新兴技术，具有高效、安全、无残留、无二次污染等优点，逐渐成为治理农药残留、重金属超标等各种污染的最佳选择方案。目前利用生物修复技术成功治理有机物污染的例子很多，例如国内的北京佳农新贸易发展有限公司已成功生产“比亚”降解酶制剂，国际上利用微生物治理石油面源污染等。但是，由于微生物对农药的矿化能力和降解性能不稳定，导致现有的降解菌资源库远远不能满足化学农药残留污染生物降解的实际需求。特别是目前还鲜有专门针对嘧菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的降解制剂产品。
副球菌(Paracoccus communis)是短杆状、革兰氏染色阴性的一种微生物，有研究显示其具有降解氟铃脲、吡啶类、噻嗪酮、久效磷及有机磷农药的报道(CN200510022549.1、CN200910027112.5、CN201610841011.1)。而对于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂有无降解作用尚未有研究报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有嘧菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂农药残留降解修复技术的缺陷和不足，提供一种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的高效降解菌，即副球菌(Paracoccus communis)，该菌能够快速高效降解嘧菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，可用于修复此类农药残留污染的土壤和水体等环境。
本发明的目的是提供副球菌(Paracoccus communis)在降解甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂以及修复甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂污染的自然环境方面的应用。
本发明另一目的是提供一株可高效降解甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的副球菌菌株ZX-3。
本发明的再一目的是提供所述副球菌菌株ZX-3在降解甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂以及修复甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂污染的自然环境方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首次发现副球菌(Paracoccus communis)对嘧菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的降解作用，并筛选得到一株高效快速降解嘧菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的副球菌菌株ZX-3，于2019年5月15日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:60667，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
该菌株是从广东肇庆农药厂污水处理口的活性污泥中经人工富集培养、分离纯化得到，对嘧菌酯具有高效快速的降解效能，在以嘧菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂为唯一碳源的基础盐培养基中培养7天，对嘧菌酯的降解率达到80％以上；且在较宽的pH和温度条件下均能较好降解嘧菌酯，可耐高浓度嘧菌酯；将该菌株接种污染土壤10天后，土壤中杀菌剂残留量降低77％以上，降解能力优异，可高效快速去除水体和土壤中该类农药残留量，菌株ZX-3可以作为优良的生物降解菌应用于嘧菌酯农药污染的生物修复。
因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：
副球菌在降解甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂或制备降解菌剂方面的应用。
副球菌在修复甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂污染的自然环境或制备修复菌剂方面的应用。
所述副球菌菌株ZX-3在降解甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂或制备降解菌剂方面的应用。
所述副球菌菌株ZX-3在修复甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂污染的自然环境或制备修复菌剂方面的应用。
其中，所述甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂包括嘧菌酯、醚菌酯和/或吡唑醚菌酯。
所述自然环境包括水体或土壤等。
一种含有副球菌的高效降解甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的菌剂，也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述副球菌为副球菌菌株ZX-3。
