CN106754574B - 一种副球菌及其在降解间苯二酚中的应用 - Google Patents

一种副球菌及其在降解间苯二酚中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种副球菌，所述副球菌为副球菌（Paracoccus sp.）JB‑3，于2017年01月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No.13607。本发明还公开了该副球菌（Paracoccus sp.）JB‑3在降解间苯二酚中的应用。本发明的副球菌Paracoccus sp.JB‑3用于含间苯二酚的工业废水或自然水体中降解间苯二酚，不仅具有很高的降解速率和耐受浓度，且无二次污染，使用安全，具有广阔的应用前景。

Description

一种副球菌及其在降解间苯二酚中的应用
技术领域
本发明涉及环境微生物资源利用及有机污染废水处理领域，具体涉及一种副球菌及其在降解间苯二酚中的应用。
背景技术
间苯二酚（C6H6O2），是一种十分重要的精细化工原料和中间体，因其易发生加氢、卤化、胺化、酰化、偶合、烷基化、硝化和磺化等反应，被广泛应用于橡胶粘合剂、合成树脂、染料、医药和分析试剂等生产行业；间苯二酚是一种重要的有机化工产品和合成中间体，广泛用于轮胎制造业、胶管制造业等橡胶制造行业；间苯二酚还是许多偶氮染料、毛皮染料的中间体；间苯二酚具有杀菌作用，可用作化妆品等防腐剂；间苯二酚还可用于医药行业，主要作为皮肤科非处方药物如复方人参间苯二酚搽剂等的原料。根据不完全统计，我国2001年消耗间苯二酚约为4000吨；2003年，我国间苯二酚消费量约为8850吨；2005年消耗量约为1.34万吨，此后我国对间苯二酚的需求量逐年增加。随着近年来汽车工业的快速发展、建筑材料及房屋装修材料的需求量的大幅增加，显著刺激橡胶产品和木材胶黏剂的消费，进而拉动间苯二酚的需求。
低浓度的酚类有机污染物能够引起蛋白质变性，高浓度的酚类有机污染物能够引起蛋白质沉淀，从而导致细胞失活或者死亡。间苯二酚废水具有色度高、有机物含量高、成分复杂、难降解等特点，是典型的毒性有机工业废水。同时间苯二酚也是对人体和自然环境毒害较大的一类酚类污染物：在培养处理48h后，间苯二酚能显著抑制水生生物多刺裸腹溞体内的谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和乙酰胆碱酯酶（AChE）活力，并且对其半抑制效应浓度仅为10.75mg/L；间苯二酚浓度为27.04 mg/L时即可在24h毒死半数的泥鳅，且这种毒害作用可随间苯二酚在泥鳅体内积聚浓度的增大、作用时间的增加而显著提高，96h的半致死浓度仅为17.40mg/L。间苯二酚还可随着生物富集和生物链等途径进入陆生动物和人体内，影响人类健康：一定浓度的间苯二酚可通过静电作用力与牛血清蛋白结合，继而破坏牛血清蛋白的空间构象并改变某些氨基酸的疏水性；间苯二酚易于被皮肤吸收，人体吸收少量间苯二酚后可引起皮肤和粘膜的发炎、痉挛、发绀、甚至死亡。间苯二酚具有良好的稳定性，并且易于在动物体内积累、难以生物降解，若未经处理的含间苯二酚废水直接排放到环境中，势必会危害自然环境和生态安全。
近年来，国内主要使用物理法（如超声波降解法、树脂吸附法）、化学法（如光化学催化法）进行降解处理含间苯二酚废水，关于生物降解间苯二酚的研究较少。已筛选发现的能用于降解间苯二酚的生物资源不多，微生物资源中只有利用黄单胞菌、不动杆菌属、假单胞菌属菌株降解间苯二酚的报道。除此之外未见有利用其他微生物降解间苯二酚的报道。至今尚未见到有关利用副球菌属菌株生物降解间苯二酚的报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种副球菌及其在降解间苯二酚中的应用，该副球菌以间苯二酚为唯一碳源进行生长繁殖，可有效降解间苯二酚，为有效、安全处理含间苯二酚工业废水提供技术支持和微生物资源。
本发明还提供了该副球菌在降解间苯二酚中的应用。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种副球菌，所述副球菌为副球菌（Paracoccus sp.）JB-3，于2017年01月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No. 13607。
本发明的副球菌取样地为山东省曲阜市某污水沟污泥，该菌株经分离、纯化、驯化获得，可利用间苯二酚作为其生长的唯一碳源。本发明的副球菌经16 SrDNA鉴定属于副球菌属（Paracoccus sp.），在National Center for Biotechnology Information（NCBI）上经BLAST比对后，与菌株Paracoccus sp. R-25059（登录号为AM084106.1）的同源性达到99%。菌落照片和革兰氏染色显微镜照片乳图1所示。
所述副球菌（Paracoccus sp.）JB-3单细胞为圆球状，属于革兰氏阴性菌，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上形成圆形、隆起的乳黄色菌落，表面光滑，湿润，边缘整齐，易挑取。
一种副球菌（Paracoccus sp.）JB-3在降解间苯二酚中的应用。
所述的，副球菌（Paracoccus sp.）JB-3降解间苯二酚的具体方法为：将副球菌（Paracoccus sp.）JB-3悬浮于含间苯二酚的水中，在24-38℃、pH值为5-10的条件下培养42-72h。
所述的，副球菌（Paracoccus sp.）JB-3的接种量为5%，v/v。
所述的，含间苯二酚的水中间苯二酚的初始浓度不大于1900mg/L。
优选的，含间苯二酚的水中间苯二酚的初始浓度为1700 mg/L。
优选的，温度为30℃，pH值为7。
本发明的有益效果：本发明的副球菌Paracoccus sp.JB-3用于含间苯二酚的工业废水或自然水体中降解间苯二酚，不仅具有很高的降解速率和耐受浓度，且无二次污染，使用安全，具有广阔的应用前景。
菌种保藏信息
保藏时间：2017年01月13日，
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，
保藏编号：CGMCC No.13607，
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
分类命名：副球菌 Paracoccus sp.。
附图说明
图1为本发明副球菌Paracoccus sp.JB-3的照片。
其中：a为菌落照片，b为革兰氏染色显微镜照片。
图2为本发明副球菌Paracoccus sp.JB-3的系统发育树图。
具体实施方式
以下为列举的具体实施方式对本发明做进一步的说明，但并不因此而限制本发明的内容。
本发明所用的牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方为：蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，121℃灭菌20 min。
