CN107058282A - 一种以绿色木霉为载体进行反硝化细菌固定化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以绿色木霉为载体进行反硝化细菌固定化的方法，是由以下步骤获得的：副球菌接种至富集培养基，摇床培养，将所得菌体悬浮于无菌生理盐水中，得反硝化细菌菌悬液；绿色木霉接种至固体培养基上培养，无菌水洗涤，低温保存，得孢子悬浮液；将反硝化细菌菌悬液和孢子悬浮液接种至菌丝球培养基中摇床培养，得绿色木霉为载体固定化反硝化细菌的混合菌丝球。本发明的方法具有操作简便、培养时间短、可重复使用、沉降性能好的优点，制备的混合菌丝球可显著降低水体中的氮素含量，改善水质状况，使污水达到排放标准，且无亚硝酸盐积累，降低环境污染，对于大规模利用副球菌处理污水具有重要意义。

Description

一种以绿色木霉为载体进行反硝化细菌固定化的方法
技术领域
本发明属于环境生物工程和水处理领域，具体涉及一种以绿色木霉为载体进行反硝化细菌固定化的方法。
背景技术
随着工农业生产的发展和人们生活水平的提高，含氮污染物的排放量迅速增加，水环境中氮污染的问题日趋严重，成为国际社会面临的一个重大问题。国内水体中氮的污染以硝态氮和亚硝态氮形式氮的污染最为严重，而生物除氮是去除水体中氮污染的最有效的方法之一。
生物脱氮技术通常有硝化工艺和反硝化工艺组成。硝化工艺以去除氨氮为主，虽然能把氨氮转化为硝酸盐，但是不能彻底将氮素从水体中去除。反硝化工艺则能从根本上消除氮素对环境的污染。反硝化细菌是反硝化作用发生的主体，然而，游离的反硝化细菌在污水处理的过程中存在诸多不足，可以考虑通过微生物固定化技术解决这一问题。
微生物固定化技术是将特选的微生物固定在选择的载体上，使其高度密集并保持生物活性，在适宜条件下能够快速、大量增殖的生物技术。这种技术应用于废水处理，有利于提高生物反应器内微生物（尤其是特殊功能的微生物）的浓度，有利于微生物抵抗不利环境的影响，有利于反应后的固液分离，缩短处理所需的时间。常见的固定化载体和包埋材料为聚乙烯醇、海藻酸钠、琼脂、明胶等。然而将反硝化细菌固定在这些化学载体上常会抑制菌体活性，一定程度上会影响到反硝化细菌处理污水脱氮的能力。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种以绿色木霉为载体进行反硝化细菌固定化的方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种以绿色木霉为载体进行反硝化细菌固定化的方法，是由以下步骤获得的：
1）由斜面上取两环副球菌接种至富集培养基，摇床培养，培养液离心去除上清液，得菌体；将菌体悬浮于无菌生理盐水中，得反硝化细菌菌悬液；
本发明的副球菌（Paracoccussp.）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），编号：CGMCCNo.13607。
2）由斜面上取两环绿色木霉接种至固体培养基上培养形成孢子，用无菌水洗涤孢子，低温保存，得孢子悬浮液；
本发明的绿色木霉（Trichodermaviride）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），编号：CGMCCNo.3.6619。
3）将反硝化细菌菌悬液和孢子悬浮液接种至菌丝球培养基中摇床培养，得绿色木霉为载体固定化反硝化细菌的混合菌丝球。
所述步骤1）中，无菌生理盐水的浓度为0.9%；菌体与无菌生理盐水的质量比为1：50-250。
所述步骤1）中，富集培养基的组成如下：KNO3 0.1-10g/L，蛋白胨0.1-20g/L，牛肉膏0.1-20g/L，K2HPO4·3H2O 0.1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-5g/L，余量为水。
所述步骤1）中，摇床培养的转速为100-200r/min，培养温度为19-35℃，培养时间为12-72h。
