CN103540555A - 一种制备耐盐微生物菌剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种制备耐盐微生物菌剂方法，该方法是在敞开培养装置中，直接在总盐浓度为1~30%的条件下对高盐环境样品中的耐盐微生物菌群进行混合培养；培养过程中按需添加有机碳源、营养元素和微量元素，控制适宜的pH、温度和溶解氧并保持相对稳定。采用本发明方法制备的耐盐微生物菌剂，具有良好的耐盐能力和抗盐度冲击能力，能够在总盐1～30%条件下降解水中的有机物而不受高浓度无机盐的抑制，可直接用于盐浓度1～30%的高含盐废水的净化处理。本发明方法操作简单、实施周期短，可快速进行工业化应用。

Description

一种制备耐盐微生物菌剂的方法

技术领域

本发明属环保微生物及污水处理技术领域，具体涉及一种制备耐盐微生物菌剂的方法。

背景技术

高盐废水是指水中无机盐质量分数大于1％的废水，其来源复杂多广，直接排放对生态环境和人体健康造成极大危害。高盐废水成分复杂，属于难降解废水之一，其中的无机盐对普通微生物的生长产生抑制或毒害作用，严重限制了生物处理技术在高盐废水中的应用。但是，包括蒸发、膜分离、离子交换、高级氧化、电解等在内的物理化学方法，不仅对污染物的处理不彻底，容易造成二次污染；而且投资成本和运行成本也高。所以，在可能的条件下，采用生化方法处理高盐废水仍然是较理想方法。

高盐废水生化处理的方法主要包括盐度驯化、稀释生化和嗜盐菌处理三种。盐度驯化普通活性污泥可以使其获得一定的耐盐能力，但是驯化需要的时间较长、有机污染物降解效率下降，而且最高耐盐浓度一般不超过3～5%、抗盐度冲击能力较差。稀释生化需要大量的淡水，多数情况下难以采用，而且即使能够处理达标，并没有减少无机盐的排放总量。嗜盐菌属于能够在高盐环境下进行正常的生长代谢，因此采用耐盐微生物处理高盐废水普遍被认为具有理论上的可能性；

但是目前国内外利用嗜盐菌处理高盐废水仍主要为实验室研究，工程应用案例极少，其根本原因在于：：

（1）嗜盐菌的分离、培养操作需要严苛的条件，从嗜盐菌的分离到制备嗜盐菌菌剂需要经历鉴定、生理生化试验、降解试验、扩增试验、复壮与保存等多个步骤，制备周期长且制备过程比较复杂，普通单位和个人难以实现。

（2）所采用的分离纯培养技术手段决定了该方法仅仅能够获得现有技术条件下可纯培养的嗜盐菌或耐盐菌，不能获得以共生、共代谢等方式存在于高盐环境中的耐盐微生物，而这部分微生物在环境中占绝大多数。

（3）菌剂的微生物构成比较简单，往往只有一种嗜盐菌或几种嗜盐菌，只能够处理成分简单的高盐废水，难以适应成分复杂的高盐废水的生化处理。

因此，目前制备耐盐微生物菌剂的方法，不能适应高盐废水处理的水质多变特点和规模化应用需要。

发明内容

本发明要解决的问题是针对传统生化法处理高盐废水耐盐能力不高、抗盐度冲击差、处理效率不高；以及针对嗜盐菌菌剂处理高盐废水难以适应高盐废水水质的多变的问题，提供一种新的制备制备耐盐微生物菌剂的方法。

本发明中所述耐盐微生物，包括耐盐和嗜盐的细菌、真菌、古菌、原生动物和后生动物。

本发明的原理：环境中微生物大多以共生、共代谢、互生、共栖等方式进行生存、生长和代谢，高盐环境中的耐盐微生物也同样如此。在高盐环境下，有机物主要通过耐盐微生物细胞之间的互利、共生、共代谢等方式被转化或降解。一个包括耐盐和嗜盐的细菌、真菌、古菌、原生动物和后生动物等在内许多种耐盐微生物构成的复合微生态系统，不仅能够适应高盐废水的高盐环境，而且能够对其中的污染物进行稳定高效的降解，还具有较强的抗环境干扰能力。