优选地，所述菌剂中菌体的数量不低于1.0×107CFU/mL。使用时可将降解菌剂稀释后喷洒到水体或土壤中，稀释后的降解菌剂中菌体的数量至少达到1.0×107CFU/mL。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次公开了副球菌(Paracoccus communis)对嘧菌酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的降解作用，并筛选得到一株高效快速降解嘧菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的副球菌菌株ZX-3，丰富了农药降解菌的种质资源库，在该类农药残留污染的水体和土壤生物修复中有重大应用价值，为打破现有治理农药残留污染瓶颈提供了新的开发途径。
而且，该菌在较宽的pH和温度范围内均能有效降解嘧菌酯，并耐受较高浓度嘧菌酯(200mg/L)，证明菌株ZX-3可以作为优良的农药降解菌应用于嘧菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂污染环境的生物修复方面。
附图说明
图1为副球菌菌株ZX-3在LB固体培养基上培养2d的菌落形态特征图。
图2为副球菌菌株ZX-3的扫描电镜图。
图3为副球菌菌株ZX-3的16S rDNA的系统发育树。
图4为副球菌菌株ZX-3生长与降解嘧菌酯的动态关系。
图5为副球菌菌株ZX-3在不同pH条件下对嘧菌酯的降解效果。
图6为副球菌菌株ZX-3在不同温度下对嘧菌酯的降解效果。
图7为副球菌菌株ZX-3在不同接菌量下对嘧菌酯的降解效果。
图8为副球菌菌株ZX-3对不同浓度嘧菌酯的降解效果。
图9为副球菌菌株ZX-3对不同甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的降解效果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中所述培养基配方如下：
基础盐培养基(MSM，g/L)：(NH4)2SO4，2.0g；CaCl2·2H2O，0.01g；FeSO4·7H2O，0.001g；Na2HPO4·12H2O，1.5g；MgSO4·7H2O，0.2g；KH2PO4，1.5g，pH 7.0。固体培养基：每1L液体培养基加入18～20g琼脂粉。
LB培养基：酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，去离子水1000mL，pH7.2，121℃灭菌20min。固体培养基：每1L液体培养基加入18～20g琼脂粉。
实施例1菌株的分离与鉴定
1、嘧菌酯降解菌株的筛选分离：
采集广东肇庆农药厂排污口的活性污泥，称取5g活性污泥样品加入到50mL含有嘧菌酯(100mg/L)的液体基础盐培养基中。经30℃，200rpm培养7d后，每次按10％的接种量，将农药质量浓度从100mg/L依次升至200mg/L、400mg/L、800mg/L连续富集培养。然后将转接3次的培养液梯度稀释涂布于含有50mg/L嘧菌酯的MSM固体平板上，30℃倒置培养2d。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落在LB平板上多次划线纯化，分离获得一株高效降解菌，编号为ZX-3。
2、菌株ZX-3的鉴定
(1)形态学鉴定：
将菌株ZX-3接种于LB固体平板上30℃倒置培养2d，观察其菌落形态。LB平板培养2d的菌落呈棕黄色，圆形，凸起，表面光滑不透明，边缘整齐(见图1)。扫描电镜下观察到该菌细胞呈球状或短杆状，易成堆，无鞭毛(见图2)。
(2)生理生化鉴定：
菌株ZX-3生理生化特性鉴定结果：该菌株为革兰氏阴性细菌，好氧，接触酶试验、氧化酶试验、明胶液化试验反应阳性，淀粉水解、硝酸盐还原试验反应阴性。其生理生化鉴定结果如表1所示。
表1菌株ZX-3生理生化特性
注：“+”代表反应阳性；“-”代表反应阴性。
(3)16S rDNA分子生物学鉴定：
提取菌株ZX-3基因组DNA，以提取的基因组为模板，采用16S rDNA细菌通用引物(27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1429R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增，PCR产物委托上海英潍捷基贸易有限公司进行测序。测序结果提交GenBank数据库并进行注册，其注册号为：MF942375。同时，将菌株测得的16S rDNA序列在GenBank数据库中利用BLAST进行比对分析，并选择同源性较高的相关序列利用Clustal 1.8.1及MAGE 5.0软件构建系统进化树及分析进化关系。
16S rDNA的系统发育树如图3所示，本发明分离纯化得到的菌株ZX-3与Paracoccus communis S3进化距离最近，其培养特征与扫描电镜观察特征与副球菌(Paracoccus communis)也最为相似，因此本发明筛选获得的降解菌鉴定为副球菌(Paracoccus communis)。
(4)Biolog鉴定系统鉴定：
