CN108102956A - 一种石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌的制备方法及其应用 - Google Patents

一种石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌的制备方法及其应用，涉及微生物环保领域，工艺步骤包括：1)取反硝化细菌接种至富集培养基培养，培养液离心去上清液，得菌体；将菌体悬浮于生理盐水中，得反硝化细菌菌悬液；2)采用1wt％木炭粉吸附菌悬液2‑6h，得吸附液；3)采用共价交联法制备石墨烯基复合材料的包埋剂；4)将吸附液与包埋剂混匀，得混合载体；5)将混合载体逐滴滴入交联剂中，交联，得固定化微生物颗粒。所得固定化微生物耐受性好活性高，能够高活性反复处理含氮污水。

Description

一种石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌的制备方法及其 应用
技术领域
本发明涉及微生物环保领域，具体涉及一种石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌的制备方法及其应用。
背景技术
氮素是水体中常见的污染物，可导致水体富营养化，给水生生物带来灾难，引发人类饮用水危机，危害人体健康，破坏水体生态环境。如何经济高效地去除水体中氮素污染已成为水污染控制领域的研究重点和热点。生物脱氮是从废水中去除氮素污染最为经济有效的方法，可实现真正意义的脱氮作用。
生物脱氮技术通常有硝化工艺和反硝化工艺组成。硝化工艺以去除氨氮为主，虽然能把氨氮转化为硝酸盐，但是不能彻底将氮素从水体中去除，反硝化工艺则能从根本上消除氮素对环境的污染。反硝化细菌是反硝化作用发生的主体，然而，游离的反硝化细菌在污水处理的过程中存在诸多不足。
微生物固定化技术是将特选的微生物固定在选择的载体上，使其高度密集并保持生物活性，在适宜条件下能够快速、大量增殖的生物技术。固定化微生物常用的方法包括吸附法、交联法、包埋法等，其中包埋法是固定化微生物最常见的方法。常见的固定化载体和包埋材料为聚乙烯醇、海藻酸钠、琼脂、明胶等，然而如图1所示，这些固定化材料机械强度低，在磷酸盐等溶液中不稳定，使其使用受到限制。
石墨烯是一种新型的碳材料，主要原因是它的成本比较低，具有比表面积高、导电性能好、机械强度好等优点。氧化石墨烯(Graphene oxide)是石墨烯高度氧化后的产物，含有羟基、环氧基、羧基、羰基等丰富的官能团，因此具有较强的亲水性，能很好的分散于水中，与水溶性的聚合物兼容性比较好。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌的制备方法及其制备固定化微生物在污水处理中的应用，所得固定化微生物耐受性好活性高，能够高活性反复处理含氮污水。
一种石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌的制备方法，工艺步骤包括：
1)取反硝化细菌接种至富集培养基培养，培养液离心去上清液，得菌体；将菌体悬浮于生理盐水中，得反硝化细菌菌悬液；
2)采用1wt％木炭粉吸附菌悬液2-6h，得吸附液；
3)采用共价交联法制备石墨烯基复合材料的包埋剂；
4)将吸附液与包埋剂混匀，得混合载体；
5)将混合载体逐滴滴入交联剂中，交联，得固定化微生物颗粒。
进一步，在步骤3)中，所述包埋剂的制备方法包括：将聚乙烯醇和海藻酸钠加入蒸馏水中，超声至溶解；加入以水为溶剂制备的氧化石墨烯溶液，超声使氧化石墨烯颗粒与海藻酸钠和聚乙烯醇相沉积，静置冷却至25-35℃，得包埋剂。氧化石墨烯因表面残存未充分氧化的联苯区域与缺陷基团。故现有技术中，氧化石墨烯分散液黏度越低，氧化程度越差，与微生物吸附亲和性越低。本发明采用特定聚合物沉积工艺，使氧化石墨烯包埋剂流体黏度增高，促进了片层排布，使包埋及固定化效果提高。
优选的，在步骤3)中，制备包埋剂的溶液配比为氧化石墨烯(0.1-0.9)wt％，聚乙烯醇(1-4)wt％，海藻酸钠(1-5)wt％。
优选的，在步骤1)中，所述生理盐水的浓度为0.9wt％；菌体与生理盐水质量比为1:(10-50)。
优选的，在步骤1)中，富集培养基包括:KNO3、蛋白胨、牛肉膏、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O和水。
优选的，培养基经摇床培养，转速为100-200r/min，培养温度为20-35℃，培养时间为12-72h。
优选的，在步骤4)中，吸附液与包埋剂体积配比为1:(8-12)，混合载体与交联剂体积配比为1:(1-5)。
优选的，在步骤5)中，交联工艺还包括：混入交联剂后0-8℃下交联6-24h，生理盐水清洗，0-8℃保存。
优选的，在步骤5)中，所述交联剂为CaCl2饱和硼酸溶液，交联剂中CaCl2浓度为3-5wt％。
一种以上述方法制备的固定化反硝化细菌在污水处理中的应用，所述污水含硝酸盐氮(化学式NO3-N)，所述污水中硝酸盐氮优选浓度≤500mg/L。
优选的，所述固定化颗粒在含硝酸盐氮废水中的接入量为(0.5-15)wt％，处理温度为25-35℃，pH6-10。所述固定化反硝化细菌能够反复应用于硝酸盐氮污水处理至少十次。
本发明所带来的综合效果包括：
本发明方法操作简单、成本低、效果好，以石墨烯基复合材料制备的固定化小球，机械强度和化学稳定性好，适应性强。本发明中石墨烯复合载体具有优良的吸附性能，不仅对菌株起到了良好的固定包埋作用，并且能够吸附污染物至菌株表面及时转化，显著降低水体中的氮素含量，改善水质状况，使污水达到排放标准，且无亚硝酸盐积累，降低环境污染，对于大规模利用副球菌处理污水具有重要意义。
尤其，本发明所采用氧化石墨烯可以改善载体聚合物(包括海藻酸钠和聚乙烯醇)的机械强度、热稳定性、化学稳定性和光降解性能，显著增加包埋载体耐受性，提高菌株固定效率和牢固度，从而进一步增强菌株对不良环境的抗性，使得固定化微生物颗粒使用周期更长。
附图说明
图1为背景技术现有方法制作的未加石墨烯的固定化颗粒的扫描电镜图。
图2为本发明实施例1方法制备的石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌颗粒的扫描电镜图。
图3为实施例3和实施例4中本发明所制颗粒对人工污水硝酸盐氮的降解图。
图4为实施例3和实施例4中对人工污水COD(化学需氧量)污染物的降解图。
