CN108373981A

CN108373981A - 一种好氧反硝化菌及其应用

Info

Publication number: CN108373981A
Application number: CN201810115056.XA
Authority: CN
Inventors: 于昌平; 王寅寒; 杨晓永; 胡安谊; 林清秀; 黄自文; 陈国良; 马聪
Original assignee: Institute of Urban Environment of CAS
Current assignee: Xiamen Municipal Environmental Technology Co.,Ltd.; Institute of Urban Environment of CAS
Priority date: 2018-02-02
Filing date: 2018-02-02
Publication date: 2018-08-07
Anticipated expiration: 2038-02-02
Also published as: CN108373981B

Abstract

本发明公开了一种好氧反硝化菌及其应用。本发明的好氧反硝化菌，该菌株命名为XPS‑1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年9月29日，保藏编号为CGMCC NO.14772。本发明还提供了所述的好氧反硝化菌在生活污水脱氮中的应用。本发明的好氧反硝化菌株能够在低碳氮比和25～30℃温度下进行高效反硝化，特别适用于碳氮比较低以及具有一定盐度的城镇生活污水处理过程中的脱氮，脱氮率最高可达100％，脱氮速度快速有效，在污水处理领域有广泛的应用前景。

Description

一种好氧反硝化菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种好氧反硝化菌及其应用。

背景技术

反硝化，也称脱氮过程，是硝酸盐或亚硝酸盐被还原成气态氮的生物过程，参与这一过程的细菌被统称为反硝化菌。一直以来，反硝化被看作只有在厌氧或缺氧条件下，反硝化菌通过将硝酸盐或亚硝酸盐作为电子受体完成呼吸作用同时获得能量才能实现。但近年来，好氧反硝化现象不断被报道。好氧反硝化指在有氧情况下将NO₃ ^--N转化为N₂的过程。

好氧反硝化具有以下优点：(1)在有氧条件下进行反硝化，使得同步硝化反硝化(SND)成为可能；(2)硝化反应的产物可直接成为反硝化反应的底物，避免了培养过程中亚硝酸盐和硝酸盐积累对硝化反应的抑制，加速了硝化和反硝化进程。同时，反硝化会补偿硝化反应消耗的碱度，维持了反应系统pH值稳定，降低了操作难度和运行成本；(3)大部分好氧反硝化菌适应性强、生长速度快、产量高并且对溶氧浓度要求极低，反硝化速度快且彻底，适合治理大面积氮污染水域。好氧反硝化技术作为一种全新的脱氮技术备受研究者关注。

目前已发现许多菌属都存在好氧反硝化现象，如红球菌属(Rhodococcus)、副球菌属(Paracoccus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱菌属(Alcaligences)、蜡状芽孢菌属(Bacillus cereus)等，这些好氧反硝化菌各有工程应用特性。由于一些工业废水具有低碳氮比(C/N，质量比)和盐度高的特点，对反硝化菌要求较高。但是国内关于低碳氮比和盐度高的好氧反硝化菌分离的报道甚少。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种好氧反硝化菌及其应用，该好氧反硝化菌株能够在低碳氮比和高盐度下进行高效反硝化，特别适用于碳氮比较低以及具有一定盐度的城镇生活污水处理过程中的脱氮。

基于上述目的，本发明提供的一种好氧反硝化菌，该菌株命名为XPS-1，分类命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年9月29日，保藏编号为CGMCC NO.14772。

本发明从水稻田土壤中采集表层土壤样品，经组织破碎仪简单破碎后，加入反硝化培养基，在120rpm条件下震荡培养。经过不断的梯度稀释，逐步降低培养基的碳氮比，分离得到一株菌，提取该菌株的DNA，经PCR扩增后，然后利用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，之后进行克隆、转化，筛选阳性克隆子菌落，经扩大培养后进行测序，测序结果为测得长度为1403bp的序列，如序列表SEQ ID NO:1所示，经16SrRNA基因比对，与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440相似度最高，同源性为99.9％，命名为XPS-1。

本发明还提供了所述的好氧反硝化菌在生活污水脱氮中的应用。

在本发明的一些实施例中，所述好氧反硝化菌对生活污水进行脱氮时的条件为：碳氮比(质量比)2～3，温度25～30℃，pH 5～9，含盐量1.2％～1.5％。

本发明的好氧反硝化菌在较高盐度和较低碳氮比条件下，具有较强的反硝化能力，其反硝化的适宜条件范围较广，分别为碳氮比2～3(质量比)，温度25～30℃，pH 5～9，含盐量1.2％～1.5％。在此条件范围内，有较高的总氮去除率。

