CN102061275B

CN102061275B - 一株施氏假单胞菌及其在水体除磷中的应用

Info

Publication number: CN102061275B
Application number: CN2010105388693A
Authority: CN
Inventors: 袁红莉; 李海峰; 杨金水; 李宝珍
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2010-11-10
Filing date: 2010-11-10
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2030-11-10
Also published as: CN102061275A

Abstract

本发明公开了一株施氏假单胞菌及其在水体除磷中的应用。本发明提供的菌株为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YG-26，其保藏编号为CGMCC No.4093。用海藻酸钠与聚乙烯醇包埋的YG-26可得到固定化菌体。菌株YG-26及其固定化菌体可以最大限度的去除污水中的磷，从而有效防控水体富营养化的发生。应用本发明的菌株或固定化菌体进行水体处理，去除率高、方法操作简单、成本低廉、经济环保、可广泛应用于污水的进一步处理，具有重大的经济、环境和社会效益。

Description

一株施氏假单胞菌及其在水体除磷中的应用

技术领域

本发明涉及一株施氏假单胞菌及其在水体除磷中的应用。

背景技术

水体富营养化已成为全球范围内严重影响水体质量的问题之一。在我国，已发生富营养化的湖泊面积达5000平方公里，具备发生富营养化条件的湖泊面积达14000平方公里。因此，对于富营养化的治理已经成为国内外研究学者重点攻克的技术难关之一。

大量研究表明，磷是引发水体富营养化的限制性因子。2008年8月，加拿大和美国的科学家基于长达37年的湖沼学实验研究，在美国《国家科学院院刊》(PNAS)上联合发表文章，提出了对淡水湖泊富营养化的治理无需控氮而只需控磷的观点。

目前针对、污水的除磷方法基本有三种：

(1)吸附法，利用某些多孔或大比表面积的固体物质对水中磷酸根离子的亲和力来实现除磷的过程。但吸附法除磷在吸附剂的抗干扰性、溶解损失和再生等方面还存在诸多问题。由于传统吸附剂吸附容量较低，吸附法作为单独除磷手段目前尚未得到广泛应用，经常作为辅助手段与其它除磷方法结合使用。

(2)化学法，主要是通过投加金属盐化学药剂形成不溶性磷酸盐沉淀物，然后通过固液分离将其从污水中去除。化学法除磷的优点是除磷效率较高，且稳定可靠，但它的主要问题是药剂价格昂贵、运行费用较高、产生大量化学污泥、污泥处置的难度大，易造成二次污染，另外，化学沉淀法除磷的极限值是0.04mg/L，不能实现对磷的完全去除。

(3)生物法，目前生物法除磷主要是通过以下两种独立的机制来完成：一种是微生物和植物同化吸收磷；另一种是活性污泥中的聚磷微生物过量摄磷。

生物除磷由于高效且环保，具有巨大的应用前景，但由于对微生物除磷机理的了解不够，对活性污泥中微生物的组成也不清楚，经常出现运行不稳定的问题，所以目前的生物除磷技术有待进一步的改进。而且，我国出水中的总磷含量为0.5或1.0mg/L(国家废水排放一级A类及B类排放标准)，远远超过发生富营养化，即“水华”暴发时水体中总磷浓度的临界值0.03mg/L，严重影响生态平衡以及居民的生产和生活。

以聚磷菌为主导的生物除磷法具有操作简单、可节约成本、不产生二次污染等的优点，是研究的热点。由于聚磷菌可以分泌生物酶，在吸收无机磷的同时能够分解污水中的有机磷而加以吸收，所以具备将出水中总磷含量降至低于0.03mg/L的潜力。但是，目前分离得到的聚磷菌种还非常少，利用高效的菌种进行除磷的方法还处于探索阶段，仍远远不能满足实际应用的需要。而且，对低浓度磷(≤1.0mg/L)的去除在国内外仍未得到足够的关注，所以利用定性定量方法筛选得到用于低浓度磷去除的高效聚磷菌株，探索其在磷的进一步去除中的应用具有重要的理论及现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株施氏假单胞菌及其在水体除磷中的应用。

菌株YG-26分离自江苏省无锡市太湖的富营养化水体区域的表层沉积物，经鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，已于2010年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号为CGMCC No.4093。施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YG-26CGMCC No.4093环境适应能力很强，可在较广的温度、pH与盐度范围内生长。