本发明所用的牛肉膏蛋白胨固体培养基的配方为：蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，121℃灭菌20 min。
本发明所用的无机盐液体培养基的其配方为：K2HPO4•3H2O 4g、NaH2PO4•2H2O 4g、(NH4)2SO4 2g、MgSO4 0.2g、CaCl2 0.01g、MnSO4•H2O 0.01g、FeSO4•7H2O 0.01g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，121℃灭菌20min。
本发明所用的无机盐固体培养基的其配方为：K2HPO4•3H2O 4g、NaH2PO4•2H2O 4g、(NH4)2SO4 2g、MgSO4 0.2g、CaCl2 0.01g、MnSO4•H2O 0.01g、FeSO4•7H2O 0.01g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，121℃灭菌20min。
实施例1
一种副球菌，所述副球菌为副球菌（Paracoccus sp.）JB-3，于2017年01月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No. 13607。
本发明的副球菌取样地为山东省曲阜市某污水沟污泥，该菌株经分离、纯化、驯化获得，可利用间苯二酚作为其生长的唯一碳源。本发明的副球菌经16 SrDNA鉴定属于副球菌属（Paracoccus sp.），在National Center for Biotechnology Information（NCBI）上经BLAST比对后，与菌株Paracoccus sp. R-25059（登录号为AM084106.1）的同源性达到99%。
所述副球菌（Paracoccus sp.）JB-3单细胞为圆球状，属于革兰氏阴性菌，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上形成圆形、隆起的乳黄色菌落，表面光滑，湿润，边缘整齐，易挑取。
一种副球菌（Paracoccus sp.）JB-3在降解间苯二酚中的应用。
所述的，副球菌（Paracoccus sp.）JB-3降解间苯二酚的具体方法为：将副球菌（Paracoccus sp.）JB-3悬浮于含间苯二酚的水中，在30℃、pH值为7的条件下培养72h，间苯二酚的降解率为38.61%。
所述的，副球菌（Paracoccus sp.）JB-3的接种量为5%，v/v。
所述的，含间苯二酚的水中间苯二酚的初始浓度为1900mg/L。
实施例2
一种副球菌，所述副球菌为副球菌（Paracoccus sp.）JB-3，于2017年01月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No. 13607。
本发明的副球菌取样地为山东省曲阜市某污水沟污泥，该菌株经分离、纯化、驯化获得，可利用间苯二酚作为其生长的唯一碳源。本发明的副球菌经16 SrDNA鉴定属于副球菌属（Paracoccus sp.），在National Center for Biotechnology Information（NCBI）上经BLAST比对后，与菌株Paracoccus sp. R-25059（登录号为AM084106.1）的同源性达到99%。
所述副球菌（Paracoccus sp.）JB-3单细胞为圆球状，属于革兰氏阴性菌，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上形成圆形、隆起的乳黄色菌落，表面光滑，湿润，边缘整齐，易挑取。
一种副球菌（Paracoccus sp.）JB-3在降解间苯二酚中的应用。
所述的，副球菌（Paracoccus sp.）JB-3降解间苯二酚的具体方法为：将副球菌（Paracoccus sp.）JB-3悬浮于含间苯二酚的水中，在30℃、pH值为7的条件下培养42h，间苯二酚可完全降解。
所述的，副球菌（Paracoccus sp.）JB-3的接种量为5%，v/v。
所述的，含间苯二酚的水中间苯二酚的初始浓度为1700 mg/L。
实施例3
一种副球菌，所述副球菌为副球菌（Paracoccus sp.）JB-3，于2017年01月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No. 13607。
本发明的副球菌取样地为山东省曲阜市某污水沟污泥，该菌株经分离、纯化、驯化获得，可利用间苯二酚作为其生长的唯一碳源。本发明的副球菌经16 SrDNA鉴定属于副球菌属（Paracoccus sp.），在National Center for Biotechnology Information（NCBI）上经BLAST比对后，与菌株Paracoccus sp. R-25059（登录号为AM084106.1）的同源性达到99%。
所述副球菌（Paracoccus sp.）JB-3单细胞为圆球状，属于革兰氏阴性菌，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上形成圆形、隆起的乳黄色菌落，表面光滑，湿润，边缘整齐，易挑取。
一种副球菌（Paracoccus sp.）JB-3在降解间苯二酚中的应用。
所述的，副球菌（Paracoccus sp.）JB-3降解间苯二酚的具体方法为：将副球菌（Paracoccus sp.）JB-3悬浮于含间苯二酚的水中，在24℃、pH值为10的条件下培养55h，间苯二酚的降解率为89.55%。
所述的，副球菌（Paracoccus sp.）JB-3的接种量为5%，v/v。
所述的，含间苯二酚的水中间苯二酚的初始浓度为1500mg/L。
副球菌（Paracoccus sp.）JB-3的初筛、复筛和驯化
副球菌（Paracoccus sp.）JB-3是从山东省曲阜市某污水沟污泥取样，经初筛和复筛得到的一株革兰氏阴性菌，具体步骤如下：
一、初筛
（1）富集培养：样品取自山东省济宁市曲阜市某污水沟污泥，称取该污泥5g接种于45ml牛肉膏蛋白胨液体培养基（内含数粒小玻璃珠，使污泥充分分散至培养基中）中，于30℃、150 r/min摇床中富集培养24h，获得富集菌液。
所述牛肉膏蛋白胨培养基的配方：蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml（固体培养基加入20 g琼脂），pH 7.2±0.2，121℃灭菌20 min。
（2）分离纯化：在无菌环境下，用移液枪取富集菌液0.5ml加入到4.5ml无菌水中，充分混匀，制备成10-1的稀释菌液；再吸取该稀释菌液0.5ml加入到4.5ml无菌水中，充分混匀，制备成10-2的菌液；同样的方法依次制备成梯度为10-3、10-4、10-5、10-6的菌液；分别取稀释梯度为10-4、10-5、10-6的菌液200μl，涂布于间苯二酚浓度为100mg/L的筛选培养基-无机盐固体培养基上，先将制得的平板培养基正置于30℃培养箱中30min，后倒置于30℃培养箱中培养48h；挑取平板上形态、大小不同的单菌落划线于纯化培养基-牛肉膏蛋白胨固体培养基，倒置于30℃培养箱中培养24h；多次重复上一步骤，直至获得纯菌落，接种于斜面培养基-牛肉膏蛋白胨固体培养基，于4℃冰箱中保存待用。