在本发明的一些实施例中，所述好氧反硝化菌对生活污水进行脱氮时的条件为：碳氮比3(质量比)，温度30℃，pH 7，含盐量1.2％。在此最佳条件范围内，本发明的好氧反硝化菌24h时总氮去除率(即脱氮率)即可达到100％，说明本发明的好氧反硝化菌对总氮的去除快速有效。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的好氧反硝化菌株能够在低碳氮比(C/N＝2～3)和25～30℃温度下进行高效反硝化，特别适用于碳氮比较低以及具有一定盐度(含盐量1.2％～1.5％)的城镇生活污水处理过程中的脱氮，脱氮率最高可达100％，脱氮速度快速有效，在污水处理领域有广泛的应用前景。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。

实施例1本发明好氧反硝化菌株的分离及鉴定

1.1培养基与方法

1.1.1培养基

反硝化液体培养基：KNO₃ 2g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄ 0.25g，蒸馏水1000mL，调节pH值7.0～7.2，再加入乙酸钠(控制不同的C/N)，121℃灭菌20min。

反硝化固体培养基：每升反硝化液体培养基中加入15g琼脂粉。

1.1.2实验方法

从水稻田土壤中采集表层土壤样品10g，经组织破碎仪简单破碎后，加入装有100mL反硝化液体培养基的500mL三角瓶中，在30℃、120rpm条件下震荡培养24h。经过不断的梯度稀释，逐步减低培养基的碳氮比，分离得到一株菌，将所得菌株命名为XPS-1。

将分离纯化的XPS-1菌株在反硝化固体培养基上扩繁，25℃培养，观察菌落特征和菌体形态结构并进行染色反应；对XPS-1菌株进行葡萄糖产酸、水解淀粉、水解明胶、吲哚、葡萄糖同化、阿拉伯糖同化等测定，以了解其生理生化特征。XPS-1菌株的硝酸还原性、反硝化性鉴定方法见《常见细菌系统鉴定手册》。

采用通用引物对XPS-1菌株的16SrDNA进行PCR扩增(上海生工生物工程技术有限公司合成)，正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。

PCR反应体系为：超纯水33.5μL、10×Ex Taq缓冲液5.0μL、dNTP(10mmol/L)2.0μL、上游引物2.0μL、下游引物2.0μL、模板DNA 5.0μL、Ex Taq酶0.5μL，共计50μL。

PCR的反应程序为：98.0℃预变性5min；80℃暂停；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min。

采用通用引物对纯化的XPS-1菌株进行16S rDNA扩增，扩增产物用1％琼脂糖凝胶电脉检测，溴化乙锭染色，紫外凝胶成像观察。以DNA Marker为参照，对比Marker的亮带，菌株在1400bp处出现亮带，回收特异条带进行测序。

2实验结果

XPS-1菌株的生理生化试验结果如下表1所示。

提取XPS-1菌株的DNA，经PCR扩增后，然后利用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，之后进行克隆、转化，筛选阳性克隆子菌落，经扩大培养后进行测序，测序结果为测得长度为1403bp的序列，如序列表SEQ ID NO:1所示，经16SrRNA基因比对，与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440相似度最高，同源性为99.9％，命名为XPS-1。

本发明提供的一种好氧反硝化菌，该菌株命名为XPS-1，分类命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年9月29日，保藏编号为CGMCCNO.14772。

实施例2盐度和碳氮质量比对菌株XPS-1好氧反硝化的影响

本实施例探求碳氮比和盐度对好氧反硝化菌株XPS-1反硝化效果的影响，实验过程中以乙酸钠(CH₃COONa)为唯一碳源，硝酸钾(KNO₃)为唯一氮源，通过调整乙酸钠质量改变反硝化液体培养基中的C/N比(质量比)，控制C/N＝2和C/N＝3，并用NaCl调节反硝化液体培养基的盐度，使其NaCl的质量分数分别为1.2％和1.5％，将活化后的菌种按照5％的接种量接种到反硝化液体培养基中，在25℃和120rpm(DO>7mg/L)下培养，每隔12h测定培养液中的总氮浓度和去除总氮效率，测定结果如表1和表2所示。

表1

通过表1可以看出，本发明的好氧反硝化菌株XPS-1具有一定的耐盐性，在高盐条件下仍具有良好的反硝化能力，在1.2％的含盐量情况下的去氮效果略好于1.5％的含盐量，但总体而言除氮效果差别不大。