本发明的思路：根据高盐环境中微生物的生长代谢特征和有机物降解特征，模拟和强化耐盐微生物的生存环境特点：既不采用对嗜盐菌进行分离和纯培养的方法，也不采用盐度驯化的方法，而是直接在高盐条件下培养耐盐微生物群，通过混合培养的方式直接构建一个由不同种类、不同功能的耐盐微生物种群构成的复合微生物生态系统。

      本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种制备制备耐盐微生物菌剂的方法，其特点是：在敞开的培养装置中，直接在总盐浓度1～30%的条件下对高盐环境样品中的耐盐微生物菌群进行混合培养，所得培养液即为耐盐微生物菌剂；培养过程中，按常规培养方法需要适量添加有机碳源、营养元素和微量元素，控制pH、温度、溶解氧、总盐保持稳定。

本发明中，可以将该培养液进行液体分装制成液体菌剂、冷冻干燥后制成固体菌剂、与高分子材料制成包埋菌剂或与多空吸附材料结合制成固化菌剂。 

本发明所述混合培养，区别于传统菌剂制备方法的富集培养、筛选分离培养过程，贯彻于制备耐盐微生物菌剂的整个过程，而且这一过程始终处在开放的高盐环境条件下。混合培养过程中，高盐环境样品中的耐盐和嗜盐的微生物种群因获得适宜的物质、营养和环境条件在培养液中生长、代谢和繁殖，而且通过微生物的相互作用和提供的代谢产物，使得那些不能通过分离纯培养的微生物也能够生长繁殖而获得富集培养。混合培养过程中的高盐环境则提供了一种自然选择作用，确保混合培养过程中能够生长繁殖的耐盐微生物群都能够在所处高盐环境下进行正常生长繁殖而不受高浓度无机盐抑制。开放或敞开的环境，使得混合培养过程中耐盐微生物群始终与外界环境保持接触，只有能够适应外界环境变化的耐盐微生物群才能够在混合培养过程中获得竞争增殖优势，因此开放或敞开环境能够确保所培养的耐盐微生物菌群具有适应外界环境的能力。

本发明方法所述高盐环境，包括以下三类：

（1）自然高盐环境：海洋、死海、盐湖、盐田、盐碱地、盐矿、地下卤水等。这些高盐环境形成时间较长，耐盐微生物种类高度丰富，微生物的耐盐能力强，耐盐微生物种群与所处高盐环境的实际含盐量和其它环境特征相适应。

（2）半自然高盐环境：晒盐场、盐碱地、腌制品、长期存放的高盐废水、高盐废水污染的土壤、河流、湖泊等。这些高盐环境形成的时间长短不一，而且盐环境特征会发生变化。

（3）土壤：农田土壤、草地土壤、森林土壤等。土壤环境整体含盐量不高，但由于土壤环境的非均质性，以及干湿变化、矿化、风化、淋溶等作用的长期存在，使得土壤环境中存在大量局部高盐环境，这些微域高盐环境足以支持各种耐盐微生物的生存。

耐盐微生物群来源于高盐环境，不同高盐环境具有不同的耐盐微生物多样性。因此，应当根据应用需要选择合适的高盐环境取样来制备耐盐微生物菌剂。如果制备耐盐微生物菌剂的目的是处理难降解工业废水，那么应当有针对性的选择受高盐废水污染的高盐环境进行取样，例如：入海排污口附近海泥，盐碱地上的受污染和河流和土壤，同类高盐废水生产车间排放口附近沟渠及土壤。如果制备耐盐微生物菌剂的目的是处理含硫酸钠废水，那么从硫酸钠型盐湖中取样效果可能会更好。如果制备耐盐微生物菌剂的目的是处理高盐低温废水，那么在冬季取样或取深海的底泥样品，同样能够缩短制备菌剂所需的周期。

