CN103667168B - 一种好氧反硝化细菌及其在污水处理中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种好氧反硝化细菌及其在污水处理中的应用，申请人通过富集从湿地中筛选出一种好氧反硝化细菌，施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）JH-1，CCTCC NO：M2013488。该细菌可用于处理高NO₃ ^-的废水，最高去除率可达99.6%，且无亚硝态氮的累积，并可同时去除有机废水中的COD，去除率可达60%-80%。相比其他报道的用于污水处理的好氧反硝化细菌，本发明菌株对污水处理高效，24h后对硝态氮的去除率可达99.6%，脱氮速率可达22.6mg?L^-1?h^-1，其除氮效率是已报道菌株的1.51～4.57倍，可以单独使用或者固定化后应用于废水处理中，应用广泛。

Description

一种好氧反硝化细菌及其在污水处理中的应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种好氧反硝化细菌，还涉及该细菌在污水处理中的应用。

背景技术

近年来，工业废水的大量排放以及农业大量施用化肥，导致氮素污染引起的水环境问题日益突出，而其中硝酸盐污染问题尤为严重。硝酸盐及其衍生物因具有致病、致癌作用而影响人类健康。因此，加大对污水中氮素污染的治理，尤其是提高硝酸盐氮的处理效率是目前污水处理技术中亟待解决的问题。

生物反硝化脱氮是利用微生物的作用，在厌氧或缺氧条件下，以硝酸盐替代氧作电子受体将硝酸盐逐步还原为气态产物脱除，是一种经济有效的脱氮方式。但往往由于受到厌氧和缺氧条件的限制，生物脱氮过程进行的并不彻底。好氧反硝化菌的出现使得反硝化过程更容易控制，其是利用好氧反硝化酶的作用，在有氧条件下进行反硝化作用的一类反硝化细菌。自20世纪80年代，Robertson等（Robertson et al.Archives of Microbiology,1984,139,351-354）在除硫和反硝化处理系统中首次分离出好氧反硝化菌以来，人们对于好氧反硝化菌的脱氮性能已经进行了一定程度上的研究。然而已筛得的好氧反硝化菌大部分脱氮效率不高，一般在溶解氧浓度较低时才会具有反硝化活性，因此，筛选分离出高效的好氧反硝化细菌菌株，并将其应用于实际污水处理中，以节约脱氮成本，提高经济效益具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一株好氧反硝化细菌，该细菌已于2013年10月23日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）JH-1，保藏编号：CCTCC NO：M2013488。该菌株具有高效脱除水体中硝酸盐氮的能力。

本发明的另一个目的在于提供了一株好氧反硝化细菌在污水处理中的应用，单独使用该菌，或者将该菌进行固定化后投放到水体中，均可以有效地去除水体中的硝酸盐氮，且无亚硝态氮的累积，并且除氮速度快。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种好氧反硝化细菌，其筛选过程是：

（1）富集

于2013年5月从增氧型复合垂直流人工湿地小试系统两套系统中采集土壤样品，采样深度为表层10cm。无菌条件下称量10g土壤接入500mL的液体培养基中进行富集，利用间歇曝气法进行富集，间歇时间为12h，每次曝气3h，于30℃温箱培养，每五天转接一次，富集时间1个月。测得硝态氮的去除率为99.9%，基本上没有亚硝氮的累积。

所述液体培养基为KNO₃2g，K₂HPO₄1g，KH₂PO₄1g，MgSO₄0.2g，柠檬酸钠5g，微量盐溶液2mL；蒸馏水1000mL。

（2）初筛

采用涂布法将富集得到的菌悬液均匀涂布于BTB选择性培养基，30℃温箱培养3d后，选取变蓝的菌落或晕圈作为初筛菌。

（3）复筛

将初筛的菌株接种于液体培养基，30℃，120r·min^-1摇床培养5d，进行复筛。每24小时利用格氏试剂、二苯胺试剂显色来检测硝酸盐的降解情况，选取去除效果好的菌株。