二、复筛
（1）菌株活化：在无菌环境下，分别挑取初筛步骤（2）获得的纯菌落一环，接种于活化培养基-牛肉膏蛋白胨固体培养基，倒置于30℃培养箱培养24h，得活化菌株；
（2）种子培养：在无菌环境下，将活化菌株以5%（V/V）接种量接种于种子培养基-牛肉膏蛋白胨固体培养基，于30℃、150 r/min摇床培养24h，得种子液；
（3）发酵降解：将种子液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为100mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床培养72h，得发酵液；
（4）离心：将发酵液用12000 r/min离心10 min，获得上清液；
（5）间苯二酚浓度检测：取步骤（4）的上清液，参照《环境化学实验》中的4-氨基安替比林法测定水体中间苯二酚浓度含量，获得高效降解间苯二酚的副球菌（Paracoccussp.）JB-3。
三、驯化
（1）菌株活化：在无菌条件下，挑取复筛步骤获得的间苯二酚降解菌副球菌（Paracoccus sp.）JB-3纯菌落一环，接种于5ml活化培养基-牛肉膏蛋白胨液体培养基，置于30℃、150 r/min摇床震荡培养24h，得活化种子液；
（2）将活化种子液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为100mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床培养72h，得驯化菌液；取驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（3）将步骤（2）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为200mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（4）将步骤（3）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为300mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（5）将步骤（4）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为400mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（6）将步骤（5）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为500mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（7）将步骤（6）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为600mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床中培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（8）将步骤（7）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为700mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床中培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（9）将步骤（8）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为800mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床中培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（10）将步骤（9）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为900mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床中培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（11）将步骤（10）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为1000mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床中培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（12）将步骤（11）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为1100mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床中培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（13）将步骤（12）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为1200mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床中培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（14）将步骤（13）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为1300mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床中培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（15）将步骤（14）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为1400mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床中培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（16）将步骤（15）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为1500mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床中培