本发明所述有机碳源，是指耐盐微生物群生长所需的有机物，是绝大部分微生物生长和繁殖的基本物质基础和能量来源。不同微生物所能够利用的有机碳源种类可能不同，即使对于一种都能够利用的有机碳源，在菌群混合培养的过程中，也会由于利用能力和效率的差异或导致竞争生长的失败。采用混合培养方法制备耐盐微生物菌剂，关键是提供适宜的物质、营养和环境条件，使不同种类、不同生理类型的耐盐微生物尽可能多的获得生长繁殖而富集到培养液当中。因此，提供的有机碳源种类越丰富，能够为耐盐微生物群提供的生长底物类型也就越丰富，那么混合培养获得的富集培养液中的耐盐微生物多样性也就更丰富。但在本发明实施过程中，不可能在一次制备菌剂的混合培养过程中，提供不限种类的有机物供不同生理代谢类型的耐盐微生物进行利用，因此在有限的条件下应当提供尽可能多的易生物利用的有机碳源。这些有机碳源既可以是单一的碳水化合物，也可以是其混合物。综合考虑有机碳源的生物降解性、获取难易度、成本、生物毒性、操作安全性及其它因素，可用于实施本发明的有机碳源可以是：葡萄糖、蔗糖、甲醇、乙醇、乙酸、苯酚、苯胺、苯甲酸、面粉、果汁、牛奶、污泥消化液、废水、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉等。在利用本发明进行菌剂的规模化制备过程中，应当根据应用目的选择容易获取且成本较低的有机碳来源。本发明所添加的有机碳源至少为1种，优选2种以上，且其B/C≥0.2，优选B/C≥0.4。

本发明方法所述营养元素，是耐盐微生物细胞干物质组成除C、H、O外含量较高的几种元素，包括N、P、K、S、Mg、Ca、Fe。其中，微生物对于N、P的需求量最大，在培养过程中一般需要足量补充。K不仅作为营养元素，而且作为部分耐盐微生物平衡细胞内外渗透压的重要离子。S、Ca、Fe、Mg虽然是必须元素，但是培养过程不一定需要特别补充，因为除蒸馏水和去离子水外，一般水源都可能含有一定浓度的S、Ca、Fe和Mg。因此本发明实施过程中，不鼓励采用去离子水和蒸馏水，所有营养元素应该按需添加。

本发明所述微量元素，作为微生物生长代谢必需但需求量很少的元素。一般培养液中的浓度处在0.001～1mg/L这个范围。浓度超过这个范围，可能对微生物的生长造成毒害和抑制作用；浓度低于这个范围，可能因为营养缺乏而影响生长。本发明实施过程中，微量元素按需要添加，需要根据培养环境中微量元素的含量进行分析后确定。例如，若以海水为水源进行制备耐盐微生物菌剂的，一般可以不用另外添加微量元素。如果添加，本发明可能需要添加的微量元素包括：Mn、Zn、Cu、Co、Ni、B、Se、V和Mo。

本发明可在pH为5.0～9.5下实施；由于大多数耐盐微生物菌群存在的高盐环境都为弱碱性环境，因此，pH控制在7.5～8.5效果更好。

本发明在常温下实施即可，也可以在低温、中温和高盐下实施。因此，本发明实施过程中，最好将培养温度控制在5～15℃、15～40℃或40℃～55℃。

本发明可用于制备耐盐厌氧微生物菌剂、耐盐兼氧微生物菌剂、耐盐好氧微生物菌剂。因此，通过在培养过程中控制培养装置中的溶解氧，可以制备出不同需氧类型的耐盐微生物群。可以通过密封、充入氮气、二氧化碳等措施将培养装置控制在完全厌氧状态，制备耐盐厌氧菌剂；通过搅拌、振荡、微曝气将培养装置中溶解氧含量控制在0.1～0.5mg/L，制备耐盐缺氧微生物菌剂；将溶解氧控制在0.5～2.0mg/L，制备耐盐兼氧微生物菌剂；将溶解氧控制在2.0～5.0mg/L，制备耐盐兼氧微生物菌剂。

本发明可实施的总盐浓度为1～30%，其中无机盐可以是NaCl、Na₂SO₄、CaCl₂、NaNO₃、KNO₃或其它无生物物毒性的无机盐的一种或多种。在某些情况下，无机盐本身可能具有除渗透压胁迫以外的生物毒性，需要在发明实施过程中予以注意。

本发明实施过程中，需要维持一个相对稳定的环境条件，即培养过程中盐浓度、pH、温度、溶解氧、有机碳源、营养元素和微量元素等参数应当与培养初始参数保持一致，不发生大的变化。但是，在不同的实施过程中，可根据应用目的选择不同的参数条件。