微生物对不同碳源的利用能力与其种类有关，这种特性可作为一种分类依据。Biolog微生物自动分析是指通过确定微生物对多种碳源(如糖、胺、醋、酸、醇和大分子聚合物等)的利用情况来鉴定微生物的属种。将菌株ZX-3培养16-24h后置于BiologMicrostation System读数仪上读结果。Biolog软件读取的96孔微平板反应结果按照与数据库的匹配程度自动列出结果，表2为菌株ZX-3的Biolog微生物自动分析系统的鉴定结果，结果表明菌株ZX-3与副球菌(Paracoccus communis)匹配良好。
表2菌株ZX-3的Biolog系统鉴定结果
注：+,代表反应阳性；－,代表反应阴性
综上鉴定结果，本发明的菌株ZX-3鉴定为副球菌(Paracoccus communis)，并于2019年5月15日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:60667，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2菌株ZX-3对嘧菌酯的降解效果实验
1、实验方法
(1)种子液制备：将纯化后的菌种ZX-3接入含有5mL的LB液体培养基过夜活化培养至对数期，4℃低温离心后菌体用生理盐水(0.9％NaCl)冲洗，所得菌体作为接种体。
(2)降解性能测定：按菌液OD600值为2.000的菌体接种至50mL含有嘧菌酯(50mg/L)的MSM培养液中，以不接菌作为对照，每组三个重复。在30℃，200rpm恒温摇床培养5d，每1d取样一次，测定菌株ZX-3的生长情况，并采用HPLC测定其对嘧菌酯的降解情况。
(3)色谱条件：
HPLC：2690型(Waters,USA)
色谱柱：C18反相柱(Phenomenex，250nm×4.60mm，5μm)
流速：1mL·min-1
柱温：常温(30±1℃)
流动相：乙腈：水＝60：40
检测波长：230nm
进样量：10μL
按照下式计算嘧菌酯降解率：降解率(％)＝(1-A1/A0)×100，
其中，A1为降解菌处理后嘧菌酯残留浓度，A0为对照处理后的嘧菌酯残留浓度。
质量控制：采用外标法校正标准物质制作标准曲线。
2、实验结果
结果如图4所示，菌株ZX-3能快速降解嘧菌酯，并利用其作为生长基质。且嘧菌酯降解与菌株ZX-3生长呈正相关。在嘧菌酯作为唯一碳源条件下，菌株ZX-3生长没有产生明显的滞后期，并迅速进入生长对数期，1～2d为菌株的生长对数期，此时该菌株对嘧菌酯的降解最快；随着菌株生长达到稳定期，此时嘧菌酯的降解曲线趋于平缓；培养4d后，菌株开始进入衰亡期。培养7d后，降解菌株ZX-3对嘧菌酯的降解率达到83.8％，而对照(自然降解率)为9.1％。
该结果说明菌株ZX-3可利用嘧菌酯作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，在嘧菌酯浓度为50mg/L时，培养至7d，降解率为83.8％，表明该菌株具有高效快速降解嘧菌酯的能力。
实施例3菌株ZX-3对嘧菌酯的降解特性研究
1、实验方法
(1)pH值对ZX-3降解嘧菌酯的影响：
将MSM液体培养基的pH值分别调至5.0、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5和10.0，并将不同pH值的MSM培养基分装50mL到250mL三角瓶中，灭菌后冷却备用。将菌液OD600值为2.000的菌体接种到培养基中，并加入嘧菌酯作为生长基质，使其最终质量浓度为50mg/L，每个处理重复3次。以不接菌的处理为对照组。样品在30℃、200rpm恒温摇床中培养5d，每隔24h取样，并采用HPLC测定菌株ZX-3在不同pH条件下对嘧菌酯的降解情况。
(2)温度对ZX-3降解嘧菌酯的影响：
将菌液OD600值为2.000的菌体接种到装有50mL灭菌MSM液体培养基(pH7.5)的250mL三角瓶中，并添加嘧菌酯标准工作母液，使其最终质量浓度为50mg/L，每个处理重复3次。以不接菌的处理为对照组。样品将分别置于20℃、25℃、30℃和35℃摇床中培养5d。每隔24h取样，并采用HPLC测定菌株ZX-3在不同培养温度条件下对嘧菌酯的降解情况。
(3)接种量对ZX-3降解嘧菌酯的影响：
将菌液OD600值分别调至1.400、1.700、2.000和2.300，然后将各个OD600值的菌体接种到装有50mL灭菌MSM液体培养基(pH 7.5)的250mL三角瓶中，并添加嘧菌酯标准工作母液，使其最终质量浓度为50mg/L，每个处理重复3次。以不接菌的处理为对照组。样品在30℃、200rpm恒温摇床中培养5d。每隔24h取样，并采用HPLC测定菌株ZX-3在不同初始接种量条件下对嘧菌酯的降解情况。
(4)嘧菌酯初始浓度对ZX-3降解性能的影响：
将菌液OD600值为2.000的菌体接种到装有50mL灭菌MSM液体培养基(pH7.5)的250mL三角瓶中，并添加不同量的嘧菌酯标准工作母液，使其最终质量浓度分别为25mg/L、50mg/L、100mg/L和200mg/L，每个处理重复3次。以不接菌的处理为对照组。样品在30℃、200rpm恒温摇床中培养5d。每隔24h取样，并采用HPLC测定菌株对不同初始浓度嘧菌酯的降解情况。
2、实验结果如图5～8所示。
图5显示pH值对菌株ZX-3降解嘧菌酯的影响，当pH＝7.5时，菌株ZX-3对嘧菌酯的降解效果最好，培养5d后，ZX-3对嘧菌酯(50mg/L)的降解率高达81.0％；pH高于或低于7.5时，菌株降解率有下降，但依然保持较高降解率。
图6显示温度对菌株ZX-3降解嘧菌酯的影响，当温度在30℃时，菌株ZX-3对嘧菌酯(50mg/L)的降解效果最好，培养5d后降解率达到80.0％；当温度高于或低于30℃时，菌株对嘧菌酯的降解能力有所下降，但依然保持较高降解率。