所述步骤2）中，固体培养基为PDA琼脂培养基；培养温度为20-32℃，培养时间为3-15d；低温保存温度为2-6℃；孢子悬浮液的浓度为1.06×105个/L-3.12×105个/L。
本发明的PDA琼脂培养基的组成为：马铃薯300g/L、葡萄糖20g/L、琼脂18g/L，余量为水。
所述步骤3）中，摇床培养的转速为100-200r/min，培养温度为20-32℃，培养时间为2-7d。
所述步骤3）中，所述菌丝球培养基的组成如下：葡萄糖10-20g/L，硝酸钾2-5g/L，K2HPO4·3H2O0.5-3g/L，NH4Cl1-3g/L，MgSO4·7H2O0.1-1.5g/L，余量为水。
所述步骤3）中，反硝化细菌菌悬液的接种量为4-20%，V/V；所述孢子悬浮液的接种量为6.34×105个/L-7.92×107个/L。
所述混合菌丝球在污水中的接种量为4-15%，在15-35℃、pH值为6-10的条件下培养。
所述污水中硝酸盐氮的浓度为500mg/L以下。
本发明的混合菌丝球可在30℃条件下烘干至恒重，30℃以下保存；烘干至恒重的混合菌丝球可大大缩小所占空间，方便贮存和运输，30℃以下保存可保存一年以上，且具有较好的溶胀性，遇水能迅速恢复原状，可大规模的应用于污水处理中。
本发明的有益效果：
1.本发明以绿色木霉培养形成的菌丝球为生物质载体，通过副球菌和绿色木霉同时混合培养，使副球菌吸附在菌丝球的表面及内部空隙中，获得混合菌丝球，从而将副球菌牢牢固定在菌丝球上，应用于污水中，显著提高污水中氮素去除率。绿色木霉以硝酸盐氮作为氮源合成自身所需的营养物质，直接降低废水中硝酸盐氮含量；副球菌通过反硝化进程将硝酸盐氮转化为亚硝酸盐氮，进而转化成无毒的氮气释放到大气中，从而降低废水中氮素含量。
2.本发明以绿色木霉为载体进行反硝化细菌固定化的方法具有操作简便、培养时间短、可重复使用、沉降性能好的优点，制备的混合菌丝球可显著降低水体中的氮素含量，改善水质状况，使污水达到排放标准，且无亚硝酸盐积累，降低环境污染，对于大规模利用副球菌处理污水具有重要意义。
附图说明
图1为本发明制备的混合菌丝球的照片。
图2为本发明制备的混合菌丝球的扫描电镜图。
图3为本发明测试例1对模拟人工污水中COD去除率曲线。
图4为本发明测试例1对模拟人工污水中硝酸盐氮降解率曲线。
图5为本发明测试例2对模拟人工污水中COD去除率曲线。
图6为本发明测试例2对模拟人工污水中硝酸盐氮降解率曲线。
图7为本发明测试例3对周边河道污水中COD去除率和硝酸盐氮降解率曲线。
具体实施方式
本发明的以下实施例仅用来说明实现本发明的具体实施方式，这些实施方式不能理解为是对本发明的限制。其它的任何在未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均视为等效的置换方式，落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的副球菌（Paracoccussp.）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），编号：CGMCCNo.13607。
本发明的绿色木霉（Trichodermaviride）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），编号：CGMCCNo.3.6619。
本发明的PDA琼脂培养基的组成为：马铃薯300g/L、葡萄糖20g/L、琼脂18g/L，余量为水。
实施例1
一种以绿色木霉为载体进行反硝化细菌固定化的方法，是由以下步骤获得的：
1）由斜面上取两环副球菌接种至富集培养基，摇床培养，培养液离心去除上清液，得菌体；将菌体悬浮于无菌生理盐水中，得反硝化细菌菌悬液；
所述步骤1）中，无菌生理盐水的浓度为0.9%；菌体与无菌生理盐水的质量比为1：50。
所述步骤1）中，富集培养基的组成如下：KNO3 10g/L，蛋白胨0.1g/L，牛肉膏20g/L，K2HPO4·3H2O 0.1g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，余量为水。
