CN105296398A - 治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂及制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂及制备方法及应用，所述菌剂是按体积比为(1～2):(1～2)的比例由腐败希瓦氏菌液和睾丸酮假单胞菌液组成，本发明耐低温复合微生物菌剂对环境的适应性能力强，尤其是耐低温，在低温环境中也能够正常生长代谢。利用环境友好微生物来增强水体的自净功能，消解河水中污染物以及河底污泥有机物，防止水体二次污染。使用时直接投放，不需要复杂的工程工艺，使用方便。本发明菌剂在低温条件下有效地降低污水COD和氨氮含量，去除率明显优于单一菌株。

Description

治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂及制备方法及应用

技术领域

本发明涉及污水处理技术领域，具体涉及一种耐低温复合微生物菌剂及制备方法及应用。

背景技术

河流水污染已经成为影响区域社会经济发展、制约人民生活水平提高的主要因素。虽然降低污泥负荷、提高污泥浓度等方法在一定程度上提高了治理效果，但运行效率和运行成本不理想，长期污染的河水仍得不到改善。生态较好、污染较少的河水中有自净微生物存在，但在污染的河流中已经缺失了自净功能，自净微生物缺乏或菌量过小，而且自然界中的微生物能够被人工培养、分离、驯化、利用，并进一步用于环境治理的少之又少。

近年来微生物制剂在污水治理方面已有所应用，但存在着很多问题。生物体中的酶受温度的影响很大，温度过高会使酶变性失活，温度过低会使酶的效率降低甚至休眠，这些都会导致微生物新陈代谢速率降低乃至停止，致使污水的生物处理效率降低。所以在低温条件下，城市污水的生物处理长期以来存在处理效果差、处理难以达标的问题。中国北方季节分明，冬季漫长，气温常常不能满足生物处理的要求，因此污水的冬季处理问题一直是困扰人们的一大难题。位于中国华北地区的天津市，据统计显示多年月平均气温在-6℃到-28℃之间波动，12～3月平均温度低于6℃，处于低温环境。因此如何提高低温环境下污水处理效率方法的研究具有一定社会效益。

微生物的新陈代谢可以吸收污染水体中的各种污染物(主要是有机物)，由于每一种微生物在水体物质循环的环节中的作用不同；单一菌种的很难满足城市污水的生物处理，特别是低温时处理的要求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的要求，提供一种在低温条件下能高效降解COD和氨氮的治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂。

本发明的第二个目的是提供一种治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂的应用。

本发明的技术方案概述如下：

治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂，其特征是所述菌剂是按体积比为(1～2):(1～2)的比例由腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefacens)液和睾丸酮假单胞菌(Comamonastestosteroni)液组成，所述腐败希瓦氏菌液的浓度为1×10⁸个/ml-5×10⁸个/ml，所述睾丸酮假单胞菌液的浓度为1×10⁸个/ml-5×10⁸个/ml。

腐败希瓦氏菌液和睾丸酮假单胞菌液的体积比优选为2:1。

治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)腐败希瓦氏菌的培养：在室温，将腐败希瓦氏菌接种到灭菌后的固体污水培养基中，在15-25℃培养箱中培养10-14h，挑取较大而光滑的单菌落，接种到灭菌后的液体污水培养基中，于15-25℃摇床中，在转速150-250rpm培养至菌个数达到1×10⁸个/ml-5×10⁸个/ml的菌液；

(2)睾丸酮假单胞菌的培养：在室温，将睾丸酮假单胞菌接种到灭菌后的固体污水培养基中，在15-25℃培养箱中培养10-14h，挑取较大而光滑的单菌落，接种到灭菌后的液体污水培养基中，于15-25℃摇床中，在转速150-250rpm培养至菌个数达到1×10⁸个/ml-5×10⁸个/ml的菌液；

(3)菌剂制备：将步骤(1)和步骤(2)获得的菌液，按体积比为(1～2):(1～2)的比例混合，得到治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂。

固体污水培养基由下述组份制成：葡萄糖0.17g，磷酸二氢钾0.07g，可溶性淀粉0.16g，无水碳酸钠0.06g，乙酸钠0.233g，牛肉膏0.06g，氯化铵0.0255g，硫酸铵0.0284g，蛋白胨0.158g，琼脂粉15g,加水至1L，调节pH值6.5～8.5。

液体污水培养基由下述组份制成：葡萄糖0.17g，磷酸二氢钾0.07g，可溶性淀粉0.16g，无水碳酸钠0.06g，乙酸钠0.233g，牛肉膏0.06g，氯化铵0.0255g，硫酸铵0.0284g，蛋白胨0.158g，加水至1L，调节pH值6.5～8.5。