施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YG-26CGMCC No.4093可用于水体除磷。施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YG-26CGMCC No.4093可用于富营养化水体(富营水体)处理和/或污水处理。施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YG-26CGMCCNo.4093可用于制备污水处理剂和/或富营养化水体处理剂。本发明还保护一种污水处理剂和/或富营养化水体处理剂，它的活性成分为施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)YG-26CGMCC No.4093。

用海藻酸钠和聚乙烯醇包埋施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YG-26可得到固定化菌体。用海藻酸钠与聚乙烯醇(PVA)包埋的固定化菌体有效解决了菌体与污水不易分离的实际问题，较好地保持了除磷效率并提高了菌体对环境pH的耐受范围。所述固定化菌体可用于水体除磷。所述固定化菌体可用于富营养化水体处理和/或污水处理。所述固定化菌体可用于制备污水处理剂和/或富营养化水体处理剂。本发明还保护一种污水处理剂和/或富营养化水体处理剂，它的活性成分为所述固定化菌体。

以上任一所述水体的总磷浓度可为0.03mg/L以上，具体可为0.03-1.0mg/L。

本发明的的有益效果：(1)菌株YG-26为一种新的适于低浓度除磷的高效菌种，可以丰富现有的聚磷菌资源；(2)利用固定化菌体进行低浓度磷的去除，固定化小球可多次使用，在一定程度上节约生产成本，有利于实际应用；(3)菌株YG-26最适于去除低浓度磷(对低浓度磷的去除率菌达97％以上)，环境适应能力强，具有应用到实际污水处理的巨大潜力；(4)应用菌株YG-26进行水体除磷，避免了化学法除磷中由于金属离子的加入而引起的二次污染，是一种环保高效的除磷方法。

菌株YG-26及其固定化菌体可以最大限度的去除污水中的磷，从而有效防控水体富营养化的发生。应用本发明的菌株或固定化菌体进行水体处理，去除率高、方法操作简单、成本低廉、经济环保、可广泛应用于污水的进一步处理，具有重大的经济、环境和社会效益。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

YG固体培养基(筛选培养基)：pH6.5；由水和溶质组成；溶质及其浓度为：葡萄糖(1.0g/L)、酵母浸膏(1.0g/L)、K₂HPO₄(0.3g/L)、KH₂PO₄(0.25g/L)、MgSO₄·7H₂O(0.2g/L)。

YG液体培养基(种子液培养基)：pH6.5；由水和溶质组成；溶质及其浓度为：葡萄糖(1.0g/L)、酵母浸膏(1.0g/L)、K₂HPO₄(0.3g/L)、KH₂PO₄(0.25g/L)、MgSO₄·7H₂O(0.2g/L)。

MOPS培养基(10×)：mops 8.370g，tricine 0.717g，定容到44mL，10mol/L KOH调pH至7.4，0.01mol/LFeSO₄1mL，按下列顺序加溶液：NH₄Cl(1.9mol/L)5mL，K₂SO₄(0.276mol/L)1mL，CaCl₂·2H₂O(0.02mol/L)0.025mL，MgCl₂·6H₂O(2.5mol/L)0.21mL，NaCl(5mol/L)10mL，微量元素混合液0.02mL，葡萄糖0.1g，X-Pi 5mg，微量thiamine溶液，定容到100mL。

限磷筛选培养基：取50mL10×MOPS培养基，置于三角瓶中，加入0.0087g K₂HPO₄。

过磷筛选培养基：取50mL10×MOPS培养基，置于三角瓶中，加入0.173g K₂HPO₄。

人工废水：pH为6.5；由水和溶质组成；溶质及其浓度为：无水乙酸钠(0.5g/L)、(NH₄)₂SO₄(0.2g/L)、MgSO₄·7H₂O(0.4g/L)、CaSO₄(0.08g/L)、FeSO₄·7H₂O(0.002g/L)、牛肉膏(0.22g/L)，按实验需求的初始总磷浓度(磷元素浓度)添加不同量的KH₂PO₄。

液体总磷浓度的测定方法为过硫酸钾消解钼酸铵分光光度法(GB11893-89)。

实施例1、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YG-26的发现

一、菌株的分离

2008年9月采集江苏省无锡市太湖水域样品(表层沉积物)，途中将样品置于4℃以下的冰盒中，带回实验室后称取5g样品放入装有45mL无菌水的三角瓶中，于28℃，180rpm摇床振荡1h，待样品均匀分散到无菌水中之后，吸取0.5mL悬液于装有4.5mL无菌水的试管中，混匀，制成浓度分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的菌悬液，从各浓度悬液中分别吸取100μL涂布于YG固体培养基平板上，每个样品三个重复，28℃恒温培养箱培养3d。将形态不同的菌落划线纯化，并依次标记为YG-1，YG-2等。