本发明某一次实施过程，应当保持盐浓度的相对稳定，包括无机盐的组成和总盐浓度都应当保持稳定。虽然耐盐微生物均能在很宽的盐浓度范围内进行正常的生长和代谢，但不同耐盐微生物生长代谢速率最快的的盐浓度存在差异。对于大多数耐盐微生物，都有一个生长代谢最适宜的盐浓度。

本发明某一次实施过程，应当保持pH的相对稳定。高盐环境大多为盐碱环境，嗜弱碱的耐盐微生物在环境中较为普遍，但是也不缺乏能够在酸性、弱酸性、中性等环境下进行最适生长代谢的耐盐微生物。因此，根据实际高盐废水的pH范围，选择合适的pH作为菌剂制备过程中的控制条件。

本发明某一次实施过程，应当保持溶解氧的相对不变。微生物根据其生长代谢对氧气需要的程度，可分为厌氧微生物、兼氧厌氧微生物、兼氧好氧微生物和好氧微生物。所以菌剂制备过程中，溶解氧的水平对混合共培养过程中耐盐微生物的富集培养效果产生影响：在溶解氧较高的情况下进行混合培养制备得到的耐盐微生物菌剂，菌群中以耐盐好氧微生物为主；在溶解氧不高的情况下制备得到的耐盐微生物菌剂，菌群中同时含有耐盐好氧微生物和兼氧微生物；在溶解氧很低的情况下，所制备菌剂中以耐盐厌氧微生物为主。因此，根据菌剂制备的应用目的选择混合培养过程的氧含量。若制备耐盐好氧菌剂，培养过程中应当进行充氧且应该维持较高的溶解氧浓度；若制备耐盐兼氧菌剂，需适当充氧，并将溶解氧维持在较低的水平；若制备耐盐厌氧菌剂，就不需要充氧。

本发明实施过程中，应当保持有机碳源来源不发生大的变化。不同微生物对同一种有机物的代谢能力会存在差异，在混合培养过程中获得的竞争优势会不同。因此，可以控制菌剂制备过程的有机碳源种类，有针对性制备适合某类高盐有机废水的耐盐微生物菌剂。例如，若制备耐盐除酚菌剂，则菌剂制备过程中有机碳源至少含有苯酚或其它简单酚类物质；若制备耐盐除胺菌剂，则菌剂制备过程中有机碳源至少含有苯胺或其它有机胺类物质。制备此类菌剂并用于工业废水的处理，特别有利于含一类物质的废水的迅速工业化启动。

利用本发明方法，可在不同的盐浓度、有机碳源、营养和环境条件下制备出不同功能的耐盐微生物菌剂，分别用于不同的生化工艺或不同的实际废水。

利用本发明方法对耐盐微生物菌剂进行制备，并进行工业化放大。至少包含2种方法：（1）直接在规模化装置中按照本发明方法实施；（2）先在较小的装置中制备耐盐微生物菌剂，然后在同样的培养条件下进行放大培养。从整个实施过程中的质量保证和可控程度，优选采用逐级放大和批量扩增培养的方法对耐盐微生物菌剂进行规模化制备。

本发明方法制备得到的耐盐微生物菌剂，能够直接用于盐浓度为1～30%的高含盐有机废水生化处理。

      本发明的有益效果：

（1）制备耐盐微生物菌剂所需的步骤和条件简单、实施周期短。

（2）所制备得到的菌剂含有丰富的耐盐微生物多样性，能够耐受的盐浓度范围达1～30%。

（3）所制备得到的菌剂具有很强的抗盐度冲击能力，短期盐度冲击不会对其降解有机物的效果产生影响。

（4）所制备得到的菌剂环境适应能力强，能够用于不同高盐废水的生化处理。

（5）利用本发明，可以直接大规模的制备菌剂并进行工业化。

需要说明的是，本发明只是采用混合培养方式在开放高盐条件下直接制备耐盐微生物菌剂一般性说明。在本发明实施过程中，影响因素包括但不限于：高盐环境样品的来源、无机盐及盐浓度、营养成分、温度、pH、氧含量、培养时间、培养装置。