腐败希瓦氏菌液和睾丸酮假单胞菌液的体积比为2:1。

上述治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂在污染水生态治理中的应用。

所述治理为降低COD，降解氨氮。

本发明优点：

(1)本发明耐低温复合微生物菌剂对环境的适应性能力强，尤其是耐低温，在低温环境中也能够正常生长代谢。

(2)本发明菌剂是利用环境友好微生物来增强水体的自净功能，消解河水中污染物以及河底污泥有机物，防止水体二次污染。使用时直接投放，不需要复杂的工程工艺，使用方便。

(3)本发明菌剂在低温条件下有效地降低污水COD和氨氮含量，去除率明显优于单一菌株。

附图说明

图1为10℃、15℃、25℃条件下本发明的治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂和单一菌COD去除率比较；

图2为10℃、15℃、25℃条件下本发明的治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂和单一菌氨氮去除率比较；

图3为pH对菌株生长的影响。

图4为10℃条件下本发明的治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂与单一菌的生长曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是限制本发明的范围。下面的实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明所提供的菌株：腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefacens)，其专利保藏编号为CGMCC1.3667。于2012年9月购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。睾丸酮假单胞菌(Comamonastestosteroni)，其专利保藏编号为CGMCC1.3167，于2012年9日购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

腐败希瓦氏菌，革兰氏阴性。菌落酪黄色，低温下可正常生长代谢，适应各类污水环境能力强，具有一定降低COD的能力。睾丸酮假单胞菌，革兰阴性。氧化酶和接触酶阳性。菌落圆形，扁平，边缘不整齐，表面光滑，透明，易挑取；产碱，使指示剂溴百里酚兰变蓝，可降解氨氮。

固体污水培养基由下述组份制成：葡萄糖0.17g，磷酸二氢钾0.07g，可溶性淀粉0.16g，无水碳酸钠0.06g，乙酸钠0.233g，牛肉膏0.06g，氯化铵0.0255g，硫酸铵0.0284g，蛋白胨0.158g，琼脂粉15g,加水至1L，调节pH值6.5～8.5。

液体污水培养基由下述组份制成：葡萄糖0.17g，磷酸二氢钾0.07g，可溶性淀粉0.16g，无水碳酸钠0.06g，乙酸钠0.233g，牛肉膏0.06g，氯化铵0.0255g，硫酸铵0.0284g，蛋白胨0.158g，加水至1L，调节pH值6.5～8.5。

实施例1

治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)腐败希瓦氏菌的培养：在室温，将从-80℃中取出腐败希瓦氏菌，吸取200μl，用涂布棒均匀涂布在灭菌后的固体污水培养基上，封口膜封严，将平板倒置在20℃培养箱中培养12h，挑取较大而光滑的单菌落，接种到灭菌后的液体污水培养基中，于20℃摇床中，在转速200rpm,震荡培养12h左右，检测腐败希瓦氏菌的活菌数，得到菌个数大于等于3×10⁸个/ml菌液；

(2)睾丸酮假单胞菌的培养：在室温，将从-80℃中取出睾丸酮假单胞菌，吸取200μl，用涂布棒均匀涂布在灭菌后的固体污水培养基上，封口膜封严，将平板倒置在20℃培养箱中培养12h，挑取较大而光滑的单菌落，接种到灭菌后的液体污水培养基中，于20℃摇床中，在转速200rpm,震荡培养12h左右，检测睾丸酮假单胞菌的活菌数，得到菌个数大于等于3×10⁸个/ml菌液；

(3)菌剂制备：将步骤(1)和步骤(2)获得的菌液，按体积比为1:1；2:1；1:2的比例混合，依次得到治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂为A组，B组和C组。

实施例2

治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)腐败希瓦氏菌的培养：在室温，将从-80℃中取出腐败希瓦氏菌，吸取200μl，用涂布棒均匀涂布在灭菌后的固体污水培养基上，封口膜封严，将平板倒置在15℃培养箱中培养14h，挑取较大而光滑的单菌落，接种到灭菌后的液体污水培养基中，于15℃摇床中，在转速150rpm,震荡培养12h左右，检测腐败希瓦氏菌的活菌数，得到菌个数大于等于1×10⁸个/ml菌液；

(2)睾丸酮假单胞菌的培养：在室温，将从-80℃中取出睾丸酮假单胞菌，吸取200μl，用涂布棒均匀涂布在灭菌后的固体污水培养基上，封口膜封严，将平板倒置在15℃培养箱中培养14h，挑取较大而光滑的单菌落，接种到灭菌后的液体污水培养基中，于15℃摇床中，在转速150rpm,震荡培养12h左右，检测睾丸酮假单胞菌的活菌数，得到菌个数大于等于1×10⁸个/ml菌液；

(3)菌剂制备：将步骤(1)和步骤(2)获得的菌液按体积比为2:1的比例混合，得到治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂为D组。