所述BTB培养基为：琼脂20g，KNO₃1g，KH₂PO₄1g，FeCl₂·6H₂O0.5g，CaCl₂·7H₂O0.2g，MgSO₄·7H₂O1g，琥珀酸钠8.5g，BTB(1%溶于酒精)1mL；蒸馏水1000mL，用1mol·L^-1NaOH调节pH至7.0～7.3。

通过综合比较硝态氮的去除率，亚硝态氮的累积量以及硝态氮的去除速率等指标，最终从28株初筛菌中筛选出一株好氧反硝化细菌JH-1，其16SrRNA为SEQ ID NO.1所示。该细菌已于2013年10月23日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）JH-1，保藏编号：CCTCC NO：M2013488，地址：中国武汉武汉大学。

JH-1为革兰氏阴性菌，为短杆菌，长为1.0um—1.5um,宽为0.2um—0,4um,无芽孢和鞭毛，在固体培养基上形成不透明的白色菌落，菌落表面光滑，边缘整齐。

JH-1生理生化特性–酶活、碳源同化

+：阳性，-：阴性，

JH-1生理生化特性--酶活

+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应

一种好氧反硝化细菌在污水处理中的应用，其步骤是：

(1)将活化后的菌液接种于待处理的含氮废水中，投加量为受处理废水体积的5%，pH范围为7.0-7.3，在摇床（30℃，120r/min）条件下，定时取样检测水样中硝态氮、COD的去除率及亚硝态氮的累积量。

(2)用三种不同的基质包埋细菌获得固定化好氧反硝化细菌，并用于废水脱氮处理中

A、海藻酸钠固定法：称取4g海藻酸钠溶解到60mL的0.9%的生理盐水中，高温高压（121℃，105-110kPa）灭菌冷却至室温（20-25℃），与80mL好氧反硝化细菌悬浮液充分混合，滴入4%w/v的CaCl₂溶液中，冰浴，边滴边搅拌，使其形成直径为2mm的小球；将形成的小球放置于4℃冰箱中交联固化12-24h后，用生理盐水洗涤2-3次备用。

B、聚乙烯醇固定法：配制60mL10%w/v的聚乙烯醇溶液，高温高压（121℃，105-110kPa）灭菌冷却到室温（20-25℃），与80mL好氧反硝化菌悬液充分混合，滴入饱和硼酸溶液中，冰浴，边滴边搅拌，使其形成直径为2mm的小球；将形成的小球放置于4℃冰箱中交联固化12-24h后，用生理盐水洗涤2-3次备用。

C、海藻酸钠和聚乙烯醇固定法：5%w/v聚乙烯醇和5%w/v的海藻酸钠的混合溶液60mL，加热使其完全混合，高温高压灭菌（121℃，105-110kPa），冷却至室温（20-25℃），与80mL好氧反硝化菌悬液充分混合；将此混合液用注射器挤入到4%w/v的CaCl₂溶液中，冰浴，边滴边搅拌，使其形成直径为2mm的小球；将形成的小球放置于4℃冰箱中交联固化11-13h，用无菌水清洗小球，再放入饱和硼酸溶液中，于4℃冰箱中交联固化11-13h，用生理盐水洗涤2-3次备用。

将A、B、C三步制得的好氧反硝化细菌小球从冰箱中取出，用双蒸水或者0.9%w/v的生理盐水洗涤3-4次，然后浸泡在0.9%的生理盐水中，曝气约11-13h左右以活化固定化小球，将一定量活化后的固定化小球填充到人工湿地模拟柱中，进行废水脱氮处理研究。

（3）于天然湖水中加入适量外加碳源柠檬酸钠，将经24h活化的施氏假单胞菌JH-1按5％的接种量接入湖水中，摇床（30℃，120rpm）培养48h测定水体中硝态氮以及亚硝态氮的量。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果