图7显示接种量对菌株ZX-3降解嘧菌酯的影响，当接菌种子液的OD600为1.400、1.700、2.000和2.300时，菌株对嘧菌酯的降解能力随着接菌量的增加而上升，即嘧菌酯降解率与接菌量呈正相关。
图8显示嘧菌酯初始浓度对菌株ZX-3降解性能的影响，当嘧菌酯的初始浓度为50mg·L-1时，菌株ZX-3对其的降解能力最好；当嘧菌酯初始浓度高于或低于50mg·L-1时，菌株降解能力有下降，但依然具有较高降解率。
结果表明，菌株ZX-3对嘧菌酯的降解作用受环境影响不大，在现有常规条件下均能高效快速降解嘧菌酯，如较宽pH(5.0～9.0)和温度范围(20～35℃)内，均能快速降解嘧菌酯，并能够耐受200mg/L嘧菌酯，为其在复杂环境中的应用提供了保证。
实施例4菌株ZX-3对土壤中嘧菌酯降解效果研究
1、供试土样
农田表层土(3～10cm)，取自华南农业大学教学农场试验田，属红壤土，超过5年未施用嘧菌酯农药。
土壤样品取回后首先置于阴凉通风处自然风干，风干后碾磨，过2mm筛，分别取一定量的嘧菌酯溶于丙酮中，然后浸泡硅藻土，使嘧菌酯被完全吸附。浸泡后的硅藻土置于通风橱中吹干，将其拌入土壤中，使土壤中嘧菌酯的终浓度为50mg/kg。取500g土样于30℃恒温恒湿培养箱中培养，按1.0×107CFU/mL的接种量接入ZX-3降解菌悬液，以加蒸馏水的作为对照，土壤的持水量保持在40％。在30℃和避光条件下连续培养10天，并定期取样，HPLC法测定嘧菌酯残留量并计算降解率。降解率计算方法如实施例2。
2、测定结果如表3，培养10d后，菌株ZX-3对土壤中的嘧菌酯降解率可达到77.1％。
表3菌株ZX-3降解土壤中嘧菌酯效果
结果表明，菌株ZX-3在直接施入土壤中后，没有出现不降解或降解滞后效应现象，其降解性能稳定，为菌株ZX-3对嘧菌酯的土壤修复提供了科学依据。
实施例5菌株ZX-3对其它甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂降解效果研究
1、实验方法
(1)种子液制备：如实施例2。
(2)降解性能测定：将菌液OD600值为2.000的菌体接种到装有50mL灭菌MSM液体培养基(pH 7.5)的250mL三角瓶中，并添加吡唑醚菌酯或醚菌酯使其终浓度为50mg/L，以不接菌作为对照，每组三个重复。在30℃，200rpm恒温摇床培养7d，每1d取样一次，并采用HPLC测定其对吡唑醚菌酯的降解情况。
色谱条件和降解率计算方法：如实施例2。
2、实验结果
结果如图9所示，测定了菌株ZX-3对不同甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的降解能力。菌株ZX-3均能利用嘧菌酯、醚菌酯和吡唑醚菌酯作为唯一碳源生长，对不同的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂都具有降解能力。
其中菌株ZX-3对嘧菌酯的降解效果最好。培养7d后，菌株ZX-3对50mg·L-1的嘧菌酯降解率为83.8％；对50mg·L-1的醚菌酯降解率为50.7％；对50mg·L-1的吡唑醚菌酯的降解率为53.7％。表明该菌株对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的降解具有广谱性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.副球菌(Paracoccus communis)在降解甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂或制备降解菌剂方面的应用。
2.副球菌(Paracoccus communis)在修复甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂污染的自然环境或制备修复菌剂方面的应用。
3.一株副球菌(Paracoccus communis)菌株ZX-3，其特征在于，于2019年5月15日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:60667，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
4.权利要求3所述副球菌菌株ZX-3在降解甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂或制备降解菌剂方面的应用。
5.权利要求3所述副球菌菌株ZX-3在修复甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂污染的自然环境或制备修复菌剂方面的应用。
6.根据权利要求1、2、4、5任一所述应用，其特征在于，所述甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂为嘧菌酯、醚菌酯和/或吡唑醚菌酯。
7.根据权利要求2或5所述应用，其特征在于，所述自然环境为水体或土壤。
8.一种高效降解甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的菌剂，其特征在于，含有副球菌。
9.根据权利要求8所述菌剂，其特征在于，所述副球菌为副球菌菌株ZX-3。
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