图5为实施例5重复利用固定化颗粒对硝酸盐氮的降解图。
在图3和图4中，◇代表实施例3组实验数据，□代表实施例4组实验数据。
具体实施方式
本发明的以下实施例仅用来说明实现本发明的具体实施方式，这些实施方式不能理解为是对本发明的限制。其它的任何在未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均视为等效的置换方式，落在本发明的保护范围之内。
本发明所采用反硝化细菌为副球菌(Paracoccussp.)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCCNo.13607。
本发明的富集培养基的组成如下：KNO32g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，余量为水。
实施例1
一种石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌的制备方法，工艺步骤包括：
1)由斜面上取两环副球菌接种至富集培养基，摇床培养，培养液离心去除上清液，得菌体；将菌体悬浮于无菌生理盐水中，得反硝化细菌菌悬液；无菌生理盐水的浓度为0.9wt％；菌体与无菌生理盐水的质量比为1:30。培养基经摇床培养时，转速为150r/min，培养温度为27℃，培养时间为40h。
2)在菌悬液中加入1wt％的木炭粉吸附4h，得吸附液；
3)采用共价交联的方法制备石墨烯基复合材料，具体操作如下：将聚乙烯醇和海藻酸钠加入100mL蒸馏水中，超声至完全溶解；加入以水为溶剂制备的氧化石墨烯溶液，继续超声使氧化石墨烯颗粒与海藻酸钠和聚乙烯醇相互沉积，在85℃水浴加热搅拌至完全溶解，静置冷却至35℃，得包埋剂。制备包埋剂的溶液中氧化石墨烯的含量为0.1％，聚乙烯醇的含量为4％，海藻酸钠的含量为3％。
4)将步骤2)制备的吸附液与步骤3)制备的包埋剂混合均匀，得混合载体，吸附液与包埋剂体积配比为1:10，混合载体与交联剂体积配比为1:5。
5)以CaCl2饱和硼酸溶液为交联剂，将混合载体逐滴滴入交联剂中，形成固定化微生物颗粒，4℃交联12h，生理盐水清洗，4℃保存，得固定化微生物颗粒。所述CaCl2饱和硼酸溶液中CaCl2为3wt％。
实施例2
一种石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌的制备方法，工艺步骤包括：
1)由斜面上取两环副球菌接种至富集培养基，摇床培养，培养液离心去除上清液，得菌体；将菌体悬浮于无菌生理盐水中，得反硝化细菌菌悬液；无菌生理盐水的浓度为0.9wt％；菌体与无菌生理盐水的质量比为1:10。培养基经摇床培养时，转速为150r/min，培养温度为30℃，培养时间为48h。
2)在菌悬液中加入1wt％的木炭粉吸附6h，得吸附液；
3)采用共价交联的方法制备石墨烯基复合材料，具体操作如下：将聚乙烯醇和海藻酸钠加入100mL蒸馏水中，超声至完全溶解；加入以水为溶剂制备的氧化石墨烯溶液，继续超声使氧化石墨烯颗粒与海藻酸钠和聚乙烯醇相互沉积，静置冷却至30℃，得包埋剂。制备包埋剂的溶液中氧化石墨烯的含量为0.9％，聚乙烯醇的含量为4％，海藻酸钠的含量为3％。
4)将步骤2)制备的吸附液与步骤3)制备的包埋剂混合均匀，得混合载体，吸附液与包埋剂体积配比为1:10，混合载体与交联剂体积配比为1:5。
5)以CaCl2饱和硼酸溶液为交联剂，将混合载体逐滴滴入交联剂中，形成固定化微生物颗粒，4℃交联18h，生理盐水清洗，4℃保存，得固定化微生物颗粒。所述CaCl2饱和硼酸溶液中CaCl2为5wt％。
实施例3
本发明制备的石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌在降解硝酸盐氮污水中的应用：
①采用如实施例1所述方法制备石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌；
②调节人工污水硝酸盐氮含量为500mg/L，如表1所示，化学需氧量(简称COD)污染物含量为800mg/L，加入制备的石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌，加入湿重为15g/L，溶液pH为8，然后于180r/min，30℃的摇床中，至硝酸盐氮充分降解。
表1模拟人工污水成分
成分 含量(g/L) 成分 含量(g/L)
KNO3 0.1-10 MgSO4·7H2O 0.01-1
乙酸钠 0.1-10 NaCl 0.01-1
葡萄糖 0.1-5 FeSO4·7H2O 0.001-1
K2HPO4 0.1-2 MnSO4·4H2O 0.001-1
实施例4
本发明制备的石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌在降解硝酸盐氮污水中的应用：
①采用如实施例2所述方法制备石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌；
②调节人工污水硝酸盐氮含量为500mg/L，COD含量为800mg/L，加入制备的石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌，加入湿重为15g/L，然后于180r/min，pH7，30℃摇床中，至硝酸盐氮充分降解。
实施例5
将实施例3石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌的重复应用于降解硝酸盐氮污水，应用方法如实施例3所示：
如图5所示，在常规条件下，石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌能够高效地降解硝酸盐氮，固定化的反硝化细菌反复处理污水至少10次，在前8次使用的过程中固定化细菌保持了较高的降解能力。显示了本发明固定化技术在含硝酸盐氮的废水处理中具有的巨大的应用潜力。
虽然本发明已作了详细描述，但对本领域技术人员来说，在本发明精神和范围内的修改将是显而易见的。此外，应当理解的是，本发明记载的各方面、不同具体实施方式的各部分、和列举的各种特征可被组合或全部或部分互换。在上述的各个具体实施方式中，那些参考另一个具体实施方式的实施方式可适当地与其它实施方式组合，这是将由本领域技术人员所能理解的。此外，本领域技术人员将会理解，前面的描述仅是示例的方式，并不旨在限制本发明。