将从YG平板上分离纯化后的菌株活化，分别接到限磷和过磷筛选培养基上，30℃培养5d，两种平板上均呈蓝斑的菌落即为初筛的聚磷菌。

再将初筛到的聚磷菌接入初始总磷浓度为1mg/L的人工废水中，28℃，180r/min摇床振荡培养24h，得到的菌悬液以8000r/min的转速离心10min，取上清液测定总磷浓度，与初始总磷浓度对照，计算除磷率。除磷率＝(初始总磷浓度-培养24h后的总磷浓度)/初始总磷浓度×100％，其中除磷率最高的菌株YG-26即为目标高效聚磷菌。

二、菌株的鉴定

YG-26的主要生物学特性：革兰氏阴性(G^-)，菌体为杆状，兼性厌氧；接触酶、硝酸盐还原、葡萄糖发酵、反硝化、柠檬酸盐、丙二酸盐反应为阳性，氧化酶、吲哚反应、硫化氢反应、甲基红实验为阴性。

YG-26可在温度为4-37℃的条件下生长，并且可以耐受较广的pH(5.5-9.0)与盐度(0-5％)范围，环境适应能力很强；对数生长末期除磷率最大，可去除初始总磷浓度为1.0mg/L的水体中97％以上的磷量(处理后水体中的总磷浓度低于引发水体富营养化的极限值0.03mg/L)。

YG-26的16S rRNA基因部分序列如序列表的序列1所示。

基于YG-26的生理生化分析及16S rRNA基因的同源性比对结果，将YG-26鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。将YG-26保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4093。

三、菌株的保存

YG-26可采用如下两种方式保存：

(1)利用脱脂牛奶做成冻干管，-70℃保存。

(2)20％甘油保存于-20℃保存。

实施例2、固定化施氏假单胞菌YG-26对天然废水的除磷能力

一、固定化施氏假单胞菌YG-26的制备

海藻酸钠：购自国药集团化学试剂公司，目录号30164428，分子量为222。聚乙烯醇(PVA)：购自国药集团化学试剂公司，目录号30153083，平均聚合度(DP)为2400-2500。溶液甲(pH6.5)：由水和溶质组成；溶质及其浓度为：海藻酸钠1g/100mL，聚乙烯醇2g/100mL。溶液乙(pH6.5)：由水和溶质组成；溶质及其浓度为：CaCl24g/100mL，硼酸5g/100mL(体积百分含量)。

1、将施氏假单胞菌YG-26接入YG液体培养基，28℃下180rpm振荡培养至对数期(OD₆₀₀＝0.2)。

2、取20mL菌液，离心(6000rpm，10min)收集菌体，用去离子水清洗两遍。

3、将菌体与20mL溶液甲混合，用注射器将混合液匀速滴入4℃预冷的溶液乙中，然后4℃交联24小时，形成直径3-4mm的小球，用去离子水冲洗小球。

二、固定化施氏假单胞菌YG-26对人工废水的除磷能力

将20g步骤一制备的小球(固定化施氏假单胞菌YG-26)接入200mL人工废水(初始总磷浓度为1.0mg/L)中，28℃下180rpm摇床培养24h，取上清液检测总磷浓度。

进行三次重复实验；每次重复实验中设置10个重复处理，结果取平均值。三次重复实验中，总磷浓度的结果分别为0.024mg/L、0.028mg/L、0.025mg/L，均低于0.03mg/L。

三、固定化施氏假单胞菌YG-26的重复使用性能

1、将20g步骤一制备的小球(固定化施氏假单胞菌YG-26)接入200mL人工废水(初始总磷浓度为1.0mg/L)中，28℃下180rpm摇床培养24h，取上清液检测总磷浓度。

2、将步骤1中的小球回收，用去离子水冲洗小球，然后将小球接入200mL人工废水(初始总磷浓度为1.0mg/L)中，28℃下180rpm摇床培养24h，取上清液检测总磷浓度。

3、将步骤2中的小球回收，用去离子水冲洗小球，然后将小球接入200mL人工废水(初始总磷浓度为1.0mg/L)中，28℃下180rpm摇床培养24h，取上清液检测总磷浓度。