具体实施方式

本发明是基于开放环境下混合培养方法制备耐盐微生物菌剂的概括性说明。影响制备耐盐微生物菌剂的因素很多，而且由于所具有的实际意义，其不一定具有最佳取值或最佳取值范围，因而不可能将所有的优选实施方式一一列出。在此，结合本发明的原理和实施步骤，对本发明的技术方案做详细的说明和解释。因此，可以认为本领域的技术人员，在理解本发明制备耐盐微生物菌剂的方法的原理和实施步骤下，能够做出大量的补充或改进，这些补充或改进都应当包含在本发明的保护范围之内。下面通过具体实施例来对本发明方法做进一步说明。

实施例1，一种制备耐盐微生物菌剂的方法，其步骤是：在敞开的培养装置中，直接在总盐质量浓度在1～30%的条件下对高盐环境样品中的耐盐微生物菌群进行混合培养，所得培养液即为耐盐微生物菌剂；培养过程中，按常规培养方法适量添加有机碳源、营养元素和微量元素，控制pH =5.0～9.5，控制温度、溶解氧、总盐浓度保持稳定。所制备得到的耐盐微生物菌剂可以用于总盐浓度为1～30%的高含盐废水的净化处理。

实施例2，实施例1所述的制备方法中：所述的敞开的培养装置在培养过程中，始终与空气保持连通。

实施例3，实施例1或2所述的制备方法中：所述高盐环境样品来源但不限于：海洋、死海、盐湖、盐田、盐碱地、盐矿、盐井、晒盐场、腌制品、高盐废水、土壤。

实施例4，实施例1-3任何一项所述的制备方法中：所添加的有机碳源至少为1种，且其B/C均≥0.2。

实施例5，实施例1-4任何一项所述的制备方法中：所添加的营养元素是为N、P、K、S、Fe、Ca、Mg。

实施例6，实施例1-5任何一项所述的制备方法中：添加的微量元素至少包含Mn、Zn、Cu、Co、Ni、B、Se、W和Mo中的一种或多种。

实施例7，实施例1-6任何一项所述的制备方法中：培养过程中控制pH =7.5～8.5。

实施例8，实施例1-7任何一项所述的制备方法中：培养过程中温度为5～15℃或者15～40℃或者40℃～55℃。 

实施例9，实施例1-8任何一项所述的制备方法中：培养过程为厌氧，或控制溶解氧为0.1～0.5mg/L或者0.5～2.0mg/L或者1.0～5.0mg/L。

实施例10：制备耐盐除酚微生物菌剂实验：

       高盐样品取自连云港海边底泥，取回后冷藏保存。

培养液含 3~7%NaCl或Na₂SO₄、牛肉膏、苯酚、营养元素、微量元素、pH为6.5~7.5，其中有机碳源：苯酚营养元素：尿素 0.1~2g/L、K₂HPO₄ 0.15~2.5g/L、KH₂PO₄ 0.05~0.75g/L、MgSO₄ 0.01~0.2g/L、CaCl₂ 0.01~0.02g/L；微量元素：MnCl₂ 0. 001~0. 4mg/L、H₃BO₃ 0. 001~0. 4mg/L、CoCl₂ 0. 01~0. 2mg/L、CuCl₂ 0. 005~0. 2mg/L、NiCl₂ 0. 005~0. 2mg/L、Na₂MoO₄ 0. 001~0. 3mg/L、ZnCl₂ 0. 005~0.2mg/L，FeSO₄ 0. 1~2mg/L、EDTA 0.3~6mg/L

制备步骤：

取1~5g底泥加入250mL三角瓶，装入50mL培养液，其中牛肉膏0.05~10g/L、蛋白胨0.05~10g/L、酵母粉0.05~10g/L，在温度为20～30℃、pH为6.5～7.5条件下振荡培养60~120h，静置30～120min后所得悬液即为含耐盐微生物菌群的混合液。取5~10mL该混合液加入装有50mL培养液的三角瓶，添加牛肉膏200~1000mg/L、苯酚20~50mg/L，温度20~30℃震荡培养24~48h。所得混合液即为含有耐盐微生物菌群的混合液，能够在3～7%NaCl或条件下对苯酚进行降解。