本发明菌株可利用的碳源和氮源范围广泛，易于培养。

本发明菌株可用于处理高NO₃ ^-的废水，最高去除率可达99.6%，且无亚硝态氮的累积。

本发明菌株可同时去除有机废水中的COD，去除率可达60%-80%。

本发明菌株可以单独使用或者固定化后应用于废水处理中，应用广泛。

相比其他已发现的好氧反硝化细菌，菌株JH-1是一株非常高效的好氧反硝化细菌，24h后对硝态氮的去除率可达99.6%，脱氮速率可达22.6mg·L^-1·h^-1，已报道分离出的好氧反硝化菌其脱氮速率大多数在4.50～13.7mg·L^-1·h^-1。JH-1脱氮速率是这些菌的1.51～4.57倍。

附图说明

图1为好氧反硝化细菌JH-1菌体电子扫描电镜照片（×40.0k）

图2为三种固定化小球好氧反硝化速率变化曲线。

图3为进行废水脱氮处理的人工湿地模拟柱结构示意图。

图4为三种不同基质填埋条件下硝态氮的去除率曲线。

系统1内下层填料为2-3mm的圆陶粒，上层填料为固定化小球；系统2内下层填料为2-3mm的圆陶粒，上层填料为被菌悬液浸泡过的陶粒；系统3内填料是与系统1、2填料高度相等，规格一样的陶粒

图5为三种不同基质填埋条件下亚硝态氮的积累量曲线。

系统1内下层填料为2-3mm的圆陶粒，上层填料为固定化小球；系统2内下层填料为2-3mm的圆陶粒，上层填料为被菌悬液浸泡过的陶粒；系统3内填料为与系统1、2填料高度相等，规格一样的陶粒

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规培养与分离方法得到。

实施例1：

一种好氧反硝化细菌的制备方法，其步骤是：

利用好氧反硝化细菌在有氧条件下进行反硝化作用的特性，采用间歇曝气法和酸碱指示剂法从人工湿地土壤中富集分离出好氧反硝化细菌。

（1）富集

无菌条件下称量10g土壤接入500mL的液体培养基中进行富集，利用间歇曝气法进行富集，间歇时间为12h，每次曝气3h，于30℃温箱培养，每五天转接一次，富集时间1个月。测得硝态氮的去除率为99.9%，基本上没有亚硝氮的累积。

所述液体培养基为KNO₃2g，K₂HPO₄1g，KH₂PO₄1g，MgSO₄0.2g，柠檬酸钠5g，微量盐溶液2mL；蒸馏水1000mL。

（2）初筛

采用涂布法将富集得到的菌悬液均匀涂布于BTB选择性培养基，30℃温箱培养3d后，选取变蓝的菌落或晕圈作为初筛菌。

（3）复筛

将初筛的菌株接种于液体培养基，30℃，120r·min^-1摇床培养5d，进行复筛。每24小时利用格氏试剂、二苯胺试剂显色来检测硝酸盐的降解情况，经过比较各菌株对硝酸盐氮的去除率及亚硝态氮的累积量，筛选到好氧反硝化菌株JH-1

所述BTB培养基为：琼脂20g，KNO₃1g，KH₂PO₄1g，FeCl₂·6H₂O0.5g，CaCl₂·7H₂O0.2g，MgSO₄·7H₂O1g，琥珀酸钠8.5g，BTB(1%溶于酒精)1mL；蒸馏水1000mL，用1mol·L^-1NaOH调节pH至7.0～7.3。

（4）菌株的保藏：保藏编号：CCTCC NO：M2013488,保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2013年10月23日，分类命名：施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）JH-1

实施例2：

施氏假单胞菌菌JH-1的安全性测定：

试验设对照、JH-1接种2个处理。每缸装水10L，放养20条大小基本一致的斑马鱼（长约2～3cm），平均每条鱼重0.5g，投JH-1菌液250mL（菌液浓度为9×105cfu·mL-1）。养鱼管理按日常管理，7d投一次菌，试验周期30d。

