CN104450567B - 假单胞菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体公开一种假单胞菌及其用途。本发明的假单胞菌已于2014年9月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为：Pseudomonas sp.SY‑JF‑1，保藏编号：CCTCC No:M2014401。本发明的假单胞菌能够用于降解间甲酚，以及用于处理含有间甲酚的工业废水。

Description

假单胞菌及其用途
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种假单胞菌及其用途。
背景技术
间甲酚是酚类化合物中具有代表性的一种物质，是生产一些杀虫剂以及彩色胶片、树脂、増塑剂和香料合成的中间体。间甲酚存在着两种异构体对甲酚(p-cresol)和邻甲酚(o-cresol)。这两种异构体均具有强烈的腐蚀性和毒性，被美国EPA列入环境优先控制污染物的黑名单，同时也是我国重点控制污染物之一。根据《污水综合排放标准》(GB8978—1996)，一切排污单位的最高允许排放间甲酚的浓度不超过0.5mg/L，可见间甲酚的环境污染控制非常重要。
在处理含甲酚的废水领域中，生物法与物化法相比较表现出经济、安全、处理阈值低、残留少、无二次污染等方面的优点，在应用方面更显优势。这方面典型的工作有：Masahiro等在一个三相生物反应器中降解邻甲酚，初始浓度在30～600mg/L时都能完全降解，降解反应符合Haldane模型；Christian Kennes等利用UASB反应器以对甲酚和挥发性脂肪酸为原料产生甲烷，效果良好；Atagana等从油污污染土壤中筛选出7种非担子类真菌及2种担子类真菌，用它们降解苯酚、间甲酚、邻甲酚及对甲酚混合物，并考察了最适环境条件。
但是，间甲酚的含量过高会抑制微生物的生长，使废水处理停留时间过长，降低处理效率。目前所报道的能降解间甲酚的菌种主要有热带假丝酵母菌、麦芽糖假丝酵母菌、杂色云芝和一些厌氧产烷微生物等。采用这些菌种进行生物法处理间甲酚的理论浓度一般都在500mg/L以下。
发明内容
本发明旨在克服现有生物法无法处理高浓度间甲酚的技术缺陷，提供一种新型假单胞菌，能够解决现有生物法处理含高浓度间甲酚工业废水时酚降解率低的问题。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种假单胞菌，保藏名称为：Pseudomonas sp.SY-JF-1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2014年9月9日，保藏号：CCTCC No:M2014401。
另一方面，本发明提供上述假单胞菌的用途，用于降解间甲酚，以及用于处理含有间甲酚的工业废水。
本发明的有益效果在于：本发明的假单胞菌能够耐受浓度高达800mg/L的间甲酚，在浓度为600mg/L的间甲酚中能够高效降解间甲酚，能够很好的应用于含间甲酚废水的生物处理。
附图说明
图1为SY-JF-1菌株对不同初始浓度间甲酚的降解曲线图；
图2为SY-JF-1菌株对浓度为800mg/L的间甲酚酚的降解曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。
本发明提供一种假单胞菌，保藏名称为：假单胞菌SY-JF-1，Pseudomonas sp.SY-JF-1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2014年9月9日，保藏号：CCTCC No:M2014401。
该假单胞菌属于革兰氏阴性菌类，简称SY-JF-1菌株。SY-JF-1菌株的形态特征为：细胞呈杆状，菌落乳白色、隆起、边缘光滑齐整。SY-JF-1菌株在生长过程中能耐受800mg/L的间甲酚，SY-JF-1菌株的最适生长条件为：pH7.0，温度30℃。