Claims (10)

1.一种石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌的制备方法，其特征在于，工艺步骤包括：
1)取反硝化细菌接种至富集培养基培养，培养液离心去上清液，得菌体；将菌体悬浮于生理盐水中，得反硝化细菌菌悬液；
2)采用1wt％木炭粉吸附菌悬液2-6h，得吸附液；
3)采用共价交联法制备石墨烯基复合材料的包埋剂；
4)将吸附液与包埋剂混匀，得混合载体；
5)将混合载体逐滴滴入交联剂中，交联，得固定化微生物颗粒。
2.根据权利要求1所述的石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌的制备方法，其特征在于，在步骤3)中，所述包埋剂的制备方法包括：将聚乙烯醇和海藻酸钠加入蒸馏水中，超声至溶解；加入以水为溶剂制备的氧化石墨烯溶液，超声使氧化石墨烯颗粒与海藻酸钠和聚乙烯醇相沉积，静置冷却至25-35℃。
3.根据权利要求2所述的石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌的制备方法，其特征在于，制备包埋剂的溶液配比为氧化石墨烯(0.1-0.9)wt％，聚乙烯醇(1-4)wt％，海藻酸钠(1-5)wt％。
4.根据权利要求1所述的石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，富集培养基包括:KNO3、蛋白胨、牛肉膏、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O和水，和/或
无菌生理盐水的浓度为0.9％；菌体与无菌生理盐水的质量比为1:(10-50)。
5.根据权利要求1所述的石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌的制备方法，其特征在于，培养基经摇床培养，转速为100-200r/min，培养温度为20-35℃，培养时间为12-72h。
6.根据权利要求1所述的石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌的制备方法，其特征在于，在步骤4)中，吸附液与包埋剂体积配比为1:(8-12)，混合载体与交联剂体积配比为1:(1-5)。
7.根据权利要求1所述的石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌的制备方法，其特征在于，在步骤5)中，交联工艺还包括：混入交联剂后0-8℃下交联6-24h，生理盐水清洗，0-8℃保存。
8.根据权利要求7所述的石墨烯基复合材料固定化反硝化细菌的制备方法，其特征在于，在步骤5)中，所述交联剂为CaCl2饱和硼酸溶液，交联剂中CaCl2浓度为3-5wt％。
9.一种如权利要求1-8中任一项所述制作方法制备的固定化反硝化细菌在污水处理中的应用，其特征在于，所述污水含硝酸盐氮，所述污水中硝酸盐氮优选浓度≤500mg/L。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述固定化颗粒在含硝酸盐氮废水中的接入量为(0.5-15)wt％，处理温度为25-35℃，pH6-10。
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