试验期间鱼苗进食正常，非常活跃，无浮头现象，所有处理未出现死亡现象。鱼的成活率均为100%，说明JH-1制剂对鱼苗是安全的。

实施例3

施氏假单胞菌JH-1对天然湖水的处理能力测定

试验所用天然湖水取之武汉东湖污染比较严重的位点，测定其硝态氮浓度为0.800mg/L，pH为6.0-6.5。将取得的天然湖水按以下处理分组：第一组，不加柠檬酸钠也不加分离菌株作为空白对照；第二组，加柠檬酸钠，不加分离菌株；第三组，不加柠檬酸钠，但是加入分离菌株；第四组，即加柠檬酸钠，也加入分离菌株。250mL三角瓶中装入100mL污水，接种5mL细菌浓度为9×10⁵cfu·mL-1菌悬液，30℃下120rpm摇床培养48h，取上清液检测硝态氮浓度，每组处理3个重复。

菌株JH-1单独加入污水的脱氮效果不是很理想，但当同时加入外加碳源柠檬酸钠后，脱氮效果明显增强，48h摇床培养后，能将硝态氮浓度为0.800mg/L的天然湖水降至0.163mg/L，降解率分别为79.6％，且亚硝态氮的最终含量为0。菌株JH-1对天然湖水中硝态氮的去除效果见表1。

表1施氏假单胞菌JH-1对天然湖水的处理效果

实施例4：

一种好氧反硝化细菌在污水处理中的应用，其应用过程是：

（1）好氧反硝化细菌的菌悬液的制备

挑选1-2环斜面保存的好氧反硝化细菌，加入到经过高温高压灭菌的富集培养基中，在30℃下曝气培养48h，得到菌液；将得到的菌液离心，弃去上清液，用0.9%生理盐水离心洗涤2-3次（6000r/min，10min），再用0.9%生理盐水稀释到500ml左右，（细菌菌悬液浓度为9×10⁷～9×10⁹cfu/mL）混合均匀，4℃贮藏备用；

所述的富集培养基组成如下:双蒸水750mL，硝酸钾2g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g，

硫酸镁0.2g，柠檬酸钠5g，微量盐溶液2mL；

所述的微量盐溶液为：乙二胺四乙酸50g，七水硫酸锌22g，无水氯化钙5.54g，四水氯化锰5.06g，七水硫酸亚铁4.99g，四水合钼酸铵1.10g，五水硫酸铜1.57g，六水氯化钴1.61g，双蒸水1000mL，

用氢氧化钾调pH至6.0；

（2）将制备好的菌液接种于待处理的含氮废水中，其中该废水初始硝态氮浓度为299.3mg/L，COD浓度为2720mg/L，投加量为受处理废水体积的5%，pH范围为7.0-7.3，在摇床（30℃，120r/min）中培养24h后，水样中硝态氮、COD的浓度分别降为1.20mg/L，486.8mg/L,脱氮速率可达22.6mg·L^-1·h^-1，对硝态氮和COD的降解率分别为99.6%和82.1%，且整个过程并无亚硝态氮的累积。

选取四因素三水平L₉(3⁴)正交表设计实验（因素水平表见表2）。实际实验中不同DO值通过设计不同的转速来实现，转速的三个水平分别为0，60，120r·min-1，对应的DO值为0.75～1.33mg·L-1，1.84～3.57mg·L-1和5.39～6.74mg·L-1。

表2L₉(3⁴)因素水平表

按表1所示条件进行正交试验，将制备好的菌液30℃培养24h，测定其硝态氮去除率，亚硝态氮积累量，重复试验3次，所得结果如表3所示。

表3L₉(3⁴)正交试验结果分析

由表2可知，当初始废水中硝态氮浓度为2mg/l，C/N=5，pH=5，DO值为5.39～6.74mg/L时，该好氧反硝化细菌对硝态氮的去除效果最好，平均去除率为97.3%，且亚硝态氮的累积量为0.06mg/L，几乎为零。

（3）用三种不同的基质包埋细菌获得固定化好氧反硝化细菌，并用于废水脱氮处理中

A、海藻酸钠（SAL）固定法：称取4g海藻酸钠溶解到60mL的0.9%的生理盐水中，高温灭菌冷却至室温，与80mL好氧反硝化细菌悬浮液充分混合，滴入4%的CaCl₂溶液中，冰浴，边滴边搅拌，使其形成直径为2mm的小球；将形成的小球放置于4℃冰箱中交联固化24h后，用生理盐水洗涤2-3次备用。