间甲酚无机盐分离培养基成分为(g/L)：0.9KH2PO4，6.5Na2HPO4·12H2O，0.4(NH4)2SO4，0.2MgSO4·7H2O；每1L培养基加入1mL微量元素溶液(微量元素溶液配制：1g FeSO4·7H2O，1g MnSO4·H2O，0.25g Na2MoO4·2H2O，0.1g H3BO4，0.25g CuCl2·2H2O，0.25g ZnCl2，0.1g NH4·VO3，0.25g Co(NO3)2·6H2O，0.1g NiSO4·6H2O，溶解于900mL蒸馏水中，加5mL浓H2SO4，补蒸馏水至1000mL)；间甲酚过滤灭菌，待无机盐培养基高温高压灭菌后加入，终浓度最初为100mg/L，以后间甲酚浓度每次增加100mg/L。
SY-JF-1菌株可以高效降解间甲酚，在以间甲酚为碳源(600mg/L)、(NH4)2SO4为氮源(400mg/L)的无机盐培养液体培养基中接种SY-JF-1菌株后，30℃，pH为6.5—9.5范围内可高效降解间甲酚，48h内间甲酚降解率达到99％以上。
SY-JF-1菌株分离自辽宁某焦化厂生化好氧池活性污泥，经人工富集驯化培养并分离纯化得到。具体包括如下步骤：
1、SY-JF-1菌株的分离和纯化
用250mL三角瓶，装100mL间甲酚无机盐培养基(g/L)(0.9KH2PO4，6.5Na2HPO4·12H2O，0.4(NH4)2SO4，0.2MgSO4·7H2O，每1L培养基加入1mL微量元素溶液，间甲酚过滤灭菌，待无机盐培养基高压灭菌后加入)。微量元素溶液配方(g/L)：1g FeSO4·7H2O，1g MnSO4·H2O，0.25g Na2MoO4·2H2O，0.1g H3BO4，0.25g CuCl2·2H2O，0.25g ZnCl2，0.1g NH4·VO3，0.25g Co(NO3)2·6H2O，0.1g NiSO4·6H2O，溶解于900mL蒸馏水中，加5mL浓H2SO4，补蒸馏水至1000mL。向培养基中接入5mL从辽宁省某焦化厂采集的生化好氧池活性污泥，于30℃、转速为150r/min的摇床中振荡培养3d得到菌液。取5mL菌液接种到100mL新培养基中，重复转接7次。间甲酚起始浓度为100mg/L，以后每次转接间甲酚浓度增加100mg/L，直到800mg/L为止。
驯化培养好的菌液按10-3、10-4、10-5、10-6和10-7稀释，取0.1mL 10-5稀释液涂在含有800mg/L苯酚的无机盐培养基平板上，30℃倒置培养2～3d，挑取单菌落，进行3次划线分离纯化，得到纯化的SY-JF-1菌株。
2、SY-JF-1菌株的鉴定
采用16S rRNA基因测序法对SY-JF-1菌株进行分类鉴定，具体步骤如下：
(1)细菌总DNA的制备：用天根公司基因组提取试剂盒提取SY-JF-1菌株的基因组DNA，作为PCR反应的模板。
(2)16S rRNA基因的PCR扩增：扩增引物如下：
27F：5’—AGAGTTTGATCMTGGCTCAG—3’[M＝C,A]
1492R：5’—CGGYTACCTTGTTACGACTT—3’[Y＝T,C]
PCR反应体系：
PCR反应条件：
a.94℃3分钟
b.94℃1分钟
c.55℃30秒
d.72℃1分钟
e.72℃1分钟
其中，在a步骤之后，b、c、d三个步骤进行30个循环，之后再进行e步骤。
(3)PCR产物的纯化、克隆、测序和分析：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后与pMD18—T载体连接，转化到大肠杆菌DH5α，然后提取重组质粒，测定16S rRNA基因序列，将基因序列登录美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，进行核苷酸序列Blast比对，得到与相关菌株的16S rRNA基因序列同源的若干核苷酸序列，结果表明SY-JF-1菌株与假单胞菌(Pseudomonas sp.)的16S rRNA基因序列的同源性在99％以上，所以分离菌株被鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。
本发明的另一个方面是SY-JF-1菌株在含间甲酚工业废水生物处理中的应用。具体应用方法为将SY-JF-1菌株在以间甲酚为碳源(800mg/L)、(NH4)2SO4为氮源(400mg/L)的无机盐培养液体培养基中25～35℃振荡培养72h，然后按5％的接种量将菌液接种到含间甲酚量低于800mg/L的工业废水中，25～35℃震荡培养72h以后，99％以上的间甲酚被去除。