继续取该混合液加入到新鲜培养液中进行培养，逐步提高苯酚的浓度，可提高所制备的耐盐微生物菌剂降解苯酚的能力。

取该混合液100mL到1000mL三角瓶中，加入同样的培养液进行振荡或曝气培养，培养时间为24～48h，可以将制备的菌剂进行放大培养。再以该1000mL菌剂接种到10L装置中进行曝气培养，可以获得10L耐盐微生物菌剂。通过这样的方式进行逐级放大培养，可以批量获得耐盐除酚微生物菌剂。

按照上述菌剂制备步骤，只是改变培养液中无机盐的浓度，例如，可以在1～3%的NaCl或Na₂SO₄制备耐盐除酚菌剂，也可以在5～10%的NaCl或Na₂SO₄制备耐盐除酚菌剂，还可以在更高的盐浓度下制备出耐盐除酚菌剂。

按照上述菌剂制备方法，将培养液中的苯酚改为苯胺或其它有机物，可以制备得到在高盐条件下能够降解苯胺类或其它有机物的耐盐微生物菌剂。

用上述菌剂处理高盐含酚废水，24h内，可在总盐1～10%范围内将1000mg/L的苯酚完全降解；可在总盐10～17%范围内将500mg/L苯酚完全降解；可在总盐17～25%范围内，将100mg/L苯酚完全降解，可在总盐25～30%范围内，将50mg/L苯酚完全降解。

实施例11：制备耐盐除酚嗜盐微生物菌剂实验：

      高盐样品取自青海某盐田。

培养液组成：（NH₄）₂SO₄ 0.1~1.0 g/L、K₂HPO₄ 0.1~2.0 g/Lg/L、MgCl₂ 0.01~0.1g/L、CaCl₂ 0.01~0.1g/L、FeSO4 0.001～0.01g/L、葡萄糖0.05~2.0g/L 、苯酚0.01~0.5g/L、酵母膏0.1~2g/L、NaCl 180~250g/L、微量元素、pH 7.5~8.5。由于培养液用自来水配制，因此未补加微量元素。

制备方法：

取约1g高盐样品加入250mL三角瓶，其中含有50mL培养液，放入恒温摇床于20~30℃培养至少120h。静止后，所得上层悬液即为富集培养得到的含有嗜盐菌的混合液。将该混合液转接培养一次，接种比例5～20%，培养液中酵母膏0.2~0.5g/L、葡萄糖0.05~0.1g/L、苯酚0.01~0.02g/L，在pH为7.5～8.5条件下培养48~120h。所得混合液即为能够在17～25%的盐浓度下降解苯酚的嗜盐菌菌剂。

将该菌液继续培养，并缓慢提高培养液中苯酚的浓度，可制备出除酚能力更加强大的嗜盐菌菌剂。

将该菌液按照5～20%的比例接种逐级放大培养，可以批量制备耐盐除酚嗜盐菌菌剂。

 实施例12：制备耐盐厌氧微生物菌剂的实验：

高盐环境样品取自海边受污染的底泥，颜色发黑。

培养液组成： NH₄Cl 0.1~1.0g/L、K₂HPO₄ 0.2~2.0g/L、KH₂PO₄ 0.16~1.6g/L、MgSO₄ 0.01~0.1g/L、CaCl₂ 0.1g/L、NaCl 30~80g/L、葡萄糖0.5~5.0g/L、pH7.5~8.5。培养液采用海水进行配制，因此未补加微量元素。

制备方法：

取1~5g海泥加入1000mL三角瓶，装入500mL培养液，其中蛋白胨0.1~0.5g/L、酵母粉0.05~0.3g/L、葡萄糖0.1~0.5g/L、纯碱0.1~0.5g/L，在温度30~40℃、pH7.5~8.5条件下恒温培养120～240h。将上清液加入新鲜培养液中，仍然在厌氧条件下进行培养，培养温度30~40℃、pH为7.5～8.5，培养时间120h以上。如此转接培养5~10个周期，可制备得到耐盐厌氧微生物菌剂。