实施例3

治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)腐败希瓦氏菌的培养：在室温，将从-80℃中取出腐败希瓦氏菌，吸取200μl，用涂布棒均匀涂布在灭菌后的固体污水培养基上，封口膜封严，将平板倒置在25℃培养箱中培养10h，挑取较大而光滑的单菌落，接种到灭菌后的液体污水培养基中，于25℃摇床中，在转速250rpm,震荡培养12h左右，检测腐败希瓦氏菌的活菌数，得到菌个数大于等于5×10⁸个/ml菌液；

(2)睾丸酮假单胞菌的培养：在室温，将从-80℃中取出睾丸酮假单胞菌，吸取200μl，用涂布棒均匀涂布在灭菌后的固体污水培养基上，封口膜封严，将平板倒置在25℃培养箱中培养10h，挑取较大而光滑的单菌落，接种到灭菌后的液体污水培养基中，于25℃摇床中，在转速250rpm,震荡培养12h左右，检测睾丸酮假单胞菌的活菌数，得到菌个数大于等于5×10⁸个/ml菌液；

(3)菌剂制备：将步骤(1)和步骤(2)获得的菌液按体积比为2:1的比例混合，得到治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂为E组。

治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂以下简称复合菌。

作为本发明进一步的方案，污水培养基为在天津海河金钢桥附近、天津西外环排污河、天津大学敬业湖、天津大学爱晚湖、污水处理厂等地采集的水样各1L混合均匀。

复合菌的使用条件要求污水pH为6.0-8.0。

实施例4

复合菌(A组，B组和C组)与腐败希瓦氏菌和睾丸酮假单胞菌COD去除能力的比较

将复合菌(A组，B组和C组)、腐败希瓦氏菌和睾丸酮假单胞菌分别接种于1L污水中，复合菌与单一菌的接菌总量相同(均为千分之一)，并分别在10℃、15℃、25℃条件下，200rpm/min的摇床中震荡培养24h后测定COD的去除率。结果见图1。

结果表明，复合菌与腐败希瓦氏菌和睾丸酮假单胞菌相比对污水中COD的去除率存在差异。在10℃、15℃、25℃条件下，按不同比例混合的复合菌的COD去除率均高于单一菌。而且随温度降低，复合菌的优势呈增大趋势。此外复合菌中腐败希瓦氏菌和睾丸酮假单胞菌按照不同比例混合，COD去除率存在差异。腐败希瓦氏菌和睾丸酮假单胞菌按照2:1的比例混合，COD的去除率最高，10℃、15℃、25℃条件下分别比腐败希瓦氏菌单一菌株高48.66％，46.73％，38.6％，比睾丸酮假单胞菌单一菌株高54.38％，53.13％，50.74％。低温条件下2:1的比例混合菌剂优势更明显。

实验证明，D组和E组的复合菌降低COD的能力分别与腐败希瓦氏菌和睾丸酮假单胞菌相比，具有显著差异。

实施例5

复合菌(A组，B组和C组)与腐败希瓦氏菌和睾丸酮假单胞菌氨氮去除能力的比较

将复合菌(A组，B组和C组)、腐败希瓦氏菌和睾丸酮假单胞菌分别接种于1L污水中，复合菌与单一菌的接菌总量相同(均为千分之一)，分别在10℃、15℃、25℃条件下，200rpm/min的摇床中震荡培养24h后测定氨氮的去除率。结果见图2。

结果表明，复合菌与腐败希瓦氏菌和睾丸酮假单胞菌相比对污水中氨氮的去除率存在差异。在10℃、15℃、25℃条件下复合菌的氨氮去除率均高于单一菌，尤其是低温条件下。此外复合菌中腐败希瓦氏菌和睾丸酮假单胞菌按照不同比例混合，氨氮去除率存在差异。25℃条件下，腐败希瓦氏菌和睾丸酮假单胞菌按照1:2的比例混合，氨氮的去除率最高，为94.2％，按照2:1的比例混合时，氨氮去除率为91.84％，略低于1:2比例混合菌剂的去除率。而在10℃、15℃条件下，腐败希瓦氏菌和睾丸酮假单胞菌按照2:1的比例混合，氨氮的去除率最高，分别高于1:2比例混合的菌剂17.1％和6.33％。腐败希瓦氏菌和睾丸酮假单胞菌按照2:1的比例混合，在10℃、15℃、25℃条件下分别比腐败希瓦氏菌单一菌株高52.38％，49.23％，50.14％，比睾丸酮假单胞菌单一菌株高39.43％，30.63％，30.4％。低温条件下2:1的比例混合菌剂优势更明显。

