CN100999712A - 一种复合培养基的制备方法及其用途 - Google Patents

一种复合培养基的制备方法及其用途 Download PDF

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吴敏
许学伟
孟凡旭
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Abstract

本发明公开了一种复合培养基的制备方法及其用途。将盐度为3％～8％的榨菜废水，采用NaOH或HCl调解pH值至6.0～8.0，115～121℃湿热灭菌。将上述的液体培养基加入质量百分数为1.0％～2.0％的琼脂，115～121℃湿热灭菌。以榨菜污水作为嗜盐菌培养基，在不添加任何其他营养成份的情况下，调节污水pH值，即可作为嗜盐微生物培养分离的良好培养基。一方面，该技术工艺简单、成本低廉，并高效利用了榨菜废水，降低了工业生产成本；另一方面，分离培养的嗜盐微生物用于高盐污水的环境治理工程，减轻了环境保护压力。既可高效利用工农业生产中的废水、减轻环境保护压力，又适合分离培养嗜盐微生物，并用于高盐污水的环境治理工程与工业化发酵生产等领域。

Description

一种复合培养基的制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种复合培养基的制备方法及其用途。
背景技术
分离培养嗜盐微生物的培养基一般采用精确定量的盐离子、蛋白胨和酵母膏为原料湿热灭菌获取。其优点在于培养基成分固定，微生物培养稳定；缺点在于成本较高，方法繁琐。
榨菜污水由于含有较高浓度的无机盐使普通的生物处理方法难以奏效，主要表现为污水处理系统有机物去除率降低，微生物呼吸速率降低，高浓度的盐干扰细胞正常代谢功能，降低生物降解动力使处理系统生物种类减少，影响污泥正常絮凝和沉淀过程等，给榨菜大量生产地区的环境治理带来很大的困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种复合培养基的制备方法及其用途。
本发明采用的技术方案如下：
一、一种复合培养基的制备方法
将盐度为3％～8％的榨菜废水，采用NaOH或HCl调解pH值至6.0～8.0，115～121℃湿热灭菌15～30分钟。
将上述的液体培养基加入质量百分数为1.0％～2.0％的琼脂，115～121℃湿热灭菌15～30分钟。
所述的复合培养基NaCl含量为3％～5％，包括镁、钙、磷酸根、硝酸根和硫酸根离子，总盐度为3％～8％，并含植物纤维、植物蛋白质、有机酸和醇类。
二、一种复合培养基的用途
1.用于分离培养Halomonas、Marinobacter、Bacillus、Chromohalobacter、Alcanivorax、Pseudomonas、Citricoccus、Haloferax属的嗜盐菌或耐盐菌。
2.用于分离培养的嗜盐菌或耐盐菌用于环境污染治理，在10小时内将含盐量在4％以上的榨菜污水COD值去除90％以上。
本发明所提供的复合培养基，主要浙江宁波地区榨菜加工厂的废水，阳离子主要为Na+，阴离子主要为Cl-，NaCl含量为3％～5％，盐度为3％～8％，还包括少量的镁、钙、磷酸根、硝酸根和硫酸根离子，并富含植物纤维、植物蛋白质、有机酸、醇类等大量氮源和碳源可供微生物生长。液体培养基直接取榨菜废水，采用NaOH或HCl调解pH至7.0，115～121℃湿热灭菌15～30min即可。固体培养基灭菌前加入15g/L琼脂。
采用所述的复合培养基，从多元地域环境的样品中共分离获得183株嗜盐或耐盐菌。通过PCR法获取分离菌株16SrRNA基因序列，结果显示目前已获得嗜盐或耐盐菌分布在Halomonas、Marinobacter、Bacillus、Chromohalobacter、Alcanivorax、Pseudomonas、Citricoccus、Haloferax等属。
将本发明提供的复合培养基分离获得的菌株处理高盐污水，获得一批能快速生长并降低废水COD值的工程菌株，并组成混合菌群。针对含盐量4％以上的榨菜污水，在10小时内混合菌群的COD值去除率达到90％以上。
本发明具有的有益效果是：以榨菜污水作为嗜盐菌培养基，在不添加任何其他营养成份的情况下，适当调节污水pH值，即可作为嗜盐微生物培养分离的良好培养基。一方面，该技术工艺简单、成本低廉，并高效利用了榨菜废水，降低了工业生产成本；另一方面，分离培养的嗜盐微生物用于高盐污水的环境治理工程，减轻了环境保护压力。采用榨菜污水作为嗜盐菌培养基，既可高效利用工农业生产中的废水、减轻环境保护压力，又适合分离培养嗜盐微生物，并用于高盐污水的环境治理工程与工业化发酵生产等领域。
附图说明
附图是混合菌群对高盐废水COD去除情况图。
具体实施方式
实施例1：液体榨菜废水培养基配置方法
液体培养基直接取榨菜废水，采用NaOH或HCl调解pH至7.0，121℃湿热灭菌30min即可。
实施例2：固体榨菜废水培养基配置方法