实施例13：制备耐盐厌氧微生物菌剂的实验：

高盐环境样品取自青海某盐湖湖底沉积物。

培养液组成为：（NH₄）₂SO₄ 0.1~2g/L、K₂HPO₄ 0.15~2.5g/L、KH₂PO₄ 0.05~0.75g/L、MgSO₄ 0.01~0.2g/L、CaCl₂ 0.01~0.02g/L、MnCl₂ 0. 001~0. 4mg/L、H₃BO₃ 0. 001~0. 4mg/L、CoCl₂ 0. 01~0. 2mg/L、CuCl₂ 0. 005~0. 2mg/L、NiCl₂ 0. 005~0. 2mg/L、Na₂MoO₄ 0. 001~0. 3mg/L、ZnCl₂ 0. 005~0.2mg/L，FeSO₄ 0. 1~2mg/L、EDTA 0.3~6mg/L，NaCl 5～10%，葡萄糖 0.5～10g/L，NaHCO3 2～20g/L，pH 7.5～8.5。

取10g盐湖沉积物，用上述培养液稀释至100mL，搅拌30～120min，静置30min后，将除沙土以外的其余混合液加入到6000mL带搅拌的有机玻璃装置，然后加入5000mL上述培养液，其中COD为500mg/L，开动慢速搅拌进行培养。培养过程中温度 30～35℃、pH 7.5～8.5。培养120h。然后排掉清夜500mL，加入上述培养液的10倍浓缩液约500mL，然后加入葡萄糖，调节pH，使COD为500mg/L，pH为7.5～8.5，培养24h。然后排掉500mL混合液，再加入500mL浓缩培养液，加入葡萄糖使COD增加至500～600mg/L。由此保持培养过程中温度和pH的稳定，逐渐增加葡萄糖，可在30～90天内制备出对葡萄糖具有很强水解酸化能力的耐盐菌剂。

上述菌剂制备过程中，若延长每个周期的培养时间，直至产甲烷并检测COD去除率＞90%再进行下一周期的培养，培养出的耐盐微生物菌剂将含有耐盐产甲烷菌群。

此外，照上述菌剂制备步骤，改变培养过程中的NaCl浓度，并适当调整每个培养周期的时间，并保证温度和pH在设定的范围内，都能够培养出具有相应厌氧降解能力的耐盐微生物菌剂。 

实施例14：制备耐盐耐碱微生物菌剂的实验：

高盐环境样品取自西藏某碳酸盐型盐湖，取回后4℃冷藏保存。

培养液组成：（NH₄）₂SO₄ 0.2~1.0g/L、MgSO₄ 0.1~2.0g/L、CaCl₂ 0.05~0.20g/L、FeCl₂ 0.005～0.02g/L、MnCl₂ 0.001~0.04mg/L、H₃BO₃ 0.001~0.04mg/L、CoCl₂ 0.01~0.02mg/L、CuCl₂ 0.005~0.2mg/L、NiCl₂ 0.005~0.2mg/L、Na₂MoO₄ 0.01~0.03mg/L、ZnCl₂ 0.005~0.02mg/L，、EDTA 0.3~5mg/L、3~9%K₂HPO₄、葡萄糖、苯酚、蛋白胨、pH为9.0~12.0。

制备步骤：

250mL三角瓶中，加入100mL 培养液，其中苯酚20～50、葡萄糖100~200mg/L、蛋白胨100~500mg/L，再加入约1~5g盐湖沉积物，置于恒温摇床于5~15℃、15~25℃或25~35℃，转速150~300rpm培养72~240h，所得即为含有耐碱微生物的种子液。静置半小时，取种子液5~10mL加入三角瓶中，再补充100mL培养液，于温度为5~15℃、15~25℃、25~35℃、35~45℃或45~55℃、转速为150~300rpm培养24~72h。如此转接培养3~6个周期，其中苯酚浓度增加至50~200mg/L、葡萄糖浓度增加至200~1000mg/L、蛋白胨浓度增加至500~5000mg/L。如此培养便可制备得到耐盐耐碱微生物菌剂。