实验证3明，D组和E组的复合菌氨氮去除能力分别与腐败希瓦氏菌和睾丸酮假单胞菌相比，具有显著差异。

综合考虑，在低温条件下，腐败希瓦氏菌和睾丸酮假单胞菌按照2:1的比例混合时，COD和氨氮的去除率最高，污水治理效果最理想。

实施例6

低温复合菌最适生长pH测定

以污水培养基为基础培养基，将培养基分别调pH值为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9，120℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后在超净台中把活化后的低温复合菌(B组)分别接入其中，接菌量为1％，放置在20℃恒温摇床中，200rpm/min，培养24h后，分别测定菌液的吸光度，结果见图3。

高浓度的氢离子浓度可导致菌体表面蛋白质和核酸水解而变性。不同种属的微生物生理活动适应的pH值，都有一定的范围。在最低或最高pH值环境中，微生物虽然能够成活，但是条件不是最适条件，酶的活性低，生理活动微弱，易于死亡。参与污水生物处理的微生物，一般最佳的pH值范围，介于6.5～8.5之间。

从图3中可以看出，在反应时间与接菌量相同的条件下，pH为7.0～7.5时菌液的吸光度最大，生长情况最好，最适pH值在7.5左右，偏碱性，且在pH为6.0～8.0之间吸光度变化细微，可见该菌剂对pH的适应性较好，最佳pH范围广，适合作为污水处理的生物菌剂。

实施例7

低温条件下复合菌和单一菌生长情况的比较

本发明通过光电比浊法测定生长曲线，了解低温复合菌的生长规律，并且与单一菌进行对比。选取可见光600nm处，在10℃下培养细菌，测定培养液的吸光度值，测定时以0h的培养液为空白，每八个小时测定复合菌和单一菌菌液的吸光度值，绘制生长曲线，结果见图4。

从图中可以发现在10℃条件下低温复合菌(B组)生长情况明显优于单一菌腐败希瓦氏菌、睾丸酮假单胞菌，并且最终生长量明显高于单一菌。说明低温条件下，复合菌具有明显的生长优势，即复合菌具有更强的环境适应能力。

在废水处理的实际生产中，尤其是北方地区，一年要经历春夏秋冬四季的变化，气温经历高温到低温的过程，所以研究温度变化对微生物菌剂的生长影响，进而探究温度变化对水处理工艺的影响尤为重要。

Claims (8)

1.治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂，其特征是所述菌剂是按体积比为(1～2):(1～2)的比例由腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefacens)液和睾丸酮假单胞菌(Comamonastestosteroni)液组成，所述腐败希瓦氏菌液的浓度为1×10⁸个/ml-5×10⁸个/ml，所述睾丸酮假单胞菌液的浓度为1×10⁸个/ml-5×10⁸个/ml。

2.根据权利要求1的治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂，其特征是所述腐败希瓦氏菌液和睾丸酮假单胞菌液的体积比为2:1。

3.治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂的制备方法，其特征是包括如下步骤：

(1)腐败希瓦氏菌的培养：在室温，将腐败希瓦氏菌接种到灭菌后的固体污水培养基中，在15-25℃培养箱中培养10-14h，挑取较大而光滑的单菌落，接种到灭菌后的液体污水培养基中，于15-25℃摇床中，在转速150-250rpm培养至菌个数达到1×10⁸个/ml-5×10⁸个/ml的菌液；

(2)睾丸酮假单胞菌的培养：在室温，将睾丸酮假单胞菌接种到灭菌后的固体污水培养基中，在15-25℃培养箱中培养10-14h，挑取较大而光滑的单菌落，接种到灭菌后的液体污水培养基中，于15-25℃摇床中，在转速150-250rpm培养至菌个数达到1×10⁸个/ml-5×10⁸个/ml的菌液；

(3)菌剂制备：将步骤(1)和步骤(2)获得的菌液，按体积比为(1～2):(1～2)的比例混合，得到治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂。

4.根据权利要求3所述的治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂的制备方法，其特征是所述固体污水培养基由下述组份制成：葡萄糖0.17g，磷酸二氢钾0.07g，可溶性淀粉0.16g，无水碳酸钠0.06g，乙酸钠0.233g，牛肉膏0.06g，氯化铵0.0255g，硫酸铵0.0284g，蛋白胨0.158g，琼脂粉15g,加水至1L，调节pH值6.5～8.5。

5.根据权利要求3所述的治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂的制备方法，其特征是所述液体污水培养基由下述组份制成：葡萄糖0.17g，磷酸二氢钾0.07g，可溶性淀粉0.16g，无水碳酸钠0.06g，乙酸钠0.233g，牛肉膏0.06g，氯化铵0.0255g，硫酸铵0.0284g，蛋白胨0.158g，加水至1L，调节pH值6.5～8.5。

6.根据权利要求3所述的治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂的制备方法，其特征是所述腐败希瓦氏菌液和睾丸酮假单胞菌液的体积比为2:1。

7.权利要求1或2治理污染水体的耐低温复合微生物菌剂在污染水生态治理中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述治理为降低COD，降解氨氮。