液体培养基加入15g/L琼脂，121℃湿热灭菌30min即可。
实施例3：榨菜废水组成成份分析
收集浙江宁波地区榨菜加工厂的废水，采用离子色谱法分析基本元素组成情况(表1)，该工作主要由浙江大学分析测试中心完成。榨菜废水主要阳离子为Na+，阴离子为Cl-，NaCl含量为3％～5％，盐度为3％～8％。根据榨菜生产主要原辅料的品种和数量分析，污水中富含植物纤维、植物蛋白质、有机酸、醇类、氯化钠及钙、镁等多种无机元素，丰富的营养物质使榨菜污水成为微生物特别是嗜盐微生物良好的培养基。
表1污水原液中阴阳离子含量(离子色谱法，g/L)：
离子类型 Na+  Ca2+  Mg2+  K+  F-  Cl-  NO3 -  PO3 3-  SO4 2-
含量(g/L) 24.56  0.2014  0.2744  0.609  0.44  25.7  0.1232  0.1953  0.5511
实施例4：利用榨菜废水分离嗜盐或耐盐菌
采用榨菜废水液体和固体培养基，从榨菜废水，浙江宁波、浙江舟山、山东莱州、广东深圳和海南海口等地的海水与盐场盐田，以及新疆众多盐湖样品中，共分离获得183株嗜盐或耐盐菌。将分离菌株接种于复合培养基斜面保存。并从斜面中直接挑取一环菌体，加入400μL无菌水混匀，90℃水浴5分钟，10000rpm离心5分钟，上清直接用于PCR。扩增16SrRNA基因的一对通用引物如下：正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。分别对应大肠杆菌的16SrRNA基因的8-27和1510-1492位碱基。PCR反应体系(50μL)为：10×buffer 5μL，10mMdNTPs1μL，10mM引物各1μL，ddH2O 42μL，Taq酶0.5μL，模板DNA 0.5μL。PCR反应条件为：94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸90s，30个循环后72℃延伸7min。PCR产物纯化与序列测定由上海南方基因中心完成，完成测定的16S rRNA基因部分片断长度为大于500bp。采用Blastn程序与GenBank数据库中序列进行同源比对，结果显示目前已获得Halomonas、Marinobacter、Bacillus、Chromohalobacter、Alcanivorax、Pseudomonas、Citricoccus、Haloferax等属的嗜盐或耐盐菌。
实施例5：利用榨菜废水高效治理环境污染
按1％的接种量，将分离菌株分批接种盐度大于4％的榨菜污水，30℃培养1～3天，采用碱性高锰酸钾法(HJ132-2003)测定废水COD值变化情况。获得一批能快速生长并降低废水COD值的菌株。挑选其中效果明显的7株嗜盐菌(表2)，组成混合菌群。该混合菌群可在10小时内将含盐量在4％以上的榨菜污水COD值去除90％以上(附图)。
表2榨菜废水高效治理工程菌
菌株编号   样品采集地   菌落形态   16S rDNA序列类似物种(％)
 Y1S1S2S5S6W1W2   浙江沿海浙江沿海浙江沿海浙江沿海浙江沿海浙江沿海浙江沿海   白色圆形白色圆形白色圆形白色圆形白色圆形白色圆形白色圆形   Marinobacter alkaliphilus(99％)Citricoccus sp.2216.25.22(98％)Halomonas sp.EF11(98％)Halomonas campisalis sp.LL6(98％)Halomonas sp.D37.1(99％)Halomonas sp.E5.3(99％)Marinobacterium sp.2085(98％)
上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (5)

1、一种复合培养基的制备方法，其特征在于：将盐度为3％～8％的榨菜废水，采用NaOH或HCl调解pH值至6.0～8.0，115～121℃湿热灭菌15～30分钟。
2、根据权利要求1所述的一种复合培养基的制备方法，其特征在于：将上述的液体培养基加入质量百分数为1.0％～2.0％的琼脂，115～121℃湿热灭菌15～30分钟。
3、根据权利要求1或2所述的一种复合培养基的制备方法，其特征在于：所述的复合培养基NaCl含量为3％～5％，包括镁、钙、磷酸根、硝酸根和硫酸根离子，总盐度为3％～8％，并含植物纤维、植物蛋白质、有机酸和醇类。
4、一种复合培养基的用途，其特征在于：用于分离培养Halomonas、Marinobacter、Bacillus、Chromohalobacter、Alcanivorax、Pseudomonas、Citricoccus、Haloferax属的嗜盐菌或耐盐菌。
5、一种复合培养基的用途，其特征在于：用于分离培养的嗜盐菌或耐盐菌用于环境污染治理，在10小时内将含盐量在4％以上的榨菜污水COD值去除90％以上。
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