仍以盐碱湖沉积物为高盐样品，培养步骤同上，只是无机盐可以换成氯化钠、硫酸钠或氯化钙，均可培养得到适盐耐碱微生物菌剂。

实施例15：制备耐盐耐酸微生物菌剂的实验：

       高盐环境样品取自新疆某硫酸盐型盐湖湖底沉积物。

培养液组成：NH₄Cl 0.5~1.0g/L、KH₂PO₄ 0.5~2.0g/L、MgSO₄ 0.1~0.5g/L、CaCl₂ 0.02~0.05g/L、MnCl₂ 0. 1~0. 4mg/L、H₃BO₃ 0. 01~0. 05mg/L、CoCl₂ 0. 01~0.02mg/L、CuCl₂ 0. 01~0. 05mg/L、NiCl₂ 0. 05~0. 1mg/L、Na₂MoO₄ 0. 01~0. 05mg/L、ZnCl₂ 0. 05~0.1mg/L、FeSO₄ 1~5mg/L、NaCl 1～15%、葡萄糖 0.5～20g/L、酵母粉0.5～2.0g/L、pH 2.0～5.0。

制备步骤：

      取5000mL培养液，加入10g高盐沉积物，其中葡萄糖500～1000mg/L，曝气培养，控制温度32～35℃，培养72h。然后转接培养24h，培养液其它成分保持不变，葡萄糖浓度为500～1000mg/L。保持培养周期为24h，温度32～35℃、pH为2.0～5.0，并逐渐增加转接培养过程中葡萄糖的浓度；经过5～10d的培养，能够迅速制备得到耐盐耐酸微生物菌剂。

按照上述步骤，只是将培养液中的NaCl换成Na₂SO₄、KNO₃、CaCl₂或其它无机盐，同样可以制备得到耐盐耐酸微生物菌剂。

实施例16：耐盐微生物菌剂的耐盐能力和抗盐度冲击能力试验：

       为研究本发明制备的耐盐好氧污泥的抗盐度冲击能力，首先在300L有机玻璃污水处理装置中按照实施例1的步骤培养得到耐盐微生物菌剂。然后将其部分分装到7个6L有机玻璃装置中。试验处理设置进水盐浓度分别为0%、1%、3%、5%、8%、10%和15%，其中5%盐浓度进水为对照；以甲醇和苯酚为模拟废水中有机污染物，进水COD和酚浓度分别为3000mg/L和700mg/L，水力停留时间HRT为24h；试验分为2个阶段：盐度冲击阶段和盐度恢复阶段，分别进行1个月。在盐度冲击阶段，分别按照0%、1%、3%、5%、8%、10%和15%盐浓度进水，每次换水3000mL；在盐度反转恢复阶段，所有处理恢复5%进水盐浓度。通过测定出水COD_Mn、酚浓度、SV₃₀、MLSS和MLVSS、污泥外观来反映盐度冲击造成的影响。

 试验结果表明，采用本专利方法培养的耐盐菌剂，在1%~15%进水盐浓度冲击下： 耐盐好氧活性污泥能够很好的抵抗盐度冲击，盐度冲击未对COD和酚的降解效果产生显著影响，并且耐盐污泥系统在盐度冲击后很快恢复。

Claims (9)

1.一种制备耐盐微生物菌剂的方法，其特征在于，其步骤是：在敞开的培养装置中，直接在总盐浓度1～30%的条件下对高盐环境样品中的耐盐微生物菌群进行混合培养，所得培养液即为耐盐微生物菌剂；培养过程中，按常规培养方法需要适量添加有机碳源、营养元素和微量元素，控制pH、温度、溶解氧、总盐保持稳定。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的敞开的培养装置在培养过程中，始终与空气保持连通。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述高盐环境样品来源但不限于：海洋、死海、盐湖、盐田、盐碱地、盐矿、盐井、晒盐场、腌制品、高盐废水、土壤。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：菌剂制备过程中加入的有机碳源至少为1种，且其B/C≥0.2，优选B/C≥0.4。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：菌剂制备过程中加入的营养元素是N、P、K、S、Fe、Ca、Mg中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：菌剂制备过程中加入的微量元素是Mn、Zn、Cu、Co、Ni、B、V、Se和Mo中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：培养过程中pH 为5.0～9.5，优选7.5~8.5。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：培养过程中温度为5～15℃或者15～40℃或者40℃～55℃。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：培养过程为厌氧，或控制溶解氧为0.1～0.5mg/L或者0.5～2.0mg/L或者1.0～5.0mg/L。