B、聚乙烯醇(PVA)固定法：配制60mL10%的聚乙烯醇溶液，高温灭菌冷却到室温，与80mL好氧反硝化菌悬液充分混合，滴入饱和硼酸溶液中，冰浴，边滴边搅拌，使其形成直径为2mm的小球；将形成的小球放置于4℃冰箱中交联固化24h后，用生理盐水洗涤2-3次备用。

C、海藻酸钠和聚乙烯醇(SAL+PVA)固定法：5%（w/v）聚乙烯醇和5%（w/v）的海藻酸钠的混合溶液60mL，加热使其完全混合，高温高压灭菌（121℃，105-110kPa），冷却至室温（20-25℃），与80mL好氧反硝化菌悬液充分混合；将此混合液用注射器挤入到4%（w/v）的CaCl₂溶液中，冰浴，边滴边搅拌，使其形成直径为2mm的小球；将形成的小球放置于4℃冰箱中交联固化11-13h，用无菌水清洗小球，再放入饱和硼酸溶液中，于4℃冰箱中交联固化11-13h。

将A、B、C三步制得的好氧反硝化细菌小球从冰箱中取出，用双蒸水或者0.9%的生理盐水洗涤3-4次，然后浸泡在一定体积的0.9%的生理盐水中，曝气约12h左右以活化固定化小球。然后将三种固定化小球分别投放于步骤（1）所述的液体培养基中，每2小时采样一次，则步骤（3）中所得固定化小球不同阶段的平均好氧反硝化速率如图2所示。其中SAL小球、SAL+PVA小球、PVA小球在前6h的平均好氧反硝化速率分别为45.85mg·L^-1·h^-1，45.70mg·L^-1·h^-1，26.71mg·L^-1·h^-1。

D、将上述步骤C制得的海藻酸钠-聚乙烯醇固定化小球应用于人工湿地模拟柱中的脱氮研究。进行脱氮处理的硝态氮废水浓度为80mg/L.，COD_Cr约为400mg/L。填充高度约为2.5cm，装置如图3所示，其中，1、2系统下层填料为2-3mm的圆陶粒，上层分别为固定化小球和被菌悬液浸泡过的陶粒，3系统中为与1、2系统填料高度相等，规格一样的陶粒，分别取4h、8h、12h、18h、24h、36h、48h、72h时段的水样进行硝化速率以及亚硝态氮残留量的分析，结果分别如图4、5所示。36h时，三个系统的硝态氮的去除率都达到了98%以上，但是填充了固定化小球的系统，亚硝态氮最终没有累积。而且将好氧反硝化细菌进行固定化后投放到人工湿地系统中，可以防止菌液的流失，提高好氧反硝化细菌的使用寿命。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院水生生物研究所

<120> 一种好氧反硝化细菌及其在污水处理中的应用

<130> 一种好氧反硝化细菌及其在污水处理中的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1409

<212> DNA

<213> 施氏假单胞菌

<400> 1

catgcaagtc gagcggatga gtggagcttg ctccatgatt cagcggcgga cgggtgagta 60

atgcctagga atctgcctgg tagtggggga caacgtttcg aaaggaacgc taataccgca 120

tacgtcctac gggagaaagt gggggatctt cggacctcac gctatcagat gagcctaggt 180

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tcatcatggc ccttacggcc tgggctacac acgtgctaca atggtcggta caaagggttg 1200

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actcgactgc gtgaagtcgg aatcgctagt aatcgtgaat cagaatgtca cggtgaatac 1320

gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtgggttgct ccagaagtag 1380

ctagtctaac cttcgggggg acggtacca 1409

Claims (5)

1.一种好氧反硝化细菌，其特征在于：施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）JH-1，CCTCC NO：M 2013488。

2.权利要求1所述的好氧反硝化细菌在污水处理中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该好氧反硝化细菌用海藻酸钠进行固定。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该好氧反硝化细菌用聚乙烯醇进行固定。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该好氧反硝化细菌用海藻酸钠和聚乙烯醇进行固定。