C/N比对细菌的物质和能量代谢影响很大，也是影响生物脱氮的主要因素之一，C/N比过高会降低硝化反应速率，C/N比过低会抑制反硝化反应进行。对比不同碳氮比的最终除氮率可以看出，碳氮比为3时，本发明的好氧反硝化菌株XPS-1的除氮能力明显优于碳氮比为2时，与预期效果相当。当C/N比为2时，反硝化速率较低，说明碳源不足，也就没有足够的能源供菌体生长，菌的反硝化效率也较低。当C/N比为3时，反硝化速率较高，说明碳源充足，菌体的生长速度快，菌体的反硝化能力强，。

实施例3pH对菌株XPS-1好氧反硝化的影响

在实施例2的基础上得出本发明好氧反硝化菌株XPS-1的最适碳氮比(质量比)为3，最适盐度为1.2％NaCl，因此，本实施例选择C/N＝3(KNO₃为唯一氮源，CH₃COONa为唯一碳源)和盐度为1.2％NaCl的反硝化培养基，分别调节反硝化培养基的pH值为pH 5、pH 6、pH7、pH 8和pH 9，将活化后的菌种按照5％的接种量接种到不同pH的好氧反硝化富集培养基中，在25℃和120rpm(DO>7mg/L)培养条件下培养，每隔12h测定培养液中的总氮浓度和去除总氮效率，测定结果如表2所示。

表2

通过表2可以看出，pH对反硝化作用影响明显，在较低pH(pH 5～6)和较高pH(pH 8～9)条件下，本发明好氧反硝化菌株XPS-1的反硝化能力迅速降低，在中性条件下(pH 7～8)有较强的脱氮能力，脱氮效果可达74％以上，其中pH 7时的脱氮能力最高。当pH过低时，不利于好氧反硝化菌株XPS-1的生长，从而影响反硝化效率；由于反硝化作用是一个产碱的过程，当pH超过8时，溶液pH会随着反硝化的进行而趋于更高水平，使脱氮效果急剧下降。

实施例4温度对菌株XPS-1好氧反硝化的影响

在实施例2和实施例3的基础上得出本发明好氧反硝化菌株XPS-1的最适碳氮比(质量比)为3，最适盐度为1.2％NaCl，最适pH 7，因此，本实施例选择C/N＝3(KNO₃为唯一氮源，CH₃COONa为唯一碳源)和盐度为1.2％NaCl的反硝化培养基，调节反硝化培养基的pH值为pH 7，将活化后的菌种按照5％的接种量接种到好氧反硝化富集培养基中，分别在25℃和30℃下进行120rpm(DO>7mg/L)震荡培养，每隔12h测定培养液中的总氮浓度和去除总氮效率，测定结果如表3所示。

表3

各种微生物都有其最适生长温度和代谢温度，不利于好氧反硝化菌株XPS-1生长和代谢的温度，都会影响其反硝化效率。从3表结果可以看出，温度对好氧反硝化菌株XPS-1脱氮能力也有较明显的影响，在25℃条件下，36h后反硝化作用速度变慢，总氮浓度几乎保持恒定。在30℃条件下，好氧反硝化菌株XPS-1对总氮的去除更加快速有效，24h时去除率即可达到100％。

由上述内容可知，本发明的好氧反硝化菌株能够在低碳氮比(C/N＝2～3)和25～30℃温度下进行高效反硝化，特别适用于碳氮比较低以及具有一定盐度(含盐量1.2％～1.5％)的城镇生活污水处理过程中的脱氮，脱氮率最高可达100％，脱氮速度快速有效，在污水处理领域有广泛的应用前景。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国科学院城市环境研究所

<120>一种好氧反硝化菌及其应用

<130> FI170638

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211>1403

<212>DNA

<213>恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）

<400> 1

tgcaagtcgagcggatgacgggagcttgctccttgattcagcggcggacgggtgagtaat 60

gcctaggaatctgcctggtagtgggggacaacgtttcgaaaggaacgctaataccgcata 120

cgtcctacgggagaaagcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcg 180

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ttgagattttagtggcgcagctaacgcattaagttgaccgcctggggagtacggccgcaa 840

ggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaatt 900

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tggtgccttcgggaactctgacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgag 1020

atgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacgttatgg 1080

tgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtc 1140

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tcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagct 1380

agtctaacct tcgggaggac ggt 1403

Claims

1.一种好氧反硝化菌，其特征在于，该菌株命名为XPS-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年9月29日，保藏编号为CGMCC NO.14772。

2.权利要求1所述的好氧反硝化菌在生活污水脱氮中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述好氧反硝化菌对生活污水进行脱氮时的条件为：碳氮比2～3，温度25～30℃，pH 5～9，含盐量1.2％～1.5％。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述好氧反硝化菌对生活污水进行脱氮时的条件为：碳氮比3，温度30℃，pH 7，含盐量1.2％。