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（17）将步骤（16）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为1600mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床中培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（18）将步骤（17）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为1700mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床中培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（19）将步骤（18）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为1800mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床中培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（20）将步骤（19）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为1900mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床中培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
（21）将步骤（20）获得的驯化菌液以5%（V/V）接种量接种于40ml间苯二酚浓度为2000mg/L的发酵培养基-无机盐液体培养基中，于30℃、150 r/min摇床中培养72h，得驯化菌液；取该驯化发酵菌液10ml于12000 r/min离心10 min后，取上清液用4-氨基安替比林法测定上清液中间苯二酚浓度含量；
经驯化后发现间苯二酚降解菌副球菌（Paracoccus sp.）JB-3能有效降解初始浓度不大于1900mg/L的间苯二酚。
副球菌（Paracoccus sp.）JB-3的16 SrDNA鉴定
通过16 SrDNA序列分析，确定JB-3菌属于副球菌（Paracoccus sp.），具体步骤如下：
一、提取基因组DNA
（1）菌株活化：在无菌环境下，分别挑取复筛步骤获得的间苯二酚降解菌纯菌落一环，接种于5ml活化培养基-牛肉膏蛋白胨液体培养基，置于30℃、150 r/min摇床中震荡培养24h。
（2）提取基因组DNA：使用北京索莱宝科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒，提取活化后的间苯二酚降解菌JB-3的基因组DNA；
（3）检验基因组DNA片段：将步骤（2）获得的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检验是否提取出目的基因组DNA。琼脂糖凝胶配方为：琼脂糖0.25 g、1×TAE 25ml、Gelred2.5μl；电泳条件为：120 V、20 min。
二、PCR产物纯化
（1）PCR扩增：使用细菌通用引物27F、1492R，50μl PCR体系对目的基因片段进行扩增。50μl PCR体系和PCR反应条件分别如表1和表2所示。
细菌通用引物27F、1492R序列如下：
27F： 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'；
1492R：5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3'；
表1 50μl PCR体系
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表2 PCR反应条件
Figure DEST_PATH_IMAGE002
（2）检验PCR产物：将步骤（1）获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以检验获得的PCR产物的纯度。琼脂糖凝胶配方为：琼脂糖0.25 g、1×TAE 25ml、Gelred 2.5μl。电泳条件为：120 V、20 min。
（3）纯化PCR产物：使用康宁生命科学（吴江）有限公司的AxyPrep PCR产物纯化试剂盒，纯化步骤（1）获得的PCR产物。
三、测序比对
（1）测序：将PCR产物纯化步骤（3）获得的PCR纯化产物寄送至山东省济南市力戈科技有限公司进行测序。
（2）序列比对：将步骤（1）获得的菌株序列在National Center forBiotechnology Information（NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov）上经核苷酸序列BLAST比对后，发现与菌株Paracoccus sp. R-25059（登录号为AM084106.1）的同源性达到99%，故该间苯二酚降解菌属于副球菌属（Paracoccus sp.）。

Claims (6)

1.一种副球菌，其特征在于，所述副球菌为副球菌（Paracoccus sp .）JB-3，于2017年01月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No . 13607。
2.根据权利要求1所述的副球菌，其特征在于，所述副球菌（Paracoccus sp .）JB-3单细胞为圆球状，属于革兰氏阴性菌，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上形成圆形、隆起的乳黄色菌落，表面光滑，湿润，边缘整齐，易挑取。
3.一种权利要求1或2所述的副球菌在降解间苯二酚中的应用，其特征在于，所述副球菌（Paracoccus sp .）JB-3在降解间苯二酚中的应用；
所述副球菌（Paracoccus sp .）JB-3降解间苯二酚的具体方法为：将副球菌（Paracoccus sp .）JB-3悬浮于含间苯二酚的水中，在24-38℃、pH值为5-10的条件下培养42-72h；
所述含间苯二酚的水中间苯二酚的初始浓度不大于1900mg/L。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述副球菌（Paracoccus sp .）JB-3的接种量为5%，v/v。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述含间苯二酚的水中间苯二酚的初始浓度为1700 mg/L。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在30℃、pH值为7的条件下培养。
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