所述步骤1）中，摇床培养的转速为100r/min，培养温度为35℃，培养时间为12h。
2）由斜面上取两环绿色木霉接种至固体培养基上培养形成孢子，用无菌水洗涤孢子，低温保存，得孢子悬浮液；
所述步骤2）中，固体培养基为PDA琼脂培养基；培养温度为32℃，培养时间为3d；低温保存温度为6℃；孢子悬浮液的浓度为1.06×105个/L。
3）将反硝化细菌菌悬液和孢子悬浮液接种至菌丝球培养基中摇床培养，得绿色木霉为载体固定化反硝化细菌的混合菌丝球。
所述步骤3）中，摇床培养的转速为200r/min，培养温度为32℃，培养时间为2d。
所述步骤3）中，所述菌丝球培养基的组成如下：葡萄糖20g/L，硝酸钾2g/L，K2HPO4·3H2O3g/L，NH4Cl1g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，余量为水。
所述步骤3）中，反硝化细菌菌悬液的接种量为20%，V/V；所述孢子悬浮液的接种量为7.92×107个/L。
所述混合菌丝球在污水中的接种量为4-15%，在15-35℃、pH值为6-10的条件下培养。
所述污水中硝酸盐氮的浓度为500mg/L以下。
随机选取50颗本实施例制备的混合菌丝球，用电子数显游标卡尺测其粒径约为4mm。
随机选取50颗本实施例制备的混合菌丝球，滤干表面水分后称重，实验表明每颗混合菌丝球颗粒重量约为0.04g。
随机选取50颗混合菌丝球，加入50mL蒸馏水，置于摇床于30℃、300r/min条件下震荡，24h后观察混合菌丝球没有出现破损，说明本实施例制备的混合菌丝球的稳定性较好。
对混合菌丝球采用“颜色浸润法”测其传质性能，表明本实施例制备的混合菌丝球传质性能较好。
实施例2
一种以绿色木霉为载体进行反硝化细菌固定化的方法，是由以下步骤获得的：
1）由斜面上取两环副球菌接种至富集培养基，摇床培养，培养液离心去除上清液，得菌体；将菌体悬浮于无菌生理盐水中，得反硝化细菌菌悬液；
所述步骤1）中，无菌生理盐水的浓度为0.9%；菌体与无菌生理盐水的质量比为1：150。
所述步骤1）中，富集培养基的组成如下：KNO3 5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，K2HPO4·3H2O 3g/L，MgSO4·7H2O 3g/L，余量为水。
所述步骤1）中，摇床培养的转速为150r/min，培养温度为25℃，培养时间为48h。
2）由斜面上取两环绿色木霉接种至固体培养基上培养形成孢子，用无菌水洗涤孢子，低温保存，得孢子悬浮液；
所述步骤2）中，固体培养基为PDA琼脂培养基；培养温度为26℃，培养时间为10d；低温保存温度为4℃；孢子悬浮液的浓度为2.10×106个/L。
3）将反硝化细菌菌悬液和孢子悬浮液接种至菌丝球培养基中摇床培养，得绿色木霉为载体固定化反硝化细菌的混合菌丝球，如图1和图2所示。
所述步骤3）中，摇床培养的转速为150r/min，培养温度为26℃，培养时间为4d。
所述步骤3）中，所述菌丝球培养基的组成如下：葡萄糖15g/L，硝酸钾4g/L，K2HPO4·3H2O2g/L，NH4Cl2g/L，MgSO4·7H2O1g/L，余量为水。
所述步骤3）中，反硝化细菌菌悬液的接种量为10%，V/V；所述孢子悬浮液的接种量为6.55×106个/L。
所述混合菌丝球在污水中的接种量为4-15%，在15-35℃、pH值为6-10的条件下培养。
所述污水中硝酸盐氮的浓度为500mg/L以下。
随机选取50颗本实施例制备的混合菌丝球，用电子数显游标卡尺测其粒径约为4mm。
随机选取50颗本实施例制备的混合菌丝球，滤干表面水分后称重，实验表明每颗混合菌丝球颗粒重量约为0.04g。
随机选取50颗混合菌丝球，加入50mL蒸馏水，置于摇床于30℃、300r/min条件下震荡，24h后观察混合菌丝球没有出现破损，说明本实施例制备的混合菌丝球的稳定性较好。