下面结合具体实施例来说明SY-JF-1的用途。
一、SY-JF-1菌株对间甲酚的降解作用
实施例1
在pH7.0，温度30℃条件下，将SY-JF-1菌株的培养物接种于100mL以间甲酚为唯一碳源的无机盐培养基中，150r/min振荡培养每隔6h取一次样，用气相色谱法测定样品中残留间甲酚含量，其中间甲酚初始浓度分别为100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L、800mg/L、900mg/L，测得数据如图1中所示。由图1可见，SY-JF-1菌株在间甲酚初始浓度低于800mg/L(含800mg/L)时可以有效的将其降解，降解率大于99％，而当间甲酚的初始浓度为900mg/L时SY-JF-1菌株失去对其的降解能力。即由图1的数据可以看出，SY-JF-1菌株对间甲酚的耐受能力为800mg/L。
另外，测定SY-JF-1菌株对初始浓度为800mg/L间甲酚的降解曲线，将SY-JF-1菌株的培养物接种于100mL以间甲酚为唯一碳源的无机盐培养基中，培养基pH为7.0，间甲酚初始浓度为800mg/L，于30℃、150r/min振荡培养，每隔6h取样，以时间为横坐标，以间甲酚的残留浓度及OD600值(菌体浓度)为纵坐标绘制降解曲线，结果见图2，其中，曲线A为间甲酚的残留浓度随时间变化的曲线，曲线B为菌体浓度随时间的变化曲线。由图2可知，培养基初始间甲酚浓度为800mg/L时，SY-JF-1菌株可在72h内将培养基中间甲酚降解99％以上，最终培养液中间甲酚浓度低于1mg/L。
二、SY-JF-1菌株在含酚工业废水处理中的应用
实施例2
SY-JF-1菌株在以间甲酚为碳源(800mg/L)、(NH4)2SO4为氮源(400mg/L)的无机盐培养液体培养基中30℃振荡培养72h，然后按5％的接种量将菌液接种到间甲酚含量为589mg/L的辽宁某石化厂废水中，30℃振荡培养48h后，间甲酚残留量为0.2mg/L，间甲酚去除率达到99％。而不添加SY-JF-1菌株的对照组间甲酚残留量为486mg/L，间甲酚去除率仅为18％。
实施例3
将SY-JF-1菌株在以间甲酚为碳源(800mg/L)、(NH4)2SO4为氮源(400mg/L)的无机盐培养液体培养基中30℃振荡培养72h，然后按5％的接种量将菌液接种到间甲酚含量为689mg/L的河北某焦化厂废水中，30℃振荡培养48h后，间甲酚残留量为257mg/L，间甲酚去除率达到62.7％。而不添加SY-JF-1菌株的对照组间甲酚残留量为596mg/L，间甲酚去除率仅为13.5％。
实施例4
将SY-JF-1菌株在以间甲酚为碳源(800mg/L)、(NH4)2SO4为氮源(400mg/L)的无机盐培养液体培养基中30℃振荡培养72h，然后按5％的接种量将菌液接种到间甲酚含量为740mg/L的黑龙江某焦化厂废水中，30℃振荡培养72h后，挥发酚残留量为0.4mg/L，挥发酚去除率达到99.9％。出水达到我国污水综合排放标准(GB16171-2012)。而不添加SY-JF-1菌株的对照组挥发酚残留量为672mg/L，间甲酚去除率仅为10％。
以上实施例均说明，SY-JF-1菌株对间甲酚具有很好的去除率，尤其是对较高浓度的间甲酚，在其他生物法难以获得高的去除率时，采用SY-JF-1菌株能够达到很好的对间甲酚的去除效果。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.一种假单胞菌(Pseudomonas sp.)，其特征在于，保藏名称为：Pseudomonas sp.SY-JF-1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2014年9月12日，保藏号：CCTCC No:M2014401。
2.如权利要求1所述的假单胞菌的用途，其特征在于，用于降解间甲酚。
3.如权利要求1所述的假单胞菌的用途，其特征在于，用于处理含有间甲酚的工业废水。
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