4、将步骤3中的小球回收，用去离子水冲洗小球，然后将小球接入200mL人工废水(初始总磷浓度为1.0mg/L)中，28℃下180rpm摇床培养24h，取上清液检测总磷浓度。

5、将步骤4中的小球回收，用去离子水冲洗小球，然后将小球接入200mL人工废水(初始总磷浓度为1.0mg/L)中，28℃下180rpm摇床培养24h，取上清液检测总磷浓度。

设置10个重复处理，结果取平均值。步骤1的上清液的总磷浓度为0.019mg/L，步骤2的上清液的总磷浓度为0.026mg/L，步骤3的上清液的总磷浓度为0.025mg/L，步骤4的上清液的总磷浓度为0.027mg/L，步骤5的上清液的总磷浓度为0.028mg/L。结果表明，固定化施氏假单胞菌YG-26连续对人工废水除磷五次，均可使其中的磷浓度低于0.03mg/L。

实施例3、固定化施氏假单胞菌YG-26对天然湖水的除磷能力

天然湖水取自太湖，总磷浓度为0.2mg/L。

一、固定化施氏假单胞菌YG-26的制备

1、将施氏假单胞菌YG-26接入YG液体培养基，28℃下180rpm振荡培养至对数期(OD₆₀₀＝0.4)。

2、取10mL菌液，离心收集菌体，用去离子水清洗两遍。

二、固定化施氏假单胞菌YG-26对天然湖水的除磷能力

将10g步骤一制备的小球接入100mL天然湖水中，28℃下180rpm摇床培养24h，取上清液检测总磷浓度。

进行三次重复实验，每次重复实验中设置10个处理，结果取10个处理的平均值。三次实验中，总磷浓度的结果分别为0.018mg/L、0.022mg/L、0.023mg/L，均低于0.03mg/L。

实施例4、施氏假单胞菌YG-26游离菌体对天然湖水的除磷能力

湖水样本甲取自太湖湖区污染较严重的10#标准采样位点，初始总磷浓度为0.15mg/L。湖水样本乙取自太湖湖区污染较严重的16#标准采样位点，初始总磷浓度为0.17mg/L。

将湖水样本甲和湖水样本乙分别进行如下处理：

1、将施氏假单胞菌YG-26接入YG液体培养基，28℃下180rpm振荡培养至对数期(OD600＝0.4)。

2、取10mL菌液，离心收集菌体，用去离子水清洗两遍。

3、将0.1g湿菌体接入100mL天然湖水中，28℃下180rpm摇床培养24h，取上清液检测总磷浓度。

每个样本进行三次重复实验，每次重复实验中设置10个处理，结果取10个处理的平均值。湖水样本甲的三次实验中，总磷浓度的结果分别为0.015mg/L、0.018mg/L、0.016mg/L，均低于0.03mg/L。湖水样本乙的三次实验中，总磷浓度的结果分别为0.013mg/L、0.01mg/L、0.012mg/L，均低于0.03mg/L。

结果表明，施氏假单胞菌YG-26具有应用于污水除磷的巨大潜力。

Claims

1.施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YG-26，其保藏编号为CGMCC No.4093。

2.权利要求1所述施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YG-26CGMCC No.4093在水体除磷中的应用。

3.权利要求1所述施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YG-26CGMCC No.4093在富营养化水体处理和/或污水处理中的应用；所述污水处理为污水除磷。

4.一种污水处理剂和/或富营养化水体处理剂，它的活性成分为权利要求1所述施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YG-26CGMCC No.4093；所述污水处理为污水除磷。

5.权利要求1所述施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YG-26CGMCC No.4093在制备污水处理剂和/或富营养化水体处理剂中的应用；所述污水处理为污水除磷。

6.用海藻酸钠和聚乙烯醇包埋权利要求1所述施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)YG-26CGMCC No.4093得到的固定化菌体。

7.权利要求6所述固定化菌体在水体除磷中的应用。

8.权利要求6所述固定化菌体在富营养化水体处理和/或污水处理中的应用；所述污水处理为污水除磷。

9.一种污水处理剂和/或富营养化水体处理剂，它的活性成分为权利要求6所述固定化菌体；所述污水处理为污水除磷。

10.权利要求6所述固定化菌体在制备污水处理剂和/或富营养化水体处理剂中的应用；所述污水处理为污水除磷。