对混合菌丝球采用“颜色浸润法”测其传质性能，表明本实施例制备的混合菌丝球传质性能较好。
实施例3
一种以绿色木霉为载体进行反硝化细菌固定化的方法，是由以下步骤获得的：
1）由斜面上取两环副球菌接种至富集培养基，摇床培养，培养液离心去除上清液，得菌体；将菌体悬浮于无菌生理盐水中，得反硝化细菌菌悬液；
所述步骤1）中，无菌生理盐水的浓度为0.9%；菌体与无菌生理盐水的质量比为1： 250。
所述步骤1）中，富集培养基的组成如下：KNO3 0.1g/L，蛋白胨20g/L，牛肉膏0.1g/L，K2HPO4·3H2O5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，余量为水。
所述步骤1）中，摇床培养的转速为200r/min，培养温度为19℃，培养时间为72h。
2）由斜面上取两环绿色木霉接种至固体培养基上培养形成孢子，用无菌水洗涤孢子，低温保存，得孢子悬浮液；
所述步骤2）中，固体培养基为PDA琼脂培养基；培养温度为20℃，培养时间为15d；低温保存温度为2℃；孢子悬浮液的浓度为3.12×105个/L。
3）将反硝化细菌菌悬液和孢子悬浮液接种至菌丝球培养基中摇床培养，得绿色木霉为载体固定化反硝化细菌的混合菌丝球。
所述步骤3）中，摇床培养的转速为100r/min，培养温度为20℃，培养时间为7d。
所述步骤3）中，所述菌丝球培养基的组成如下：葡萄糖10g/L，硝酸钾5g/L，K2HPO4·3H2O0.5g/L，NH4Cl3g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，余量为水。
所述步骤3）中，反硝化细菌菌悬液的接种量为4%，V/V；所述孢子悬浮液的接种量为6.34×105个/L。
所述混合菌丝球在污水中的接种量为4-15%，在15-35℃、pH值为6-10的条件下培养。
所述污水中硝酸盐氮的浓度为500mg/L以下。
随机选取50颗本实施例制备的混合菌丝球，用电子数显游标卡尺测其粒径约为4mm。
随机选取50颗本实施例制备的混合菌丝球，滤干表面水分后称重，实验表明每颗混合菌丝球颗粒重量约为0.04g。
随机选取50颗混合菌丝球，加入50mL蒸馏水，置于摇床于30℃、300r/min条件下震荡，24h后观察混合菌丝球没有出现破损，说明本实施例制备的混合菌丝球的稳定性较好。
对混合菌丝球采用“颜色浸润法”测其传质性能，表明本实施例制备的混合菌丝球传质性能较好。
测试例1
按照表1配制模拟人工污水，调节模拟人工污水中硝酸盐氮浓度为500mg/L，COD为500mg/L，pH为6，水温为15℃。按照4%的接种量分别将实施例1-3制备的混合菌丝球置于100mL模拟人工污水中，对照组模拟人工污水不添加任何物质，每隔4h取上清液检测硝酸盐氮和COD的浓度，COD的去除率和硝酸盐氮降解率分别如图3和图4所示。
表1 模拟人工污水成分
成分 含量（g/L） 成分 含量（g/L）
KNO3 0.1-10 MgSO4·7H2O 0.01-1
乙酸钠 0.1-10 NaCl 0.01-1
葡萄糖 0.1-5 FeSO4·7H2O 0.001-1
K2HPO4 0.1-2 MnSO4·4H2O 0.001-1
由图3和图4可知，实施例1在培养28h时，硝酸盐氮降解率为93.22％，COD去除率为90.10％；实施例2在培养40h时，硝酸盐氮降解率为92.31％，COD去除率为88.64％。实施例3在培养44h时，硝酸盐氮降解率为89.85％，COD去除率为85.34％。
测试例2
按照表1配制模拟人工污水，调节模拟人工污水中硝酸盐氮浓度为277mg/L，COD为500mg/L，pH为10，水温为35℃。按照15%的接种量分别将实施例1-3制备的混合菌丝球置于100mL模拟人工污水中，对照组模拟人工污水不添加任何物质，每隔4h取上清液检测硝酸盐氮和COD的浓度，COD的去除率和硝酸盐氮降解率分别如图5和图6所示。
由图5和图6可知，实施例1在培养24h时，硝酸盐氮降解率为99.09％，COD去除率为96.88％；实施例2在培养32h时，硝酸盐氮降解率为97.26％，COD去除率为94.55％。实施例3在培养36h时，硝酸盐氮降解率为94.22％，COD去除率为92.00％。
测试例3
采集曲阜市周边河道污水，主要污染物情况如表2所示。调节该河道污水中硝酸盐氮浓度为20mg/L，COD为80mg/L，pH为6，水温为32℃。取2g实施例2制备的混合菌丝球于100mL模拟污水中，对照组污水不添加任何物质，每隔4h取上清液检测硝酸盐氮和COD，结果如图7所示。
表2 曲阜市周边河道污水主要污染物情况
COD（mg/L） 总氮（mg/L） 总磷（mg/L） 硝酸盐氮（mg/L）
33.0 4.67 0.04 3.9
由图7可知，在培养32h时，硝酸盐氮降解率为99.11％，COD去除率为86.12％。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种以绿色木霉为载体进行反硝化细菌固定化的方法，其特征在于，是由以下步骤获得的：
1）由斜面上取两环副球菌接种至富集培养基，摇床培养，培养液离心去除上清液，得菌体；将菌体悬浮于无菌生理盐水中，得反硝化细菌菌悬液；
2）由斜面上取两环绿色木霉接种至固体培养基上培养形成孢子，用无菌水洗涤孢子，低温保存，得孢子悬浮液；
3）将反硝化细菌菌悬液和孢子悬浮液接种至菌丝球培养基中摇床培养，得绿色木霉为载体固定化反硝化细菌的混合菌丝球。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，无菌生理盐水的浓度为0.9%；菌体与无菌生理盐水的质量比为1：50-250。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，富集培养基的组成如下：KNO3 0.1-10g/L，蛋白胨0.1-20g/L，牛肉膏0.1-20g/L，K2HPO4·3H2O 0.1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-5g/L，余量为水。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，摇床培养的转速为100-200r/min，培养温度为19-35℃，培养时间为12-72h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中，固体培养基为PDA琼脂培养基；培养温度为20-32℃，培养时间为3-15d；低温保存温度为2-6℃；孢子悬浮液的浓度为1.06×105个/L-3.12×105个/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中，摇床培养的转速为100-200r/min，培养温度为20-32℃，培养时间为2-7d。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中，所述菌丝球培养基的组成如下：葡萄糖10-20g/L，硝酸钾2-5g/L，K2HPO4·3H2O0.5-3g/L，NH4Cl1-3g/L，MgSO4·7H2O0.1-1.5g/L，余量为水。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 所述步骤3）中，反硝化细菌菌悬液的接种量为4-20%，V/V；所述孢子悬浮液的接种量为6.34×105个/L-7.92×107个/L。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合菌丝球在污水中的接种量为4-15%，在15-35℃、pH值为6-10的条件下培养。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述污水中硝酸盐氮的浓度为500mg/L以下。
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